CN114317545B - 一种核酸适体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸适体及其应用，所述核酸适体为能够特异性地识别膀胱肿瘤细胞，并且能够内化进入膀胱肿瘤细胞内的核酸适体。该核酸适体的特异性、内化力以及稳定性均好，可以用作检测及标记肿瘤细胞的分子工具，还可将该靶向性较强的核酸适体与具有治疗效果的药物结合应用，可定向作用于肿瘤细胞中，提高对肿瘤细胞的治疗效果，减少了目前抗肿瘤药物特异性不强而导致的毒副作用，综合应用前景佳。

Description

一种核酸适体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种核酸适体、能够转录所述核酸适体的基因分子及该核酸适体的应用。
背景技术
膀胱尿路上皮癌是泌尿系统中常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌(浅表性)和肌层浸润性膀胱癌，其中浅表性膀胱癌约占75％-80％。目前临床的治疗手段主要为手术切除，继而辅助进行药物灌注化疗。表阿霉素(Epirubicin，EPI)是常用的化疗药物之一，因其分子量小(MW：543.52)，极易进入细胞，所以被用于多种癌症的治疗。但是表阿霉素缺少靶向性，无法有效地区分肿瘤组织和正常组织，在杀死癌细胞的同时也会破坏正常细胞，有明显的毒副作用。为了解决这个问题，研究者们将药物与抗体偶联，构建抗体药物偶联物(Antibody-drug conjugate，ADCs)，试图提高药物的靶向性。抗体药物偶联物是通过一个化学连接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，利用单抗特异结合细胞表面靶标蛋白的特性，将小分子药物靶向运输到目标细胞中。这种联用的方式也存在一些缺陷：1)引入的抗体多是基于癌细胞表面的标志物，目前这种标志物还比较少，所以可供选用的抗体种类也很少；2)抗体的制备过程比较繁琐，而且热稳定差，在后续修饰药物的过程中存在降解的风险；3)抗体的分子量比较大，药物分子量比较小，偶联后存在药物分子失效的可能；4)抗体药物偶联物进入细胞后，可能会产生免疫原性。介于以上的情况，临床施药亟需我们找到新的方式。
核酸适体是一种由几十个核苷酸组成的单链核酸分子，对靶标有明显的选择性，可以与蛋白质、金属离子、有机小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合。由于核酸适体(aptamer)具有与抗体类似的特异结合靶标的性质，又有“化学抗体”之称。与传统的抗体相比，核酸适体有诸多优势：1)在序列确定后，可以直接通过化学合成制备，成本低，过程简单；2)分子量小，免疫原性低；3)可以引入非天然核苷酸，提高序列的生物学及热力学稳定性；抗核酸酶降解、耐高温的能力；4)容易进行化学修饰，可以做多种标记等。
核酸适体的应用能够摆脱细胞表面癌症标志物的限制，尽可能保留癌细胞的自然状态，因此，其可能是一个新的研究和应用热点，在药物检测和治疗等领域极具应用前景。目前已经有研究者的实验室逐渐研究出了一些亲和力高、特异性较好的核酸适体分子，但其仅为初步研究。最重要的是，目前针对膀胱癌细胞的核酸适体的研究仍是空白，亟需我们做一些努力，将核酸适体引入到膀胱癌的治疗中。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷提供了一种核酸适体、能够转录所述核酸适体的基因分子及该核酸适体的应用，旨在克服现有技术中的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明的一个发明点为提供一种新型的核酸适体，其为能够特异性地识别膀胱癌细胞，并且能够内化进入膀胱癌细胞内的核酸适体，所述核酸适体的长度为20-1000bp。
进一步地，所述核酸适体中的部分碱基能够配对成为局部双链结构，如部分碱基C和碱基G能够配对成为双链。
进一步地，所述核酸适体包括第一序列，所述第一序列为含有seq1的序列或与该seq1序列80％以上同源的序列；该同源的序列包括在seq1基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个或几个碱基，此处的几个包括两个及两个以上数量的碱基。该第一序列可以特异性识别并内化进入膀胱肿瘤细胞，并且其具有极高的特异性和内化能力。
上述的seq1为5’-CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGG-3’。
