CN105087593A - 一种her2核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与HER2多肽或HER2阳性的肿瘤细胞特异性结合的核酸适配体，在该适配体的两端可进行基团修饰，所述基团为氨基、氨基、羧基、巯基、荧光分子、胆固醇或聚乙二醇的任一种或多种；所述适配体的碱基可做任何修饰，所述修饰为硫代、氨基、氟基、甲氧基或羧基任一种或多种修饰。还涉及上述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗HER2阳性乳腺癌制剂中的应用。制备的治疗HER2阳性乳腺癌制剂能选择性的结合HER2阳性的乳腺癌细胞，而与HER2阴性的乳腺癌细胞结合较弱。

Description

一种HER2核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种能与人表皮生长因子受体2(HER2)分子相结合的核酸适配体，尤其涉及一种可抗核酸酶的HER2核酸适配体，以及该核酸适配体在制备检测和/或治疗HER2阳性乳腺癌制剂中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其中约20～30％为人表皮生长因子受体2(HER2)过表达。和其它类型的乳腺癌相比，HER2阳性的乳腺癌恶性程度更高，进展更快，更易复发和向远处转移，对化疗药物敏感性低。此外，有超过50％的HER2阳性的乳腺癌缺少雌、孕激素受体，以致这部分患者对内分泌治疗也不敏感。由于HR2阳性的乳腺癌患者往往对化疗药物和内分泌治疗不敏感，所以一般预后较差。经过传统方法治疗的乳腺癌患者中，包括手术切除，术后化疗和内分泌治疗，HER2过表达的乳腺癌患者的中位生存期比HER2阴性者的中位生存期要缩短一半以上。因此，需要研发更有效的针对HER2阳性乳腺癌的治疗技术，包括靶向治疗。

在肿瘤的靶向治疗中，单克隆抗体是最常用到的药物之一。曲妥珠单抗(trastuzumab,商品名赫赛汀)是目前临床上应用比较广泛的靶向HER2的人源化单克隆抗体药物，已被批准作为治疗HER2过表达的转移性乳腺癌的一线临床用药。然而，已有临床数据表明，有相当一部分HER2阳性的乳腺癌患者对曲妥珠单抗的治疗没有反应，并且对于已有转移的HER2阳性的乳腺癌患者，大约60％～80％会在短时间内对该药物产生获得耐药性。因此，目前非常有必要研发针对HER2的新型靶向治疗药物。

要想实现针对HER2的靶向治疗，我们需要能够和HER2分子结合的配体。除了抗体以外，核酸适配体也可作为一类新型的靶向配体分子。核酸适配体(aptamer)是具有一定序列的单链DNA、RNA或是经过修饰的寡核苷酸，可形成复杂的三维结构，与靶标分子结合。核酸适配体和其靶标分子的结合具有特异性强、亲和力高的特点。和抗体相比，核酸适配体有许多独特的优势，如易于大规模合成，价格便宜，易于体外修饰，体内的免疫原性较低，易于穿透肿瘤组织等。由于具有上述特点，核酸适配体在肿瘤的靶向治疗方面，具有广泛的应用前景，有些甚至已进入临床研究阶段。第一个被美国FBA批准的可在临床中使用的核酸适配体药物是Mucagen，已用于治疗老年黄斑变性。此外，目前还有许多其它的核酸适配体药物在进行临床试验，如AS1411和NOX-A12。AS1411是靶向核仁素的适配体，用于治疗急性髓系白血病，目前处于II期临床实验阶段。NOX-A12是靶向CXCL12的镜像异构适配体，用于治疗多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤，目前处于临床I期试验阶段。

