CN116751785A - 特异性结合Trop2的核酸适配体、其筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合Trop2的核酸适配体、其筛选方法及应用。所述核酸适配体是通过工程化细胞SELEX筛选法进行多轮筛选获得多条Trop2的核酸适配体候选序列。所述核酸适配体具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任意一者所示的核苷酸序列。本发明筛选的核酸适配体能和Trop2特异、稳定的结合，在Trop2相关的肿瘤诊断和治疗等方面具有广阔的应用前景；同时本发明提供的Trop2核酸适配体可以与DM1偶联，从而实现对肿瘤的有效杀伤，并减轻其副作用，为针对Trop2精准治疗提供了新的方案和思路。

Description

特异性结合Trop2的核酸适配体、其筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，具体涉及一种特异性结合Trop2的核酸适配体、其筛选方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
Trop2是近年来发现的肿瘤相关基因，可调控肿瘤细胞的信号转导和增殖。Trop2在如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌以及卵巢癌在内的各种上皮恶性肿瘤中都有表达。Trop2的过表达在肿瘤生长中起着关键作用，并且已经证实与癌症中更广泛的侵袭性疾病和疾病的不良预后相关。近年来，在Trop2的精准治疗方面，抗癌药物的靶向已经取得很好的进展，例如单克隆抗体和ADC，其中ADC的研究成果尤为丰硕。FDA批准的ADC主要是基于新的高毒性化疗药物以及改进的抗体与药物连接子的发现。例如，FDA已批准Trop2人源化单抗(hRS7)与拓扑异构酶I抑制剂伊立替康的活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38)结合。除此之外，现在也有多种Trop2的ADC药物正在进行临床试验，比如，抗Trop2的人源化IgG1单克隆抗体与拓扑异构酶I抑制剂DXd的偶联药等。
适配体能够作为新的靶向剂出现，因其具有许多优势，例如较高的亲和力，约为皮摩尔至纳摩尔范围内；分子量低，可以更容易进入肿瘤细胞和组织，进而更有效地靶向治疗；并且化学合成和修饰非常简单，可以更快更易于获得更多的适配体。此外，适配体的致病性和免疫原性已被证明是很低的，这对于其实际应用至关重要，为肿瘤治疗带来更多的机会和选择。这就要求研究人员需要进一步改良和发展适配体的筛选技术，以提高适配体的结合亲和力，并且探索其作为靶向配体材料的应用潜力。
常规的适配体是通过SELEX方法从随机寡核苷酸文库产生。对于已知的肿瘤细胞膜标志蛋白，大多数适配体是使用纯化的蛋白质筛选获得的。然而，由于纯化蛋白质的分子结构和存在形式与它们在细胞膜上的天然状态不同，得到的适配体不一定与靶标细胞中的自然空间结构的膜蛋白质相互作用。因此，适配体常常缺乏用于靶向目的的基本的结合亲和力和特异性。基于此，为了获得与肿瘤细胞上的Trop2膜蛋白特异结合的DNA适配体，采用改进的细胞-SELEX的方法具有明显优势。筛选的主要策略是将Trop2蛋白转染后高表达的细胞作为阳性筛选对象，而将没有被转染的CHO-K1作为阴性筛选对象。所分离的适配体能够与天然构象的细胞膜蛋白特异性结合，从而通过适配体与Trop2膜蛋白的相互作用识别整个细胞。
DM1是一种作用机理清楚、抑制微管解聚的天然生物碱，能防止细胞有丝分裂期间纺锤体的形成，并且具有抑制肿瘤细胞生长的能力。由于有限的治疗给药窗口和缺乏选择性而产生的毒副作用，例如神经毒性和胃肠道副作用等问题，不鼓励在临床治疗中直接使用DM1。然而，DM1的高细胞毒性满足ADC药物的要求，这使得DM1及其衍生物在ADC开发中被广泛使用。例如，Kadcyla(曲妥珠单抗-美登素偶联体，Trastuzumab Emtansine，T-DM1)是第一个以DM1衍生物为基础的ADC，于2013年在临床上已被FDA认定为治疗HER-2阳性晚期或转移性乳腺癌患者的肿瘤靶向药物。因此，构建并评估新型的靶向Trop2的适配体与药物偶联体的肿瘤杀伤效力很有必要，尤其是将小分子药物美登素衍生物DM1化学连接到筛选获得的适配体上。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种特异性结合Trop2的核酸适配体、其筛选方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种特异性结合Trop2的核酸适配体，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3中任意一者所示的核苷酸序列。