进一步地，所述核酸适体包括第二序列，该第二序列为含有seq2的序列或与该seq2序列80％以上同源的序列；该同源的序列包括在seq2基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个碱基。
上述seq2序列为GAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAG。
进一步地，所述第二序列优选设置于所述第一序列的3’端。如核酸适体可以为序列CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUU GCUGGUCGGGAACAGUCUCAG，该序列记为A1序列。
进一步地，所述核酸适体还包括第三序列，该第三序列包括含有seq3的序列或与该seq3序列80％以上同源的序列；该同源的序列包括在seq3基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个碱基。
上述Seq3序列为CUGGUCGGUCGACUCCUAU。
进一步地，所述第三序列设置于第一序列的两端、第一序列中间任意位置、第二序列的两端或第二序列中间任意位置。
优选地，所述第三序列设置于第二序列的3'端，如核酸适体为5'-CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAGCUGGUCGGUCGACUCCUAU-3'，该序列记为A2序列。
进一步地，所述核酸适体的5'端设置有序列GUAU或与该序列75％以上同源的序列，如5'-GUAUCCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAGCUGGUCGGUCGACUCCUAU-3'，该序列记为A3序列。
进一步地，所述核酸适体还包括富GC序列，该富GC序列设置于所述第一序列的两端或中间任意位置；优选地，所述核酸序列的两端各设置一段富GC序列，且优选两端的两段富GC序列能够部分或全部配对为双链，该富GC序列的长度为4-1000bp。
进一步地，所述富GC序列为含有GC的碱基数量和占富GC序列中总碱基数量的60％～100％，富GC序列中碱基G和碱基C的比例为1：(0.5～2)。本发明所构建的富GC的序列，可进一步提高药物的载量，从而提高药物对肿瘤的杀伤作用。
进一步地，所述核酸适体(包括所述第一序列、第二序列、第三序列或其他等)中的任意一个或几个碱基均独立地为修饰过的碱基或未经过修饰的碱基，此处的几个包括两个及两个以上数量的碱基。在一些特定情形下，通过修饰能够增加抗核酸酶降解并快速进入细胞内实现药物等递送的目的。
进一步地，所述核酸适体的两端独立地为经过修饰的或未经过修饰的端部。在一些特定情形下，通过修饰能够增加抗核酸酶降解并快速进入细胞内实现药物等递送的目的。
进一步地，所述核酸适体的两端独立地通过氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。根据实际情况选择合适的修饰，可增加生物学稳定性等。
进一步地，所述核酸适体中碱基的修饰包括硫代修饰、氟代修饰、氨代修饰、甲氧基修饰。
进一步地，所述碱基C/U优选进行氟代修饰，修饰后的核酸适体具有更优的抗核酸酶降解及快速进入膀胱癌细胞的能力。
进一步地，所述核酸适体的碱基A和/或G的修饰可为硫代修饰，也可以不修饰。
本发明另一个发明点为提供了一种基因分子，所述基因分子为能够转录以上任意一段所述的核酸适体的碱基序列。
本发明另一个发明点为提供了一种载体，所述载体为包含以上任意一段中的碱基序列的载体。
本发明还有一个发明点为提供了一种根据以上任意一段所述核酸适体在制备用于检测和/或治疗膀胱肿瘤制剂中的应用。
本发明还有一个发明点为提供了一种负载系统，该系统包括以上任意一段所述的核酸适体以及与该核酸适体配合的负载体。
进一步地，所述负载体包括药物、药学上可接受的载体物或赋形剂。
进一步地，所述载体物选自药物载体、显影剂或染色分子，所述药物载体选自脂质体、胶束或纳米粒；显影剂可为肿瘤造影剂粒子，如纳米铁、包裹了造影剂的纳米粒等；染色分子如辣根过氧化物酶等。
进一步地，所述药物包括抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包括抗代谢类抗肿瘤药、抗生素类抗肿瘤药物、植物碱类抗肿瘤药、激素类抗肿瘤药、铂类抗癌药或抗肿瘤小分子靶向药物。核酸适体和抗肿瘤药物是以复合体形式存在，纳米火车载药系统或纳米载药系统，可以直接携带抗肿瘤药物，如化疗药物表阿霉素，特异性识别并内化进入肿瘤细胞(如膀胱癌细胞)，从而提高药物的靶向性及对肿瘤的杀伤作用，因此，本发明提供了所述核酸适体应用于治疗肿瘤尤其是膀胱癌方面的应用。核酸适体与载体物或赋形剂是可形成靶向药剂混合物，该混合物也可以与药物结合形成药物体系。
