CN109576366A - lnc-TALC作为分子标志物在评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效和预后中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了lnc‑TALC作为分子标志物在评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效和预后中的用途。本发明利用lnc‑RNA芯片并结合临床数据和体内外实验结果，发现lnc‑TALC在耐药胶质母细胞瘤细胞中高表达，敲低后，耐药细胞对TMZ的IC50明显降低，在复发胶质母细胞瘤患者肿瘤组织中lnc‑TALC表达水平远高于原发胶质母细胞瘤患者肿瘤组织。lnc‑TALC的高表达和胶质母细胞瘤TMZ化疗耐药密切相关，表明lnc‑TALC可作为胶质母细胞瘤替莫唑胺治疗的分子标志物以评估胶质母细胞瘤患者替莫唑胺治疗的疗效。此外，本发明还提出lnc‑TALC siRNA在制备逆转胶质母细胞瘤对烷化剂替莫唑胺抗性的试剂中的用途。本发明的提出为胶质母细胞瘤的治疗以及克服胶质母细胞瘤患者的TMZ化疗耐药提供了技术手段。

Description

lnc-TALC作为分子标志物在评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效 和预后中的用途

技术领域

本发明涉及胶质母细胞瘤用TMZ治疗的分子标志物和检测胶质母细胞瘤lnc-TALC的试剂盒及其在评估TMZ化疗疗效和预后中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

胶质母细胞瘤是恶性程度最高的颅内原发肿瘤，患者复发率高，生存时间短。针对胶质母细胞瘤，目前强调最大程度手术切除、放射治疗和化学治疗等综合治疗策略，然而患者生存预后极差，中位生存期约为12-14个月。大量临床研究表明，常规病理学诊断相同的胶质母细胞瘤，对各种治疗的效果及临床预后存在显著差异。因此，年龄等传统临床预后因素的预测价值极为有限。

胶质母细胞瘤治疗重大进展是发现烷化剂替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)联合放疗有益于患者预后。虽然胶质母细胞瘤患者都需接受这种治疗方案，但只有小部分病人通过这种治疗方案获得生存收益。因为目前不能预测哪些患者可以从中受益。因此，寻找和发现胶质母细胞瘤中新的标志分子评估TMZ化疗疗效和预后，以及克服胶质母细胞瘤患者的TMZ化疗耐药是胶质母细胞瘤治疗的重要研究内容。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够用于评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效和预后的分子标志物。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测胶质母细胞瘤lnc-TALC的试剂盒及其在评估TMZ化疗疗效和预后中的应用。

本发明的目的之三在于提供lnc-TALC siRNA在制备逆转胶质母细胞瘤对烷化剂替莫唑胺抗性的试剂中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用lncRNA芯片(Agilent-74348)对TMZ耐药的胶质母细胞瘤细胞和亲代细胞lncRNA表达水平分析，结合临床数据和体内外实验结果，发现在胶质母耐药和敏感细胞中，lncRNA表达差异显著，本发明发明人选择在耐药胶质母细胞瘤细胞中上调差异最大的10个lncRNA，分别在LN229/229R、U251/251R、551W/551WR、HG7/HG7R四组细胞中提取RNA经qPCR验证。其中发现lnc-TALC在耐药细胞中高表达，在敲低后，229R和HG7R对TMZ的IC50明显降低。通过对耐药胶质母细胞瘤细胞和复发胶质母细胞瘤患者肿瘤组织检测，发现lnc-TALC的表达水平远高于亲代细胞和原发胶质母细胞瘤患者，lnc-TALC的高表达和胶质母细胞瘤TMZ化疗耐药密切相关，表明lnc-TALC可用于胶质母细胞瘤用替莫唑胺治疗的分子标志物以及评估胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效。

因此，在上述研究的基础上本发明提出了lnc-TALC作为分子标志物在制备评估胶质母细胞瘤烷化剂替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗疗效和预后试剂中的用途。以及

用于检测lnc-TALC表达水平的试剂在制备评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效和预后试剂盒中的用途。

