CN108350459B - 结合癌细胞的dna适配体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种针对癌细胞的适配体，其与现有适配体比具有更高的结合能力、特异性和/或稳定性。本发明通过结合癌细胞并含有人工碱基的DNA适配体来解决上述问题。

Description

结合癌细胞的DNA适配体
技术领域
本发明涉及结合癌细胞并含有人工碱基的DNA适配体、含有该DNA适配体的药物组合物以及使用该DNA适配体检测癌细胞的方法等。
背景技术
具有针对靶标分子的结合活性的核酸片段称为核酸适配体，其被期待着能作为核酸药物而广泛地应用到医疗中。近年来，揭示了不仅是低分子物质和蛋白质，而且细胞和病毒本身也能成为核酸适配体的靶标(非专利文献1～3)。通过将全细胞作为靶标，可以获得识别在细胞表面表达的受体和糖链等表征该细胞的表面分子的适配体。
另外，近年来，在癌症治疗方面，以肿瘤标志物的表达状态为指标来确定治疗策略变得日益普遍。但是，已知的标志物的种类目前仍然很少。如果通过获得以癌细胞为靶标的核酸适配体能发现可以表征多种癌的新标志物的话，则对各种癌症的早期诊断有帮助。此外，如果能获得与癌细胞特异性靶标结合的核酸适配体，则也可以应用于抗癌药物和给药系统(DDS)。但是，目前的核酸适配体在用于以治疗和诊断为代表的医疗领域方面，在结合能力、特异性以及稳定性等方面还有所欠缺。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Sefah,K.et al.,Nature protocols 2010,5,6,pp.1169-1185
非专利文献2：Acquah,C.et al.,Critical Reviews in Biotechnology 2015,early Online(Doi:10.3109/07388551.2015.1083940)
非专利文献3：Meyer,M.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97,pp.7097-7109.
发明内容
发明所要解决的问题
因此，需要开发一种针对癌细胞的适配体，其与现有的核酸适配体相比具有更高的结合能力、特异性和/或稳定性
解决问题的技术方案
本发明人分别以来源于乳腺癌的三种细胞株(MCF7、MDA-MB-231、T-47D)为靶标，实施使用含有本发明人开发的人工碱基的文库的Cell-SELEX方法(WO2013/073602)，得到了含有人工碱基的多个DNA适配体。每个含有人工碱基的DNA适配体虽然与作为靶标的细胞株紧密结合，但基本没有确认到与非癌细胞的亲和性。此外，对得到的DNA适配体进行了进一步研究，结果确认到结合绝大多数癌细胞的DNA适配体，以及结合能力因细胞株而异的DNA适配体。前者的DNA适配体在可以检测到广泛的癌细胞方面具有较高实用性，后者的DNA适配体在可以用于癌细胞分类方面具有较高实用性。
本发明基于上述见解而完成的，包括以下方案。
(1)一种结合癌细胞的DNA适配体，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：
(i)(a)N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(即SEQ ID NO:35)所示的核苷酸序列，
该序列中，N1～N5独立地为G、T、A或C，N26为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N30与N5形成碱基对，N31与N4形成碱基对，N32与N3形成碱基对，N33与N2形成碱基对，N34与N1形成碱基对；或者
(b)在(i)(a)所示的核苷酸序列中除N26以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个(1又は数個)核苷酸而成的核苷酸序列；以及
(ii)(a)N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(即SEQ ID NO:28)所示的核苷酸序列，
该序列中，N1～N6、N14、N25独立地为G、T、A或C，N13和N22为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N26与N4形成碱基对，N29与N3形成碱基对，N30与N2形成碱基对，N31与N1形成碱基对，N27和N28独立地为G、T、A、C或不存在；或者
(b)在(ii)(a)所示的核苷酸序列中除N13和N22以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
(2)根据(1)所述的DNA适配体，其中，(i)(a)或(ii)(a)的核苷酸序列在末端还含有1～5个GC碱基对。
(3)根据(1)或(2)所述的DNA适配体，其中，所述碱基对为GC碱基对。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的DNA适配体，其中，(i)(b)的添加、缺失和/或置换是在SEQ ID NO:35的第1位～第5位或第30位～第34位进行的。
(5)根据(1)～(3)中任一项所述的DNA适配体，其中，(ii)(b)的添加、缺失和/或置换是在SEQ ID NO:28的第1位～第6位、第14位或第25位～第31位进行的。
(6)根据(1)或(2)所述的DNA适配体，其中，(i)(a)的核苷酸序列是SEQID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:40所示的序列。
(7)根据(1)或(2)所述的DNA适配体，其中，(ii)(a)的核苷酸序列是SEQ ID NO:29所示的序列。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的DNA适配体，其在3’末端还含有小发夹结构，
所述小发夹结构由从5’末端向3’末端依次连接的下述(A)～(C)的核酸区域组成：
(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；
(B)由GNA或GNNA的核苷酸序列组成的第二核酸区域，其中，各个N独立地为G、T、A或C中的任一个；以及
(C)由与第一核酸区域互补的核苷酸序列组成的第三核酸区域，
并且，所述小发夹结构由茎部和环部构成，其中，所述茎部是第一核酸区域和第三核酸区域相互碱基配对而成的，所述环部由第二核酸区域组成。
(9)一种结合乳腺癌细胞的DNA适配体，其含有以下(I)～(IV)中任一个核苷酸序列：
(I)(a)N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N4 4N45(即SEQ ID NO:43)所示的核苷酸序列，
该序列中，N1～N6、N18、N24、N31和N36独立地为G、T、A或C，N16为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N29为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C，N40与N6形成碱基对，N41与N5形成碱基对，N42与N4形成碱基对，N43与N3形成碱基对，N44与N2形成碱基对，N45与N1形成碱基对；或者
(b)在(I)(a)所示的核苷酸序列中除N16以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列；以及
(II)(a)N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(即SEQ ID NO:2)所示的核苷酸序列，
该序列中，N1～N4、N7、N16、N23、N26和N31独立地为G、T、A或C，N6为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C，N17为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N27与N3形成碱基对，N28与N2形成碱基对，N29和N30为G、T、A、C或不存在；或者
(b)在(II)(a)所示的核苷酸序列中除N17以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列；
(III)(a)N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(即SEQ ID NO:18)所示的核苷酸序列，
该序列中，N1～N3、N13～N17、N19～N22、N33、N46～N48和N50独立地为G、T、A或C，N10～N12和N23～N25为G、T、A、C或不存在，N18为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基、G、T、A或C、或者不存在，N32为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N49与N3形成碱基对，N51与N1形成碱基对，N10～N15中的三个以上与N20～N25中的三个以上形成碱基对；或者
