CN103290017B - Her2蛋白核酸适配子、复合体、组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及HER2蛋白核酸适配子、复合体、组合物及其用途。具体而言,本发明涉及一种HER2蛋白特异性结合核酸适配子,其序列如SEQ?ID?NO:5所示。本发明还涉及由所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物结合而成或被共同包在纳米粒中而形成的复合体、包含所述复合体的组合物及所述核酸适配子、复合体和组合物的抗肿瘤用途及肿瘤靶向造影用途。
Description
技术领域
本发明涉及HER2蛋白核酸适配子、复合、组合物及其用途。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其中大约20%至30%的患者为人类表皮生长因子受体-2(ERBB2,HER2)阳性(King CR,Kraus MH,Aaronson SA(1985)Amplification of a novel v-erbB-related gene in ahuman mammary carcinoma.Science 229:974-976)。HER2阳性的患者同其他乳腺癌病人相比,肿瘤恶性程度更高,进展更快,更容易复发和远处转移,远期生存率更差(Garrett JT,Arteaga CL(2011)Resistanceto HER2-directed antibodies and tyrosine kinase inhibitors:mechanismsand clinical implications.Cancer Biol Ther 11:793-800.;Nahta R,O′ReganRM(2010)Evolving strategies for overcoming resistance toHER2-directed therapy:targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway.ClinBreast Cancer 10 Suppl 3:S72-78.;Cooke T,Reeves J,Lanigan A,StantonP(2001)HER2 as a prognostic and predictive marker for breast cancer.Ann Oncol 12Suppl 1:S23-28.),而且此类病人通常对内分泌治疗不敏感,预后较差(Wright C,Nicholson S,Angus B,Sainsbury JR,Farndon J,et al.(1992)Relationship between c-erbB-2 protein product expression andresponse to endocrine therapy in advanced breast cancer.Br J Cancer 65:118-121.;Ariazi EA,Clark GM,Mertz JE(2002)Estrogen-related receptoralpha and estrogen-related receptor gamma associate with unfavorable andfavorable biomarkers,respectively,in human breast cancer.Cancer Res 62:6510-6518.)。如果只接受手术、放疗、化疗和内分泌治疗这些常规的综合治疗,HER2阳性乳腺癌患者的生存时间仅为HER2阴性患者的一半(Press MF,Bernstein L,Thomas PA,Meisner LF,Zhou JY,et al.(1997)HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situhybridization:poor prognosis in node-negative breast carcinomas.J ClinOncol 15:2894-2904.)。鉴于此,开发HER2阳性乳腺癌的新型治疗,如肿瘤靶向治疗是无法避免的一个趋势。生物靶向治疗的特点是集中作用于肿瘤组织、细胞或基因,选择性地杀灭肿瘤细胞,而对人体正常组织细胞损伤较小。因此,与常规治疗方法相比,靶向治疗不仅可以提高疗效,还可以降低副作用的发生率。曲妥珠单抗(赫赛汀)是全球第一种被批准应用于临床靶向HER2(ERBB2,人体表皮生长因子受体2)的人源化单克隆抗体。它能特异性作用于乳腺癌细胞表面的HER2受体,并诱导人体免疫细胞杀伤肿瘤细胞。然而,有研究报道,长期应用曲妥珠单抗容易发生获得性耐受(Garrett JT,Arteaga CL(2011)Resistance to HER2-directed antibodies and tyrosine kinase inhibitors:mechanisms and clinical implications.Cancer Biol Ther 11:793-800.;Nahta R,O′Regan RM(2010)Evolving strategies for overcomingresistance to HER2-directed therapy:targeting the PI3K/Akt/mTORpathway.Clin Breast Cancer 10 Suppl 3:S72-78.;Cobleigh MA,Vogel CL,Tripathy D,Robert NJ,Scholl S,et al.(1999)Multinational study of theefficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody inwomen who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that hasprogressed after chemotherapy for metastatic disease.J Clin Oncol 17:2639-2648.;Vogel CL,Cobleigh MA,Tripathy D,Gutheil JC,Harris LN,et al.