CN108795945A - 自组装核酸适配体dna纳米火车及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

自组装核酸适配体DNA纳米火车及其制备方法和应用，由M1和M2与多肽AKTin进行共轭反应，得M1‑AKTin和M2‑AKTin；将M1‑AKTin、M2‑AKTin和TA6‑tethered trigger混合制得TA6NT‑AKTin。TA6NT‑AKTin和阿霉素室温下反应振摇得到TA6NT‑AKTin‑DOX。该DNA纳米火车在装载阿霉素后具有治疗乳腺癌作用。

Description

自组装核酸适配体DNA纳米火车及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及一种具有治疗乳腺癌作用的可装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌作为一种最为常见的女性恶性肿瘤，它的发病率在全球各类肿瘤中位居第二。有研究表明，约40％乳腺癌患者在经过化疗或辅助治疗后肿瘤仍会复发，而在复发患者中约有60％到70％的患者会发生肿瘤的转移。因此，肿瘤的复发和转移已经成为乳腺癌治疗过程中的巨大障碍。目前，对于肿瘤的复发和转移有学说认为是由于肿瘤中存在一小部分的具有类似干细胞特性的细胞我们称之为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)，例如乳腺癌中存在乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)。肿瘤干细胞的抗凋亡作用和能够将药物泵出细胞外的ATP-结合盒转运体(ATP-binding cassette(ABC)transporter)的过表达使得这些细胞不仅影响着肿瘤的发生、发展，而且在肿瘤的耐药中发挥着重要的作用。传统化疗药物如阿霉素(DOX)的治疗失败很有可能是因为阿霉素无法彻底杀死乳腺癌干细胞所导致的。因此，发明一种能够靶向杀死乳腺癌干细胞的新型药物是有助于乳腺癌治疗的。
有研究发现，跨膜糖蛋白CD44可以作为筛选乳腺癌干细胞的标志物。而核酸适配体(aptamer)是通过SELEX技术(指数富集的配基系统进化技术)筛选出来的单链DNA分子或RNA分子，近年来有研究筛选出了能够特异性识别CD44的核酸适配体TA6。与此同时，核酸适配体已经被广泛应用在药物递送中。然而，由于制备过程复杂、载药量小等原因，简单得直接将核酸适配体与药物连接所得到的复合物很难被应用到临床中。而基于杂交链式反应自组装形成的长双链DNA纳米结构则为核酸适配体递送药物提供了新的方向。杂交链式反应是通过加入核酸适配体-引发序列后引起两段原本不能杂交的互补配对序列不断杂交的反应。阿霉素和其他药物可以被插入或固定到杂交链式反应所形成的DNA双链中，以期提高载药量，增强疗效。
由于肿瘤干细胞的抗凋亡作用和ATP-结合盒转运体的过表达，因此除了靶向递送药物外，寻找一种可以克服乳腺癌干细胞耐药的药物也是至关重要的。目前，有研究发现AKT(蛋白激酶B)在肿瘤干细胞耐药中发挥着重要的作用。AKT能够调节ATP-结合盒转运体的表达以及功能。与此同时，AKT信号通路调控着肿瘤干细胞的凋亡。因此，AKT的多肽抑制剂有望逆转乳腺癌干细胞耐药从而改善患者临床治疗效果。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种自组装核酸适配体DNA纳米火车及其制备方法和应用，该DNA纳米火车在装载阿霉素后具有治疗乳腺癌作用。
技术方案：自组装核酸适配体DNA纳米火车，由以下组分制得：
M1序列：CGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC；
M2序列：TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGT；
TA6-tethered trigger序列：
TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGTTTGAGATTCATCACGCGCATAGTCTTGGGACGGTGTTAAACGAAAGGGGACGACCGACTATGCGATGATGTCTTC；
多肽AKTin序列：AVTDHPDRLWAWEKF。
自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，制备步骤为：以磷酸三氯乙酯为还原剂，100μL浓度为20μM的二硫键修饰的M1、M2分别与50μL的TCEP还原珠混合，在37℃反应振摇2h；然后将样品1000×g离心5min；取上述制备的含有还原了的M1和M2的上清液，分别在上清中加入相同体积的200μM的马来酰亚胺修饰的多肽AKTin，37℃振荡4h进行共轭反应，使用高效液相色谱对反应产物进行纯化，去除多余的M1、M2和多肽AKTin得到DNA-多肽复合物：M1-AKTin和M2-AKTin；将M1-AKTin、M2-AKTin和TA6-tethered trigger分别95℃加热5min，冰上冷却5min后室温下放置1h；将M1-AKTin、M2-AKTin和TA6-tethered trigger混合，室温下反应振摇24h得到TA6NT-AKTin。