(b)在(III)(a)所示的核苷酸序列中除N32以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列；
(IV)(a)N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(即SEQ ID NO:50)所示的核苷酸序列，
该序列中，N1～N3、N15、N17、N20～N23、N25～N29、N31～N32、N34和N46独立地为G、T、A或C，N18和N30为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，N47与N3形成碱基对，N48与N2形成碱基对，N49与N1形成碱基对；或者
(b)在(IV)(a)所示的核苷酸序列中除N18和N30以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
(10)根据(9)所述的DNA适配体，其中，(I)(a)、(II)(a)、(III)(a)或(IV)(a)的核苷酸序列在末端还含有1～5个GC碱基对。
(11)根据(9)或(10)所述的DNA适配体，其中，所述碱基对为GC碱基对。
(12)根据(9)～(11)中任一项所述的DNA适配体，其中，(I)(b)的添加、缺失和/或置换是在SEQ ID NO:43的第1位～第6位、第18位、第24位、第29位、第31位、第36位或第40位～第45位进行的。
(13)根据(9)～(11)中任一项所述的DNA适配体，其中，(II)(b)的添加、缺失和/或置换是在SEQ ID NO:2的第1位～第4位、第6位～第7位、第16位、第23位或第26位～第31位进行的。
(14)根据(9)～(11)中任一项所述的DNA适配体，其中，(III)(b)的添加、缺失和/或置换是在SEQ ID NO:18的第1位～第3位、第10位～第25位、第33位或第46位～第51位进行的。
(15)根据(9)～(11)中任一项所述的DNA适配体，其中，(IV)(b)的添加、缺失和/或置换是在SEQ ID NO:50的第1位～第3位、第15位、第17位、第20位～第23位、第25位～第29位、第31位～第32位、第34位或第46位～第49位进行的。
(16)根据(9)或(10)所述的DNA适配体，其中，(I)(a)的核苷酸序列是SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46所示的序列。
(17)根据(9)或(10)所述的DNA适配体，其中，(II)(a)的核苷酸序列是SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:16中任一个所示的序列。
(18)根据(9)或(10)所述的DNA适配体，其中，(III)(a)的核苷酸序列是SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26中任一个所示的序列。
(19)根据(9)或(10)所述的DNA适配体，其中，(IV)(a)的核苷酸序列是SEQ ID NO:51所示的序列。
(20)根据(9)～(19)中任一项所述的DNA适配体，其在3’末端还含有小发夹结构，
所述小发夹结构由从5’末端向3’末端依次连接的下述(A)～(C)的核酸区域组成：
(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；
(B)由GNA或GNNA的核苷酸序列组成的第二核酸区域，其中，各个N独立地为G、T、A或C中的任一个；以及
(C)由与第一核酸区域互补的核苷酸序列组成的第三核酸区域，
并且，所述小发夹结构由茎部和环部构成，其中，所述茎部是第一核酸区域和第三核酸区域相互碱基配对而成的，所述环部由第二核酸区域组成。
(21)一种癌症检测试剂，其含有(1)～(20)中任一项所述的DNA适配体。
(22)一种癌细胞检测用试剂盒，其含有(1)～(20)中任一项所述的DNA适配体。
(23)一种药物组合物，其含有(1)～(20)中任一项所述的DNA适配体。
(24)一种抗癌药物，其由含有(1)～(8)中任一项所述的(i)(a)或(b)的核苷酸序列的DNA适配体组成。
(25)一种用于将药物递送至癌细胞的药物组合物，其含有(1)～(20)中任一项所述的DNA适配体和药物。
(26)一种检测癌细胞的方法，其包括以下步骤：
使含有从受试对象获得的细胞的样品与(1)～(8)中任一项所述的DNA适配体接触的步骤；以及
基于所述样品与所述DNA适配体的结合来检测癌细胞的步骤。
(27)一种检测乳腺癌细胞的方法，其包括以下步骤：
使含有从受试对象获得的细胞的样品与(9)～(20)中任一项所述的DNA适配体接触的步骤；以及
基于所述样品与所述DNA适配体的结合来检测乳腺癌细胞的步骤。
(28)一种对从受试对象获得的癌细胞进行分类的方法，其包括以下步骤：
使从受试对象获得的癌细胞与(1)～(20)中任一项所述的DNA适配体接触的步骤；
对所述癌细胞与所述DNA适配体是否有结合或结合强度进行测定的步骤；以及
基于是否有所述结合或所述结合强度对癌细胞进行分类的步骤。
(29)一种对从受试对象获得的乳腺癌细胞进行分类的方法，其包括以下步骤：
使从受试对象获得的乳腺癌细胞与(9)～(20)中任一项所述的DNA适配体接触的步骤；
对所述乳腺癌细胞与所述DNA适配体是否有结合或结合强度进行测定的步骤；以及
基于是否有所述结合或所述结合强度对乳腺癌细胞进行分类的步骤。
(30)根据(29)所述的方法，其中，接触步骤是使从受试对象获得的乳腺癌细胞与选自(9)～(20)中任一项所述的(I)～(IV)四组中的至少两组的两种以上的DNA适配体接触的步骤。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2015-214591号的公开内容。
发明效果
根据本发明，能够提供一种针对癌细胞的DNA适配体，其与现有的核酸适配体相比具有更高的结合能力、特异性和/或稳定性。此外，根据本发明的DNA适配体，能够提供辅助诊断是否患有癌症的方法、癌症的检测方法以及用于治疗和/或预防癌症的药物组合物等。
附图简述
图1表示利用针对MCF7细胞的Cell-SELEX而获得的DNA适配体(14A-MCF7)的序列(SEQ ID NO:4)和推定二级结构。在二次筛选中确认到85％以上保守性的碱基用圆圈表示，人工碱基Ds用方框表示。图中，粗线表示能够形成沃森-克里克碱基对的碱基，虚线表示能够形成非沃森-克里克碱基对的碱基，普通线表示碱基是通过磷酸二酯键连接的。粗线、虚线、普通线的含义在以下的图2～7、9、11、13、15、17、19中是相同的。
图2表示利用针对MCF7细胞的Cell-SELEX而获得的DNA适配体(08B-MCF7)的序列(SEQ ID NO:17)和推定二级结构。在二次筛选中确认到85％以上保守性的碱基用圆圈表示，Ds用方框表示。
图3表示利用针对T47D细胞的Cell-SELEX而获得的DNA适配体(03-T47D)的序列(SEQ ID NO:27)和推定二级结构。在二次筛选中确认到85％以上保守性的碱基用圆圈表示，Ds用方框表示。
图4表示利用针对MB231细胞的Cell-SELEX而获得的DNA适配体(05-MB231)的序列(SEQ ID NO:34)和推定二级结构。在二次筛选中确认到85％以上保守性的碱基用圆圈表示，Ds用方框表示。
图5表示利用针对MB231细胞的Cell-SELEX而获得的DNA适配体(07-MB231)的序列(SEQ ID NO:42)和推定二级结构。在二次筛选中确认到85％以上保守性的碱基用圆圈表示，Ds用方框表示。
图6表示利用针对MB231细胞的Cell-SELEX而获得的DNA适配体(23-MB231)的序列(SEQ ID NO:49)和推定二级结构。在二次筛选中确认到85％以上保守性的碱基用圆圈表示，Ds用方框表示。
图7表示实施例4使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以14A-MCF7(53DsDs)(SEQ ID NO:4)为基础，设计了将第17位的Ds置换为A而成的14A-MCF7(53ADs)(SEQ ID NO:5)、将第28位的Ds置换为A而成的14A-MCF7(53DsA)(SEQ ID NO:6)、将第17位和第28位的Ds置换为A而成的14A-MCF7(53AA)(SEQ ID NO:7)、将3’末端侧的凸起部分的AG置换为TT并将茎部的一部分错配部分置换为形成碱基对而成的14A-MCF7(Opt53DsDs)(SEQ ID NO:3)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。