(2002)Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent infirst-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer.J ClinOncol 20:719-726.;Raguz S,Yague E(2008)Resistance to chemotherapy:new treatments and novel insights into an old problem.Br J Cancer 99:387-391.;Shattuck DL,Miller JK,Carraway KL,3rd,Sweeney C(2008)Met receptor contributes to trastuzumab resistance of Her2-overexpressingbreast cancer cells.Cancer Res 68:1471-1477)。而且,赫赛汀抗体价格昂贵,成本高,增加了发展中国家患者的负担。这限制了其在乳腺癌及其他肿瘤治疗中的应用。
此外,HER2不仅仅在20%-30%的乳腺癌中呈现过表达的状态,还在胃癌、肺癌、卵巢癌和膀胱癌等多种实体瘤中过表达,因此,它是重要的具有广谱意义的肿瘤靶标之一(Yoshino I,Goedegebuure PS,Peoples GE,Parikh AS,DiMaio JM,et al.(1994)HER2/neu-derivedpeptides are shared antigens among human non-small cell lung cancer andovarian cancer.Cancer Res 54:3387-3390.;Brabender J,Danenberg KD,Metzger R,Schneider PM,Park J,et al.(2001)Epidermal growth factorreceptor and HER2-neu mRNA expression in non-small cell lung cancer Iscorrelated with survival.Clin Cancer Res 7:1850-1855.;Coombs LM,Pigott DA,Sweeney E,Proctor AJ,Eydmann ME,et al.(1991)Amplification and over-expression of c-erbB-2 in transitional cellcarcinoma of the urinary bladder.Br J Cancer 63:601-608.;Berchuck A,Kamel A,Whitaker R,Kerns B,Olt G,et al.(1990)Overexpression ofHER-2/neu is associated with poor survival in advanced epithelial ovariancancer.Cancer Res 50:4087-4091.;Gravalos C,Gomez-Martin C,Rivera F,Ales I,Queralt B,et al.(2011)Phase II study of trastuzumab and cisplatinas first-line therapy in patients with HER2-positive advanced gastric orgastroesophageal junction cancer.Clin Transl Oncol 13:179-184.)。所以非常有必要开发新型的针对该靶标的治疗HER2阳性乳腺癌和其他HER2阳性肿瘤的靶向治疗策略。
除了抗体可以作为靶向分子以外,适配子(Aptamer)也是近二十年来出现的性能非常良好的一类小的靶向分子(Barbas AS,Mi J,ClaryBM,White RR(2010)Aptamer applications for targeted cancer therapy.Future Oncol 6:1117-1126.)。它是一类单链核酸小分子,在溶液中能够折叠成特定的空间结构,它能够以较高的特异性和高亲和力结合靶标,免疫原性低,易于通过化学修饰提高稳定性,成本低,易于大规模合成(Famulok M,Hartig JS,Mayer G(2007)Functional aptamers andaptazymes in biotechnology,diagnostics,and therapy.Chem Rev 107:3715-3743.)。基于适配子的这些优点,它在肿瘤的靶向治疗方面有着广泛的应用前景。Mucagen是FDA批准的第一个适配子,被用于治疗老年黄斑变性。其他一些适配子药物正在进行临床试验(Bates PJ,LaberDA,Miller DM,Thomas SD,Trent JO(2009)Discovery and developmentof the G-rich oligonucleotide AS1411 as a novel treatment for cancer.ExpMol Pathol 86:151-164.;Ng EW,Shima DT,Calias P,Cunningham ET,Jr.,Guyer DR,et al.(2006)Pegaptanib,a targeted anti-VEGF aptamer forocular vascular disease.Nat Rev Drug Discov 5:123-132.)。