核酸适配体要想应用于临床，需要克服一些药代动力学方面的问题。核酸适配体容易被血液中的核酸酶降解，在血液中较不稳定，限制了其在体内的应用。解决这个问题的技术路径之一，是通过化学方法修饰核酸适配体，以稳定其结构，免受血液中核酸酶的降解，进而延长其在体内的半衰期。常用的化学修饰包括两大类：对寡核苷酸磷酸骨架的修饰，以及对核糖2’位的化学修饰。磷酸骨架的修饰主要方法，是将磷酸基团中的氧原子用硫原子替代而实现的硫代修饰。核苷酸中核糖2’位的修饰，主要是指将戊糖中2’位的氧原子，用氨基、氟基、甲氧基等替代。尽管核糖2’位的修饰能增强寡核苷酸对核酸酶的抵抗，但往往会降低该核酸适配体和靶标分子的结合能力。而磷酸骨架的硫代修饰，既能增强核酸适配体对核酸酶的抵抗，亦能提高其对靶标分子的亲和力，是一种更为理想的技术。

发明内容

本发明一方面提供了一种新的核酸适配体，所述核酸适配体能够与人表皮生长因子受体2(HER2)相结合，所述核酸适配体包括如下核酸序列：X-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT-Y，其中：

X、Y各自独立地为A、T、C、G中的至少一个碱基；

或者X、Y至少一个不存在。

本发明研究人员发现，与HER2相结合的核酸适配体的核苷酸分子，一级结构为5’GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT3’(SEQIDNO：1)为其核心序列，该核心序列是保证所述核酸适配体分子与人表皮生长因子受体2相结合的关键。在该核心序列的基础上，可以进行不同的变化，衍生得到不同的能与HER2相结合的核酸适配体分子，这种衍生的方式，可以是在HB3-1核酸序列的基础上，进行插入或者延长的方式。

因此，本发明的再一方面，进一步提供了一种优选的包括HB3-1核酸序列的延长序列的适配体，所述优选的适配体的核酸序列为：X-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT-Y，其中：X为TGCGTGTGTA，Y为GGGCGG(SEQIDNO：2)，其一级序列为：5’TGCGTGTGTAGTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTTGGGCGG3’。

进一步地，本发明所述核酸适配体，在核酸适配体的两端，可以进行基团修饰，所述修饰的基团可以是选自氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。本发明的一个实施例中，提供了在所述的核心的核酸适配体的两端分别进行生物素、荧光素修饰后得到的经修饰的核酸适配体分子，经修饰后的核酸适配体分子，能够与HER2多肽以及HER2阳性肿瘤细胞相结合。

本发明的再一方面，可以对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，如硫代、氨代、氟代、甲氧基修饰，得到碱基修饰后的核酸适配体分子，优选地，对所述碱基进行硫代修饰，硫代修饰的方式为将碱基磷酸基团中的氧原子用硫原子替代。本发明的一优选实施例中，将所述核酸适配体中所有的碱基A进行硫代，例如将核心序列的A经硫代，得到所述的硫代修饰的核心适配体序列(命名为HB3-1)；又如，将优选的核酸适配体序列碱基A经硫代，得到优所述的硫代修饰的优选核酸适配体序列(命名为HB3)，经硫代修饰后，其具有较未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性，可抗核酸酶。

本发明所述核酸适配体，能够和HER2表位肽结合，尤其是HB3，其能与HER2表位肽以较高的亲和力结合，Kd值为183nM。

本发明所述核酸适配体，还能够选择性的结合HER2阳性的肿瘤细胞，而与HER2阴性的细胞结合较弱。

更为重要的是，对本发明所述核酸适配体碱基进行修饰后，如对其中的碱基A进行硫代修饰，相比其它非硫代修饰的単链DNA序列，该硫代修饰的核酸适配体具有了一定的抵抗核酸酶的能力，在血清中的存在时间显著延长。

基于此，该核酸适配体可以直接携带细胞毒性药物(如阿霉素)，选择性的杀伤HER2阳性的肿瘤细胞，因此，本发明的再一方面，提供了本发明所述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗HER2阳性的乳腺癌制剂中的应用。