图8表示利用流式细胞仪分析图7所示的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图9表示实施例4使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以14A-MCF7(53DsDs)为基础，设计了从5’末端和3’末端分别除去8个碱基共16个碱基而成的14A-MCF7(37DsDs)(SEQ ID NO:8)、从14A-MCF7(37DsDs)中再除去由AG组成的凸起结构并将茎部末端的几个碱基置换为GC碱基对而成的14A-MCF7(35DsDs)(SEQ ID NO:9)、在14A-MCF7(35DsDs)的3’末端添加小发夹而成的14A-MCF7mh(44DsDs)(SEQ ID NO:10)、对茎部结构分别除去1对、2对和3对GC碱基对而成的14A-MCF7mh(SEQ ID NO:11)、14A-MCF7mh(40DsDs)(SEQ ID NO:12)和14A-MCF7mh(38DsDs)(SEQ ID NO:13)。Ds用方框表示。
图10表示利用流式细胞仪分析图9所示的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图11表示实施例5使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以08B-MCF7(51DsDs)(SEQ ID NO:20)为基础，设计了将第18位的Ds置换为A而成的08B-MCF7(51ADs)(SEQ IDNO:21)、将第32位的Ds置换为A而成的08B-MCF7(51DsA)(SEQ ID NO:22)、将第18位和第32位的Ds置换为A而成的08B-MCF7(51AA)(SEQ ID NO:23)、在08B-MCF7(51DsDs)中添加小发夹而成的08B-MCF7mh(SEQ ID NO:24)、将08B-MCF7mh内部的茎环置换为小发夹而成的08B-MCF7mh2(SEQ ID NO:25)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示，茎环置换为小发夹的部位用附带箭头的方框表示。
图12表示利用流式细胞仪分析图11所示的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图13表示实施例6使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以03-T47D(DsDs)(SEQ ID NO:29)为基础，设计了将第24位的Ds置换为A而成的03-T47D(DsA)(SEQ ID NO:30)、将第15位的Ds置换为A而成的03-T47D(ADs)(SEQ ID NO:31)、将第15位和第24位的Ds置换为A而成的03-T47D(AA)(SEQ ID NO:32)、在03-T47D(DsDs)的末端添加小发夹而成的03-T47Dmh(SEQ ID NO:33)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。
图14表示利用流式细胞仪分析图13所示的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图15表示实施例7使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以05-MB231(DsDs)(SEQ ID NO:36)为基础，设计了将第44位的Ds置换为A而成的05-MB231(DsA)(SEQ ID NO:37)、将第33位的Ds置换为A而成的05-MB231(ADs)(SEQ ID NO:38)、将第33位和第44位的Ds置换为A而成的05-MB231(AA)(SEQ ID NO:39)、将05-MB231(DsDs)末端的一部分序列除去并将一部分茎部置换为GC碱基对而成的05-MB231GC(SEQ ID NO:40)，以及在05-MB231GC中添加小发夹而成的05-MB231GCmh(SEQ ID NO:41)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。
图16表示利用流式细胞仪分析图15所示的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图17表示实施例8使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以07-MB231(DsDs)(SEQ ID NO:44)为基础，设计了将第28位的Ds置换为A而成的07-MB231(DsA)(SEQ ID NO:46)、将第15位的Ds置换为A而成的07-MB231(ADs)(SEQ ID NO:47)、将第15位和第28位的Ds置换为A而成的07-MB231(AA)(SEQ ID NO:48)、在07-MB231的末端添加小发夹而成的07-MB231mh(SEQ ID NO:45)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。
图18表示利用流式细胞仪分析图17所示的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图19表示实施例9使用的DNA适配体的序列和推定二级结构。以23-MB231b(SEQ IDNO:51)为基础，设计了在末端添加小发夹而成的23-MB231bmh(SEQ ID NO:52)。Ds用方框表示。
图20表示利用流式细胞仪分析实施例9使用的DNA适配体以及AS1411和Cont26对细胞结合能力的结果。
图21表示利用流式细胞仪测定14A-MCF7(37DsDs)及其修饰体的Kd值的结果。横轴表示DNA适配体的浓度，纵轴表示荧光强度。A表示14A-MCF7(37DsDs)的结果，B表示14A-MCF7mh(44DsDs)的结果，C表示14A-MCF7mh的结果，D表示14A-MCF7mh(40DsDs)的结果，E表示14A-MCF7mh(38DsDs)的结果。
图22表示利用流式细胞仪测定08B-MCF7(51DsDs)及其修饰体的Kd值的结果。横轴表示DNA适配体的浓度，纵轴表示荧光强度。A表示08B-MCF7(51DsDs)的结果，B表示08B-MCF7mh的结果，C表示08B-MCF7mh2的结果。
图23表示利用流式细胞仪测定03-T47D(DsDs)及其修饰体的Kd值的结果。横轴表示DNA适配体的浓度，纵轴表示荧光强度。A表示03-T47D(DsDs)的结果，B表示03-T47Dmh的结果。
图24表示利用流式细胞仪测定05-MB231GC及其修饰体的Kd值的结果。横轴表示DNA适配体的浓度，纵轴表示荧光强度。A表示05-MB231GC的结果，B表示05-MB231GCmh的结果。
图25表示利用流式细胞仪测定07-MB231(DsDs)及其修饰体的Kd值的结果。横轴表示DNA适配体的浓度，纵轴表示荧光强度。A表示07-MB231(DsDs)的结果，B表示07-MB231mh的结果。
图26表示利用流式细胞仪测定23-MB231b及其修饰体的Kd值的结果。横轴表示DNA适配体的浓度，纵轴表示荧光强度。A表示23-MB231b的结果，B表示23-MB231bmh的结果。
图27表示14A-MCF7(37DsDs)和14A-MCF7mh(44DsDs)的Tm值的测定结果，以及08B-MCF7(51DsDs)和08B-MCF7mh的Tm值的测定结果。横轴表示温度。A表示260nm处的吸光度的一阶导数，B表示260nm处的吸光度。
图28表示各DNA适配体(08B-MCF7mh2、14A-MCF7mh、AS1411)与细胞的结合以及在细胞内定位的分析结果。A表示Alexa488的荧光下的观察结果，B表示DAPI的荧光下的观察结果，C表示透射光下的观察结果。
图29表示各DNA适配体(05-MB231GCmh、07-MB231mh、23-MB231bmh)与细胞的结合以及在细胞内定位的分析结果。A表示Alexa488的荧光下的观察结果，B表示DAPI的荧光下的观察结果，C表示透射光下的观察结果。
图30表示14A-MCF7mh(44DsDs)适配体与细胞的结合以及在细胞内定位的分析结果。
图31表示AS1411与细胞的结合以及在细胞内定位的分析结果。
图32-1表示非标记的08B-MCF7mh和14A-MCF7mh及其他药物对靶标癌细胞(MCF7)(A、C)和非癌细胞(MCF10A)(B、D)的细胞增殖的影响。FUdR是指氟尿苷，PTX是指紫杉醇。N.A.(Not available，不可用)意为未测定。
图32-2表示非标记的05-MB231GCmh和07-MB231mh及其他药物对靶标癌细胞(MB231)(A、C)和非癌细胞(MCF10A)(B、D)的细胞增殖的影响。FUdR是指氟尿苷，PTX是指紫杉醇。
图32-3表示非标记的03-T47Dmh及其他药物对靶标癌细胞(T47D)(A)和非癌细胞(MCF10A)(B)的细胞增殖的影响。FUdR是指氟尿苷，PTX是指紫杉醇。
