CN103160513B - Muc1蛋白核酸适配子、复合体、组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及MUC1蛋白核酸适配子、复合体、组合物及其用途。具体而言，本发明涉及一种MUC1蛋白特异性结合核酸适配子，其序列如SEQ ID NO：9所示。本发明还涉及由所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物结合而成或被共同包在纳米粒中而形成的复合体、包含所述复合体的组合物及所述核酸适配子、复合体和组合物的抗肿瘤用途及肿瘤靶向造影用途。

Description

MUC1蛋白核酸适配子、复合体、组合物及其用途

技术领域

本发明涉及MUC1蛋白核酸适配子、复合、组合物及其用途。

背景技术

化疗是治疗肿瘤最主要的手段，尤其是对于晚期阶段的转移性肿瘤。但是，细胞毒药物产生的副作用往往限制了化疗的效果。细胞毒药物最主要的问题是它们能同时损伤肿瘤细胞和正常组织，引起严重的副反应，限制了化疗的强度和时程。因此，细胞毒药物很难能够清除体内的肿瘤细胞，进而导致了临床上治疗的失败和患者预后的不良。基于这一点，需要研发新的方法来降低化疗药物的毒性。靶向治疗是实现这一目标的途径之一。靶向治疗是指靶向分子携带药物特异性地到达肿瘤部位，使药物更多的富集在肿瘤组织中，而在正常组织中的含量较少。由于药物被特异性地带到肿瘤部位，对肿瘤组织的杀伤增强而对正常组织杀伤较弱，从而有助于清除体内的肿瘤细胞，并大大降低毒副作用。靶向治疗是有希望改善抗肿瘤化疗疗效的重要方向之一。已有文献报道，核酸适配子作为靶向分子的纳米载体携带顺铂在小鼠肿瘤模型中能够显著增强抗前列腺癌的效果(Dhar S，Gu FX，Langer R，Farokhzad OC，Lippard SJ(2008)Targeted delivery of cisplatinto prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt(IV)prodrug-PLGA-PEG nanoparticles.Proc Natl Acad Sci U S A 105：17356-17361.)。单克隆抗体和药物共价连接已经用于肿瘤的靶向治疗研究。其中，HER2抗体和一种化学药物形成的复合体正在进行III期临床试验(Vogel CL，Burris HA，Limentani S，Borson R，O′Shaughnessy J，etal.(2009)A phase II study of trastuzumab-DM1(T-DM1)，a HER2antibody-drug conjugate(ADC)，in patients(pts)with HER2+metastaticbreast cancer(MBC)：Final results.Journal of Clinical Oncology 27.)。

靶向药物传递系统通常包括抗肿瘤药物和靶向分子，靶向分子能够和表达在肿瘤细胞表面的肿瘤标志物特异性的结合。一个理想的分子靶标最好是表达在肿瘤细胞膜表面，并且在肿瘤部位高表达而正常组织低表达或不表达。MUC1蛋白是一种广泛的表达在多种肿瘤细胞膜上的糖蛋白，在大多数腺癌(乳腺癌、肺癌、结肠癌等)中高表达，表达量是正常组织的10倍以上(Taylor-Papadimitriou J，Burchell J，MilesDW，Dalziel M(1999)MUC1and cancer.BBA-Mol Basis Dis 1455：301-313.)，因而是一个较为理想的靶标。MUC1蛋白由肽核心和糖链组成，肽核心是一段可变的重复序列，是具有免疫原性的部分，正常表达时，糖链的存在使肽核心隐蔽起来，失去免疫原性，肿瘤组织中异常表达时，由于糖链的丢失而使肽核心部分暴露了出来，成为治疗的靶点。现有技术中对MUC1蛋白的筛选也是应用这段多肽作为靶标，这可能是由于很难获得整个MUC1蛋白。