以抗生素类药物为例，抗生素类抗肿瘤药物如表阿霉素，是一种蒽环霉素类药物，可以自发嵌入核酸适体中的双链序列的GC间。基于此，构建的核酸适体纳米火车载药系统，可以直接携带化疗药物表阿霉素，特异性识别并内化进入膀胱癌细胞，因此，本发明的再一方面，提供了本发明所述核酸适体在治疗膀胱癌方面的应用。
本发明的主要具有的有益效果为：
本发明的核酸适体具有特异性识别包括膀胱癌细胞在内的肿瘤细胞，并且其可以内化进入膀胱癌细胞等肿瘤细胞中，特异性、内化力以及稳定性均好。
本申请中的核酸适体具有抗核酸酶降解及快速进入细胞递送药物的能力。
本申请富GC序列的设计能够大大提高载药量，应用前景和效果更佳。
本发明核酸适体的成功研发为肿瘤方面的治疗提供了一种新的思路和方法，即通过将药物等或药物载体等与该核酸适体结合来实现药物的特异性治疗。即将该靶向性较强的核酸适体与治疗效果较好的药物结合应用，其可定向作用于肿瘤细胞中，提高对肿瘤细胞的治疗效果，减少了目前抗肿瘤药物特异性不强而导致的毒副作用，即可减少对正常细胞的杀伤作用。
此外，本申请中的核酸适体还能极佳地应用于肿瘤等的检测中。
附图说明
图1A为本发明实施例所述的A3序列的二级结构示意图。
图1B为本发明实施例所述的seq1的二级结构示意图。
图2为本发明实施例所述的构建RNA文库并验证其识别和进入细胞内的流程示意图。
图3A为本发明实施例所述的流式细胞仪分析A3序列内化膀胱癌细胞T24的水平。
图3B为本发明实施例所述的激光共聚焦显微镜成像图。
图3C为本发明实施例所述的不同浓度A3序列内化膀胱癌细胞及膀胱正常上皮细胞的水平变化。
图4为本发明实施例所述的核酸适体第一序列特异性识别并内化进入人膀胱癌细胞T24的实验验证图。
图5为本发明实施例所述的核酸适体第一序列与膀胱癌细胞亲和力示意图。
图6为本发明实施例所述的核酸适体第一序列与对照序列内化膀胱癌细胞效果比较图。
图7A为本发明实施例所述的seq1介导的纳米火车(seq1 NTrs)载药示意图。
图7B为本发明实施例所述的琼脂糖凝胶分析seq1 NTrs的每个部件及组装后的结构。
图7C为本发明实施例所述的流式细胞仪分析seq1 NTrs内化人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1的水平。
图7D为本发明实施例所述的激光共聚焦显微镜成像seq1 NTrs内化T24细胞及SV-huc-1细胞的分布情况。
图8A为本发明实施例所述的表阿霉素成功装载进seq1 NTrs的验证图。
图8B为本发明实施例所述的seq1 NT-EPI稳定性的比较示意图。
图9为本发明实施例所述的seq1 NT-EPI特异性识别并内化膀胱癌细胞的实验结果。
图10为本发明实施例所述的seq1 NT-EPI特异杀伤膀胱癌细胞的实验结果。
图11为本发明实施例所述的seq1 NT-EPI在活体水平抑制膀胱肿瘤生长的实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种可特异性识别肿瘤细胞的核酸适体，所述核酸适体的长度为20-1000bp，如20bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、57bp、64bp、72bp、83bp、87bp、95bp、110bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、750bp、1000bp等。优选地，该核酸适体可以为以下任意一项中的任意一个碱基序列。
①所述核酸适体包括第一序列，所述第一序列为含有seq1的序列或与该seq1序列80％以上同源的序列，如80％、85％、90％、95％同源；seq1为(5’-)CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGG(-3’)。
②所述核酸适体包括第二序列以及①中所示的第一序列；该第二序列为含有seq2的序列或与该seq2序列80％以上同源的序列，如80％、85％、90％、95％同源。seq2序列为GAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAG。该第二序列设置于所述第一序列的两端或中间任意位置。
作为本实施例优选的实施方式，所述第二序列优选设置于所述第一序列的3’端。如核酸适体为序列CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAG，该序列可记为A1序列。
③所述核酸适体包括第三序列，该第三序列包括含有seq3的序列或与该seq3序列80％以上同源的序列，如80％、85％、90％、95％同源；Seq3序列为5'-CUGGUCGGUCGACUCCUAU-3'。