图33-1表示非标记的05-MB231GCmmh适配体及其他药物针对各种癌细胞(A：MCF7、B：T47D、C：MDA-MB231、D：MDA-MB453)的增殖的影响。FUdR是指氟尿苷，PTX是指紫杉醇。
图33-2表示非标记的05-MB231GCmmh适配体及其他药物针对各种癌细胞(A：MIAPaCa-2、B：PC-3、C：HCT116、D：A549)的增殖的影响。FUdR是指氟尿苷，PTX是指紫杉醇。
图33-3表示非标记的05-MB231GCmmh及其他药物针对癌细胞(KG-1)(A)和非癌细胞(B：MCF10A、C：HUVEC)的细胞增殖的影响。FUdR是指氟尿苷，PTX是指紫杉醇。
具体实施方式
1.定义
下面对本说明书中使用的普通术语的定义进行说明。
本说明书中，“核酸”或“核酸分子”是指原则上以核苷酸为组成单位，通过磷酸二酯键将这些核苷酸连接而成的生物高分子。
本说明书中，“天然型核苷酸”是指在自然界中存在的核苷酸，可举出：由具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中任一种天然碱基的脱氧核糖核苷酸构成的DNA，以及由具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中任一种天然碱基的核糖核苷酸构成的RNA，或它们的组合。
本说明书中，“非天然型核苷酸”是指其碱基由人工碱基构成的在自然界中不存在的核苷酸。本发明中构成非天然型核苷酸的磷酸基团和糖，在结构上与天然型核苷酸的磷酸基团和糖相同。
本说明书中，“人工碱基”或“碱基类似物”是指人工构建的化学物质，其具有与构成天然型核苷酸的天然碱基类似的性质，是与天然碱基一样具有能够形成人工碱基对的对象的碱基类似物(本说明书中，以下称为“互补人工碱基”)。本说明书中，“人工碱基配对”是指像天然碱基的腺嘌呤与胸腺嘧啶、腺嘌呤与尿嘧啶或者鸟嘌呤与胞嘧啶那样，一对互补人工碱基彼此形成的碱基配对。人工碱基配对包括通过在天然碱基间的碱基配对中可见的氢键的化学结合，通过基于人工碱基间的分子结构的嵌合的物理结合，以及通过疏水相互作用的堆积效果。
人工碱基所具有的“与天然碱基类似的性质”中，包括可通过人工碱基配对的互补性进行核酸的复制或转录(包括反转录)的性质。人工碱基与天然碱基相同，在人工碱基配对中具有排他选择性。因此，在底物核苷酸中如果存在具有一对互补的人工碱基的非天然型核苷酸，则即使是包含非天然型核苷酸的核酸分子，也可以通过人工碱基间的互补性与天然型核苷酸同样地进行准确的复制和转录。所以，虽然包含非天然型核苷酸，但可以通过PCR等核酸扩增法进行DNA分子的扩增等。
作为上述人工碱基的具体示例，可举出：Ds(7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，本说明书中称为“Ds”)、Pn(2-硝基吡咯-1-基；本说明书中称为“Pn”)、Pa(2-甲酰基-1H-吡咯-1-基；本说明书中称为“Pa”)、P(2-氨基-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8H)-酮；本说明书中称为“P”)、Z(6-氨基-5-硝基-2(1H)-吡啶酮，本说明书中称为“Z”)、5SICS(6-甲基异喹啉-1(2H)-硫酮，本说明书中称为“5SICS”)、NaM(3-甲氧基萘-2-基，本说明书中称为“NaM”)，以及MMO2(2-甲氧基-4-甲苯基，本说明书中称为“MMO2”)。在这些人工碱基中，Ds的互补人工碱基可举出Pn和Pa。P的互补人工碱基可举出Z。5SICS的互补人工碱基可举出NaM和MMO2。
需要说明的是，人工碱基在复制和转录时，当底物中未包含具有互补人工碱基的非天然型核苷酸时，互补人工碱基与在结构和/或性质上相近的天然碱基能够替代地进行碱基配对。这种情况下，作为模板的核酸分子中的非天然型核苷酸在复制或转录后会被置换为天然型核苷酸。例如，已知在Ds的情况下，会被置换为A或T。
本说明书中，“修饰碱基”是指经过人工化学修饰的碱基。作为修饰碱基，例如可举出：修饰化嘧啶(例如5-羟基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-(3-吲哚-2-乙基)尿嘧啶、5-(4-羟基苯基-2-乙基)尿嘧啶)、修饰化嘌呤(例如，6-甲基腺呤、6-硫鸟苷)及其他杂环碱基等。
本说明书中，“DNA适配体”是指由DNA构成的适配体，是利用基于通过氢键等形成的单链核酸分子的二级结构以及三级结构而形成的三维结构与靶标分子牢固且特异性地结合的配体分子。当DNA适配体具有特异性地阻碍或抑制靶标分子的生理活性等功能的能力时，DNA适配体能够作为靶标分子的功能抑制剂。本说明书中，“靶标分子的功能抑制”是指阻碍或抑制靶标分子所具有的如催化剂功能或基因表达控制功能(包括转录、翻译、运输等的控制)、凋亡控制功能这样的生物学功能。
本说明书中，“靶标分子”是指能够成为DNA适配体的结合对象的物质。关于靶标分子的种类，只要是DNA适配体能够结合的生物物质，就没有特别限制。例如，可以是肽(寡肽或多肽)、核酸、脂质、糖(包括糖链)、低分子化合物、来源于天然的物质、化学合成物质、基因重组物质、细胞、病毒等任一种，优选为癌细胞或在癌细胞中表达的蛋白质等物质。
本说明书中，只要没有特别说明，则“碱基对”是指沃森-克里克型的碱基对，即AT碱基对或GC碱基对。
本说明书中，“小发夹结构”具有以下第一核酸区域、第二核酸区域以及第三核酸区域这三个DNA核酸区域分别从5’末端侧向3’末端侧依次连接而成的结构。小发夹型DNA通过提高对核酸酶的耐分解性和/或提升DNA适配体的Tm值来提高DNA适配体的热稳定性。
“第一核酸区域”是由2～5个任意核苷酸组成的核酸区域。所述核苷酸是指具有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)碱基的脱氧核苷酸。此核酸区域的碱基优选为鸟嘌呤或胞嘧啶。这是因为在与后述的第三核酸区域之间形成茎部结构时，GC含量越高，Tm值也越增高，能够稳定保持所述茎部结构。因此，第一核酸区域的整个核苷酸序列更优选由G和/或C构成。
“第二核酸区域”是由5’-GNA-3’或5’-GNNA-3’的核苷酸序列组成的核酸区域。序列中的各个N独立地由天然碱基(G、A、T或C)中任一种组成，例如由T组成。
“第三核酸区域”是具有与第一核酸区域互补的核苷酸序列的核酸区域。因此，第三核酸区域的核苷酸序列由第一核酸区域的核苷酸序列决定，并且第一核酸区域和第三核酸区域在分子内形成碱基对。其结果，第一核酸区域和第三核酸区域构成相互完全配对的茎部，此外存在于第一核酸区域与第三核酸区域之间的第二核酸区域构成环部，作为整体，形成有由7～14个核苷酸组成的小发夹型DNA。作为小发夹型DNA的示例，可举出由CGCGTAGCG(即SEQ ID NO:83)所示的核苷酸序列组成的DNA。
2.结合癌细胞的DNA适配体
在一个方案中，本发明涉及一种结合癌细胞的DNA适配体，其含有以下(i)(a)～(b)或(ii)(a)～(b)的核苷酸序列。
所述(i)(a)的核苷酸序列为N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(即SEQ ID NO:35)所示的核苷酸序列(该序列中，N1～N5独立地为G、T、A或C，N26为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基(本说明书中以下简称为“Ds”)，N30与N5形成碱基对，N31与N4形成碱基对，N32与N3形成碱基对，N33与N2形成碱基对，N34与N1形成碱基对)。所述碱基对可以为GC碱基对。在一个实施方式中，N30为A，N32为C，N33为G和/或N34为T。作为(i)(a)的核苷酸序列的示例，可举出SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:40所示的序列。
所述(i)(b)的核苷酸序列是在(i)(a)所示的核苷酸序列中除N26以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。本说明书中，“一个或数个”是指例如1～6个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个。添加、缺失和/或置换可以通过实施例3的二次筛选，在保守性低的部位等进行，例如在SEQ ID NO:35的第1位～第5位或第30位～第34位进行，优选在第1位～第5位或第31位进行。
所述(ii)(a)的核苷酸序列是N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N2 9N30N31(即SEQ ID NO:28)所示的核苷酸序列(该序列中，N1～N6、N14、N25独立地为G、T、A或C，N13和N22为Ds，N26与N4形成碱基对，N29与N3形成碱基对，N30与N2形成碱基对，N31与N1形成碱基对，N27和N28独立地为G、T、A、C或不存在)。所述碱基对可以为GC碱基对。在一个实施方式中，N3为C，N4为G和/或N14为A。作为(ii)(a)的核苷酸序列，可举出SEQ ID NO:29所示的序列。