靶向治疗的实现还需要合适的靶向分子，理想的靶向分子是能够和靶标特异性结合，亲和力高，在体内免疫原性弱，稳定性好。最近，一批新的靶向分子例如核酸适配子、短肽和小分子已经成为了新一代的靶向分子。核酸适配子(aptamer)是近几十年发展起来的新型核苷酸配体分子，特异性强，亲和力高，相比抗体有许多优势，例如易于大规模合成，价格便宜，易于体外修饰，体内低免疫原性，易于穿透肿瘤组织等。因此，核酸适配子越来越广泛的作为靶向载体工具应用到肿瘤的靶向治疗研究中。根据已有的报道，Ferreira小组筛选到了一组MUC1蛋白的适配子，能够选择性的和MUC1阳性的肿瘤细胞结合，并且，筛选出来的适配子还可在体外选择性的携带光动力治疗剂到MUC1阳性肿瘤细胞(Ferreira CS，Cheung MC，Missailidis S，Bisland S，Gariepy J(2009)Phototoxic aptamers selectively enter and kill epithelialcancer cells.Nucleic Acids Res 37：866-876.)。

细胞毒药物是化疗中最重要的成分，因此，研究MUC1的适配子能否直接携带细胞毒药物到肿瘤细胞是非常重要的。至今为止，还没有文献报道过这项研究。细胞毒药物是化疗中最重要的成分，还没有文献报道过MUC1的适配子能否直接携带细胞毒药物到肿瘤细胞。

发明内容

因此，本发明的目的在于获取能高特异性地结合肿瘤细胞MUC1蛋白的核酸适配子并探寻其在制备肿瘤特异性靶向治疗药物中的用途。

因此，本发明的第一方面涉及一种MUC1蛋白特异性结合核酸适配子，其序列如SEQ ID NO：9所示，以及其保持与MUC1蛋白特异性结合能力的长度介于70-110、优选75-100、更优选80-90、最优选86个核苷酸的变体，优选地，所述变体具有如SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11所示的序列。

本发明的第二方面涉及一种复合体，其由如第一方面所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物结合而成或被共同包在纳米粒中，优选地，MUC1蛋白特异性结合核酸适配子的序列如SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示，且其中MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.001～1，优选地，0.003～0.1，更优选地，0.005～0.03。

优选地，所述化疗药物选自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌，优选地，所述化疗药物为阿霉素。

本发明的第三方面涉及一种组合物，其活性成分为上述第二方面所述的复合体。

本发明的第四方面涉及根据上述第一方面所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子作为化疗药物靶向载体的用途，优选地，所述化疗药物选自抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼，更优选地，所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

优选地，所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物组成复合体或者被共同包在纳米粒中。

本发明的第五方面涉及根据上述第二方面所述的复合体或根据第四方面所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述肿瘤为腺癌，优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最优选地，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、结肠癌或肝癌。

优选地，所述抗肿瘤药物的剂型为口服剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。

本发明的第六方面涉及一种根据上述第一方面所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂的组合物，优选地，所述MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂形成复合体，优选地，所述显影剂是铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒，优选地，所述组合物中含有一种或多种MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和/或肿瘤显影剂。

本发明的第七方面涉及一种根据上述第六发明所述的组合物在制备肿瘤靶向造影剂中的用途，优选地，所述肿瘤为腺癌，更优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最优选地，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、结肠癌或肝癌。

换言之，本发明利用SELEX技术(Kim Y，Liu C，Tan W(2009)Aptamers generated by Cell SELEX for biomarker discovery.BiomarkMed 3：193-202.)筛选到一个和MUC1蛋白特异性结合的核苷酸适配子(aptamer)，并用该核苷酸适配子作为载体直接携带细胞毒药物选择性的到达MUC1阳性的肿瘤细胞中，因此，只要是MUC1呈阳性的肿瘤细胞均可以被本发明所述的核苷酸适配子所靶向，由于大多数的腺癌如乳腺癌、肺癌、结肠癌等均高表达MUC1蛋白，因此，本发明的核苷酸适配子可以靶向大多数的腺癌。

即，本发明选取了MUC1蛋白肽核心中最具有免疫原性的部分，用它筛选到了新的MUC1的核酸适配子，并在体外评估了它携带细胞毒药物的能力。具体来说，本发明用MUC1的核心抗原肽为靶标筛选到了一个新的核酸适配子MA3，序列如SEQ ID NO：9所示。该筛选出来的适配子具有86个碱基长度，能形成更复杂的二级结构，亲和系数为38nM。

