CN117363619A - 一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体及其筛选方法和应用 - Google Patents
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体及其筛选方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体的筛选方法及可特异性识别高转移风险胰腺癌组织细胞的新的核酸适体；所述分离方法包括：1)将肿瘤组织匀浆形成细胞群；2)将ssDNA文库与高转移风险的组织匀浆液结合；3)PCR扩增与之结合的序列；4)将扩增产物与低转移风险组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；5)将扩增产物与正常组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；经过多轮步骤1)‑5)的筛选，最终扩增及序列鉴定即得；本发明新的核酸适体具有如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明为核酸适体的筛选提供了新的方法，为胰腺癌的靶向提供了新的工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体及其筛选方法和应用。
背景技术
胰腺癌
胰腺癌是全球发病率和致死率最高的肿瘤之一。随着诊疗水平的提高，很多肿瘤的死亡率已呈现降低的趋势，但胰腺癌的死亡率依然在缓慢增加，5年生存率仅有12％，中位生存期为6个月，预计到2030年将成为致死率第二的肿瘤1。双胰腺导管腺癌(pancreaticductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺癌的主要类型，占胰腺癌的90％。胰腺癌的致病因素包括遗传因素(10％)，抽烟(20％)，肥胖，酗酒等2。现阶段对于胰腺癌的研究发现，KRAS，SMAD4，CDKN2A和TP53是驱动胰腺癌发生的4个主要基因3。
胰腺癌的转移
肝转移是胰腺癌致死的主要原因之一，研究表明80％的胰腺癌首诊病人存在肝转移，无法手术。仅1/4到1/3的转移型胰腺癌对于化疗、放疗等治疗方法有响应，且易产生耐药。20％的病人经手术后依然有80％的病人会出现肝转移。转移型胰腺癌的五年生存率仅有3％，如何提高转移型胰腺癌病人的生存率是一个十分关键的问题4。
胰腺癌的治疗
当前对于胰腺癌的治疗方式较少，主要包括手术治疗、化疗、放疗和靶向治疗。手术是唯一可治愈的机会，但手术只能针对未发生转移的胰腺癌病人，且切除后仍然有较大的概率会复发和转移。另外80％-85％的病人发现时已经处于晚期发生了转移，无法进行手术治疗，对此一般使用吉西他滨作为晚期胰腺癌患者的标准一线姑息治疗方案，然而大多数晚期胰腺癌患者并不能从此获益并且会很快死亡。胰腺癌免疫抑制性的肿瘤微环境也限制了免疫治疗的效果5。特异性靶向转移型胰腺癌是解决问题的重要方向，然而当前的靶向药针对胰腺癌作用不大，因此亟需开发新的靶向治疗方法，实现胰腺癌的有效治疗6。
核酸适体
核酸适体(Aptamer)是通过SELEX技术筛选得到的能够高度特异性、高亲和性结合靶标分子的单链寡核苷酸。其通过折叠成二级和三级结构，借助静电引力、疏水作用力、范得华力等分子间的作用力，与靶分子构象的匹配，从而特异地识别靶分子。核酸适体具有与抗体相似的分子识别功能，但与抗体相比具有更多的应用优势，例如可不依赖生物体在体外筛选，靶分子范围广(金属离子、毒素、病毒、细菌、细胞、组织等)，分子量小，低免疫原性、易固相合成与标记，化学稳定性好、可常温保存等。核酸适体在疾病标志物的发现、分子诊断、靶向治疗、分子病理等领域显示出巨大的临床应用前景7。因此需要设计一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体及其筛选方法和应用。
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发明内容
本发明提供了一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体及其筛选方法和应用。
本发明通过下述方案实现：
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，所述核酸适体包含SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3中任一项所示核苷酸序列的全部或者部分。
所述核酸适体包含序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的任一项具有至少30％同源性且高转移风险胰腺癌靶向的核苷酸序列。
所述核酸适体包含由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的任一项所示的核昔酸序列转录的RNA序列。
修饰所述核酸适体的骨架或糖环，所述修饰包括硫代、甲氧基、乙基、GalNAc修饰。
所述核酸适体包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中任一项所示核苷酸序列的截短、延长或碱基取代。