该第三序列可以与第一序列连接作为核酸适体，也可以与第一序列和第二序列一起连接作为核酸适体。所述第三序列设置于第一序列的两端、第一序列中间任意位置、第二序列的两端或第二序列中间任意位置。
作为本实施例优选的实施方式，优选地，所述第三序列设置于第二序列的3’端，如核酸适体为5'-CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAGCUGGUCGGUCGACUCCUAU-3'，该序列记为A2序列。
作为进一步优选的实施方式，所述核酸适体的5'端设置有序列GUAU或与该序列75％以上同源的序列，如5'-GUAUCCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAGCUGGUCGGUCGACUCCUAU-3'，该序列记为A3序列。
以上所述的同源的序列均为在原有序列基础上增加碱基、减少碱基或替换其中任意一个或几个碱基。
作为本实施例优选的实施方式，所述核酸适体中的任意一个碱基均独立地为修饰过的碱基或未经过修饰的碱基。在一些特定情形下，所述核酸适体中碱基的修饰包括硫代修饰、氟代修饰、氨代修饰、甲氧基修饰，如核酸适体中的所述碱基C和碱基U的修饰为氟代修饰。根据实际情况选择合适的修饰，可增加生物学稳定性等。
作为本实施例优选的实施方式，所述核酸适体的两端独立地为修饰过的或未修饰过的端部。在一些特定情形下，通过修饰能够增加抗核酸酶降解并快速进入细胞内实现药物等递送的目的。所述核酸适体的两端独立地通过氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。
作为进一步优选的实施方式，所述核酸适体包括富GC的序列，该富GC序列设置于所述第一序列的两端或中间任意位置。优选地，所述富GC的序列设置于核酸适体的两端。更优选地，所述核酸序列的两端各设置一段富GC序列，且优选两端的两段富GC序列能够部分或全部配对为双链，增加载药量，从而提高药物对肿瘤的杀伤作用。
该富GC序列的长度优选为4-1000bp，如4bp、6bp、10bp、20bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、57bp、64bp、72bp、83bp、87bp、95bp、110bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、750bp、1000bp等
作为进一步优选的实施方式，所述富GC序列为含有GC的碱基数量和占富GC序列中总碱基数量的60％～100％，如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，富GC序列中碱基G和碱基C的比例为1：(0.5～2)，如1：0.5、1：0.8、1：1、1：1.5、1：2等。只要符合前述限定的所有富GC序列均可以实现本申请的功效，也均在本申请保护范围内，本申请只以M1和M2为例来说明。
为了进一步了解该序列的结构，且由于符合本申请的相似序列较多，无法一一列举，因此，本实施例以seq1以及A3序列为例，给出了这两个序列的二级结构，如图1A和1B所示。
在本实施例中，所述的所有核酸适体的序列中的部分碱基可配对，如碱基C和碱基G形成双链，配对的双链更容易与药物结合，即药物嵌入双链中。富GC碱基序列的增加能够进一步增加双链长度，可增加载药量，效果更好。
实施例2
如图2所示，将本发明中所保护的多个核酸适体以及非本发明保护的多个RNA片段一起构成成为RNA文库，其中，本发明中所保护的核酸适体包括第一序列(即seq1及与其80％以上同源的序列)、第一序列与第二序列的组合序列(包括A1序列及第一、二序列的其他组合序列)、第一、二、三序列组合的序列(包括A2序列、A3序列以及其他组合方式的序列)等，其中seq1、A1序列、A2序列、A3序列还包括将其碱基中的碱基A进行硫代修改以后的序列、将其碱基序列中的C/U的2’位做氟代修饰以后的序列以及将序列两端分别通过氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰的序列。
将以上多个RNA片段所组成的RNA文库与人膀胱癌细胞系T24细胞孵育一定时间后，用0.05％Trypsin-EDTA消化细胞。离心重悬后，用强效的核酸酶混合物(包含DNase I，RNase I，RNase T1/A)降解结合在细胞表面的序列。然后用Trizol裂解细胞，提取总RNA。再利用逆转录酶及引物将活性序列逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。富集活性序列后，进入下一轮。经过多轮筛选及测序分析，最后获得了进入膀胱癌细胞内的序列为所加入的本申请中的序列，则可知，本申请所保护的核酸适体序列稳定性强，抗核酸酶消化，且能够很好的内化入膀胱癌细胞内部，而与本申请不同的RNA序列，其内化入膀胱癌细胞内的几率极低。