所述(ii)(b)的核苷酸序列是在(ii)(a)所示的核苷酸序列中除N13和N22以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。添加、缺失和/或置换可以通过实施例3的二次筛选，在保守性低的部位等进行，例如在SEQ ID NO:28的第1位～第6位、第14位或第25位～第31位进行，如在第1位～第6位或第25位～第31位进行，优选在第1位～第2位、第5位～第6位或第25位～第31位进行。
在一个实施方式中，(i)(a)或(ii)(a)的核苷酸序列在其末端含有碱基对，例如含有1～5个，如1～4个、1～3个、1～2个或1个GC碱基对。(i)(a)或(ii)(a)的核苷酸序列除这些碱基对以外，或者替代这些碱基对，还可以含有形成小发夹结构的序列(以下在本说明书中也称为“小发夹序列”)。
作为在(i)(a)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:40所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:80所示的序列。此外，作为在(ii)(a)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:29所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:33所示的序列。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体可以由上述(i)(a)～(b)或(ii)(a)～(b)的核苷酸序列，或者在这些核苷酸序列中添加GC碱基对和/或小发夹序列而成的序列组成。
作为本发明的DNA适配体所结合的癌细胞，没有限制，可举出：乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、大肠(例如结肠)癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞等。本说明书中，癌细胞也包括白血病细胞和恶性淋巴瘤细胞。作为癌细胞来源的生物物种没有限制，例如可举出哺乳动物，如人和黑猩猩等灵长类，大鼠和小鼠等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物，优选为人的癌细胞。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体由于与广泛的癌细胞结合，因此可以用于各种癌细胞和癌症的检测或治疗。此外，含有(i)(a)或(i)(b)所示的核苷酸序列的DNA适配体不仅结合癌细胞，而且还能抑制癌细胞的增殖，因此可以用作抗癌药物。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体的长度例如为150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下，优选为100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下或60mer以下。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体除Ds以外，还可以含有任意碱基类似物、其他的人工碱基或其他的修饰碱基等。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体也可以通过添加其他物质进行修饰，例如聚乙二醇(PEG)(例如约20kDa～约60kDa的PEG聚合物)、氨基酸、肽、反向dT(inverted dT)、脂质、色素、荧光物质、酶、放射性物质、生物素等。这些物质也可以根据需要通过公知的接头连接。作为本说明书中的接头的示例，可举出：核苷酸接头、肽接头和含有二硫键的接头等。已知通过连接PEG，一般可以延长DNA适配体的半衰期。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体针对癌细胞，根据流式细胞仪的测定，例如具有100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下的Kd值，优选具有10nM以下、9nM以下、8nM以下、7nM以下、6nM以下、5nM以下、4nM以下或3nM以下的Kd值。
本发明的结合癌细胞的DNA适配体的制造方法没有特别限定。使用本领域公知的方法即可。例如，本发明的DNA适配体可以根据上述序列，按照公知的固相合成法进行化学合成。关于核酸的化学合成法，例如建议参考《核酸化学实验室指南》(Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry)，第1卷，第3节。此外，关于这样的化学合成，很多生命科学类厂商(例如宝生物株式会社、西格玛奥德里奇公司等)正在开展委托制造服务，可以利用这些服务。根据DNA适配体的序列合成一些片段后，也可以通过分子内退火和连接酶进行的连接等将片段连接来制备DNA适配体。
化学合成后的本发明的DNA适配体在使用前，优选利用该领域公知的方法进行纯化。作为纯化方法，例如可举出：凝胶纯化法、亲和柱纯化法、HPLC法等。
3.结合乳腺癌细胞的DNA适配体
在一个方案中，本发明涉及一种结合乳腺癌细胞的DNA适配体，其含有以下(I)(a)～(b)、(II)(a)～(b)、(III)(a)～(b)或(IV)(a)～(b)的核苷酸序列。
所述(I)(a)的核苷酸序列是N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(即SEQ ID NO:43)所示的核苷酸序列(该序列中，N1～N6、N18、N24、N31和N36独立地为G、T、A或C，N16为Ds，N29为Ds、G、T、A或C，优选为Ds，N40与N6形成碱基对，N41与N5形成碱基对，N42与N4形成碱基对，N43与N3形成碱基对，N44与N2形成碱基对，N45与N1形成碱基对)。在一个实施方式中，N3为T，N18为C，N24为T，N31为G和/或N36为A。作为(I)(a)的核苷酸序列，例如可举出SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46所示的序列。
所述(I)(b)的核苷酸序列是在(I)(a)所示的核苷酸序列中除N16以外的位置、优选在除N16和N29以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。添加、缺失和/或置换可以通过实施例3的二次筛选，在保守性低的部位等进行，例如在SEQ IDNO:43的第1位～第6位、第18位、第24位、第29位、第31位、第36位或第40位～第45位进行，如在第1位～第6位、第18位、第24位、第31位、第36位或第40位～第45位进行，优选在第1位～第6位或第40位～第45位进行，进一步优选在第1位～第2位、第4位～第6位或第40位～第45位进行。
所述(II)(a)的核苷酸序列是N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N2 9N30N31(即SEQ ID NO:2)所示的核苷酸序列(该序列中，N1～N4、N7、N16、N23、N26和N31独立地为G、T、A或C，优选为Ds，N6为Ds、G、T、A或C，N17为Ds，N27与N3形成碱基对，N28与N2形成碱基对，N29和N30独立地为G、T、A、C或不存在)。N23与N7、N31与N1也可以形成碱基对。在一个实施方式中，N7为G，N16为T和/或N23为C。作为(II)(a)的核苷酸序列，例如可举出SEQ ID NO:3～SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:16所示的序列。
所述(II)(b)的核苷酸序列是在(II)(a)所示的核苷酸序列中除N17以外的位置、优选在除N6和N17以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。添加、缺失和/或置换可以通过实施例3的二次筛选，在保守性低的部位等进行，例如在SEQ IDNO:2的第1位～第4位、第6位～第7位、第16位、第23位或第26位～第31位进行，如在第1位～第4位、第7位、第16位、第23位或第26位～第31位进行，优选在第1位～第4位、第7位、第23位或第26位～第31位进行，优选在第1位～第4位或第26位～第31位进行。