所述核酸适体包含的序列的延长是与其他核酸序列进行偶连；所述其他核酸序列包括siRNA、ASO、miRNA。
所述核酸适体包含的序列的延长或碱基取代是与放射性物质、荧光物质、药物、抗体、细菌进行偶连；所述药物包括碱基类似物，通过碱基取代或末端连接的形式偶连。
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体所包含的序列的筛选方法，该方法包括以下步骤：
1)将肿瘤组织匀浆形成细胞群；
2)将ssDNA文库与步骤1)所得的高转移风险的组织匀浆液结合；
3)PCR扩增与步骤2)结合的序列；
4)将步骤3)所得的扩增产物与低转移风险组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；
5)将扩增产物与正常组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；经过多轮步骤1)-5)的筛选，最终扩增及序列鉴定即得高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列；
组织进行匀浆形成细胞团，所述细胞团经过滤网过滤；
所述低转移风险组织为胰腺癌的低转移风险组织，所述正常组织为正常胰腺组织，所述胰腺癌的低转移风险组织和正常胰腺组织均为负筛样本。
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体的应用，所述核酸适体序列用于胰腺癌的诊断。
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体的应用，所述核酸适体序列用于胰腺癌的治疗。
本发明的有益效果为：
本发明通过多轮组织筛选的方式获得了靶向高转移风险胰腺癌的核酸适体，可以为高转移风险胰腺癌提供了新的诊断工具，有助于为病人评估胰腺癌的转移风险，设置合理的治疗方式，为高转移胰腺癌提供新的靶向工具，为胰腺癌的靶向用药提供了新的选择。
附图说明
图1为筛选流程。将肿瘤组织匀浆形成细胞群；将ssDNA文库与所得的高转移风险的组织匀浆液结合；PCR扩增与之结合的序列；所得的扩增产物与低转移风险组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；将扩增产物与正常组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；经过多轮的筛选，最终扩增及序列鉴定即得高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列。
图2为经过11轮筛选之后，每轮筛选保留率情况，具体的Elution-为负筛组洗脱后保留的核酸适体，Elution+为正筛组洗脱后保留的核酸适体，从图2中可以看出，每次筛选组织细胞表明均保留有较多的核酸适体，且随着筛选压力的增加以及筛选轮数的增加保留率有所下降，第1，3，8，11轮可以看出阳性组的保留率高于阴性组。
图3为流式实验检测第1轮、第8轮和第11轮筛选富集后的核酸适体文库与胰腺癌组织的结合情况，具体为将组织匀浆、过滤收集细胞。之后将细胞与荧光修饰的aptamer结合，通过流式监测细胞表面的荧光。1T为高转移胰腺癌组织，2T为低转移胰腺癌组织。从图3中可以看出，筛选富集后的核酸适体文库与高转移胰腺癌组织的结合更强。
图4为流式实验检测经过多轮筛选、测序之后挑选的核酸适体序列与胰腺癌组织的结合情况，具体为将组织匀浆、过滤收集细胞。之后将细胞与荧光修饰的aptamer结合，通过流式监测细胞表面的荧光。1T为高转移胰腺癌组织，2T为低转移胰腺癌组织。从图4中可以看出，多条序列与高转移胰腺癌组织都有较强结合。
图5为体内检测挑选的第25、26、58、201和340号核酸适体靶向高转移胰腺癌组织的情况。利用人高转移胰腺癌组织接种至裸鼠皮下，构建PDX模型，尾静脉注射核酸适体-荧光基团复合物，小动物成像仪检测肿瘤部位荧光强度随时间变化的情况。从图5中可以看出，其中的第201号核酸适体靶向效果最好。
图6为组织免疫荧光检测核酸适体靶向胰腺癌病人样本组织的情况。具体的，将胰腺癌石蜡组织芯片经过脱蜡、抗原修复、水化、封闭之后与带荧光的aptamer孵育，利用核酸适体-荧光基团复合物对胰腺癌病人组织染色，利用组织切片扫描仪监测荧光，并对荧光强度进行统计分析。结果显示高转移胰腺癌组织染色最强，低转移胰腺癌组织和癌旁组织染色较弱。
图7为核酸适体搭载药物的方式示意图，包括药物末端连接，碱基取代，互补配对，核酸序列连接，药物嵌入等方式。
图8为核酸适体-荧光基团复合物对高转移胰腺癌病人组织的染色情况。DAPI显示肿瘤细胞核的位置，Cy5显示核酸适体靶向肿瘤细胞情况。
图9为CCK-8检测核酸适体-药物偶联物对细胞活性的影响，具体为接种细胞至96孔板，次日加入1μM不同核酸适体药物复合物孵育24h-72h，加入CCK-8监测细胞活性。MIAPaCa-2为低转移胰腺癌细胞，Puta-8988T为高转移胰腺癌细胞，从图9中可以看出，核酸适体-药物偶联物对高转移胰腺癌细胞的抑制增殖能力更强。