本发明实施例还提供了一种核酸适配体的筛选方法，其包括：利用cell-SELEX技术，以慢病毒转染稳定表达Trop2的CHO-K1为靶细胞，以正常细胞CHO-K1为对照细胞，进行Trop2核酸适配体筛选，从而获得前述的特异性结合Trop2的核酸适配体。
本发明实施例还提供了前述的特异性结合Trop2的核酸适配体在制备能够特异性识别和结合靶蛋白Trop2的产品中的应用。
本发明实施例还提供了前述的特异性结合Trop2的核酸适配体在制备肿瘤检测试剂或预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括前述的特异性结合Trop2的核酸适配体。
本发明实施例还提供了一种核酸适配体与化学小分子药物的偶联体，其包括前述的特异性结合Trop2的核酸适配体、连接子和化学小分子药物，所述核酸适配体通过连接子与化学小分子药物偶联。
本发明实施例还提供了一种核酸适配体与化学小分子药物的偶联体的制备方法，其包括：将前述的特异性结合Trop2的核酸适配体经连接子与化学小分子药物偶联。
本发明实施例还提供了一种抗体偶联药物，其包括前述的核酸适配体与化学小分子药物的偶联体。
与现有技术相比，本发明以上所提供的技术方案的优点至少包括：
(1)本发明通过细胞-SELEX技术筛选得到的核酸适配体，与传统以纯化蛋白或人工合成蛋白为靶点相比，具有亲和力高、特异性强，能更好的与天然状态下的表达Trop2的细胞进行结合；
(2)本发明筛选出的一种Trop2核酸适配体能够高效特异的结合靶蛋白Trop2，具有明显的亲和力，这对于癌症的早期诊断和治疗等方面应用提供了一种有效的工具和手段；
(3)本发明将筛选出的Trop2适配体与DM1这一高细胞毒性药物偶联，首次构建了基于Trop2这一靶点的适配体与药物偶联的设计，并实现对肿瘤杀伤的有效性及较轻的副作用，本发明为针对Trop2精准治疗提供了新的方案和思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅作为本文发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1a-图1b是本发明一典型实施方式中工程化高表达Trop2稳转细胞系的验证图；
图2是本发明一典型实施方式中利用细胞-SELEX方法筛选Trop2的核酸适配体的示意图；
图3是本发明一典型实施方式中利用Mfold软件模拟的适配体Apt14，Apt20s和Apt20s2的二级结构示意图；
图4是本发明一典型实施方式中偶联体的设计模式图；
图5a-图5c是本发明实施例1中各核酸适配体与Trop2细胞或CHO-K1细胞结合的流式分析图；
图6是本发明实施例2中核酸适配体Apt14与Trop2细胞的解离常数曲线拟合图；
图7是本发明实施例2中核酸适配体Apt20s与Trop2细胞的解离常数曲线拟合图；
图8是本发明实施例2中核酸适配体Apt20s2与Trop2细胞的解离常数曲线拟合图；
图9是本发明实施例2中核酸适配体Apt20s2与Trop2细胞的荧光共聚焦显微图；
图10a-图10e是本发明实施例3中核酸适配体FAM-Apt14、FAM-Apt20s和FAM-Apt20s2与各种癌细胞系的结合情况图；
图11是本发明实施例3中核酸适配体Apt20s2与肠癌细胞HT29和正常肠上皮细胞HIEC的荧光显微图；
图12a-图12b是本发明实施例4中核酸适配体-药物偶联体对肠癌细胞HT29和正常肠上皮细胞HIEC的毒性作用图；
图13a-图13b是本发明实施例5中核酸适配体及与DM1偶联在10％胎牛血清(FBS)中或小鼠血清中的稳定性图；
图14a-图14c是本发明实施例6中PBS、适配体、DM1-SMCC、C51-DM1和Apt-DM1组疗效，包括治疗后各组肿瘤照片、治疗前后各组肿瘤体积以及治疗后各组肿瘤重量统计；
图15是本发明实施例6中PBS、Aptamer、DM1-SMCC、C51-DM1和Apt-DM1组小鼠肝组织切片H&E染色图；
图16是本发明实施例6中PBS、Aptamer、DM1-SMCC、C51-DM1和Apt-DM1组的小鼠心、脾、肺和肾等器官的H&E染色图；
图17是本发明实施例6中PBS、Aptamer、DM1-SMCC、C51-DM1和Apt-DM1组给药前后的体重变化统计图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出了本发明的技术方案，采用改良的cell-SELEX方法获得Trop2候选适配体。本发明构建了过表达Trop2的CHO-K1细胞作为靶细胞，CHO-K1细胞作为cell-SELEX的对照细胞。这种基于工程化细胞系的cell-SELEX方法有其独特的优点，比如分离的适配体可以特异性地结合具有天然构象的细胞表面蛋白质，可以更准确地反映其生物信息；而且适配体可以直接和膜蛋白相互作用以识别整个细胞。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供的一种特异性结合Trop2的核酸适配体具有SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3中任意一者所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸适配体具有SEQ ID No.3中任意一者所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，二级结构预测显示，所述核酸适配体具有稳定的茎环状或发卡状结构。