流式细胞分析仪验证了该适配子和血浆中的白蛋白(BSA)具有很弱的交叉反应，靶标特异性较好。本发明还挑选了已发表的MUC1适配子中亲和力最高的一个S2.2(Ferreira CS，Cheung MC，Missailidis S，Bisland S，Gariepy J(2009)Phototoxic aptamers selectively enter and killepithelial cancer cells.Nucleic Acids Res 37：866-876.；Ferreira CSM，Matthews CS，Missailidis S(2006)DNA Aptamers That Bind to MUC1Tumour Marker：Design and Characterization of MUC 1-BindingSingle-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27：289-301.)，将其和MA3在结合BSA方面进行了比较。实验结果表明，MA3和S2.2和靶标多肽都有比较高的结合力，但是MA3和BSA的结合要明显弱于S2.2。相对于S2.2，MA3和BSA的交叉反应很弱，能够选择性的结合MUC1多肽。

流式细胞分析仪验证了该适配子和MUC1多肽具有较强的结合力，和MUC1阳性细胞具有较高的结合力而和MUC1阴性细胞具有很弱的结合力。

利用dox能嵌入到双链DNA中的特性，制备了适配子-dox靶向载药复合体。通过对阿霉素荧光光谱值的测定，确定阿霉素确实能够嵌入到该适配子中。通过共聚焦显微镜和流式细胞分析仪检测了Dox和适配子-dox靶向载药复合体与MUC1阳性和阴性肿瘤细胞的结合力。结果显示，游离Dox在两种细胞中的摄入都较高，没有表现出选择性，可能是因为游离Dox在不同细胞中的摄入机制是一样的。相反，适配子-dox复合体在MUC1阳性细胞中的摄入明显高于在MUC1阴性细胞中的摄入，能够区别靶向细胞和非靶向细胞。共聚焦显微镜显示游离dox主要集中在细胞的细胞核内，而适配子-dox则存在于细胞核和细胞质中，这可能是游离dox和适配子-dox复合体被细胞摄入的不同机制造成的，游离的dox是通过细胞膜的扩散进入到细胞内，嵌入到细胞核内双链DNA中，没有细胞选择性。而当嵌入到适配子中后，DNA的极性成分阻断了dox进入细胞膜。适配子-dox复合体进入细胞很可能是由于适配子和A549细胞表面的MUC1蛋白结合，通过受体介导的内吞作用进入细胞质。由于HepG2细胞缺乏表面的受体蛋白，因而造成复合体不能进入细胞内，Dox在细胞的摄入降低。发现适配子-dox复合体能够选择性的被MUC1阳性肿瘤细胞摄入，而在MUC1阴性细胞HepG2中摄入量明显减少。MTS试验也证实了上面的细胞摄入Dox实验的结果。当然，本发明选择dox来进行适配子靶向载药复合体的实验仅是出于便于定量和动态监测二者结合及摄入的目的，并非意味着本发明所述的适配子必须要依靠化疗药物能插入到DNA双链中的特性。与此相反，本发明所述的适配子可以与化疗药物如抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼进行复合使用，实现特异性靶向MUC1阳性细胞的目的。

细胞增殖实验结果表明，对MUC1阳性细胞，载药复合体引起的细胞毒作用和游离dox相似：然而，对于MUC1阴性细胞，载药复合体引起的细胞毒作用低于游离dox(p＜0.01)。这些数据再一次说明适配子-dox能选择性地携带dox到MUC1阳性的肿瘤细胞。从而降低dox对不表达MUC1蛋白的正常细胞的毒副作用。细胞毒药物能同时损伤肿瘤细胞和正常细胞，从而引起毒副作用，严重限制了化疗的效果和应用。由于本发明的上述实验说明适配子-dox复合体能够区分靶向和非靶向细胞，而且MUC1蛋白在大多数腺癌表面高表达，因此MA3可以作为靶向分子在对多种恶性肿瘤的靶向治疗方面找到潜在的应用价值。