其中，优选的，所述的试剂为引物。

其中，优选的，所述的引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还提出了一种检测lnc-TALC的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于逆转录反应的试剂以及用于检测生物样品中lnc-TALC的表达水平的PCR反应试剂。

其中，优选的，所述的生物样品为胶质母细胞瘤新鲜病理组织。

其中，优选的，所述的用于检测生物样品中lnc-TALC的表达水平的PCR反应试剂中包括引物，所述的引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

再进一步的，本发明还提出了lnc-TALC siRNA在制备逆转胶质母细胞瘤对烷化剂替莫唑胺抗性的试剂中的用途。

其中，优选的，所述的lnc-TALC siRNA由正义链和反义链组成，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了lnc-TALC作为分子标志物在制备评估胶质母细胞瘤烷化剂替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗疗效和预后试剂中的用途。还提出了lnc-TALC siRNA在制备逆转胶质母细胞瘤对烷化剂替莫唑胺抗性的试剂中的用途。本发明的提出为胶质母细胞瘤的治疗以及克服胶质母细胞瘤患者的TMZ化疗耐药提供了技术手段。

附图说明

图1为耐药胶质母细胞瘤细胞和亲代细胞TMZ IC50测定，验证胶质母细胞瘤耐药细胞系构建成功；

图2为lncRNA芯片中上调的TOP10lncRNA在耐药胶质母细胞瘤细胞和亲代细胞中的表达检测；

图3为在耐药胶质母细胞瘤细胞中敲低lncRNA，耐药细胞TMZ IC50改变；

图4为临床原发和复发胶质母细胞瘤患者肿瘤组织中lnc-TALC的mRNA表达水平；

图5为原位杂交检测初发胶质母细胞瘤患者和TMZ治疗后复发患者的肿瘤组织样本中的lnc-TALC表达量检测；

图6为临床高表达lnc-TALC和低表达lnc-TALC的胶质母细胞瘤患者TMZ治疗后的生存期；

图7为CCGA，TCGA和临床患者组织中MET和MGMT表达水平检测以及MET和MGMT相关性；

图8为免疫组化检测胶质母细胞瘤患者初发和TMZ治疗后复发的肿瘤组织样本中的c-Met表达量检测；

图9为初发和复发胶质母细胞瘤患者肿瘤组织样本中的p-Met和c-Met表达水平检测；

图10为胶质母细胞瘤患者肿瘤样本中lnc-TALC和MET表达相关性。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1耐药胶质母细胞瘤细胞TMZ的IC50明显增高

IC50是指被测量药物诱导一半肿瘤细胞死亡的浓度，IC50值可以用来衡量药物导致细胞凋亡的能力，即促凋亡能力越强，说明药物敏感性越好，也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。通过对胶质母细胞瘤细胞系LN229和U251以及原代细胞551W和HG7，利用细胞生长曲线计算替莫唑胺IC50值。分别用各细胞的1/50IC50浓度为初始浓度，15天为周期TMZ浓度加倍递增，直至5个月，成功诱导出耐药的胶质母细胞瘤细胞229R,251R,551WR和HG7R。

实验方法如下：胶质母细胞瘤细胞在96孔板中培养，至70-80％融合时采用0μM，25μM，50μM，100μM，200μM，400μM浓度的替莫唑胺处理细胞72h后加入10μl的CCK8试剂，孵育1h，于450nm的波长下测量吸光度值，绘制细胞生长曲线，计算替莫唑胺IC50值。

结果显示，与亲代胶质母细胞瘤细胞LN229、U251、551W、HG7相比，替莫唑胺对耐药胶质母细胞瘤细胞229R、251R、551WR、HG7R的抑制效率降低，IC50显示LN229为32.56±11.41，229R为684.34±42.43，U251为50.29±13.45，251R为412.53±23.47，551W为50.34±10.32，551WR为294.56±20.12，HG7为78.23±7.23，HG7R为391.45±21.35，耐药胶质母细胞瘤细胞229R、251R、551WR、HG7R的IC50值显著高于亲本细胞系LN229、U251、551W、HG7，提示耐药细胞系229R、251R、551WR、HG7R构建成功。结果见图1。