在本实施例中，本发明中的核酸适体能够选择内化进入膀胱癌细胞中，而且，通过所检测到的数量比例发现，未经过修饰的、碱基经过修饰的、两端经过修饰的核酸适体基本均能顺利进入肿瘤细胞内，稳定性和内化性普遍较佳。
实施例3
如图3A、图3B和图3C所示，为了进一步验证本申请中的核酸适体A3序列可以特异性识别并内化进入膀胱癌细胞，分别选择膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1进行实验，具体如下所示。
200nM Cy5.5修饰的两种序列分别处理T24细胞，37℃温育1h。在流式细胞仪分析实验中，反应结束后用Trypsin消化细胞，PBS清洗细胞两次，1mL PBS重悬细胞后进行上机分析。数据用FlowJo软件统计。在荧光共聚焦显微镜成像实验中，反应结束后，PBS清洗细胞两次，用Hoechst染细胞核，室温孵育15min。最后用PBS清洗细胞两次，4％多聚甲醛固定细胞，随后用激光共聚焦显微镜成像。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析证实，相对参照序列，本发明筛选获得的核酸适体A3序列可以特异性识别并内化进入人膀胱癌细胞T24。最后，用不同浓度的A3序列(0-800nM)分别孵育细胞，反应结束后，用流式细胞仪进行分析，利用FlowJo计算荧光密度的中位数，最后用GraphPad拟合荧光密度与A3序列的浓度的关系。结果证实，相对正常膀胱上皮细胞SV-huc-1，本发明筛选获得的核酸适体A3序列更多地进入到人膀胱癌细胞T24中。
此外，在图3A中，原始文库(naive library)指的是利用引物延伸反应获得的化学修饰的随机文库。以最初合成的DNA文库(Biotin-ATAGGAGTCGACCGACCAG-N40-CAGGACGCTTCACTGGATAC)为模板，以Cy5.5修饰的primer 2R(Cy5.5-GTATCCAGTGAAGCGTCCTG)为引物，在聚合酶SFM4-3的作用下，延伸获得的79-nt的DNA-RNA嵌合序列。
实施例4
如图4所示，验证核酸适体第一序列可以特异性识别并内化进入膀胱癌细胞，以seq1为例来说明。用200nM Cy5.5修饰(序列5’端修饰Cy5.5荧光染料分子)的核酸适体seq1分别孵育人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1，37℃温育1h。反应结束后，PBS清洗细胞两次，用Hoechst染细胞核，室温孵育15min。最后用激光共聚焦显微镜成像。
结果发现，本发明中的核酸适体seq1特异性内化膀胱癌细胞T24和KU-7，但是不会进入正常细胞SV-huc-1中。
实施例5
如图5所示，核酸适体seq1对T24细胞内化水平测试。用不同浓度的Cy5.5修饰的seq1序列分别处理细胞，37℃温育1h。反应结束后，用Trypsin消化细胞，PBS清洗细胞2次，继而用流式细胞仪分析。
结果显示，核酸适体seq1与膀胱癌细胞亲和力强。且通过将不同浓度的seq1分别与人膀胱癌细胞T24共孵育，结果发现，随着seq1浓度的增加，内化细胞水平增强。
实施例6
如图6所示，核酸适体seq1与对照序列内化膀胱癌细胞效果比较。实验组seq1为序列中的碱基C和碱基U均进行了F代修饰，对照组Scrambled是每种碱基数与本实施例实验组中的核酸适体相同，但经过随机排列后的序列。分别用不同浓度的两种序列处理T24细胞，37℃温育1h，随后用Trypsin消化细胞，PBS清洗细胞2次，继而用流式细胞仪分析。GraphPad分析统计数据。
结果显示，实验组seq1内化膀胱癌细胞T24的水平明显且远远高于对照组序列，则说明seq1特异内化细胞的性质与碱基组成、排列及化学修饰核酸骨架密切相关。且通常与本申请序列同源性在80％以上的，效果均较佳。
实施例7