此外,适配子可以作为靶向载药系统中的靶向分子,在体内试验中,能够显著增强靶向治疗体系抑制肿瘤的效果(Dhar S,Kolishetti N,Lippard SJ,Farokhzad OC(2011)Targeted delivery of a cisplatin prodrug for safer andmore effective prostate cancer therapy in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A108:1850-1855.;Dhar S,Gu FX,Langer R,Farokhzad OC,Lippard SJ(2008)Targeted delivery of cisplatin to prostate cancer cells by aptamerfunctionalized Pt(IV)prodrug-PLGA-PEG nanoparticles.Proc Natl AcadSci U S A 105:17356-17361.;Farokhzad OC,Cheng J,Teply BA,Sherifi I,Jon S,et al.(2006)Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancerchemotherapy in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A 103:6315-6320.;DassieJP,Liu XY,Thomas GS,Whitaker RM,Thiel KW,et al.(2009)Systemicadministration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regressionof PSMA-expressing tumors.Nat Biotechnol 27:839-849.)。Dassie等设计的适配子-siRNA嵌合体,在全身给药时,能够显著增强对小鼠体内前列腺肿瘤的抑制效应(Dassie JP,Liu XY,Thomas GS,Whitaker RM,Thiel KW,et al.(2009)Systemic administration of optimizedaptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.Nat Biotechnol 27:839-849.)。Farokhzhad等构建了基于适配子的紫杉醇纳米载药颗粒,该载药体系在体内试验中能够显著增加对肿瘤的特异性杀伤作用(Farokhzad OC,Cheng J,Teply BA,Sherifi I,Jon S,et al.(2006)Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancerchemotherapy in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A 103:6315-6320.)。这些研究表明适配子作为一类优秀的肿瘤靶向配体,有希望在肿瘤靶向治疗方面发挥重要作用。
在针对以HER2为靶标的适配子方面,目前,Mee Young Kim等以Her2蛋白为靶标筛选出一个RNA适配子,验证了其与HER2阳性肿瘤细胞的结合能力,并讨论了该适配子在肿瘤成像方面的应用可能性(Kim MY,Jeong S(2011)In vitro selection of RNA aptamer andspecific targeting of ErbB2 in breast cancer cells.Nucleic Acid Ther 21:173-178.)。此外,Kazem Dastjerdi等利用cell-selex技术得到了能够识别Her2阳性细胞的DNA适配子库(Dastjerdi K,Tabar GH,Dehghani H,Haghparast A(2011)Generation of an enriched pool of DNA aptamers foran HER2-overexpressing cell line selected by Cell SELEX.BiotechnolAppl Biochem 58:226-230.)。但是,二者并没有在适配子的靶向治疗的应用方面作进一步的研究探索。迄今为止,没有关于HER2适配子在靶向装载化疗药物来治疗HER2阳性肿瘤方面的报道。
因此,以适配子作为靶向HER2的分子,开发能携带化疗药物的靶向载药体系,是治疗HER2阳性肿瘤的一个非常有前景的研究方向。因为化疗目前仍旧是治疗肿瘤的不可或缺的重要治疗手段,但是由于化疗药物非特异性杀伤正常的组织和细胞,毒副作用非常大,从而限制了化疗药物的剂量和时程,使得化疗药物无法彻底清除体内的肿瘤细胞,导致了临床上治疗的失败和患者的预后不良。而开发基于适配子的化疗药载药体系为克服肿瘤术后化疗毒副作用提供了新的治疗途径,即在杀伤肿瘤细胞的同时避免了非特异杀伤正常的组织和细胞。理想的靶向载药体系一定要有肿瘤靶标,而一个良好的肿瘤靶标要能区分大多数肿瘤组织与正常组织的不同,要能靶向性的递送药物至肿瘤组织,在杀伤肿瘤细胞的同时不影响周围的正常组织。而HER2就是这样一个良好的靶标,它在乳腺癌,胃癌,肺癌,卵巢癌和膀胱癌等多种实体瘤中呈现过度表达。因此,开发基于适配子的化疗药载药体系靶向杀伤HER2阳性的肿瘤细胞是非常有意义和应用价值的,然而迄今为止并没有关于HER2适配子-化疗药载药体系靶向杀伤HER2阳性肿瘤细胞的研究报道。
发明内容
因此,本发明的目的在于获取能高特异性地结合肿瘤细胞HER2蛋白的核酸适配子并探寻其在制备肿瘤特异性靶向治疗药物中的用途。
因此,本发明的第一方面涉及一种HER2蛋白特异性结合核酸适配子,其序列如SEQ ID NO:5所示,以及其保持与HER2蛋白特异性结合能力的长度介于70-110、优选75-100、更优选80-90、最优选86个核苷酸的变体。
本发明的第二方面涉及一种复合体,其由如第一方面所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物结合而成或被共同包在纳米粒中,优选地,HER2蛋白特异性结合核酸适配子的序列如SEQ ID NO:5所示,且其中HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.0001~1,优选地,0.003~0.1,更优选地,0.01~0.1。