图10为检测核酸适体-药物偶联物对肿瘤增殖的影响。利用人高转移胰腺癌组织构建PDX模型，尾静脉注射核酸适体-药物偶联物，每三天一次，给药6次，检测肿瘤的增殖。201组为单独核酸适体给药组，VC-MMAE组为单独化疗药物给药组，ApDC为核酸适体-药物偶联物给药组。从图10中可以看出，相比于单独核酸适体或单独化疗药物组，核酸适体-药物偶联物组对肿瘤有更明显的抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图对本发明优选的实施例进一步说明：
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，所述核酸适体包含SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3中任一项所示核苷酸序列的全部或者部分。
所述核酸适体包含序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的任一项具有至少30％同源性且高转移风险胰腺癌靶向的核苷酸序列。
所述核酸适体包含由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的任一项所示的核昔酸序列转录的RNA序列。
修饰所述核酸适体的骨架或糖环，所述修饰包括硫代、甲氧基、乙基、GalNAc修饰。
所述核酸适体包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中任一项所示核苷酸序列的截短、延长或碱基取代。
所述核酸适体包含的序列的延长是与其他核酸序列进行偶连。
所述其他核酸序列包括siRNA、ASO、miRNA。
所述核酸适体包含的序列的延长或碱基取代是与放射性物质、荧光物质、药物、抗体、细菌进行偶连；所述药物包括碱基类似物，通过碱基取代或末端连接的形式偶连。
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体所包含的序列的筛选方法，该方法包括以下步骤：
1)将肿瘤组织匀浆形成细胞群；
2)将ssDNA文库与步骤1)所得的高转移风险的组织匀浆液结合；
3)PCR扩增与步骤2)结合的序列；
4)将步骤3)所得的扩增产物与低转移风险组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；
5)将扩增产物与正常组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；经过多轮步骤1)-5)的筛选，最终扩增及序列鉴定即得高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列；
组织进行匀浆形成细胞团，所述细胞团经过滤网过滤；
所述低转移风险组织为胰腺癌的低转移风险组织，所述正常组织为正常胰腺组织，所述胰腺癌的低转移风险组织和正常胰腺组织均为负筛样本。
一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体的应用，所述核酸适体序列用于胰腺癌的诊断、治疗。所述核酸适体序列用于胰腺癌的诊断时，核酸适体序列可以与影像制剂、荧光物质、化学发光试剂、HRP、生物素等偶连；在所述核酸适体序列用于胰腺癌的治疗时，核酸适体序列可以与放化疗药物、核酸药物、抑制剂、抗体药物、纳米材料等偶连。
核酸适体(Aptamer)是从人工合成的DNA/RNA文库中通过SELEX技术筛选得到的能够高度特异性、高亲和性结合靶标分子的单链寡核苷酸。其折叠成二级和三级结构，借助静电引力、疏水作用力、范得华力等分子间的作用力，通过空间结构与靶分子构象的匹配，从而特异地识别靶分子。核酸适体具有与抗体相似的分子识别功能，但与抗体相比具有更多的应用优势，例如可不依赖生物体在体外筛选，靶分子范围广(金属离子、毒素、病毒、细菌、细胞、组织等)，分子量小，低免疫原性、易固相合成与标记，化学稳定性好、可常温保存等。核酸适体在疾病标志物的发现、分子诊断、靶向分子医药、分子病理等领域显示出巨大的临床应用前景。
本申请的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列筛选方法的应用，该方法用于高转移风险胰腺癌的诊断和靶向治疗。所述方法用于高转移风险胰腺癌的诊断是基于所述核酸适体对高转移胰腺癌的靶向性。通过基于核酸适体的IHC技术区分胰腺癌是否存在高肝转移风险，为病人评估胰腺癌的转移风险。本申请为胰腺癌提供了新的诊断工具，有助于为病人评估胰腺癌的转移风险，设置合理的治疗方式。
所述方法用于高转移风险胰腺癌的靶向治疗是为高转移胰腺癌提供新的靶向工具。所述靶向工具是将所述核酸适体与放化疗的药物进行连接，实现对高转移风险胰腺癌的靶向给药。本申请通过连接药物，可以实现高肝转移风险组的靶向给药，为胰腺癌的诊断和靶向治疗提供了新的工具和选择。
下面结合附图对本申请做进一步阐述：
从图1-4中可以看出本申请高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列的筛选过程和效果。本申请通过11轮组织筛选的方法获得靶向胰腺癌组织的库，如图1、2所示。图3为通过流式实验，证实富集后的文库对于高转移胰腺癌组织的靶向性。从图4中可以看出，通过测序后挑选序列，验证了其中一些序列对高转移胰腺癌组织有较好的结合。