所述(III)(a)的核苷酸序列是N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N2 2N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(即SEQ ID NO:18)所示的核苷酸序列(该序列中，N1～N3、N13～N17、N19～N22、N33、N46～N48和N50独立地为G、T、A或C，N10～N12和N23～N25为G、T、A、C或不存在，N18为Ds、G、T、A或C，或不存在，N32为Ds，N49与N3形成碱基对，N51与N1形成碱基对，N10～N15中的三个以上与N20～N25中的三个以上形成碱基对)。N50与N2也可以进行碱基配对，N10～N15与N20～N25也完全可以进行碱基配对。N10～N25作为整体，也可以形成小发夹结构。在一个实施方式中，N33为C，N46为A，N47为G和/或N48为G。作为(III)(a)的核苷酸序列的示例，例如可举出SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26中任一个所示的序列。
所述(III)(b)的核苷酸序列是在(III)(a)所示的核苷酸序列中除N32以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。添加、缺失和/或置换可以通过实施例3的二次筛选，在保守性低的部位等进行，例如在SEQ ID NO:18的第1位～第3位、第10位～第25位、第33位或第46位～第51位进行，如在第1位～第3位、第10位～第25位或第46位～第51位进行，优选在第1位～第3位或第46位～第51位进行。
所述(IV)(a)的核苷酸序列是N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N2 7N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(即SEQ ID NO:50)所示的核苷酸序列(该序列中，N1～N3、N15、N17、N20～N23、N25～N29、N31～N32、N34和N46独立地为G、T、A或C，N18和N30为Ds，N47与N3形成碱基对，N48与N2形成碱基对，N49与N1形成碱基对)。在一个实施方式中，N1为C，N2为C，N15为T和/或N34为A。作为(IV)(a)的核苷酸序列，例如可举出SEQ ID NO:51所示的序列。
所述(IV)(b)的核苷酸序列是在(IV)(a)所示的核苷酸序列中除N18和N30以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。添加、缺失和/或置换可以通过实施例3的二次筛选，在保守性低的部位等进行，例如在SEQ ID NO:50的第1位～第3位、第15位、第17位、第20位～第23位、第25位～第29位、第31位～第32位、第34位或第46位～第49位进行，如在第1位～第3位或第47位～第49位进行，优选在第3位或第47位～第49位进行。
在一个实施方式中，(I)(a)、(II)(a)、(III)(a)或(VI)(a)的核苷酸序列在其末端含有碱基对，例如含有1～5个，如1～4个、1～3个、1～2个或1个GC碱基对。
另外，(I)(a)、(II)(a)、(III)(a)或(VI)(a)的核苷酸序列除这些碱基对以外，或者替代这些碱基对，还可以含有形成小发夹结构的序列。作为在(I)(a)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:44所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:45所示的序列。作为在(II)(a)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:16所示的序列中分别添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:13所示的序列。作为在(III)(a)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26所示的序列中分别添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的序列。作为在(IV)(a)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:51所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:52所示的序列。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体除Ds以外，还可以含有任意碱基类似物、其他的人工碱基或修饰碱基等。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体可以由上述(I)(a)～(b)、(II)(a)～(b)、(III)(a)～(b)或(IV)(a)～(b)的核苷酸序列，或者在这些核苷酸序列中添加GC碱基对和/或小发夹序列而成的序列组成。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体也可以与乳腺癌细胞以外的癌细胞结合。作为这样的癌细胞，没有限制，可举出前列腺癌细胞和肺癌细胞。作为癌细胞来源的生物物种没有限制，例如可举出哺乳动物，如人和黑猩猩等灵长类，大鼠和小鼠等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物，优选为人的癌细胞。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体，尤其是(I)～(III)的DNA适配体分别来源于07-MB231适配体、14A-MCF7适配体和08B-MCF7适配体，这些DNA适配体表现出其结合能力根据乳腺癌细胞的细胞株而不同，因此可以对乳腺癌细胞进行分类。例如，07-MB231适配体只与三阴性细胞即MDA-MB-231细胞结合，因此含有来源于07-MB231适配体的(I)(a)或(I)(b)的核苷酸序列的DNA适配体可以判断乳腺癌细胞是否为三阴性细胞，可以用于三阴性乳腺癌的诊断，因此尤其有用。三阴性乳腺癌是指乳腺癌致病基因即雌激素受体(EstrogenReceptor：ER)、孕酮受体(Progesterone Receptor：PR)和人表皮生长因子受体2(HumanEpidermal growth factor Receptor 2：HER2)均未确认到过量表达的类型的乳腺癌。正因为如此，已知没有确立的治疗策略且预后不良，此外其检测也较为困难。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体也可以通过添加其他物质进行修饰，例如聚乙二醇(PEG)(例如约20kDa～约60kDa的PEG聚合物)、氨基酸、肽、反向dT(inverted dT)、脂质、色素、荧光物质、酶、放射性物质、生物素等。这些物质也可以根据需要通过公知的接头连接。已知通过连接PEG，一般可以延长DNA适配体的半衰期。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体的长度例如为150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下，优选为100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下或60mer以下。
本发明的结合乳腺癌细胞的DNA适配体的制造方法与上述“2.结合癌细胞的DNA适配体”中记载的方法相同，因此在此处省略该记载。
4.含有DNA适配体的药物组合物
在一个方案中，本发明涉及一种药物组合物，其含有上述2或3所述的DNA适配体(本说明书中也将这些适配体合并简称为“本发明的DNA适配体”)。本发明的药物组合物在不丧失本发明的适配体所具有的与癌细胞的结合能力的范围内，还可以含有一种以上的其他药物。例如，可以含有预定量的抗癌药物。
在一个实施方式中，本发明涉及一种用于将药物递送至癌细胞的药物组合物，其含有DNA适配体和其他药物。其他药物也可以与DNA适配体结合，由此利用DNA适配体与癌细胞的结合能力，能够将药物有效地递送至癌细胞。DNA适配体与药物的结合方法没有限制。
作为本发明的药物组合物的预防和/或治疗对象的疾病为癌症。例如可举出：乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌和肺癌，以及白血病和恶性淋巴瘤等。
向患有癌症的受试对象给予药物组合物的治疗效果和向有患有癌症风险的受试对象给予药物组合物的预防效果受到期待。
本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指在制剂技术领域中使通常使用的药物组合物容易地进行制剂化和应用于生物体，在不阻碍或抑制其作用的范围内添加的物质。作为载体，例如可举出：赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂(流動添加調節剤)、润滑剂或稳定剂。