本发明的又一方面，提供了一种组合物，该组合物包括本发明所述的核酸适配体，以及制药上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，所述载体如可以是纳米药物载体，将本发明所述核酸适配体偶联到所述纳米药物载体上(纳米载体如脂质体、胶束、纳米粒等)，可以作为HER2靶向分子，用于HER2阳性肿瘤的靶向治疗，将适配体欧联到纳米载体上的方法，本发明技术人员可以根据现已有的制剂技术进行。或者本发明所述的载体也可以是造影剂粒子(如纳米铁、包裹了造影剂的纳米粒等)，将所述适配体偶联到造影剂粒子上，作为HER2靶向分子，用于HER2阳性肿瘤的靶向显影，将适配体欧联到造影粒子上的方法，本发明技术人员可以根据现已有的制剂技术进行。或者，本发明所述的载体还可以是染色分子(如辣根过氧化物酶)，作为HER2靶向分子，用于HER2阳性肿瘤的组化染色。

本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物，包括本发明所述的核算适配体、以及选自至少一种抗肿瘤药物，和制药上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，所述的核酸适配体和至少一种抗肿瘤药物，所述复合体是所述核酸适配体与化疗药物形成的复合体，该复合体可用于HER2阳性的乳腺癌的治疗。

本发明中，抗肿瘤药物，选自抗代谢类抗肿瘤药(如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨或雷替曲塞)、抗生素类抗肿瘤药物(如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌)、植物碱类抗肿瘤药(如长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱)、激素类抗肿瘤药(如他莫昔芬、来曲唑或强的松)、铂类抗癌药(如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂或乐铂)或抗肿瘤小分子靶向药物(如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼)。

由于本发明所述核酸适配体能够选择性的结合HER2阳性的肿瘤细胞，而与HER2阴性的细胞结合较弱，因此本发明的又一方面，提供所述适配体作为HER2阳性的肿瘤化疗靶向药物载体的应用，将化疗药物结合于所述核酸适配体上，进行肿瘤放化疗时，可以选择性地杀伤HER2阳性的肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒性，所述的化疗药物，可以是选自代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼，更优选地，所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

本发明所述核酸适配体还可以偶联到纳米药物载体上，如脂质体、胶束、纳米粒等，作为HER2靶向分子，用于HER2阳性肿瘤的靶向治疗，基于此，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物包括本发明所述的核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，和药物可接受的载体，所述核酸适配体与至少一种抗肿瘤药物以复合体形式存在，所述载体为载药纳米粒。

附图说明

图1为HB3适配体的结构图，其中图中A为一级序列，B为二级结构。

图2为适配体HB3-1与HER2多肽结合性质图。

图3为适配体HB3-1与HER2阳性的肿瘤细胞结合性质图。

图4为经核酸酶处理后HB3-1与HER2阳性的肿瘤细胞结合特性的检测。

图5为流式细胞术分析HB3和HER2多肽、胰酶以及IgG抗体的结合特性。

图6为适配体HB3和靶标多肽的亲和力的检测。

图7为流式细胞术分析硫代适配体HB3与HER2阳性细胞和HER2阴性细胞的结合性质。

图8为硫代适配体HB3在血清中稳定性的研究。

图9为流式细胞术分析在有无血清的情况下硫代修饰的HB3和非硫代修饰的HB3与HER2多肽以及HER2阳性细胞的结合能力。

图10为MTS法测定适配体HB3、dox和适配体-dox复合体对MDA-MB-231和SK-BR-3细胞的杀伤。

具体实施方式

本发明针对HER2多肽的结构特点，设计了一种全新的HER2核酸适配体，更为优选地是、设计了一种具有一定核酸酶抵抗能力的硫代核酸适配体。本领域人员应当理解，在所述序列基础上进行微小的变动(例如增加、缺少或取代一个或多个，例如1、2或3个)而不影响所述序列与HER2相互结合的其它核酸序列也包括在该序列的等同范围之内。

本发明一个优选的实施方案为HER2核酸适配体的核酸序列为：5’-TGCCCGTGTCCCGAGGAGGTGCCCTATTTTGCTTGATTATCTCTAAGGGATTTGGGCGG-3’，该序列的核心序列为：5’GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT3’，此序列可通过DNA合成仪大规模合成生产，或通过PCR反应来合成。