在一些实施方案中，所述核酸适配体能够特异性识别并稳定结合靶蛋白Trop2。
进一步地，所述核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸适配体的筛选方法，其主要是利用cell-SELEX技术，以慢病毒转染稳定表达Trop2的CHO-K1为靶细胞，以正常细胞CHO-K1为对照细胞，进行Trop2核酸适配体筛选。
进一步地，所述核酸适配体是通过工程化细胞SELEX筛选法进行多轮筛选获得多条Trop2的核酸适配体候选序列，选择测序结果出现频次较高的适配体，用流式细胞术测定了全长序列和截短序列与Trop2细胞的结合情况。
在一些实施方案中，所述核酸适配体的筛选方法包括：
1)利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染，获得Trop2稳定表达的Trop2细胞系，用于靶细胞的正筛选；
2)选取未进行转染的CHO-K1细胞系作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；
3)利用cell-SELEX技术进行Trop2核酸适配体的筛选，获得前述特异性结合Trop2的核酸适配体。
在本发明的一个具体实施方案中，可以通过改良的核酸适配体筛选(cell-SELEX)方法分离出所述特异性结合Trop2的核酸适配体序列。请参阅图1a-图1b、图2所示，该筛选方法可以包括以下步骤：
(1)利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染，获得Trop2稳定表达的Trop2细胞系，并用Trop2抗体对稳定表达Trop2的CHO-K1细胞系进行表达情况验证。
(2)将单链DNA文库(第一轮为10nmol m-lib，随后几轮逐渐减少至0.2nmol)在95℃下变性5min，然后缓慢冷却至室温(RT)。
(3)然后将结合缓冲液中的单链DNA文库转移到含有90％Trop2细胞的培养皿中(100×20mm培养皿用于第1-6轮，60×15mm培养皿用于第7-15轮)，并在4℃下孵育60min(随后各轮逐渐减少至30min)使潜在的序列与靶细胞结合。
(4)使用洗涤缓冲液洗涤3次以去除未结合的DNA，并使用1mL Milli-Q水从培养皿中刮去细胞。在95℃下加热10min后，悬浮液在14,000rpm下离心10min，以将序列从细胞中分离并收集到离心管。
(5)然后使用生物素修饰的反向引物biotin-P2对收集的文库进行PCR扩增(8-16个循环，94℃30s，48℃30s，72℃20s，72℃5min)。
(6)PCR产物首先加入空的微型亲和色谱柱(Bio-rad，美国)中与链霉亲和素琼脂糖珠(150μL)孵育10min，重复3次。为了消除未结合的DNA，用800μL PBS洗涤柱3次。加入0.1M NaOH溶液变性2min后，从链霉亲和素琼脂糖珠中获得所需的单链DNA。单链DNA溶液用1.5M盐酸溶液将pH值调为6.5-7.5，之后用乙醇沉淀纯化。
(7)从第3轮筛选开始，进行反向筛选以去除非特异性结合序列。具体操作为收集的ssDNA文库在4℃下与阴性对照CHO-K1细胞(第3-10轮为60×15mm培养皿，第11-15轮为100×20mm培养皿)孵育30min(时间随轮数逐渐增加到60min)，收集与CHO-K1不结合的序列，并与Trop2细胞孵育。
(8)对最终得到的富集的单链DNA文库进行PCR扩增，之后进行高通量测序，并分析序列的二级结构，优化序列，获得优化的特异性结合Trop2的核酸适配体，结果如图3所示。
进一步的，该具体实施方案筛选得到的Trop2的核酸适配体的序列为：
5’-ATACCAGCTTATTCAATTACTAGATGTGAGTTTAGATTTTGAGATGATTAGTTTAGCAGATAGTAAGTGCAATCT-3’(SEQ ID No.1)；
5’-ACCAGCTTATTCAATTGACGCTCCACCGGGGACTGGGCCGGATGCTGGATCATTACAGATAGTAAGTGC-3’(SEQ ID No.2)；
通过软件Mfold预测的二级结构，对前述核酸适配体的序列进行优化，可以分别得到序列缩短的特异性结合Trop2的核酸适配体，具体为：
5’-ATCCAGCTTATTCAATTGACGCTCCACCGGGGACTGGGCCGGATGCTGGAT-3’(SEQ IDNo.3)。