作为“赋形剂”，例如可举出：单糖、二糖类、环糊精和多糖类这样的糖(具体没有限制，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉和纤维素)、金属盐(例如磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低/中/高分子量的聚乙二醇(PEG)、普兰尼克(Pluronic)或它们的组合。
作为“粘合剂”，例如可举出：使用玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉的淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮等。
作为“崩解剂”，例如可举出：上述淀粉、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠或它们的盐。
作为“填充剂”，例如可举出：上述糖和/或磷酸钙(例如磷酸三钙或磷酸氢钙)。
作为“乳化剂”，例如可举出：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯等。
作为“流动添加调节剂”和“润滑剂”，例如可举出：硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙二醇。
作为“稳定剂”，例如可举出：抗坏血酸和亚硫酸盐等抗氧化剂、海藻糖和葡萄糖等糖类。
这样的载体根据需要适当使用即可。本发明的药物组合物除上述添加剂以外，还可以根据需要含有：矫味矫臭剂、助溶剂(增溶剂)、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、吸收促进剂(例如季铵盐类、月桂醇硫酸钠等)、增稠剂、湿润剂、保湿剂(例如甘油、淀粉等)、吸附剂(例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体状硅酸等)、崩解抑制剂(例如白糖、硬脂精、可可脂、氢化油等)、包衣剂、着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂、等渗剂、舒缓剂、助溶剂等。
作为“表面活性剂”，例如可举出：木质素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸酯、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化醇乙二醇醚，还有磺化萘与萘衍生物和甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯基醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯基聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、乙醇和脂肪醇/环氧乙烷的缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧化乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸废液和甲基纤维素。
本实施方式的药物组合物可以在一种药物组合物中含有一种以上的上述载体。
本发明的药物组合物的剂型为不会使有效成分失活的形式，只要是在给药后能够在生物体内发挥其药理作用的形式，就没有特别限定。一般是因给药方法和/或处方条件而异。
例如，作为适合于经口给药的剂型，可举出：固体制剂(包括片剂、丸剂、舌下片剂、胶囊剂、滴剂、锭剂)、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂等。此外，固体制剂可以根据需要采用实施该领域中公知的包衣的剂型，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、薄膜包衣片、双层片、多层片。
非经口给药可以细分为全身给药和局部给药，局部给药可以进一步细分为组织内给药、经皮给药、经粘膜给药和经直肠给药，药物组合物也可以制成适合于各给药方法的剂型。作为适合于全身或组织内给药的剂型，例如可举出作为液剂的注射剂。作为适合于经皮给药或经粘膜给药的剂型，例如可举出：液剂(包括涂布剂、滴眼剂、滴鼻剂、吸入剂)、悬浮剂(包括乳剂、霜剂)、粉剂(包括滴鼻剂、吸入剂)、糊剂、凝胶剂、软膏剂、硬膏剂等。作为适合于经直肠给药的剂型，例如可举出栓剂等。
需要说明的是，上述各剂型的具体形状、大小只要在各剂型中均处于该领域公知的剂型范围内即可，没有特别限定。
制造本发明的药物组合物，原则上应用该领域公知的制剂化方法即可。例如，可参考《雷明顿氏制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州)中记载的方法。
例如，在注射剂的情况下，可以将本发明的DNA适配体溶解在药学上可接受的溶剂中，根据需要添加药学上可接受的载体，通过该领域惯用的方法来制造。
作为“药学上可接受的溶剂”，例如可举出：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚环氧乙烷山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。这些优选根据需要调节为与血液等渗。
本发明的药物组合物可以按照制药上的有效量向生物体给药，以治疗或预防目标癌症等疾病。作为给药对象的生物体为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。
本发明的药物组合物也可以采用全身给药或局部给药中的任一种。可以根据疾病的种类、发病部位或发展程度等适当选择。如果是发病部位为局部的疾病，则优选为通过注射等向发病部位及其周围直接给药的局部给药。可以向待治疗的部位(组织或器官)给予足够量的本发明的DNA适配体，此外这也是因为其对其他组织不易产生影响。另一方面，在无法确定治疗部位的情况和全身性发病的疾病的情况下，则没有限制，但优选采用通过静脉注射等的全身给药。这是因为，通过血流使本发明的DNA适配体遍布全身，由此也可以向在诊断中未发现的病变部给药。
本发明的药物组合物可以通过使有效成分不失活的所有适当方法给药。例如，可以采用非经口(例如注射、气雾、涂布、滴眼、滴鼻)或经口中的任一种。优选为注射。
在通过注射给药时，注入部位没有特别限定。只要作为有效成分的DNA适配体能与靶物质结合，则任何部位都可以。例如可举出：静脉内、动脉内、肝脏内、肌肉内、关节内、骨髓内、髓腔内、心室内、经肺、经皮、皮下、皮内、腹腔内等。
5.由DNA适配体组成的抗癌药物
在一个方案中，本发明涉及一种由含有上述“2.结合癌细胞的DNA适配体”的(i)(a)或(i)(b)中记载的核苷酸序列的DNA适配体组成的抗癌药物。作为该DNA适配体来源的05-MB231适配体不仅能结合癌细胞，而且还表现出能够抑制癌细胞的增殖，因此可以用作抗癌药物。此外，在一个实施方式中，本发明涉及一种含有由上述DNA适配体组成的抗癌药物作为有效成分的药物组合物。药物组合物的构成如上所述，因此在此处省略该记载。
6.使用DNA适配体的治疗方法
在一个方案中，本发明涉及一种癌症的治疗和/或预防方法，其包括：向受试对象给予上述药物组合物或抗癌药物。
作为本发明的药物组合物的预防和/或治疗对象的疾病为癌症，例如为：乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌和肺癌，以及白血病和恶性淋巴瘤等。
本说明书中，能够作为“受试对象”的动物物种例如为哺乳动物，如人和黑猩猩等灵长类，大鼠和小鼠等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物，优选为人。
7.含有DNA适配体的检测试剂
在一个方案中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的癌症检测试剂。本发明的癌症检测试剂是用于利用DNA适配体与癌细胞的结合能力，在体内或体外检测癌症或癌细胞的组合物。例如，可以预先用荧光试剂等对DNA适配体进行标记并将该DNA适配体进行给药，由此确定生物体内有无癌细胞存在，此外当存在癌细胞时检查其定位。本发明的DNA适配体在成像和组织染色中有用。
在一个实施方式中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的癌症检测用组合物。该组合物的构成与上述药物组合物相同，因此在此处省略该记载。
在一个方案中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的癌细胞检测用试剂盒。本发明的试剂盒除本发明的DNA适配体以外，还可以包括缓冲液、标记试剂和/或说明书等。
本发明的癌症检测试剂、癌症检测用组合物和癌症检测用试剂盒可以在辅助诊断是否患有癌症的方法，或者在下述癌细胞的分类方法中使用。
8.癌细胞的检测方法