在上述序列的两端进行基团修饰，如氨基、羧基、巯基、荧光分子、胆固醇、聚乙二醇等，所产生的衍生物与HER2核酸适配体具有等同效果。

在上述序列的碱基做任何修饰，如硫代、氨基、氟基、甲氧基修饰后所产生的衍生物与HER2核酸适配体具有等同效果。

本发明还提供了核酸适配体在制备用于检测和/或治疗HER2阳性肿瘤制剂中的应用。

本发明的HER2核酸适配体作为化疗药物靶向载体的用途，所述化疗药物选自抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼，更优选地，所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

特异性是评价核酸适配子的一个重要指标，为了验证本发明的HER2核酸适配体是否具有一定的靶标特异性，检测了其与HER2多肽、胰蛋白酶、IgG抗体的结合情况。结果表明，与随机对照相比，优选的HER2核酸适配体与胰蛋白酶、IgG抗体结合能力比较弱，而与HER2多肽反应后荧光信号明显增大，说明HER2核酸适配体比较好的靶标特异性。

为了检测本发明的HER2核酸适配体和靶标多肽结合的亲和力，采用不同浓度FITC标记的HER2核酸适配体与靶标多肽包被的磁珠孵育，流式细胞仪检测平均荧光强度，在一个优选的实施例方式中，用非线性回归分析测得HER2核酸适配体与靶标多肽的Kd值为183nM，说明HER2核酸适配体与靶标多肽即HER2多肽的结合能力强，进一步说明FITC标记的HER2核酸适配体可作为检测HER2多肽的检测试剂，更进一步的，FITC标记的HER2核酸适配体可作为检测HER2阳性细胞的检测试剂。等同的HER2核酸适配体不仅可采用FITC标记也可采用其他免疫学试剂所用标记的荧光基团或酶进行标记，如采用辣根过氧化物酶进行标记，用于制备检测HER2阳性细胞的检测试剂。

为了评估本发明的HER2核酸适配体是否能够与HER2阳性乳腺癌细胞结合，选取高表达HER2的阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-453，以及不表达HER2的肿瘤细胞系MDA-MB-231，分别和标记有FITC的HER2核酸适配体孵育，流式细胞仪检测荧光信号。同等长度随机DNA库作为随机对照。在优选地实施方式中，结果显示，HER2核酸适配体和SK-BR-3、MDA-MB-453细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照，而与MDA-MB-231细胞反应后荧光强度与随机对照基本一样。上述实验结果表明本发明的HER2核酸适配体和HER2阳性乳腺癌细胞的结合强，和HER2阴性的乳腺癌细胞结合弱，所述HER2核酸适配体能够识别表达HER2蛋白的乳腺癌细胞表面的HER2结构。

硫代修饰能够保护寡核苷酸免受血清中核酸酶的攻击，保持序列的完整性，并进一步证明经过核酸酶处理的HER2核酸适配体还具有和HER2多肽以及HER2阳性的乳腺癌细胞结合的特性。

由于抗肿瘤-细胞毒性药物对细胞没有选择性，对正常细胞的杀伤作用也很强，因而具有很强的毒副作用。本发明的HER2核酸适配体适配体携带细胞毒性药物能选择性的结合HER2阳性的肿瘤细胞，对HER2阴性细胞的毒性作用减弱。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下所举实施例是为便于更好地理解本发明，但并不用来限定本发明，本领域技术人员可以对本发明做各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明的实施例中所用的试剂如下：

试剂

HER2多肽多肽，北京赛百盛公司(氨基酸序列为:INCTHSCVDLDDKGCPAEQR)，下文中也称“靶标多肽”。

牛血清白蛋白，天津灏洋生物科技有限公司

单分散磁珠，链酶亲和素包被磁珠，普洛麦格公司(磁珠表面为链霉亲和素修饰)。

胰蛋白酶(美Aamesco)

IgG(北京普利莱基因技术有限公司)

EDC，Sigma公司。

细胞系：HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-453和HER2阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，中国医学科学院细胞中心

RPMI1640，(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)

胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)