进一步地，本次筛选的核酸适配体能和Trop2特异、稳定的结合，在Trop2相关的肿瘤诊断和治疗等方面具有广阔的应用前景。
(9)将5’端氨基修饰的适配体Apt20s2(NH2-Apt20s2)和DM1-SMCC偶联，制备适配体-药物偶联体(Apt-DM1)或对照DNA序列(5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’)与药物的偶联体(C51-DM1)。将100nmol NH2-Apt20s2溶于1mL PB缓冲液(pH 8.0)中，5mmol DM1-SMCC溶于1mL DMSO中；混合溶液，并在37℃振荡器中以150rpm孵育过夜。然后，使用Amicon Ultra 0.5mL 10kDa离心超滤管将混合液离心洗涤3次，以完全除去游离的DM1-SMCC，同时将核酸适配体与药物偶联体的截留液收集在超滤管中，将截留液原液用PB缓冲液稀释。图4显示了核酸适配体与药物偶联体的设计。将氨基修饰的适配体化学连接至治疗性中间体DM1-SMCC，理论上，一分子适配体可连接至一分子DM1-SMCC，以此将核酸适配体偶联到DM1上。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的特异性结合Trop2的核酸适配体在制备能够特异性识别和结合靶蛋白Trop2的产品中的应用。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的特异性结合Trop2的核酸适配体在制备肿瘤检测试剂或预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，上述的核酸适配体能够用于Trop2的识别以及应用于肿瘤诊断与治疗中。
进一步地，所述肿瘤包括胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌或乳腺癌。
进一步地，所述肿瘤治疗药物的成分包括美登素衍生物DM1或DM1-SMCC。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种试剂盒，其包括前述的特异性结合Trop2的核酸适配体。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸适配体与化学小分子药物的偶联体，其包括前述的特异性结合Trop2的核酸适配体、连接子和化学小分子药物，所述核酸适配体通过连接子与化学小分子药物偶联。
在一些实施方案中，所述化学小分子药物包括美登素衍生物，且不限于此。
进一步地，所述化学小分子药物为DM1。
在一些实施方案中，所述连接子可以是连接子SMCC，同时本发明中的连接子可以采用本领域习用的多种类型的连接子，例如可裂解连接子和不可裂解连接子，其中，可裂解连接子又包括化学裂解连接子和酶催化裂解连接子两种；不可裂解连接子包括硫醚键连接子、马来酰亚胺键连接子等，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸适配体与化学小分子药物的偶联体的制备方法，其包括：将前述的特异性结合Trop2的核酸适配体经连接子与化学小分子药物偶联。
具体的，所述核酸适配体与化学小分子药物的偶联体的制备方法包括：
采用连接子琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(SMCC)与N2′-脱乙酰-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)进行连接，获得DM1-SMCC；
对前述的特异性结合Trop2的核酸适配体进行氨基修饰，获得氨基修饰的核酸适配体；
以及，使所述DM1-SMCC与氨基修饰的核酸适配体发生反应，获得DM1与Trop2核酸适配体的偶联体。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种抗体偶联药物，其包括前述的核酸适配体与化学小分子药物的偶联体。
进一步地，所述抗体偶联药物为用于预防和/或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤包括胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌或乳腺癌。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。以下实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的生物化学、分子生物学、分析化学及相关领域的常规技术。
实施例1
采用如下方法对特异性结合Trop2的核酸适配体的全长序列(序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.3所示，定义为适配体Apt14、Apt20s)及其截短适配体(序列如SEQ IDNo.3所示，定义为适配体Apt20s2)与Trop2细胞系的结合情况进行测试，具体步骤如下：