优选地,所述化疗药物选自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌,优选地,所述化疗药物为阿霉素。
本发明的第三方面涉及一种组合物,其活性成分为上述第二方面所述的复合体。
本发明的第四方面涉及根据上述第一方面所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子作为化疗药物靶向载体的用途,优选地,所述化疗药物选自抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞,抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星,植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱,抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松,杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌,抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼,更优选地,所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。
优选地,所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物组成复合体或者被共同包在纳米粒中。
本发明的第五方面涉及根据上述第二方面所述的复合体或根据第四方面所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途,其中所述肿瘤为实体瘤,优选地,所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌,最优选地,所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、肺腺癌或卵巢癌。
优选地,所述抗肿瘤药物的剂型为口服剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。
本发明的第六方面涉及一种根据上述第一方面所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂的组合物,优选地,所述HER2蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂形成复合体,优选地,所述显影剂是铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒,优选地,所述组合物中含有一种或多种HER2蛋白特异性结合核酸适配子和/或肿瘤显影剂。
本发明的第七方面涉及一种根据上述第六发明所述的组合物在制备肿瘤靶向造影剂中的用途,优选地,所述肿瘤为实体瘤,更优选地,所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌,最优选地,所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、肺腺癌、或卵巢癌。
换言之,本发明利用SELEX技术(Stoltenburg R,Reinemann C,Strehlitz B(2007)SELEX--a(r)evolutionary method to generatehigh-affinity nucleic acid ligands.Biomol Eng 24:381-403.)筛选到一个和HER2蛋白特异性结合的核苷酸适配子(aptamer),并用该核苷酸适配子作为载体直接携带化疗药物阿霉素选择性的到达HER2阳性的肿瘤细胞中,因此,只要是HER2呈阳性的肿瘤细胞均可以被本发明所述的核苷酸适配子所靶向,由于大多数的实体瘤如乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等均过表达HER2蛋白,因此,本发明的核苷酸适配子可以靶向大多数的实体瘤。
即,本发明选取了HER2蛋白胞外结构域靠近细胞膜最具免疫原性的表位肽部分,用它筛选到了新的HER2的核酸适配子,并在体外评估了它携带化疗药物的能力。在体外验证了该适配子具有相对特异性,它与HER2多肽、HER2蛋白、HER2过表达肿瘤细胞株的结合特异性强,而与BSA、胰酶、HER2低表达的肿瘤细胞株、正常细胞系结合弱或不结合。然后构建了该适配子-运载化疗药Dox这一药物模型体系,该载药体系初步证明了适配子-Dox复合物在高表达HER2细胞系中具备了一定的选择性杀伤作用。所以如果开发以该适配子为基础的靶向肿瘤杀伤载药体系,是有潜在的应用价值的。
具体来说,本发明用HER2的表位肽为靶标筛选到了一个新的核酸适配子HB5,序列如SEQ ID NO:5所示。该筛选出来的适配子具有86个碱基长度,能形成更复杂的二级结构,亲和系数为18.9nM。
流式细胞分析仪验证了该适配子和血浆中的白蛋白(BSA)及消化细胞常用的胰蛋白酶仅具有很弱的交叉反应,靶标特异性较好。
流式细胞分析仪还验证了该适配子和HER2多肽以及含有HER2多肽序列的HER2蛋白具有较强的结合力,和HER2阳性细胞具有较高的结合力而和HER2阴性细胞仅具有很弱的结合力。