本发明还研究了上述序列的变体的MUC1蛋白的特异性结合能力，所述变体通过在上述序列的两端或一段添加部分核苷酸或者改变所述序列中的部分核苷酸而获得，所述变体保持或基本保持与SEQ IDNO：9相同的二级结构，从而保持了其与MUC1蛋白特异性结合的能力。上述核苷酸序列二级结构的预测方法是本领域技术人员所熟知的，另外本发明的上述内容中也具体公开了适配子与MUC1蛋白特异性结合的方法，本领域技术人员可以据此容易地获得这样的变体。这样的变体的例子如下述序列：

5′-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’(SEQ ID NO：10)，和

5’-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’(SEQ ID NO：11)，它们与MUC1蛋白的结合能力也较强(数据略)。

另外，本发明的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子还可以和肿瘤显影剂联合使用，实现对具体肿瘤的靶向显影，从而为更精确地确定肿瘤的分期、转移、定位提供可以视觉化的判断方式。

附图说明

图1：流式细胞分析仪检测SELEX筛选进程。

图2：流式细胞分析仪检测适配子MA3的靶标特异性。(a)适配子和靶标多肽的结合。(b)适配子和BSA的结合。(c)S2.2和靶标多肽的结合。(d)S2.2和BSA的结合。

图3：(a)适配子MA3和靶标多肽的亲和力的检测。(b)流式细胞分析仪检测适配子和26-AA多肽的结合，黑色部分是随机对照。

图4：流式细胞分析仪检测适配子MA3和MUC1阳性细胞特异性结合。(a)MUC1⁺细胞A549。(b)MUC1⁺细胞MCH7。(c)MUC1^-细胞HepG2。(d)MUC1^-细胞L02。

图5：荧光光谱分析不同摩尔比的适配子MA3和阿霉素的混合后阿霉素荧光光谱值的变化。

从上到下摩尔比依次为：0，0.001，0.003，0.005，0.01，0.03，0.1，1。

图6：上图a-d：共聚焦显微镜检测游离阿霉素和适配子-dox复合体在A549细胞和HepG2细胞中的摄入。下图：流式细胞分析仪测定游离阿霉素(黑线)和适配子-dox复合体(灰线)在A549细胞(e)和HepG2细胞中(f)的摄入。

图7：MTS法测定适配子MA3、dox和适配子-dox复合体对HepG2细胞的杀伤。

图8：MTS法测定适配子MA3、dox和适配子-dox复合体对A549细胞的杀伤。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1

一、材料和方法

试剂

单链寡核苷酸由Invitrogen公司合成。多肽购买于北京赛百盛公司。牛血清白蛋白购买自天津灏洋生物科技有限公司。单分散磁珠，链酶亲和素包被磁珠购买自普洛麦格公司。EDC购买自Sigma公司。

细胞系

人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF7、人肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞L02均购自中国医学科学院细胞中心。细胞培养在含有10％FBS、常规浓度青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基中(厂家：北京盈信阳光生物技术有限公司，货号：07-021，商品名：DMEM高糖培养基)。细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养。所有试验所用细胞均是处于对数生长期的细胞。

靶标和磁珠的连接

用于筛选的靶标为9个氨基酸长度的多肽1(peptide1)，序列为APDTRPAPG(SEQ ID NO：1)，其来自MUC1蛋白的高免疫原性的VNTR区域。多肽用含1％DMSO的双蒸水溶解。2ug多肽和5×10⁵磁珠混合，在40mM EDC水溶液中室温反应2h，PBS洗5次，最后重悬于PBS中，于4℃保存。用相同的方法处理BSA以及含有29个氨基酸残基的GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP(SEQ ID NO：2)的多肽2(peptide2)和磁珠的连接。