DMEM高糖培养基，货号：07-021，北京盈信阳光生物技术有限公司

实施例1HB3-1、HB3的制备

本发明中，HER2核酸适配体的核心序列为43各碱基长度的单链核苷酸，其核苷酸序列为：5’GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT3’；优选的HER2核酸适配体，为59个碱基长度的单链核苷酸，序列为：5’TGCCCGTGTCCCGAGGAGGTGCCCTATTTTGCTTGATTATCTCTAAGGGATTTGGGCGG-3’；更为优选地是，合成时，将上述该序列中的所有碱基A均用硫代修饰，得到一种硫代的HER核酸适配体，分别将其命名为(核心序列经硫代(HB3-1)、优选序列经硫代(HB3))上述序列均由Invitrogen公司合成。HB3适配体的结构如图1所示，其中图中A为一级序列，B为二级结构。

下文中，如果没有特别声明，术语“HB3”和“硫代HB3”均是指序列中所有碱基A经硫代后的，二者可以通用；同样，术语“HB3-1”和“硫代HB3-1”均是指序列中所有碱基A经硫代后的，二者可以通用；仅在指明是“非硫代修饰的HB3”、“非硫代修饰的HB3-1”时，该HB3或HB3-1为原始的碱基A未经硫代修饰的序列。术语“HER2多肽”和“靶标多肽”可以互换使用，均是指合成的HER2多肽。

实施例2HB3-1与HER2多肽结合的能力

将HB3-1在3’端修饰生物素(biotin)，5’端修饰荧光素(FITC)，在200μl的结合缓冲液(pH为7.4的PBS缓冲液)中与分别和HER2多肽、胰蛋白酶和IgG包被的磁珠于37℃反应30min，PBS洗两遍，流式分析。修饰后的HB3-1一级结构如下：

5’FITC-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT-biotin-3’。序列中的碱基A为硫代修饰。

同样的条件，我们检测了碱基A为未经硫代修饰时与HER2多肽结合的情况。

结果如图2，其中(A)HER2多肽包被的磁珠和FITC标记的HB3-1的结合；(B)IgG抗体包被的磁珠和FITC标记的HB3-1的结合；(C)胰酶包被的磁珠和FITC标记的HB3-1的结合；(D)HER2多肽包被的磁珠与FITC标记的非硫代修饰的HB3-1的结合。黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线为硫代HB3-1产生的荧光信号。结果显示HB3-1和胰蛋白酶(Trypsin)以及IgG结合的荧光强度与随机对照组的荧光强度基本一致(图2B和图2C)，而HB3-1、非硫代修饰的HB3-1和靶标多肽结合的荧光强度显著高于随机对照组(图2A、图2D)，说明HB3-1与胰蛋白酶和IgG的结合能力比较弱，HER2核酸适配子更倾向与靶标多肽结合，显示了比较好的靶标特异性。

实施例3HB3-1与HER2阳性的肿瘤细胞结合的能力

SK-BR-3细胞培养在含有15％FBS的改良RPMI1640中，MDA-MB-231细胞培养在含有10％的FBS、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，所有细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养，以下试验所用细胞均是处于对数生长期的细胞。

分别刮取5×10⁵的SK-BR-3和MDA-MB-231细胞，将其和HB3-1(3’端修饰生物素，5’端修饰荧光素)在200μl结合缓冲液(PBS)中于37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞仪分析。结果见图3，(A)为HER2阳性SK-BR-3细胞。(B)HER2阴性MDA-MB-231细胞。黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线为硫代HB3-1产生的荧光信号。附图结果显示，HB3-1与HER2阳性的肿瘤细胞具有较高的结合能力，而与HER2阴性的肿瘤细胞结合较弱。