为了评估抗Trop2适配体的结合能力，将500nM FAM修饰的DNA加入靶细胞中，每管1×105个细胞。在4℃下将靶细胞于200μL结合缓冲液中孵育45min。孵育完成后，加入700μL洗涤缓冲液，离心去除上清液，重复洗涤3次，以去除未结合的DNA。使用C6流式细胞仪收集每个样品的荧光信号。结果如图5a-图5b所示，FAM修饰的Apt14和Apt20s与Trop2细胞有较好的结合，与CHO-K1细胞不结合，以原始文库m-lib为对照；如图5c所示，可以看出截短适配体Apt20s2相比于适配体Apt20s来说，与Trop2细胞的结合能力未有明显损失，表明Apt20s截短成功。
实施例2
本发明的特异性结合Trop2的核酸适配体(序列如SEQ ID No.1-3所示，定义为适配体Apt14、Apt20s或Apt20s2)的亲和力进行测试。具体步骤如下：
为了测定解离常数，在结合缓冲液环境下，用不同浓度(0、5、10、25、50、100、200、300、400和500nM)的FAM修饰的适配体于4℃条件下孵育Trop2细胞(1×105个/管)。洗涤3次后，进行流式荧光收集。使用以下公式计算平衡解离常数(Kd)：F-F0＝Bmax×X/(Kd+X)(F：与FAM修饰的适配体结合的细胞的荧光强度；F0：与FAM修饰原始文库结合细胞的荧光强度；X：适配体浓度)。使用GraphPad Prism 5软件模拟亲和力实验的解离常数(Kd)，结果如图6-图8所示，获得的适配体Apt14、Apt20s、Apt20s2的解离常数分别为35.92±13.02nM、107.5±50.53nM和67.55±19.89nM。较为优选地，本案发明人使用共聚焦显微镜对FAM标记的Apt20s2进行了结合表征，结果如图9所示，Apt20s2对Trop2细胞有特异性结合作用。
实施例3
使用流式细胞术对不同的细胞系测试特异性结合Trop2的核酸适配体Apt14、Apt20s和Apt20s2的特异性。结果如图10a-图10e所示，所有适配体与癌细胞HT29、MCF7和OVCR3有不同程度的结合，与Trop2阴性的细胞A549和293T没有明显结合，表明它们对Trop2阳性细胞具有靶向结合亲和力和特异性。本案发明人使用荧光显微镜对FAM标记的Apt20s2与HT29细胞进行了结合表征，结果如图11所示，Apt20s2对肠癌细胞HT29有特异性识别作用，以人正常肠上皮细胞HIEC为对照。
实施例4
使用CCK-8试剂进行细胞毒性试验，评价偶联体是否将DM1-SMCC选择性递送至HT29细胞，具体步骤如下：
将细胞(6×103个/孔)铺在96孔板中并培养12h，然后加入不同剂量的DM1-SMCC、C51-DM1或是偶联体Apt-DM1处理HT29或HIEC细胞。孵育72h后，更换培养基，采用CCK-8法，利用酶标仪在450nm下测定每个孔细胞的吸收。如图12a，图12b所示，HT29和HIEC细胞50％抑制(IC50值)所需的游离DM1-SMCC浓度分别为46.31nM和100nM，表明游离DM1-SMCC对HT29具有致死性，对HIEC细胞也具有相当强的细胞毒性。结果显示，适配体-DM1偶联体对HT29具有更强的细胞毒性(IC50＝13.55nM)；100nM浓度下游离药物对HIEC为致死率约为50％，和适配体偶联后，由于偶联体不能识别HIEC，HIEC存活率上升至80％左右，表明偶联体对HIEC的细胞毒性显著降低。这些结果证明了Trop2的适配体具有选择性递送细胞毒性药物用于靶向治疗的潜力。
实施例5
为了验证适配体与DM1-SMCC偶联体在生理状态下的稳定性，探索了样品在10％胎牛血清和小鼠新鲜血清中的稳定性，具体步骤如下：
取15μM适配体或15μM适配体与DM1-SMCC形成的偶联体，置于10％FBS或小鼠血清样品中0h、1h、6h、9h、12h、24h、48h，每个样10μL。制备4％琼脂糖凝胶，上样缓冲液中提前加入SYBR GREEN I染料，点样，于1×TBE缓冲液中，130V电压下进行45min的电泳，并用凝胶成像系统拍照。图13a，图13b结果显示，偶联体的稳定性相对于纯适配体序列均有提高。这可以解释为由于药物连接在适配体5’末端时，可以在一定程度上有效地保护适配体不被核酸酶降解。
实施例6
使用HT29异种移植裸鼠模型来评估偶联体的抗癌效果，具体步骤如下：