DNA文库的构建

起始随机文库为含有86个碱基的单链DNA(ssDNA)文库，中间为40个随机序列，两边为固定的引物P1序列：5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC(N40)CACAGACACACTACACACGCACA3’(SEQ ID NO：3)，FITC修饰的引物P2(5’-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’(SEQ ID NO：4))和生物素修饰的引物P3(5’-B-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’(SEQ ID NO：5))用于PCR扩增双标记的双链DNA分子(dsDNA)。上述反应产生的dsDNA和链霉素包被的磁珠共反应10min，PBS洗3遍，然后加入0.1M NaOH变性5min，将FITC标记的ssDNA和生物素标记的ssDNA分开。分离出的带有FITC的单链被分离出来用于流式检测和下一轮的筛选。

体外筛选过程

200pm随机ssDNA文库在Hank’s溶液中95℃变性5min，冰浴10min，为了降低非特异性的结合，在Hank’s溶液中加入0.1mg/ml鲑精DNA和1mg/ml的BSA，作为结合缓冲液。然后，随机文库和2ug靶标多肽在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min，用结合缓冲液洗3次，以结合了ssDNA的磁珠为模板，用标记有FITC和生物素的引物扩增dsDNA，扩增条件为：94℃40s，65℃30s，72℃40s，72℃10m，25个循环。双链产物经磁珠分离后得到富集的单链文库，用于下一轮筛选。4轮筛选后，用没有修饰的引物P4：

5’-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’(SEQ ID NO：6)和P5：

5’-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’(SEQ ID NO：7)扩增dsDNA，TA克隆，测序。

流式细胞分析

用流式细胞仪检测筛选的进程，方法：FITC标记的单链文库和靶标多肽包被的磁珠在含有10％FBS的结合缓冲液中于37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞分析仪检测，未筛选的随机文库作为对照；

为了检测适配子和靶标的特异性结合，将FITC标记的适配子在200ul结合缓冲液中分别和BSA或29-AA的多肽包被的磁珠于37℃反应30min，PBS洗两遍，用流式细胞仪分析；

为了检测适配子和细胞的结合，分别刮取5×10⁵的A549、MCF7、HepG2和L02细胞，将其和FITC标记的适配子在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min，PBS洗两遍，用流式细胞仪分析

K_d值的测定：靶标多肽包被的磁珠和FITC标记的不同浓度的适配子在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞仪检测平均荧光强度，未筛选的随机文库作为阴性对照用于非特异性的结合，适配子和靶标结合的平均荧光强度减去随机文库非特异性结合的平均荧光强度，根据公式Y＝B max X/(Kd+X)(Y：平均荧光强度，X：所用的aptamer的浓度，B是一个常数，max是最大值的意思)计算适配子和靶标结合的K_d值。

荧光光谱分析阿霉素嵌入到适配子中

适配子预先于95℃孵育5min，冰浴10min，取不同量的适配子和3nm阿霉素混匀，适配子和阿霉素的摩尔比例依次为：0.001、0.003、0.005、0.01、0.03、0.1和1。在黑色96孔板中静置1h，测量阿霉素的荧光光谱值。Dox的激发光谱为480nm。发射光谱为520-700nm。

细胞摄入实验

共聚焦显微镜检测：制备A549和HepG2的细胞爬片，1.5uM dox和适配子-dox(适配子和阿霉素的复合体)分别和两种细胞于37℃反应2h，用PBS洗两遍，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3遍，封片，荧光共聚焦显微镜检测。