实施例4经核酸酶处理后HB3-1与HER2阳性的肿瘤细胞结合特性的检测

将硫代修饰的HB3-1和非硫代修饰的HB3-1分别在不含和含有10％的FBS中孵育24小时，然后和MDA-MB-453细胞在37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞仪检测磁珠和细胞表面荧光强度的变化。结果如图4所述，其中(A)为无血清孵育HB3-1和MDA-MB-453细胞的结合；(B)为有血清孵育HB3-1和MDA-MB-453细胞的结合；(C)为无血清孵育非硫代修饰的HB3-1和MDA-MB-453细胞的结合；(D)为有血清孵育非硫代修饰的HB3-1和MDA-MB-453细胞的结合；黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线为硫代HB3-1产生的荧光信号。结果表明，没有和血清孵育的硫代或非硫代修饰的HB3-1和MDA-MB-453反应后的荧光强度均高于随机对照组，而和血清孵育后，硫代修饰的HB3-1和MDA-MB-453细胞结合的荧光强度仍高于随机对照组，而非硫代修饰的HB3-1和MDA-MB-453细胞结合的荧光强度变得与随机对照组一致，说明硫代修饰后的核酸适配体HB3-1具有抵抗核酸酶的能力。

为进一步优化本发明核酸适配体，在核心序列HB3-1的基础上，发明人在在5’端、3’端经一定延长，设计得到一种改良的包含HB3-1核心序列的新的核酸适配体序列，命名为HB3，以下通过实验进一步验证改良的HB3的与HER2、HER2阳性的肿瘤细胞的结合及其他方面的能力。

实施例5HB3与靶标的特异性结合

将FITC标记的HER2核酸适配子(在5’端标记)在200ul结合缓冲液(PBS，pH为7.4)中分别和HER2多肽、胰蛋白酶和IgG包被的磁珠于37℃反应30min，PBS洗两遍。

为了评估硫代HB3的靶标特异性，我们检测了HB3和胰酶、IgG抗体的结合情况。我们将胰酶和IgG与磁珠共价连接，和FITC标记的HB3孵育，然后用流式细胞术检测HB3和胰酶以及IgG的结合情况，未经筛选的随机ssDNA文库作为对照。

流式细胞术分析HB3和HER2多肽、胰酶以及IgG抗体的结合特性结果如图5所示，其中(A)为HER2多肽包被的磁珠和FITC标记的HB3的结合；(B)为胰蛋白酶包被的磁珠和FITC标记的HB3的结合；(C)为IgG抗体包被的磁珠和FITC标记的HB3的结合。黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线为HB3产生的荧光信号。结果显示HB3和胰蛋白酶(Trypsin)以及IgG结合的荧光强度与随机对照组的荧光强度基本一致(图5B和图5C)，而HB3和靶标多肽结合的荧光强度显著高于随机对照组(图5A)，说明HB3与胰蛋白酶和IgG的结合能力比较弱，HER2核酸适配子更倾向与靶标多肽结合，显示了比较好的靶标特异性。

实施例6HB3与靶标多肽结合的Kd值

采用不同浓度的FITC标记的HB3和靶标多肽包被的磁珠在200ul结合缓冲液(pH为7.4的PBS缓冲液)中于37℃孵育30min，流式细胞仪检测平均荧光强度，同等长度的随机文库作为阴性对照用于非特异性的结合，适配子和靶标结合的平均荧光强度减去随机文库非特异性结合的平均荧光强度，根据公式Y＝BmaxX/(Kd+X)(Y：平均荧光强度，X：所用的aptamer的浓度，B是一个常数，max是最大值)计算核酸适配体和靶标结合的Kd值。用非线性回归分析测得HB3和靶标多肽的Kd值为183nM，结果如图6所示。

实施例7HB3与癌细胞的结合

SK-BR-3细胞培养在含有15％FBS的改良RPMI1640中。MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞培养在含有10％的FBS、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，所有细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养，以下试验所用细胞均是处于对数生长期的细胞。

分别刮取5×10⁵的SK-BR-3、MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞，将其和FITC标记的HB3在200μl结合缓冲液(PBS)中于37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞仪分析。