图7为核酸适体seq1介导的纳米火车式载药体系(seq1 NTrs)的构建及内化水平表征，如图7A、图7B、图7C、图7D所示，构建核酸适体seq1介导的纳米火车载药结构体系seq1NTrs。常用化疗药物表阿霉素是一种蒽环霉素类药物，可以自发嵌入双链DNA的GC碱基对间。包含seq1的启动链、M1和M2以1:5:5的比例组装seq1 NTrs，室温反应24h。seq1 NTrs结构组装完成后，利用琼脂糖凝胶分析seq1 NTrs的每个部件及组装后的结构(图7B)。利用流式细胞仪分析seq1 NTrs(seq1，200nM)框架结构内化人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1的情况，将seq1 NTrs分别孵育人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1，在0.5小时和2小时后进行流式细胞仪分析，随机核酸序列作为对照，从实验结果可以看出，seq1 NTrs可以特异性识别并内化进入人膀胱癌细胞T24。利用激光共聚焦显微镜成像seq1 NTrs框架结构内化人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1的情况，实验结果同样证实，seq1NTrs可以特异性识别并内化进入人膀胱癌细胞T24。
具体地，图7A为seq1介导的纳米火车(seq1 NTrs)载药示意图；图7B为琼脂糖凝胶分析seq1 NTrs的每个部件及组装后的结构。从结果看，阶梯状的长双链纳米载药结构组装成功；图7C为流式细胞仪分析seq1 NTrs内化人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1的水平。从结果看，随着时间的增加，seq1 NTrs内化细胞的水平逐渐增加，但是几乎不会进入到正常细胞中。图7D为激光共聚焦显微镜成像seq1 NTrs内化T24细胞及SV-huc-1细胞的分布情况。成像结果与流式细胞仪的分析一致。
其中，M1和M2为所设计的富GC单体序列，M是DNAmarker，M1和M2与核酸适体的连接方式参考图7A。FAM是5-羧基荧光素(5-Carboxyfluorescein)。具体地，启动链Seq1trigger:TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGTTTCCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGG；M1:FAM-CGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC；M2:FAM-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGT。
实施例8
如图8所示，seq1介导的纳米结构装载EPI能力及稳定性分析。M1和M2(与实施例7中的M1、M2序列一样)是短的发夹结构，在seq1 trigger(与实施例7中的启动链一样)的作用下才能启动并自发组装在trigger链的下游。在实验中，seq1 trigger、M1和M2分别进行退火处理，95℃热处理5min，室温放置2h。随后将200nM的seq1 trigger和不同比例的后置链M1和M2混合，室温放置24h，使其组装成不同长度的纳米火车结构。接着在每个体系中加入16μM表阿霉素(Epirubicin,EPI)，构建纳米载药体系(seq1 NT-EPI)，室温反应过夜。最后用酶标仪检测EPI荧光水平，确定seq1 trigger、M1和M2及EPI的使用比例。
另外，为了评估载药系统的稳定性，将300μL装载了EPI的纳米火车结构及等量游离的EPI分别装入透析袋(3.5k)中，整个体系再置于含20mL PBS溶液(补充5mM MgCl2)的烧杯中，底部用磁力搅拌棒以135rpm的速度不停地搅拌。在特定的时间点取样，用酶标仪测定荧光值，从而分析EPI渗出到PBS溶液中的含量。
结果如图8所示，图8为表阿霉素装载进seq1 NTrs的结果及稳定性说明。具体地，图8A为表阿霉素成功装载进seq1 NTrs的验证图。在图8A中，右上方的比例与曲线图中的线对应，具体地，二者均为由上到下一一对应，即第一个对应第一个，第二个对应第二个，以此类推。从结果看，seq1 trigger与EPI的比例为1:80时，EPI几乎完全装载进双链结构中。图8B为seq1 NT-EPI稳定性的比较。从结果看，游离的EPI很快渗出到透析袋的液体中，而seq1NT-EPI结构非常稳定，在缓冲液中稳定存在超过50h，而不会解离。
实施例9
如图9所示，验证seq1 NT-EPI可以特异性识别并内化到膀胱癌细胞。用游离EPI和seq1 NT-EPI分别处理人膀胱癌细胞T24、KU-7和正常膀胱上皮细胞SV-huc-1，细胞核用DAPI染色。
结果发现，游离EPI快速进入三种细胞中，但是seq1 NT-EPI主要内化人膀胱癌细胞T24和KU-7，正常膀胱上皮细胞SV-huc-1中的seq1 NT-EPI荧光信号极弱，几乎不会内化正常细胞。
实施例10