图5-6具体展示了本申请高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列用于胰腺癌转移的诊断，其中，图5通过小鼠体内实验证实本申请高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列对高转移胰腺癌的靶向性。图6为通过对病人术后组织样本IHC的方法，实现高转移风险胰腺癌的诊断。
图7-10是本申请高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列用于转移型胰腺癌的靶向治疗过程和效果。其中，图7为将本申请高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列与放化疗的药物进行连接的示意图，放疗药物与核酸适体序列可以进行末端偶联、嵌入和碱基取代，核酸适体序列的延伸包括siRNA、ASO、miRNA，核酸适体序列也可以延伸后进行药物偶联。图8为胰腺癌组织水平，验证了ApDC(核酸适体与放化疗药物的连接物)的靶向性。图9为细胞水平通过CCK-8实验，验证了ApDC对胰腺癌细胞的毒性。图10为通过小鼠体内实验验证ApDC的靶向治疗效果。
本申请中，核酸适体序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3分别为：
SEQ ID NO.1：
CACGCATAACTCCGGGCGAGACGCAGCTTGGTGATTCGTTGGGGGAGCGTTATGCGTG
SEQ ID NO.2：
CACGCATAACCTAAGCCACTCGAGTGTCGACCGGTGGTGTGTTCTGGCGTTATGCGTG
SEQ ID NO.3：
CACGCATAACGAATCCAACCGGGGGGAATCGTATGTGCTCGACTCGGCGTTATGCGTG
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中任一项所示核苷酸序列的全部或者部分。
2.根据权利要求1所述的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体包含序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的任一项具有至少30％同源性且高转移风险胰腺癌靶向的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体包含由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的任一项所示的核昔酸序列转录的RNA序列。
4.根据权利要求1所述的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：修饰所述核酸适体的骨架或糖环，所述修饰包括硫代、甲氧基、乙基、GalNAc修饰。
5.根据权利要求1-4任一权利项所述的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中任一项所示核苷酸序列的截短、延长或碱基取代。
6.根据权利要求5所述的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体包含的序列的延长是与其他核酸序列进行偶连；所述其他核酸序列包括siRNA、ASO、miRNA。
7.根据权利要求5所述的一种高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体包含的序列的延长或碱基取代是与放射性物质、荧光物质、药物、抗体、细菌进行偶连；所述药物包括碱基类似物，通过碱基取代或末端连接的形式偶连。
8.一种如权利要求1-7中任一权利项所述高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体所包含的序列的筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将肿瘤组织匀浆形成细胞群；
2)将ssDNA文库与步骤1)所得的高转移风险的组织匀浆液结合；
3)PCR扩增与步骤2)结合的序列；
4)将步骤3)所得的扩增产物与低转移风险组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；
5)将扩增产物与正常组织匀浆液结合，保留并扩增不结合的序列；经过多轮步骤1)-5)的筛选，最终扩增及序列鉴定即得高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体序列；
组织进行匀浆形成细胞团，所述细胞团经过滤网过滤；
所述低转移风险组织为胰腺癌的低转移风险组织，所述正常组织为正常胰腺组织，所述胰腺癌的低转移风险组织和正常胰腺组织均为负筛样本。
9.一种如权利要求1-7任一权利项所述的高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体的应用，其特征在于：所述核酸适体序列用于胰腺癌的诊断。
10.一种如权利要求1-7任一权利项所述的高转移风险胰腺癌靶向的核酸适体的应用，其特征在于：所述核酸适体序列用于胰腺癌的治疗。
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