流式细胞术分析HB3与HER2阳性细胞和HER2阴性细胞结合的特性，结果如图7所示，其中图中(A)为HER2阳性SK-BR-3细胞；(B)为HER2阳性MDA-MB-453细胞；(C)为HER2阴性MDA-MB-231细胞；黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线为硫代HB3产生的荧光信号。结果显示，HB3和过表达HER2的乳腺癌细胞系孵育后的荧光强度明显高于随机对照组(图7A、B)，而与HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231孵育后的荧光强度和随机组的基本一样(图7C)。以上结果表明HB3选择性结合HER2阳性的乳腺癌细胞，和HER2阴性的乳腺癌细胞结合较弱。

实施例8HB3对血清中核酸酶抵抗能力的检测

分别将四种不同形式的单链DNA序列：硫代修饰的HB3、非硫代修饰的随机库DNA、非硫代修饰的HB3和非硫代修饰的已有报道的HER2aptamerHB5分别在不含和含有10％胎牛血清的PBS中孵育24小时，用变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳分析各序列条带的变化。结果如图8所示，图中条带1和2为随机库单链DNA、条带3和4为硫代修饰的HER2核酸适配体、条带5和6为非硫代修饰的HER2核酸适配体和条带7和8为已报道过的针对HER2的非硫代修饰的核酸适配体HB5。PAGE胶显示，在不含血清的PBS中孵育后，所有的序列均有清晰的条带(条带1、3、5和7)，说明四种单链DNA都保持了序列的完整性。而在含有血清的PBS中孵育后，只有硫代修饰的HER2核酸适配体具有清晰的条带(条带4)，其余三种DNA都已看不到较清晰的条带(条带2、6和8)。这说明硫代修饰能够保护寡核苷酸免受血清中核酸酶的攻击，保持了序列的完整性，而其余三种未硫代修饰的单链DNA序列都被核酸酶降解。

实施例9经核酸酶处理后HB3与HER2多肽以及HER2阳性的肿瘤细胞结合特性的检测

将硫代修饰的HB3和非硫代修饰的HB3分别在不含或含有10％的FBS中孵育24小时，然后和HER2多肽包被的磁珠以及SK-BR-3细胞在37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞仪检测磁珠和细胞表面荧光强度的变化。结果如图9所述，其中图中(A)为无血清孵育HB3和HER2多肽的结合；(B)为有血清孵育HB3和HER2多肽的结合；(C)为无血清孵育HB3和SK-BR-3细胞的结合；(D)为有血清孵育HB3和SK-BR-3细胞的结合；(E)为无血清孵育的非硫代修饰的HB3和HER2多肽的结合；(F)为有血清孵育的非硫代修饰的HB3和HER2多肽的结合；(G)为无血清孵育的非硫代修饰的HB3和SK-BR-3细胞的结合；(H)为有血清孵育的非硫代修饰的HB3和SK-BR-3的结合。黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线为硫代HB3-1产生的荧光信号。

显示，没有和血清孵育的两种核酸适配体和HER2多肽(图9A和E)以及SK-BR-3(图9C和G)反应后的荧光强度均高于随机对照，说明两种核酸适配体和HER2多肽以及SK-BR-3细胞都具有较强的结合能力。而当两种核酸适配体和血清孵育后，本发明的HB3和HER2多肽(图9B)以及SK-BR-3(图9D)反应后的荧光强度仍高于随机对照，提示经过血清处理后的本发明的HB3和HER2多肽以及SK-BR-3有较强的结合能力；相反的，非硫代修饰的HB3和HER2多肽以及SK-BR-3反应后的荧光强度确变得和随机对照一致(图9F和9H)，提示经过血清处理后的非硫代修饰的HB3失去了和HER2多肽以及SK-BR-3结合的能力。以上说明由于硫代修饰的HB3具有了抵抗核酸酶的能力，因此经过核酸酶处理后仍然和HER2多肽以及SK-BR-3有较强的结合能力。

实施例10HB3载药后对细胞的杀伤力

构建适配体-阿霉素复合体

由于细胞毒药物对细胞没有选择性，对正常细胞的杀伤作用也很强，因而具有很强的毒副作用。既然适配体能选择性的结合HER2阳性的肿瘤细胞，如果用此适配体携带细胞毒性药物，则有可能造成对HER2阴性细胞的毒性作用减弱。为了验证上述假设，选用细胞毒性药物阿霉素(Dox)，利用阿霉素能嵌入双链DNA中的特点，构建适配体-阿霉素复合体。设立适配体组、Dox组和适配体-dox组，分别与SK-BR-3细胞、MDA-MB-231细胞孵育。