流式细胞仪检测：刮取A549和HepG细胞，PBS洗两遍，1.5uM dox和适配子-dox分别和两种细胞于37℃反应4h，PBS洗两遍，流式仪检测。

细胞增殖实验

3uM适配子、dox和适配子-dox分别和A549和HepG2细胞于37℃孵育4h，PBS洗两遍，MTS法检测细胞的增殖。

二、结果

1、适配子的筛选和特点

1)MUC1蛋白的细胞外肽骨架由空间结构稳定一致的可变数目的重复序列组成，基本的重复序列含有20个氨基酸(TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS(SEQ ID NO：8)。其中，肽段APDTRPAPG(SEQ ID NO：1)是重复序列中暴露在外的最具有免疫原性的部分，在以往的研究中，被作为靶标用于MUC1的适配子的筛选(Ferreira CSM，Matthews CS，Missailidis S(2006)DNA Aptamers ThatBind to MUC1 Tumour Marker：Design and Characterization ofMUC1-Binding Single-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27：289-301.)。在本研究中，也选了这段多肽作为靶标来筛选MUC1蛋白的适配子。在筛选过程中，将多肽在EDC的作用下共价连接到UF磁珠(天津倍思乐色谱技术开发中心，目录号：3392)表面，任何与荧光标记的ssDNA文库孵育，每轮筛选后，用流式细胞分析仪检测筛选文库的富集情况。4轮筛选后，和随机文库相比，所筛文库和靶标多肽结合的荧光强度有了显著的提高(图1)，说明所筛文库中富集到了一些和靶标多肽结合的适配子。将所筛文库的DNA进行克隆，测序，进一步检测每个克隆和多肽的结合情况，从50个克隆中筛选出了一个和多肽结合最强的适配子(MA3)，其DNA一级序列为5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3’(SEQ ID NO：9)。另外，本发明还研究了上述序列的变体的MUC1蛋白的特异性结合能力，所述变体通过在上述序列的两端或一段添加部分核苷酸或者改变所述序列中的部分核苷酸而获得，所述变体保持或基本保持与SEQ ID NO：9相同的二级结构，从而保持了其与MUC1蛋白特异性结合的能力。上述核苷酸序列二级结构的预测方法是本领域技术人员所熟知的，另外本发明的上述内容中也具体公开了适配子与MUC1蛋白特异性结合的方法，本领域技术人员可以据此容易地获得这样的变体。这样的变体的例子如下述序列：

5′-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’(SEQ ID NO：10)，和

5’-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’(SEQ ID NO：11)，它们与MUC1蛋白的结合能力也较强(数据略)。

2)特异性是评价适配子的一个重要指标，为了验证筛选出来的适配子是否具备一定的靶标特异性，检测了其与其他蛋白的结合情况。因为白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白，因此检测了适配子与牛血清白蛋白(BSA)的结合。BSA共价连接到UF磁珠表面，和标记有FITC的适配子反应，流式细胞仪检测结合情况。随机库DNA(合成的随机模板链)作为随机对照。流式结果显示，MA3和BSA反应后的荧光强度和随机对照一致(图2b)，而MA3和靶标多肽反应后的荧光强度显著高于随机对照(图2a)，说明MA3和BSA有很弱的交叉反应。同时也用相同的方法将MA3和S2.2在这一方面做了比较，S2.2是文献报道的MUC1核酸适配子中亲和力最高的一个(Ferreira CSM，MatthewsCS，Missailidis S(2006)DNA Aptamers That Bind to MUC1 TumourMarker：Design and Characterization of MUC1-Binding Single-StrandedDNA Aptamers.Tumor Biol 27：289-301.Ferreira CS，Cheung MC，Missailidis S，Bisland S，Gariepy J(2009)Phototoxic aptamers selectivelyenter and kill epithelial cancer cells.Nucleic Acids Res 37：866-876.)。结果显示，S2.2在结合靶标多肽的同时，也和BSA具有一定的结合(图2c和图2d)，说明MA3和BSA的交叉反应弱于S2.2。

3)MA3显示了比较好的靶标特异性，然后用流式细胞仪测定了它和靶标多肽结合的亲和力。不同浓度的FITC标记的MA3和靶标多肽包被的磁珠孵育，流式细胞仪检测平均荧光强度，用非线性回归分析测得MA3和靶标多肽的K_d值为38.3±0.6nM(图3a)。

4)为了进一步验证适配子和MUC1结构结合的可能性，合成了含有整个基本重复序列序列的由29个氨基酸组成的多肽(GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP(SEQ ID NO：2))。将多肽连接到磁珠表面，和标记有FITC的适配子反应，随机库DNA作为随机对照，流式结果显示适配子和29肽反应后的荧光强度仍然显著高于随机对照(图3b)，这表明以9肽为靶标所筛选到的适配子和含有整个基本重复序列的多肽也有较高的结合。因为MUC1蛋白的细胞外结构由不同数目的基本重复序列组成，因此所筛的适配子和MUC1阳性细胞表面的MUC1结构的结合可能性较大。