利用Dox能嵌入到双链DNA中的特性,制备了适配子-Dox靶向载药复合体。通过对阿霉素荧光光谱值的测定,确定阿霉素确实能够嵌入到该适配子中。通过共聚焦显微镜和流式细胞分析仪检测了Dox和适配子-Dox靶向载药复合体与HER2阳性和阴性肿瘤细胞的结合力。结果显示,游离Dox在两种细胞中的摄入都较高,没有表现出选择性,可能是因为游离Dox在不同细胞中的摄入机制是一样的。相反地,适配子-Dox复合体在HER2阳性细胞中的摄入明显高于在HER2阴性细胞中的摄入,能够区别靶向细胞和非靶向细胞。共聚焦显微镜显示游离Dox主要集中在细胞的细胞核内,而适配子-Dox则存在于细胞核和细胞质中,这可能是游离Dox和适配子-Dox复合体被细胞摄入的不同机制造成的,游离的Dox是通过细胞膜的扩散进入到细胞内,嵌入到细胞核内双链DNA中,没有细胞选择性。而当嵌入到适配子中后,DNA的极性成分阻断了非极性的Dox进入细胞膜。适配子-Dox复合体进入细胞很可能是由于适配子和SK-BR-3细胞表面的HER2蛋白胞外结构域结合,通过受体介导的内吞作用进入细胞质。由于MDA-MB-231细胞缺乏表面的受体蛋白,因而造成复合体不能进入细胞内,Dox在细胞的摄入降低。发现适配子-Dox复合体能够选择性地被HER2阳性肿瘤细胞摄入,而在HER2阴性细胞MDA-MB-231中摄入量明显减少。MTS试验也证实了上面的细胞摄入Dox实验的结果。当然,本发明选择Dox来进行适配子靶向载药复合体的实验仅是出于便于定量和动态监测二者结合及摄入的目的,并非意味着本发明所述的适配子必须要依靠化疗药物能插入到DNA双链中的特性。与此相反,本发明所述的适配子可以与化疗药物如抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞,抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星,植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱,抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松,杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌,抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼进行复合使用,实现特异性靶向HER2阳性细胞的目的。
细胞增殖实验结果表明,对HER2阳性细胞,载药复合体引起的细胞毒作用和游离Dox相似:然而,对于HER2阴性细胞,载药复合体引起的细胞毒作用低于游离Dox(p<0.05)。这些数据再一次说明适配子-Dox能选择性地携带Dox到HER2阳性的肿瘤细胞。从而降低Dox对不表达HER2蛋白的正常细胞的毒副作用。化疗药物能同时损伤肿瘤细胞和正常细胞,从而引起毒副作用,严重限制了化疗的效果和应用。由于本发明的上述实验说明适配子-Dox复合体能够区分靶向和非靶向细胞,而且HER2蛋白在大多数恶性肿瘤表面高表达,因此HB5可以作为靶向分子在对多种HER2阳性恶性肿瘤的靶向治疗方面找到潜在的应用价值。
另外,本发明的HER2蛋白特异性结合核酸适配子还可以和肿瘤显影剂联合使用,实现对具体肿瘤的靶向显影,从而为更精确地确定肿瘤的分期、转移、定位提供可以视觉化的判断方式。
附图说明
图1:流式细胞分析仪检测SELEX筛选进程。
图2:流式细胞分析仪检测适配子HB5的靶标特异性。A:适配子和靶标多肽的结合。B:适配子和HER2蛋白的结合。C:适配子和BSA的结合。D:适配子和胰酶的结合。
图3:适配子HB5和靶标多肽的亲和力的检测。
图4:流式细胞分析仪检测适配子HB5和HER2阳性细胞特异性结合。A:HER2+细胞SK-BR-3。B:HER2+细胞MDA-MB-453。C:HER2-细胞MDA-MB-231。D:HER2-细胞MCF-7。E:HER2-细胞L02。
图5:荧光光谱分析不同摩尔比的适配子HB5和阿霉素混合后阿霉素荧光光谱值的变化。从上到下摩尔比依次为:0、0.0001、0.003、0.01、0.1、1。
图6:上图A-D:共聚焦显微镜检测游离阿霉素和适配子-Dox复合体在SK-BR-3细胞和MDA-MB-231细胞中的摄入。下图:流式细胞分析仪测定游离阿霉素(黑线)和适配子-Dox复合体(灰线)在SK-BR-3细胞(E)和MDA-MB-231细胞中(F)的摄入。
图7:MTS法测定适配子HB5、Dox和适配子-Dox复合体对MDA-MB-231细胞的杀伤。
图8:MTS法测定适配子HB5、Dox和适配子-Dox复合体对SK-BR-3细胞的杀伤。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明,均为常规方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1
一、材料和方法
试剂
单链寡核苷酸由Invitrogen公司合成。多肽购买于北京赛百盛公司。HER2蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司,货号:10004-H08H。牛血清白蛋白购买自天津灏洋生物科技有限公司。单分散磁珠,链酶亲和素包被磁珠购买自普洛麦格公司。EDC购买自Sigma公司。
细胞系
人乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-453、SK-BR-3、人正常肝细胞L02均购自中国医学科学院细胞中心。细胞培养在含有10%FBS、常规浓度青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基中(厂家:北京盈信阳光生物技术有限公司,货号:07-021,商品名:DMEM高糖培养基)。细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养。所有试验所用细胞均是处于对数生长期的细胞。
靶标和磁珠的连接
用于筛选的靶标为20个氨基酸长度的HER2多肽,序列为INCTHSCVDLDDKGCPAEQR(SEQ ID NO:1),其来自HER2蛋白的胞外结构域靠近细胞膜的区域。多肽用含1%DMSO的双蒸水溶解。2ug多肽和5×105磁珠混合,在40mM EDC水溶液中室温反应2h,PBS洗5次,最后重悬于PBS中,于4℃保存。用相同的方法处理BSA、胰酶以及含有该HER2多肽序列的HER2蛋白。
DNA文库的构建
单链DNA文库和引物均由Invitrogen公司合成。其中单链DNA库由86个脱氧核苷酸构成,两端为固定序列,中间为40个碱基的随机序列,表示为
5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3’(SEQ ID NO:2)。