实施例2lnc-TALC的筛选、鉴定

利用lncRNA芯片对成功构建的耐药胶质母细胞瘤细胞229R和亲代细胞LN229的lncRNA水平分析，lncRNA芯片杂交和分析由上海博豪生物公司提供技术支持。芯片结果显示，在耐药胶质母细胞瘤细胞和亲代细胞中，lncRNA表达水平差异显著，发明人选择在耐药胶质母细胞瘤细胞中上调差异最大的10个lncRNA，分别在LN229/229R、U251/251R、551W/551WR、HG7/HG7R四组细胞中提取RNA经qPCR验证(图2)。

为验证这些lncRNA是否在胶质母细胞瘤TMZ耐药中起到作用，发明人利用siDirect网站(http://sidirect2.rnai.jp/)设计siRNA序列并委托上海吉凯基因公司合成(表1)。

表1 siRNA序列

利用siRNA在耐药细胞229R和HG7R敲低这10个lncRNA，检测这些lncRNA对细胞TMZ的IC50影响。发现lnc-TALC和NR_028415在耐药细胞中高表达，在敲低后，229R和HG7R对TMZ的IC50明显降低(图3)。

实施例3复发胶质母细胞瘤患者组织中lnc-TALC高表达

通过qPCR和ISH技术评价79例临床复发胶质母细胞瘤患者和原发胶质母细胞瘤患者组织样本中lnc-TALC的表达水平。

1、lnc-TALC的序列：

利用Ensemble数据库查询lnc-TALC的全长序列，全长包括2个外显子，328个碱基，序列如SEQ ID NO.5所示。

2、设计lnc-TALC引物

针对lnc-TALC的序列利用Primer Blast网站设计qPCR的正反向引物，由优宁维公司负责引物合成。

正向引物(5’-3’)：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT(SEQ ID NO.1)

反向引物(5’-3’)：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA(SEQ ID NO.2)

3、抽提临床原发和复发胶质母细胞瘤组织中的的总RNA，利用qPCR和ISH技术，检测lnc-TALC的表达水平。

(1)RNA提取：

①每个组织样品均取100mg，研磨成粉末②按照从Sigma公司购买的Trizol，提取RNA

(2)逆转录反应

每个样品取相同量RNA，用随机引物进行逆转录，反应体系如下表2所示。

表2逆转录反应体系

试剂使用量终浓度	使用量	终浓度
			5×PrimeScript Buffer(for Real Time)	2μl	1×
PrimeScript RT Enzyme Mix 1	0.5μl
			Oligo dT Primer(50μM)	0.5μl	25pmol
Random 6 mers(100μM)	0.5μl	50pmol
			总RNA
RNAase Free dH2O	至10μl

(3)PCR扩增反应

①按下表3配制RCR反应体系，选择β-Actin作内参基因，根据下表配制20μl/孔PCR反应体系。

表3 PCR反应体系

试剂	使用量	终浓度
			SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)	12.5μl	1×
PCR正向引物(1 0μM)	1.0μl	0.4μM
			PCR反向引物(10μM)	1.0μl	0.4μM
RT反应液(cDNA溶液〉	2μl
			dH<sub>2</sub>O(灭菌蒸馏水)	8.5μl
总体系	25μl

②准备96孔PCR反应板，每例样本重复三次，充分离心避免气泡产生

③反应条件

95℃30s；95℃5s，60℃15s，进行44个循环；72℃30s；4℃保存。

④数据分析：观测扩增曲线图，设置基线和阈值，以β-Actin为内源性对照，应用相对CT值的方法计算所检测lnc-TALC的相对表达量

qPCR结果显示，与原发胶质母细胞瘤患者相比，复发胶质母细胞瘤患者组织中lnc-TALC的表达水平明显升高，结果见图4。ISH结果显示，具有同样遗传背景的同一患者，和原发的肿瘤组织相比，复发后的肿瘤组织中lnc-TALC水平明显升高，结果见图5。