优选的，所述M1、M2与多肽AKTin的摩尔比分别为1:10。
优选的，所述TA6-tethered trigger与M1-AKTin、M2-AKTin摩尔比为1:3:3。
所述使用高效液相色谱纯化的方法为：使用19mm×150mm，5μm Waters XBridgeC18色谱柱在室温下进行色谱分离，流动相A为50mM三乙胺-水溶液，流动相B为100％乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为：0～5min，5～20％B；5～20min，20％～30％B；20～25min，30％～5％B。
装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，制备步骤为将制得的TA6NT-AKTin和阿霉素室温下反应振摇2h得到TA6NT-AKTin-DOX。
上述制得的装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车。
装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车在制备抗肿瘤药物中的应用。
装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车在制备治疗乳腺癌制剂中的应用。
有益效果：
1)本发明所述的AKTin为多肽，可化学合成，稳定性好；
2)本发明所述的DNA-多肽复合物制备方法简单易行，利用的是多肽氨基端修饰的马来酰亚胺与M1和M2修饰的巯基发生迈克尔加成反应，属于共价连接，反应速率高，耗时短，产物的纯度和产率较高；
3)本发明所述的杂交链式反应是一种无酶、等温扩增反应，反应条件简单、易于操作。
4)本发明所述的TA6NT-AKTin-DOX在肿瘤微环境中，释放出药理活性的阿霉素和AKT多肽抑制剂AKTin；
5)本发明通过各部分结合，达到一个综合性的效果，相比单一药物具有更高肿瘤生长抑制特征，以人乳腺癌细胞MCF-7中筛选出CD44+/CD24-的BCSCs为细胞模型，以荷瘤小鼠为动物模型，TA6NT-AKTin-DOX可增强肿瘤细胞对阿霉素的摄取，提高细胞内药物浓度，降低AKT表达活性，抑制肿瘤细胞增殖，抑制ABCG2的作用，诱导其凋亡，抑制裸鼠移植肿瘤的生长；
6)本发明的装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车整体效果能综合各组成部分(如DOX，AKTin等)的作用，并且各组成部分之间不会相互影响，能够使得各组成部分发挥最佳效果。
附图说明
图1为本发明的M1、M2和多肽AKTin在反应前后的高效液相色谱图；
图2为本发明的DNA-多肽复合物以及单独的DNA用LCQ Deca XP Plus离子阱质谱在电喷雾正离子模式下检测得到的质谱图；
图3为本发明阿霉素与不同浓度TA6NT-AKTin反应后阿霉素荧光淬灭结果；
图4为本发明的杂交链式反应产物与各反应原料的琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为本发明的TA6NT-AKTin-DOX和游离DOX抑制BCSCs乳腺球形成的示意图；
图6为本发明的TA6NT-AKTin-DOX及游离DOX对BCSCs生长抑制曲线；
图7为BCSCs和NIH-3T3细胞对TA6NT-AKTin-DOX和游离DOX的摄取比较示意图；
图8为本发明的TA6NT-AKTin-DOX和游离DOX引起的细胞凋亡情况检测示意图；其中，分别代表DAPI染核图像，TUNEL检测凋亡的细胞图像；
图9为本发明的TA6NT-AKTin-DOX和游离DOX对pAKT、ABCG2和Cleaved Caspase-3表达的影响示意图；
图10为本发明的TA6NT-AKTin-DOX和游离DOX对移植瘤裸鼠模型瘤体积的抑制情况示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车的合成及纯化
(1)TA6NT-AKTin-DOX的制备
1)DNA-多肽复合物的制备和纯化
以磷酸三氯乙酯(TCEP)为还原剂，100μL浓度为20μM的二硫键修饰的M1和M2分别与50μL的TCEP还原珠混合，在37℃反应振摇2h。然后将样品1000×g离心5min。取含有还原了的M1和M2的上清液，分别在上清中加入相同体积的200μM的马来酰亚胺修饰的多肽AKTin，37℃、振荡4h进行共轭反应，紧接着利用共轭前后保留时间的不同(M1、M1-AKTin、M2和M2-AKTin的保留时间分别是10.6min、12.9min、8.4min和12.4min，如图1)使用制备型高效液相色谱对反应产物进行纯化。
2)构建TA6NT-AKTin-DOX
100μL浓度为3μM的TA6-tethered trigger与100μL浓度为9μM的M1-AKTin和100μL浓度为9μM的M2-AKTin混合，37℃反应振摇24h得到杂交链式反应产物TA6NT-AKTin。将50μL浓度为2μM的阿霉素与等体积不同浓度的TA6NT-AKTin混合，37℃反应振摇2h后检测荧光强度的变化，发现TA6NT-AKTin：DOX＝1：20时阿霉素荧光完全淬灭(如图3)，说明平均一个TA6NT-AKTin可以插入20个阿霉素。100μL浓度为1μM的TA6NT-AKTin与浓度为20μM的等体积阿霉素混合，37℃反应振摇2h得到TA6NT-AKTin-DOX。