HB3预先于95℃孵育5min，冰浴10min，取0.3nmol(指明用量的单位)的HER2核酸适配体适配子和3nmol阿霉素(dox)(请问3nm是否写错了，还是指用量为，单位为---此处nmol为用量单位)混匀，在黑色96孔板中静置1h。

细胞增殖实验

将浓度均为3μM的HB3、dox和适配体-dox分别和SK-BR-3和MDA-MB-231细胞于37℃孵育4h，PBS洗两遍，MTS法检测细胞的增殖。

结果如图10所示，结果表明，对于HER2阴性的MDA-MB-231细胞，dox组细胞的存活率为67.45％，而HER2核酸适配体-dox组细胞存活率为82.69％，显示HER2核酸适配体-dox对MDA-MB-231细胞的杀伤显著低于游离Dox(p<0.01)，如图10A所示。然而，对于HER2阳性的SK-BR-3细胞，Dox组中细胞的存活率为77.06％，HER2核酸适配体-dox组中的存活率为71.96％，显示HER2核酸适配体-dox对HER2阳性的SK-BR-3细胞的杀伤作用和游离的dox没有显著差别，结果如图10B所示。上述实验结果表明HER2核酸适配体-dox能够减弱Dox对HER2阴性细胞的毒性，而对HER2阳性细胞的杀伤作用没有变化。另外，单纯HER2核酸适配体组中，SK-BR-3细胞和MDA-MB-231细胞的存活率都接近100％，显示单独的HER2核酸适配体对两种细胞没有毒性。

Claims (13)

1.一种结合人表皮生长因子受体2(HER2)的核酸适配体，所述核酸适配体包括如下核苷酸序列：

X-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTT-Y，其中：

X、Y各自独立地为A、T、C、G中的至少一个碱基；

或者X、Y二者中至少其中之一不存在。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述X为：TGCGTGTGTA，所述Y为GGGCGG。

3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。

4.根据权利要求1或2所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的碱基为经硫代、氨基、氟基或甲氧基修饰。

5.根据权利要求1或2所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸分子，其中碱基A均经过硫代修饰，所述的硫代修饰方式为将碱基A磷酸基团中的氧原子用硫原子替代。

6.根据权利要求1-5中任意一权利要求所述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗HER2阳性的乳腺癌制剂中的应用。

7.一种HER2靶向分子，其特征在于，所述靶向分子包括权利要求1-5中任意一权利要求所述的核酸适配体，以及选自制药上可接受的载体或赋形剂。

8.根据权利要求7所述的靶向分子，其特征在于，所述载体选自纳米药物载体(如脂质体、胶束或纳米粒)、肿瘤显影剂(如铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒)或染色分子(如辣根过氧化酶)中的任意一种。

9.根据权利要求7或8所述靶向分子在HER2阳性肿瘤的靶向治疗药物、HER2阳性肿瘤的靶向显影或HER2阳性肿瘤的组化染色中的应用。

10.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1-5中任意一权利要求所述核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，以及制药上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述药物组合物，其特征在于，所述核酸适配体和至少一种抗肿瘤药物是以复合体形式存在。

12.根据权利要求11所述药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自抗代谢类抗肿瘤药(如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨或雷替曲塞)、抗生素类抗肿瘤药物(如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌)、植物碱类抗肿瘤药(如长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱)、激素类抗肿瘤药(如他莫昔芬、来曲唑或强的松)、铂类抗癌药(如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂或乐铂)或抗肿瘤小分子靶向药物(如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼)。

13.根据权利要求11所述药物组合物，包括权利要求1-5中任意一权利要求所述的核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，和药物可接受的载体，所述核酸适配体与至少一种抗肿瘤药物以复合体形式存在，所述载体为载药纳米粒。