5)为了评估MA3能否和表达MUC1的肿瘤细胞结合，选取高表达MUC1的肿瘤细胞系MCF7和A549以及不表达MUC1的肿瘤细胞系HepG2和正常肝上皮细胞系L02，分别和标记有FITC的MA3孵育，流式细胞仪检测细胞荧光强度的变化。随机库DNA作为随机对照。结果显示，MA3和MCF7、A549细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照(图4a和图4b)，而和HepG2、L02细胞反应后的荧光强度和随机对照一致(图4c图4d)。上述实验结果表明MA3和MUC1阳性的肿瘤细胞结合强，和MUC1阴性细胞结合弱，MA3能够识别表达MUC1蛋白的肿瘤细胞表面的MUC1结构。

2、阿霉素(dox)是很重要的一种治疗肿瘤的化疗药物，为了验证筛选出来的适配子能够选择性的携带药物到达肿瘤细胞，我们制备了不同配比浓度的适配子-dox复合体(Bagalkot V，Farokhzad OC，Langer R，Jon S(2006)An aptamer-doxorubicin physical conjugate as anovel targeted drug-delivery platform.Angew Chem Int Ed Engl 45：8149-8152.)，荧光光谱分析表明阿霉素嵌入到适配子中(图5)。单纯的dox是通过细胞膜的被动扩散进入细胞内，不能区分肿瘤细胞和正常细胞，毒副作用比较大。由于适配子能够和表达MUC1阳性的肿瘤细胞特异性结合，适配子-dox载药复合体应该也有可能被表达MUC1的肿瘤细胞特异性的摄取。为了验证上述假设，通过共聚焦显微镜检测了适配子-dox在MUC1阳性和阴性肿瘤细胞中的摄入。设立Dox和适配子-dox组，分别和MUC1阳性的A549以及MUC1阴性的HepG2细胞孵育，共聚焦显微镜观察细胞内dox的含量。结果显示，游离dox在两种细胞内都有强的荧光，含量都很高，对两种细胞的摄入没有选择性(图6a和图6b)。与此相反，适配子-dox组中，A549细胞中荧光强度明显强于HepG2细胞(图6c和图6d)。这表明适配子-dox在HepG2细胞中的摄入明显低于游离dox。上述实验结果表明，适配子-dox在MUC1阳性的肿瘤细胞中的摄入多，在MUC1阴性的肿瘤细胞中的摄入少，适配子-dox能够被MUC1阳性的肿瘤细胞选择性地摄取。

为了更进一步证明适配子-Dox是否被MUC1阳性的肿瘤细胞选择性地摄取，将游离Dox和适配子-dox复合体分别和A549、HepG2孵育，用流式细胞仪检测其荧光强度的变化，流式结果显示：对于MUC1阳性细胞A549，游离Dox组和适配子-dox复合体组的荧光强度一致，没有变化(图6e)。而对于MUC1阴性细胞HepG2，适配子-dox组的荧光强度明显低于游离Dox(图6f)。上述实验再次说明了适配子-dox在MUC1阳性的肿瘤细胞中的摄入多，在MUC1阴性细胞中的摄入少，能够被MUC1阳性的肿瘤细胞选择性地摄取。总的来说，共聚焦显微镜试验和流式细胞仪试验说明MA3可以作为一个载体工具靶向性地携带Dox到MUC1阳性的肿瘤细胞。

4)因为适配子-Dox被MUC1阴性细胞选择性的摄取减弱，因此有可能造成对MUC1阴性细胞的毒性作用减弱。为了验证上述假设，设立适配子组、Dox组和适配子-dox组，分别与A549细胞、HepG2细胞孵育，MTS法检测细胞的增殖情况。对于MUC1阴性的HepG2细胞，dox组细胞的存活率为68.71％，而适配子-dox组细胞存活率为83.28％，显示适配子-dox对HepG2细胞的杀伤显著低于游离Dox(p＜0.01)(图7)。然而，对于MUC1阳性的A549细胞，Dox组中细胞的存活率为78.09％，适配子-dox组中的存活率为72.68％，显示适配子-dox对MUC1阳性的A549细胞的杀伤作用和游离的dox没有显著差别(图8)。上述实验结果表明适配子-dox能够减弱Dox对MUC1阴性细胞的毒性，而对MUC1阳性细胞的杀伤作用没有变化。另外，单纯适配子组中，A549细胞和HepG2细胞的存活率都接近100％，显示适配子对两种细胞没有毒性。