(2)离子阱质谱和琼脂糖凝胶电泳鉴定产物
新合成的DNA-多肽复合物经过LCQ Deca XP Plus离子阱质谱分析进行验证，如图2所示，M1-AKTin和M2-AKTin增加的分子量与多肽AKTin的分子量相匹配。琼脂糖凝胶电泳结果(如图4)验证了反应后产物分子量的增加且没有TA6-tethered trigger、M1-AKTin和M2-AKTin条带出现，说明杂交链式反应完全。
实施例2乳腺球形成试验
BCSCs分别给与DOX和TA6NT-AKTin-DOX，37℃孵育12h后将BCSCs消化，BCSCs以1×104/孔的密度接种于6孔培养板中，置于37℃、5％二氧化碳环境中孵育，14天后观察乳腺球形成数量。如图5所示，与对照组相比DOX组乳腺球数量没有明显变化，而给与TA6NT-AKTin-DOX乳腺球数量减少了约60％，说明TA6NT-AKTin-DOX可以抑制BCSCs的自我更新能力。
实施例3MTT法测定细胞存活率试验
将状态良好的BCSCs消化，用培养液稀释至5×104cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置37℃、5％二氧化碳环境中孵育24h。换用200μL DOX和TA6NT-AKTin-DOX含药培养液，每个浓度设5个平行孔，同时设置空白对照组，均置于培养箱中孵育48h，再向每孔加入MTT液(5mg/mL)20μL，继续培养4h，吸去培养液，加入DMSO 150μL，室温下微孔板震荡器上震荡30min，在酶联免疫检测仪490nm下测定各孔吸光值。以对照细胞为100％，以给药组的细胞存活相对于对照细胞存活的百分率来测定其存活率。
通过MTT方法考察两种药物对BCSCs的细胞毒性作用，绘制细胞存活率曲线，计算IC50值，评价药物的体外细胞毒性。如图6所示，DOX对BCSCs的IC50值分别为3618.0±436.0nM，而TA6NT-AKTin-DOX对BCSCs的IC50分别为879.2±103.7nM，说明相比DOX，BCSCs对TA6NT-AKTin-DOX更加敏感。
实施例4细胞内阿霉素蓄积实验
BCSCs以1×105/孔的密度接种于6孔培养板中，置37℃、5％二氧化碳环境中孵育24h后，加入DOX和TA6NT-AKTin-DOX，阿霉素终浓度都为1.5μM，药物作用12h。吸弃含药培养液，用冷PBS洗细胞3次，激光共聚焦显微镜下观察各组处理细胞，结果见图7。BCSCs经过不同的给药处理后，TA6NT-AKTin-DOX组细胞内的荧光强度明显高于DOX组。而NIH-3T3细胞结果与BCSCs相反，DOX组细胞内的荧光强度明显高于TA6NT-AKTin-DOX组，说明TA6NT-AKTin-DOX在增强BCSCs的摄取的同时能够降低正常细胞的摄取。
实施例5缺口末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡
将2×107/mL密度的细胞制成细胞涂片后，用4％多聚甲醛/PBS液，4℃固定20min。加入20μg/mL的蛋白酶K 100μL作透化处理，室温孵育5min，PBS洗涤3次。滴加100μL平衡液，室温孵育30min，再加入TdT孵育缓冲液50μL，37℃温育1h，PBS洗涤后，再用DAPI复染，荧光显微镜下分析样品，结果如图6所示，DAPI染核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色。
凋亡检测结果如图8所示。DOX组BCSCs凋亡率为25.3±1.6％，而TA6NT-AKTin-DOX组凋亡率明显增高，为54.5±2.4％。，说明相比于DOX，TA6NT-AKTin-DOX可以促进肿瘤细胞的凋亡。
实施例6 TA6NT-AKTin-DOX对AKT信号通路的影响
将BCSCs分别暴露于溶于无血清培养液的DOX和TA6NT-AKTin-DOX 24h，通过western bloting检测细胞内pAKT、cleaved caspase-3和膜蛋白ABCG2的表达。图9表明相比于DOX组，TA6NT-AKTin-DOX组pAKT和ABCG2的表达显著降低而cleaved caspase-3表达明显增强，说明AKT多肽抑制剂AKTin能够对AKT信号通路起到一定的抑制作用从而逆转BCSCs的耐药。
实施例7体内抗肿瘤活性
将处于对数生长期的BCSCs，用PBS调制细胞混悬液至细胞数为5×l04/mL，以每只0.1mL接种于小鼠乳腺垫中，建立小鼠乳腺癌瘤株原位接种模型。
待肿瘤体积生长至约50mm3，对荷瘤小鼠进行尾静脉注射给药。将荷瘤小鼠随机分成3组(每组6只)，分别为模型对照组(生理盐水)、DOX和TA6NT-AKTin-DOX组，对照组尾静脉给予生理盐水，其余各组分别尾静脉注射给予相应药物，每7天给药3次，给药剂量为5mgDOX/kg鼠重，其中TA6NT-AKTin-DOX组需以DOX为有效成分，经换算后再按5mgDOX/kg鼠重标准给药。
给药后，每三天观察小鼠的存活状态，用游标卡尺测量肿瘤体积。待各给药组与荷瘤对照组间的肿瘤体积存在明显差异后，结束观察。处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率。