所有动物操作均按照苏州纳米技术与纳米仿生研究所实验动物护理与使用指南进行，并经苏州纳米技术与纳米仿生研究所动物实验伦理委员会批准。将1×106个HT29细胞注入裸鼠体内，建立了HT29异种移植荷瘤实验模型。在瘤体积增大至50mm3左右时，将其分为5组：PBS、适配体、DM1-SMCC、C51-DM1和Apt-DM1组。在同样的情况下，给予相应的药物治疗。100μL的PBS在第一组小鼠的尾静脉内注入，而第二组小鼠注射100μL溶于PBS的无标记适配体(Apt20s2，37.5μM)。第三组小鼠静脉注射100μL DM1-SMCC(0.2mg/kg)，第四组和第五组分别接受100μL C51-DM1(0.2mg/kg)和100μL Apt-DM1(0.2mg/kg)。每两天给药一次，共给药五次。每次给药前测量肿瘤体积以监测疾病进展。按以下公式算出肿瘤体积：肿瘤体积＝(瘤体长)×(瘤体宽)2/2。每两天测量小鼠的体重。首次给药后第13天，摘眼球取血进行肝功能碱性磷酸酶ALP测试；之后处死小鼠，取肿瘤进行肉眼观察、拍照、H&E染色和免疫组化检测等。结果如图14a-图14c所示，经过11天的治疗后，Apt-DM1组的肿瘤体积明显小于PBS组，治疗效果也略优于DM1-SMCC组或C51-DM1组。Apt-DM1组小鼠的肿瘤负荷也是低于其他组。这些结果表明，适配体与DM1的偶联体可以有效地抑制HT29肿瘤的生长，*表示差异有统计学意义(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
采集治疗后的小鼠的主要脏器，固定，石蜡包埋、切片和H&E染色，如图15的染色结果所示，小鼠单独给药DM1-SMCC，即使仅为0.2mg/kg，便可对肝脏产生较为严重的损伤，而具有靶向功能的Apt-DM1组给药后，对肝脏组织的损伤程度并不显著。如表1，肝功能指标测试结果显示，虽然Apt-DM1组并非100％对肝无毒性，但相对于单药DM1-SMCC导致的肝损伤，Apt-DM1显示出了明显改善的趋势。如图16，H&E染色后，除肝脏外的主要脏器(心、脾、肺、肾)均未见明显的损伤，且如图17，每组小鼠体重没有较为明显的下降，证明Apt-DM1组在体内展现出较好的生物安全性。
表1碱性磷酸酶(ALP)测试
应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (14)

1.一种特异性结合Trop2的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3中任意一者所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的特异性结合Trop2的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合Trop2的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体能够特异性识别并稳定结合靶蛋白Trop2。
4.一种核酸适配体的筛选方法，其特征在于包括：利用cell-SELEX技术，以慢病毒转染稳定表达Trop2的CHO-K1为靶细胞，以正常细胞CHO-K1为对照细胞，进行Trop2核酸适配体筛选，从而获得权利要求1-3中任一项所述的特异性结合Trop2的核酸适配体。
5.权利要求1-3中任一项所述的特异性结合Trop2的核酸适配体在制备能够特异性识别和结合靶蛋白Trop2的产品中的应用。
6.权利要求1-3中任一项所述的特异性结合Trop2的核酸适配体在制备肿瘤检测试剂或预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌或乳腺癌。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤治疗药物的成分还包括美登素衍生物DM1或DM1-SMCC。
9.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的特异性结合Trop2的核酸适配体。
10.一种核酸适配体与化学小分子药物的偶联体，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的特异性结合Trop2的核酸适配体、连接子和化学小分子药物，所述核酸适配体通过连接子与化学小分子药物偶联。
11.根据权利要求10所述的偶联体，其特征在于：所述化学小分子药物包括美登素衍生物，优选为DM1。
12.一种核酸适配体与化学小分子药物的偶联体的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1-3中任一项所述的特异性结合Trop2的核酸适配体经连接子与化学小分子药物偶联。
13.一种抗体偶联药物，其特征在于，包括权利要求10或11所述的核酸适配体与化学小分子药物的偶联体。
14.根据权利要求13所述的抗体偶联药物，其特征在于：所述抗体偶联药物为用于预防和/或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤包括胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌或乳腺癌。
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