实施例4 lnc-TALC表达水平与患者的生存时间相关

(1)临床胶质母细胞瘤患者，根据每位患者组织中lnc-TALC表达水平的中位数，将这些患者分为lnc-TALC高表达和低表达患者，作生存曲线分析。

结果显示，临床低表达lnc-TALC胶质母细胞瘤患者在接受TMZ治疗比没有接受TMZ治疗，生存期明显延迟。高表达lnc-TALC胶质母细胞瘤患者在接受TMZ治疗和没有接受TMZ治疗，生存期没有明显地改变(图6)。

(2)Cox回归分析显示，在修正过患者年龄、KPS_Score和放疗后，TMZ化疗与lnc-TALC低表达的患者的总生存率有关(表4)。

表4 Cox回归分析

实施例5 CCGA，TCGA和临床患者组织中复发胶质瘤患者MET和MGMT表达水平增高，MET和MGMT表达水平正相关

利用肿瘤数据库CGGA，和TCGA和GSE16011累计620例胶质瘤病例中对复发胶质瘤和原发胶质瘤中MET和MGMT的表达水平验证，并对MET和MGMT表达水平的相关性验证，同时qPCR检测临床原发和复发胶质母细胞瘤患者组织中的MET表达水平。结果显示，在CGGA和TCGA数据库以及临床患者中，相比原发胶质母细胞瘤患者，复发胶质母细胞瘤患者组织中的MET和MGMT高表达，MET和MGMT的表达呈正相关(图7)。同时免疫组化和WB结果也表明，p-Met，c-Met在复发胶质母细胞瘤患者中高表达(图8-9)。

以上表明在复发胶质母细胞瘤患者中，MET和MGMT高表达，并且他们的表达呈正相关。

实施例6胶质母细胞瘤患者肿瘤样本中lnc-TALC和MET表达正相关

依据实施例3中的方法，提取患者肿瘤组织RNA，通过qPCR检测lnc-TALC和MET的表达水平，分析它们表达水平相关性。结果显示在胶质母细胞瘤患者中，lnc-TALC和MET表达水平呈正相关(图10)。

这些结果提示，lnc-TALC在耐药胶质母细胞瘤中高表达，并可能通过调控c-Met的表达上调MGMT的表达水平，促进TMZ耐药。因此，lnc-TALC可作为胶质母细胞瘤用TMZ治疗的分子标志物以及应用于检测胶质母细胞瘤lnc-TALC并评估TMZ化疗疗效和预后。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> lnc-TALC作为分子标志物在评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效和预后中的用途

<130> KLPI180871

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tttgaaatgc tctttgaggg at 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

tgcaggttgt ctgaagttgg a 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 3

auaaugacau guuaccaaga g 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 4

cuugguaaca ugucauuaua a 21

<210> 5

<211> 328

<212> DNA

<213> lnc-TALC

<400> 5

tcacccaggt gcaagcccag aggcagtcta taccccaact caactggctg gtcctcaatg 60

ctgcctgctt ccgtgcccaa cttagaacta cacatctgct gcctcttggt aacatgtcat 120

tataagtctg aagattgcca tttgaaatgc tctttgaggg atgcgaagtc aaccctggat 180

ccaaagtagc tttgatgttt gtcaggaaaa tgctggaatt ctatacacta cagtttctac 240

agagcatgaa gaactccaac ttcagacaac ctgcaaaaaa agtcagagag caattaaata 300

taaaaataaa ttcctttgat aaaacaaa 328

Claims (9)

1.lnc-TALC作为分子标志物在制备评估胶质母细胞瘤烷化剂替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗疗效和预后试剂中的用途。

2.用于检测lnc-TALC表达水平的试剂在制备评估胶质母细胞瘤TMZ化疗疗效和预后试剂盒中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的试剂为引物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5.一种检测lnc-TALC的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有用于逆转录反应的试剂以及用于检测生物样品中lnc-TALC的表达水平的PCR反应试剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的生物样品为胶质母细胞瘤新鲜病理组织。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测生物样品中lnc-TALC的表达水平的PCR反应试剂中包括引物，所述的引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.lnc-TALC siRNA在制备逆转胶质母细胞瘤对烷化剂替莫唑胺抗性的试剂中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的lnc-TALC siRNA由正义链和反义链组成，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。