如图10所示，评估seq1 NT-EPI和游离EPI对正常细胞SV-huc-1及膀胱癌细胞T24和KU-7的杀伤作用。将1×104个细胞铺入96孔板中，培养过夜。当细胞密度达到80％时，分别加入不同浓度的三种药物体系(以EPI量计算，0.04-0.63μM)，在37℃培养箱中孵育24h。加入20μL的MTT，反应4h。反应结束后，去除上清液，加入100μL的DMSO溶解细胞内蓝紫色的甲臜，用酶标仪检测溶液在490nm处的吸光值。GraphPad Prism 7分析统计吸光值。
结果发现，seq1 NT-EPI与游离EPI对膀胱癌细胞T24和KU-7有几乎相当的杀伤作用，但是对正常细胞SV-huc-1，EPI的杀伤作用明显高于seq1 NT-EPI。说明本实施例所构建的seq1与EPI联用体系可以降低EPI对正常细胞的毒性作用。
实施例11
如图11所示，seq1 NT-EPI在活体水平抑制膀胱肿瘤的生长。所有动物实验都参照实验室动物福利准则进行。裸鼠从上海斯莱克实验动物有限公司购买。待其在实验室生长稳定后，进行膀胱内原位瘤的种植。首先用5％的戊巴比妥钠对裸鼠进行麻醉，并排出残留在膀胱内的尿液。用5μL 0.3M的硝酸银处理膀胱上皮，持续20s。接着在膀胱内注射50μL稳定表达荧光素酶的KU-7细胞悬液(2×107个/mL)，维持2h。2周后，经腹腔注射荧光素钠，在小鼠肿瘤部位，荧光素钠在荧光素酶的作用下产生荧光，利用小鼠成像系统(IVIS)观察肿瘤的荧光信号。在肿瘤植入的14天后，将所有裸鼠分为3组，进行后续的实验。3组老鼠分别灌注50μLPBS、游离EPI和seq1 NT-EPI，EPI浓度为0.4mg/mL。每5天灌注一次，共进行7次。最后一次灌注药物的5天后，在IVIS系统中观察肿瘤的荧光信号。
结果发现，药物治疗组的肿瘤发生率明显低于对照组，另外seq1 NT-EPI治疗组肿瘤的发生率及尺寸都低于游离EPI。说明本实施例所构建的seq1和EPI联用体系可以提高药物的治疗效果，降低毒性作用。
此外，本发明中的A1序列、A2序列也同样具有较佳的特异性识别并内化进入膀胱癌细胞中的优势，其效果基本介于seq1和A3序列之间，或与这两个序列相当，由于篇幅关系，不再一一说明。总体而言，seq1具有更高的内化水平，且核酸适体-药物复合体抑制肿瘤生长效果明显优于游离药物分子。
在本发明中，通过试验发现，seq1、seq2、seq3及其在本发明范围内的同源序列都可以实现本申请的功效，均在本申请的保护范围内，由于篇幅关系，不再一一说明。
本发明所述的核酸适体虽然给出了明确的序列。但是本领域人员应当理解，在上述序列基础上进行微小的变动(例如增加、缺少或取代一个或多个，例如1、2或3个)而不影响本发明所述序列的保护，且能够生成本发明核酸适体的序列、表达体或者包含有本发明核酸适体的载体或表达体等，均在本发明的保护范围内。
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 南京大学
<120> 一种核酸适体及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ccagugaagc guccuggaga uggauguugu gaugg 35
<210> 2
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gagcuguugc uggucgggaa cagucucag 29
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
cuggucgguc gacuccuau 19
<210> 4
<211> 64
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ccagugaagc guccuggaga uggauguugu gaugggagcu guugcugguc gggaacaguc 60
ucag 64
<210> 5
<211> 83
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
ccagugaagc guccuggaga uggauguugu gaugggagcu guugcugguc gggaacaguc 60
ucagcugguc ggucgacucc uau 83
<210> 6
<211> 87
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
guauccagug aagcguccug gagauggaug uugugauggg agcuguugcu ggucgggaac 60
agucucagcu ggucggucga cuccuau 87
<210> 7