合成的引物如下:P15’-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’(SEQ ID NO:3)和P25’-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’(SEQ ID NO:4);FITC-P1和Biotin-P2;其中FITC-P1和Biotin-P2这对引物用于在每轮筛选中扩增双链DNA,并通过与链霉素包被的磁珠孵育后分离出FITC标记的单链DNA。另外一对不标记的P1和P2引物则在筛选结束后,扩增dsDNA,后者用于后续的克隆测序分析。上述反应产生的双标记dsDNA和链霉素包被的磁珠共反应10min,PBS洗3遍,然后加入0.1M NaOH变性5min,将FITC标记的ssDNA和生物素标记的ssDNA分开。带有FITC的单链被分离出来用于流式检测和下一轮的筛选。
体外筛选过程
200pm随机ssDNA文库在Hank’s溶液中95℃变性5min,冰浴10min,为了降低非特异性的结合,在Hank’s溶液中加入0.1mg/ml鲑精DNA和1mg/ml的BSA,作为结合缓冲液。然后,随机文库和2ug靶标多肽在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min,用结合缓冲液洗3次,以结合了ssDNA的磁珠为模板,用标记有FITC和生物素的引物扩增dsDNA,扩增条件为:94℃40s,65℃30s,72℃40s,72℃10min,25个循环。双链产物经磁珠分离后得到富集的单链文库,用于下一轮筛选。5轮筛选后,用没有修饰的引物P1:5’-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’(SEQ ID NO:3)和P2:5’-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’(SEQ ID NO:4)扩增dsDNA,TA克隆,测序。
流式细胞分析
用流式细胞仪检测筛选的进程,方法:FITC标记的单链文库和靶标多肽包被的磁珠在含有10%FBS的结合缓冲液中于37℃反应30min,PBS洗两遍,流式细胞分析仪检测,未筛选的随机文库作为对照。
为了检测适配子和靶标的特异性结合,将FITC标记的适配子在200ul结合缓冲液中分别和BSA或胰酶或HER2蛋白包被的磁珠于37℃反应30min,PBS洗两遍,用流式细胞仪分析。
为了检测适配子和细胞的结合,分别刮取5×105的SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-231、MCF7和L02细胞,将其和FITC标记的适配子在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min,PBS洗两遍,用流式细胞仪分析。
Kd值的测定:靶标多肽包被的磁珠和FITC标记的不同浓度的适配子在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min,PBS洗两遍,流式细胞仪检测平均荧光强度,未筛选的随机文库作为阴性对照用于非特异性的结合。适配子和靶标结合的平均荧光强度值等于适配子和靶标结合的平均荧光强度测量值减去随机文库的平均荧光强度测量值,然后根据公式Y=BmaxX/(Kd+X)(Y:平均荧光强度值,X:所用的适配子的浓度,B是一个常数,max是最大值的意思)计算适配子和靶标结合的Kd值。
荧光光谱分析阿霉素嵌入到适配子中
适配子预先于95℃孵育5min,冰浴10min,取不同量的适配子和3nm阿霉素混匀,适配子和阿霉素的摩尔比例依次为:0、0.0001、0.003、0.01、0.1和1。在黑色96孔板中静置1h,测量阿霉素的荧光光谱值。Dox的激发光谱为480nm。发射光谱为520-720nm。
细胞摄入实验
共聚焦显微镜检测:制备SK-BR-3和MDA-MB-231的细胞爬片,1.5uM Dox和适配子-Dox(适配子和阿霉素的复合体)分别和两种细胞于37℃反应2h,用PBS洗两遍,4%多聚甲醛固定10min,PBS洗3遍,封片,荧光共聚焦显微镜检测。
流式细胞仪检测:刮取SK-BR-3和MDA-MB-231细胞,PBS洗两遍,2uM Dox和适配子-Dox分别和两种细胞于37℃反应4h,PBS洗两遍,流式仪检测。
细胞增殖实验
1.5uM适配子、Dox和适配子-Dox分别和SK-BR-3和MDA-MB-231细胞于37℃孵育4h,PBS洗两遍,全培养基继续孵育40h后,MTS法检测细胞的增殖。
二、结果
1、适配子的筛选和特点
1)在本研究中,我们用HER2胞外结构域靠近细胞膜的一段表位肽序列作为靶标进行富集筛选。在每轮筛选中,首先在EDC作用下把HER2多肽通过共价连接的方式固定在SLE磁珠上(天津倍思乐色谱技术开发中心,目录号:3392),再将每轮筛选后经PCR扩增得到的带有FITC荧光的dsDNA库与HER2多肽磁珠混合孵育,然后通过流式检测每轮荧光强度变化来监测适配子的富集程度。和随机文库相比,所筛文库和靶标多肽结合的荧光强度有了显著的提高(图1),说明所筛文库中富集到了一些和靶标多肽结合的适配子。筛选结束后,将富集到的适配子库克隆,对其中96个克隆进行分析。在这些克隆中,筛选出了一个和多肽结合最强的适配子HB5。HB5的序列为5’-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATTTTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACTACACACGCACA-3’(SEQ ID NO:5)。
2)特异性是评价适配子的一个重要指标,为了验证筛选出来的适配子是否具备一定的靶标特异性,检测了其与其他蛋白的结合情况。首先,我们将包含HER2多肽序列的HER2-ECD蛋白通过EDC共价连接在SLE磁珠上,然后与FITC-HB5混合孵育,进行流式分析。结果显示,与随机库比,HB5与HER2蛋白结合仍高于与随机库的结合。(图2的B)说明HB5也能够与包含有HER2多肽序列的HER2蛋白的胞外结构域特异性结合。