如图10所示，DOX和TA6NT-AKTin-DOX组均能一定程度上抑制肿瘤体积的增长，呈现一定的抗肿瘤活性，DOX和TA6NT-AKTin-DOX组抑瘤率分别为43.0±2.5％和72.8±2.5％，TA6NT-AKTin-DOX的平均抑瘤率明显增加。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 自组装核酸适配体DNA纳米火车及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtcgtgcag cagcagcagc agcaacggct tgctgctgct gctgctgc 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctgctgct gctgctgcac gacggcagca gcagcagcag caagccgt 48
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctgctgct gctgctgcac gacgtttgag attcatcacg cgcatagtct tgggacggtg 60
ttaaacgaaa ggggacgacc gactatgcga tgatgtcttc 100
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Val Thr Asp His Pro Asp Arg Leu Trp Ala Trp Glu Lys Phe
1 5 10 15

Claims (9)

1.自组装核酸适配体DNA纳米火车，其特征在于由以下组分制得：
M1序列：CGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC；
M2序列：TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGT；
TA6-tethered trigger序列：
TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGTTTGAGATTCATCACGCGCATAGTCTTGGGACGGTGTTAAACGAAAGGGGACGACCGACTATGCGATGATGTCTTC；
多肽AKTin序列：AVTDHPDRLWAWEKF。
2.权利要求1所述自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，其特征在于制备步骤为：以磷酸三氯乙酯为还原剂，100 μL浓度为20 μM的二硫键修饰的M1、M2分别与50 μL的TCEP还原珠混合，在37℃反应振摇2 h；然后将样品1000 × g离心5 min；取上述制备的含有还原了的M1和M2的上清液，分别在上清中加入相同体积的200 μM的马来酰亚胺修饰的多肽AKTin，37℃振荡4 h进行共轭反应，使用高效液相色谱对反应产物进行纯化，去除多余的M1、M2和多肽AKTin得到DNA-多肽复合物：M1-AKTin和M2-AKTin；将M1-AKTin、M2-AKTin和TA6-tethered trigger分别95℃加热5 min，冰上冷却5 min后室温下放置1 h；将M1-AKTin、M2-AKTin和TA6-tethered trigger混合，室温下反应振摇24 h得到TA6NT-AKTin。
3.根据权利要求2所述自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，其特征在于所述M1、M2与多肽AKTin的摩尔比分别为1:10。
4.根据权利要求2所述自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，其特征在于所述TA6-tethered trigger与M1-AKTin、M2-AKTin摩尔比为1:3:3。
5.根据权利要求2所述自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，其特征在于所述使用高效液相色谱纯化的方法为：使用19 mm×150 mm，5 µm Waters XBridge C18 色谱柱在室温下进行色谱分离，流动相A为50 mM三乙胺-水溶液，流动相B为100%乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为：0～5 min，5～20% B；5～20 min，20%～30% B；20～25 min，30%～5% B。
6.装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车的制备方法，其特征在于制备步骤为将权利要求2制得的TA6NT-AKTin和阿霉素室温下反应振摇2 h得到TA6NT-AKTin-DOX。
7.权利要求6制得的装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车。
8.权利要求7所述装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求7所述装载阿霉素的自组装核酸适配体DNA纳米火车在制备治疗乳腺癌制剂中的应用。
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