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
tgctgctgct gctgctgcac gacgtttcca gugaagcguc cuggagaugg auguugugau 60
gg 62
<210> 8
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
cgtcgtgcag cagcagcagc agcaacggct tgctgctgct gctgctgc 48
<210> 9
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
tgctgctgct gctgctgcac gacggcagca gcagcagcag caagccgt 48

Claims (8)

1.一种核酸适体，其特征在于：其为能够特异性地识别膀胱肿瘤细胞，并且能够内化进入膀胱肿瘤细胞内的适体；
所述核酸适体的长度为20-1000 bp；
所述核酸适体为：
第一序列seq1，或
第一序列seq1和第二序列seq2组成的A1序列，或
第一序列seq1、第二序列seq2和第三序列seq3组成的A2序列，或
第一序列seq1、第二序列seq2、第三序列seq3和GUAU序列组成的A3序列；
所述第二序列seq2设置于第一序列seq1的3’端；
所述第三序列seq3设置于第二序列seq2的3'端；
所述GUAU序列设置于核酸适体的5’端；
所述seq1序列为：
CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGG；
所述seq2序列为：
GAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAG；
所述seq3序列为：
CUGGUCGGUCGACUCCUAU；
所述A1序列为：
CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAG；
所述A2序列为：
CCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAGCUGGUCGGUCGACUCCUAU；
所述A3序列为：
GUAUCCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGGGAGCUGUUGCUGGUCGGGAACAGUCUCAGCUGGUCGGUCGACUCCUAU。
2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体中碱基的修饰为：将seq1所示序列、A1所示序列、A2所示序列、A3所示序列碱基中的碱基A进行硫代修饰；或将核酸适体中的碱基C/碱基U进行氟代修饰。
3.一种基因分子，其特征在于：所述基因分子为能够转录获得权利要求1或2所述的核酸适体的碱基序列。
4.一种含有权利要求1或2所述的核酸适体的火车式载药体系，其特征在于，所述火车式载药体系为阶梯状长双链纳米载药结构，由包含seq1序列的启动链、富GC序列M1和富GC序列M2组成，启动链、序列M1、序列M2的组装比例为1：5：5；
所述包含seq1序列的启动链为：
TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGTTTCCAGUGAAGCGUCCUGGAGAUGGAUGUUGUGAUGG；
所述M1序列为：
CGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC；
所述M2序列为：
TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGT。
5.一种根据权利要求1或2所述的核酸适体或权利要求3所述的基因分子或权利要求4所述的火车式载药体系在制备用于检测和/或治疗膀胱肿瘤的制剂中的应用。
6.一种负载系统，其特征在于：该系统包括权利要求1或2所述的核酸适体以及与该核酸适体配合的负载体；
所述负载体包括药物、药学上可接受的载体物或赋形剂。
7.根据权利要求6所述的负载系统，其特征在于，所述载体物选自纳米药物载体、显影剂或染色分子，所述纳米药物载体选自脂质体、胶束或纳米粒。
8.根据权利要求6所述的负载系统，其特征在于，所述药物包括抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包括抗代谢类抗肿瘤药、抗生素类抗肿瘤药物、植物碱类抗肿瘤药、激素类抗肿瘤药、铂类抗癌药或抗肿瘤小分子靶向药物。
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