其次,因为白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白,因此检测了适配子与牛血清白蛋白(BSA)的结合。BSA共价连接到SLE磁珠表面,和标记有FITC的适配子反应,流式细胞仪检测结合情况。随机库DNA(合成的随机模板链)作为随机对照。流式结果显示,HB5和BSA反应后的荧光强度和随机对照一致(图2的C),而HB5和靶标多肽反应后的荧光强度显著高于随机对照(图2的A),说明HB5和BSA有很弱的交叉反应。同样,HB5和胰酶几乎不反应(图2的D)。
HB5显示了比较好的靶标特异性,然后用流式细胞仪测定了它和靶标多肽结合的亲和力。不同浓度的FITC标记的HB5和靶标多肽包被的磁珠孵育,流式细胞仪检测平均荧光强度,用非线性回归分析测得HB5和靶标多肽的Kd值约为18.9nM(图3)。
3)为了评估HB5能否和表达HER2的肿瘤细胞结合,选取过表达HER2的肿瘤细胞系SK-BR-3和MDA-MB-453以及HER2阴性的肿瘤细胞系MDA-MB-231、MCF7和正常胎肝上皮细胞系L02,分别和标记有FITC的HB5孵育,流式细胞仪检测细胞荧光强度的变化。随机库DNA作为随机对照。结果显示,HB5和SK-BR-3、MDA-MB-453细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照(图4的A和图4的B),而和MDA-MB-231、MCF7、L02细胞反应后的荧光强度和随机对照一致(图4的C、图4的D和图4的E)。上述实验结果表明HB5和HER2阳性的肿瘤细胞结合强,和HER2阴性细胞结合弱,HB5能够识别表达在HER2阳性肿瘤细胞表面的HER2蛋白的结构。
2、阿霉素(Dox)是很重要的一种治疗肿瘤的化疗药物,为了验证筛选出来的适配子能够选择性的携带药物到达肿瘤细胞,我们制备了不同配比浓度的适配子-Dox复合体(Bagalkot V,Farokhzad OC,Langer R,Jon S(2006)An aptamer-doxorubicin physical conjugate as anovel targeted drug-delivery platform.Angew Chem Int Ed Engl 45:8149-8152.),荧光光谱分析表明阿霉素嵌入到适配子中(图5)。单纯的Dox是通过细胞膜的被动扩散进入细胞内,不能区分肿瘤细胞和正常细胞,毒副作用比较大。由于适配子能够和表达HER2阳性的肿瘤细胞特异性结合,适配子-Dox载药复合体应该也有可能被表达HER2的肿瘤细胞特异性的摄取。为了验证上述假设,通过共聚焦显微镜检测了适配子-Dox在HER2阳性和阴性肿瘤细胞中的摄入。设立Dox和适配子-Dox组,分别和HER2阳性的SK-BR-3以及HER2阴性的MDA-MB-231细胞孵育,共聚焦显微镜观察细胞内Dox的含量。结果显示,游离Dox在两种细胞内都有强的荧光,含量都很高,对两种细胞的摄入没有选择性(图6的A和图6的B)。与此相反,适配子-Dox组中,SK-BR-3细胞中荧光强度明显强于MDA-MB-231细胞(图6的C和图6的D)。这表明适配子-Dox在MDA-MB-231细胞中的摄入明显低于游离Dox。上述实验结果表明,适配子-Dox在HER2阳性的肿瘤细胞中的摄入多,在HER2阴性的肿瘤细胞中的摄入少,适配子-Dox能够被HER2阳性的肿瘤细胞选择性地摄取。
为了更进一步证明适配子-Dox是否被HER2阳性的肿瘤细胞选择性地摄取,将游离Dox和适配子-Dox复合体分别和SK-BR-3、MDA-MB-231孵育,用流式细胞仪检测其荧光强度的变化,流式结果显示:对于HER2阳性细胞SK-BR-3,游离Dox组和适配子-Dox复合体组的荧光强度一致,没有变化(图6的E)。而对于HER2阴性细胞MDA-MB-231,适配子-Dox组的荧光强度明显低于游离Dox(图6的F)。上述实验再次说明了适配子-Dox在HER2阳性的肿瘤细胞中的摄入多,在HER2阴性细胞中的摄入少,能够被HER2阳性的肿瘤细胞选择性地摄取。总的来说,共聚焦显微镜试验和流式细胞仪试验说明HB5可以作为一个载体工具靶向性地携带Dox到HER2阳性的肿瘤细胞。
4)因为适配子-Dox被HER2阴性细胞选择性的摄取减弱,因此有可能造成对HER2阴性细胞的毒性作用减弱。为了验证上述假设,设立适配子组、Dox组和适配子-Dox组,分别与SK-BR-3细胞、MDA-MB-231细胞孵育,MTS法检测细胞的增殖情况。对于HER2阴性的MDA-MB-231细胞,Dox组细胞的存活率为58.4%,而适配子-Dox组细胞存活率为70.5%,显示适配子-Dox对HER2阴性细胞的杀伤显著低于游离Dox(p<0.05)(图7)。然而,对于HER2阳性的SK-BR-3细胞,Dox组中细胞的存活率为62.09%,适配子-Dox组中的存活率为60.68%,显示适配子-Dox对HER2阳性细胞的杀伤作用和游离的Dox没有显著差别(图8)。上述实验结果表明适配子-Dox能够减弱Dox对HER2阴性细胞的毒性,而HER2阳性细胞的杀伤作用没有影响。另外,单纯适配子组中,SK-BR-3细胞和MDA-MB-231细胞的存活率都接近100%,显示适配子对两种细胞没有毒性。
申请人也做了HB5和其他主要类型的化疗药物结合形成复合体及验证该复合体生物活性的实验,其实验流程与上述实施例1中的流程相似,结果表明主要的化疗药物类型,如抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞,抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星,植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱,抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松,杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌,抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼均可以有效地与本发明的HER2蛋白特异性结合核酸适配子结合成为复合体,实现靶向抗肿瘤的效果。同时,本领域技术人员理解,本发明技术方案的作用机理在于HER2核酸适配子可以与其靶标HER2蛋白特异性结合,因此所有表达HER2蛋白特别是高表达HER2蛋白的细胞均可以被本发明的HER2核酸适配子特异性靶向。