申请人也做了MA3和其他主要类型的化疗药物结合形成复合体及验证该复合体生物活性的实验，其实验流程与上述实施例1中的流程相似，结果表明主要的化疗药物类型，如抗代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼均可以有效地与本发明的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子结合成为复合体，实现靶向抗肿瘤的效果。

虽然本发明在上述具体实施方案中示例性地列出了实施本发明的优选技术方案，本领域技术人员公知，本领域技术人员可以在不背离本发明的精神的情况下，对本发明做出大量的修改、修饰。这样的修改和修饰也落在本发明的范围之内。例如，本发明的适配子可以和非化疗药物类型的物质结合形成复合体，并进而用于特定展示或成像MUC1蛋白阳性的肿瘤细胞及其定位、代谢。本发明的适配子在与化疗药物或非化疗药物组合使用时，既可以处于结合的状态，也可以处于简单混合(非结合)的状态。同时，本领域技术人员公知，虽然本发明仅列出了MUC1蛋白特异性核酸适配子的具体序列，但该序列的部分碱基可以被去除、替换或者额外的部分碱基(如1-10个，加于一端或两端)被加到该序列而仍然保持其与MUC1蛋白的特异性结合能力，这样的序列也包括在本发明的范围之内。同时，本发明的适配子和/或适配子-化疗药物复合体可以与其他的适配子和/或适配子-化疗药物联合使用，从而达到同时治疗多种肿瘤的目的。

Claims (18)

1.一种MUC1蛋白特异性结合核酸适配子，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:9所示。

2.一种复合体，其特征在于，由如权利要求1所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物结合而成或被共同包在纳米粒中，MUC1蛋白特异性结合核酸适配子的序列如SEQ ID NO:9，且其中MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.001～1。

3.根据权利要求2所述的复合体，其特征在于，所述MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物的摩尔比例的范围为0.005～0.03。

4.根据权利要求2所述的复合体，其特征在于，所述化疗药物选自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌。

5.一种组合物，其特征在于，其活性成分为根据权利要求2、3或4所述的复合体。

6.根据权利要求1所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子在制备化疗药物靶向载体中的运用，其特征在于，所述化疗药物选自抗代谢类药物、抗癌抗生素类药物、植物碱类、抗肿瘤激素类、杂类或抗肿瘤小分子靶向药物。

7.根据权利要求6所述的运用，其特征在于，所述抗代谢类药物选自甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨或雷替曲塞，所述抗癌抗生素类药物选自丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星或吡柔比星，所述植物碱类选自长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱，所述抗肿瘤激素类选自他莫昔芬、来曲唑或强的松，所述杂类选自顺铂、卡铂或米妥蒽醌，所述抗肿瘤小分子靶向药物选自如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

8.根据权利要求6所述的运用，其特征在于，所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

9.根据权利要求6、7或8所述的运用，其特征在于，所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和化疗药物组成复合体或者被共同包在纳米粒中。

10.根据权利要求2、3或4所述的复合体或根据权利要求5所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述肿瘤为腺癌。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述腺癌选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌。

12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述腺癌选自肺癌、乳腺癌、结肠腺癌或肝癌。

13.根据权利要求10、11或12所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物的剂型为口服剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。

14.一种根据权利要求1所述的MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂的组合物，其特征在于，所述MUC1蛋白特异性结合核酸适配子和肿瘤显影剂形成复合体。

15.根据权利要求14所述组合物，其特征在于，所述显影剂是铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒。

16.一种根据权利要求14或15所述的组合物在制备肿瘤靶向造影剂中的用途，其特征在于，所述肿瘤为腺癌。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述腺癌选自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌或食道腺癌。

18.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述腺癌选自肺癌、乳腺癌、结肠腺癌或肝癌。