虽然本发明在上述具体实施方案中示例性地列出了实施本发明的优选技术方案,本领域技术人员公知,本领域技术人员可以在不背离本发明的精神的情况下,对本发明做出大量的修改、修饰。这样的修改和修饰也落在本发明的范围之内。例如,本发明的适配子可以和非化疗药物类型的物质结合形成复合体,并进而用于特定展示或成像HER2蛋白阳性的肿瘤细胞及其定位、代谢。本发明的适配子在与化疗药物或非化疗药物组合使用时,既可以处于结合的状态,也可以处于简单混合(非结合)的状态。同时,本领域技术人员公知,虽然本发明仅列出了HER2蛋白特异性核酸适配子的具体序列,但该序列的部分碱基可以被去除、替换或者额外的部分碱基(如1-10个,加于一端或两端)被加到该序列而仍然保持其与HER2蛋白的特异性结合能力,这样的序列也包括在本发明的范围之内。同时,本发明的适配子和/或适配子-化疗药物复合体可以与其他的适配子和/或适配子-化疗药物联合使用,从而达到同时治疗多种肿瘤的目的。
Claims (21)
1.一种HER2蛋白特异性结合核酸适配子,其序列如SEQ ID NO:5所示,其保持与HER2蛋白特异性结合能力的长度为86个核苷酸。
2.一种复合体,其由如权利要求1所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物结合而成或被共同包在纳米粒中,HER2蛋白特异性结合核酸适配子的序列如SEQ ID NO:5所示,且其中HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.0001~1。
3.根据权利要求2所述的复合体,其中HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.003~0.1。
4.根据权利要求2所述的复合体,其中HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.01~0.1。
5.根据权利要求2所述的复合体,其特征在于所述化疗药物选自阿霉素、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌。
6.根据权利要求5所述的复合体,所述化疗药物为阿霉素。
7.一种组合物,其活性成分为根据权利要求2-6中任意一权利要求所述的复合体。
8.根据权利要求1所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子在制备化疗药物靶向载体中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途,其中所述化疗药物选自抗代谢类药物、抗癌抗生素类药物、植物碱类、抗肿瘤激素类、杂类、抗肿瘤小分子靶向药物。
10.根据权利要求9所述的用途,其中所述抗代谢类药物选自甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞;抗癌抗生素类药物选自丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、表柔比星、吡柔比星;植物碱类选自长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱;肿瘤激素类选自他莫昔芬、来曲唑、强的松;杂类选自顺铂、卡铂、米妥蒽醌;抗肿瘤小分子靶向药物选自吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。
11.根据权利要求10所述的用途,其中所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。
12.根据权利要求8-11中任意一权利要求所述的用途,其特征在于所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物组成复合体或者被共同包在纳米粒中。
13.根据权利要求2-6中任意一权利要求所述的复合体或根据权利要求7所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途,其中所述肿瘤为实体瘤。
14.根据权利要求13所述的用途,所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌。
15.根据权利要求14所述的用途,所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、肺腺癌、卵巢癌。
16.根据权利要求13、14或15所述的用途,其特征在于所述抗肿瘤药物的剂型为口服剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。
17.一种根据权利要求1所述的HER2蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂的组合物,所述HER2蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂形成复合体。
18.根据权利要求17所述的组合物,所述显影剂是铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒。
19.根据权利要求18所述的组合物,所述组合物中含有一种或多种HER2蛋白特异性结合核酸适配子和/或肿瘤显影剂。
20.一种根据权利要求17-19中任意一权利要求所述的组合物在制备肿瘤靶向造影剂中的用途,其中所述肿瘤为实体瘤,所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌。
21.根据权利要求20所述的用途,所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、肺腺癌、卵巢癌。
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