在一个方案中，本发明涉及一种检测癌细胞的方法。本方法包括：使从受试对象获得的样品与本发明的DNA适配体接触的步骤；以及基于样品与DNA适配体的结合来检测癌细胞的步骤。通过本方法，可以辅助诊断受试对象是否患有癌症。
作为本方法中使用的样品，可举出含有组织和细胞的生物样品。作为组织的示例，可举出病变部位，例如乳房、肝脏、胰腺、前列腺、卵巢、大肠、结肠、胃、宫颈、肺、骨髓、淋巴结、脾脏、胸腺等，例如可以使用这些组织的活检样品。作为细胞的示例，例如可举出：外周血细胞、含有细胞的淋巴液和组织液、毛母细胞、口腔细胞、鼻腔细胞、肠道细胞、阴道细胞、粘膜细胞、痰(可以包括肺泡细胞或气管细胞等)。
另外，当本发明的DNA适配体识别存在于癌细胞中的蛋白质、脂质、糖链等标志物时，并且当这些标志物被分泌、被切割等而出现在尿液和血液等体液中时，本发明的DNA适配体也可用于检测体液中的这些标志物。
本发明的检测方法的检测步骤只要是利用样品与DNA适配体的结合，就没有特别限定，使用公知的方法即可。例如，可以使用SPR法、比浊法、比色法或荧光法。
SPR(表面等离子体共振)是指当向金属薄膜照射激光时，反射光强度会在特定的入射角度(共振角)明显衰减的现象。SPR法就是利用该现象的测定方法，可以高灵敏度地测定作为传感器部的金属薄膜表面上的吸附物。本发明中，例如，预先将本发明的DNA适配体固定在金属薄膜表面上，使样品在该金属薄膜表面上通过，对该核酸分子与靶物质的结合所产生的样品通过前后的金属表面上的吸附物之差进行检测，由此可以检测样品中的靶物质。SPR法也可以使用置换法、间接竞争法等已知的任一种方法。
比浊法是向溶液照射光，使用比色计等对因溶液中漂浮的物质而散射的散射光的衰减或透过该溶液的透射光进行光学测量，由此测定溶液中的物质量的方法。本发明中，通过测量在样品中添加本发明的DNA适配体前后的吸光度，可以定量检测样品中的靶物质。
另外，也可以通过联合使用针对靶物质的抗体来检测靶物质。例如，也可以使用应用ELISA法的夹心法的方法。该方法中，首先将本发明的DNA适配体固定在固相载体上，然后添加样品，使存在于样品中的靶物质与上述DNA适配体结合。接着，在将样品洗脱后，加入抗靶物质抗体，使其与靶物质结合。洗涤后，使用进行了适当标记的二抗检测抗靶物质抗体，由此可以检测样品中的靶物质。作为固相载体，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、纤维素、琼脂糖凝胶、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材料形成的珠、微板、试管、棒或试验片等形状的不溶性载体。
在一个方案中，本发明涉及一种辅助诊断受试对象是否患有癌症的方法。本方法包括：向受试对象给予本发明的DNA适配体或本发明的癌症检测试剂或者癌症检测用组合物的步骤；以及检测DNA适配体的步骤。例如，当在生物体内的特定部位检测到高浓度的DNA适配体时，可以确定癌症发生在该部位。检测步骤使用公知方法即可，例如可以使用上述荧光法。
9.癌细胞的分类方法
在一个方案中，本发明涉及一种对从受试对象获得的癌细胞进行分类的方法。本方法包括：使从受试对象获得的癌细胞与本发明的DNA适配体接触的步骤；对所述癌细胞与所述DNA适配体是否有结合或结合强度进行测定的步骤；以及基于是否有所述结合或所述结合强度对癌细胞进行分类的步骤。关于对癌细胞与DNA适配体是否有结合或结合强度进行测定的步骤，其与上述癌细胞的检测方法中记载的内容相同，因此在此处省略该记载。
本方法可以只使用一种本发明的DNA适配体，也可以使用多种本发明的DNA适配体。当只使用一种本发明的DNA适配体时，可以与形态学观察、癌标志物的测定、染色法及使用现有适配体的方法等现有的癌分类方法相结合，从而更加详细地对癌细胞进行分类。
在本发明的癌细胞的分类方法中，基于癌细胞与DNA适配体的结合，可以对癌细胞的来源组织、亚型、固有亚型(intrinsic subtype)、分化程度及浸润性等进行分类。此外，根据癌细胞的分类，也可以进行癌细胞来源的受试对象的临床分期(发展程度、阶段)、预后预测和治疗计划的制定等。
在一个实施方式中，本方法中被分类的癌细胞为乳腺癌细胞。本方法优选使用选自上述“3.结合乳腺癌细胞的DNA适配体”中记载的(I)～(IV)四组中的两种以上的DNA适配体，例如使用选自(I)～(III)三组中的两种以上的DNA适配体。这是因为(I)～(III)三组的DNA适配体分别来源于07-MB231适配体、14A-MCF7适配体和08B-MCF7适配体，这些DNA适配体表现出其结合能力根据乳腺癌细胞的细胞株而不同。例如，07-MB231适配体只与三阴性细胞即MDA-MB-231细胞结合，因此含有来源于本DNA适配体的(I)(a)或(b)的核苷酸序列的DNA适配体可以判断是否为三阴性细胞，可以用于三阴性乳腺癌的诊断，因此尤其有用。三阴性乳腺癌是指乳腺癌致病基因即雌激素受体(Estrogen Receptor：ER)、孕酮受体(Progesterone Receptor：PR)和人表皮生长因子受体2(Human Epidermal growth factorReceptor 2：HER2)均未确认到过量表达的类型的乳腺癌。正因为如此，已知没有确立的治疗策略且预后不良，此外其检测也较为困难。
实施例
<实施例1：Cell-SELEX>
细胞株：
实施例中使用的细胞株的获得来源及其培养基如下：来源于人乳腺癌的细胞株MCF7(日本理研生物资源中心(BRC)，RCB1904，MEM)、T-47D(ATCC，HTB-133TM，RPMI1640培养基)、MDA-MB-231(ATCC，HTB-26TM，无CO2环境下为L15培养基，CO2环境下为DMEM培养基)、MDA-MB-453(BRC，RCB1192，无CO2环境下为L15培养基，CO2环境下为DMEM培养基)、来源于人乳腺纤维化的细胞株MCF 10A(ATCC，CRL-10317TM，MEGM培养基)、来源于大肠癌的细胞株HCT-116(BRC，RCB2979，DMEM培养基)、来源于肺癌的细胞株A549(BRC，RCB0098，F12K培养基)、来源于胃癌的细胞株MKN45(BRC，RCB1001，RPMI1640培养基)、来源于卵巢癌的细胞株NIH:OVCAR-3(BRC，RCB2135，RPMI1640培养基)、来源于前列腺癌的细胞株PC-3(ATCC，CRL-1435，RPMI1640培养基)、来源于胰腺癌的细胞株MIAPaca2(日本东北大学加龄医学研究所，TKG0227，RPMI1640培养基)、Panc1(日本东北大学加龄医学研究所，TKG0606，RPMI1640培养基)、来源于肝癌的细胞株PLC/PRT/5(JCRB，JCRB0406，RPMI1640培养基)、来源于宫颈癌的细胞株HeLa(BRC，BRC0007，MEM培养基)、来源于髓细胞白血病的细胞株KG-1(BRC，RCB1166，RPMI1640培养基)、来源于急性淋巴性白血病的细胞株CCRF-CEM(日本东北大学加龄医学研究所，I-4924，RPMI1640培养基)、人脐带血内皮细胞株Huvec(Lonza，CC-2519，MEG培养基)。除非另有说明，在所有实施例中使用上述细胞株。
(Cell-SELEX)
首先按照WO2013/073602中记载的方法制备DNA文库。DNA文库由含有以下共95个核苷酸序列的核酸构成，该序列由两末端的引物序列(25个碱基)和中间部分的45个碱基的随机序列组成。在45个碱基的随机序列中的两处，引入人工碱基Ds，其引入位置可以根据构成随机序列5’末端的3个碱基的序列(标签序列)进行决定。对这些具有标签序列的24种子文库进行化学合成并混合，从而制备DNA文库(N42Ds3nmix-P003)(表1)。
[表1]
表1：试验所使用的文库和引物序列一览
名称 序列 SEQ ID No：
N42Ds-01 5’-GAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3′ 53
N42Ds-02 5’-GACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3’ 54
N42Ds-03 5’-CAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3′ 55
N42Ds-04 5’-CACNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3′ 56
N42Ds-05 5’-AGGNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3′ 57
N42Ds-06 5’-GGANNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3’ 58
N42Ds-07 5′-GGGNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3’ 59
N42Ds-08 5′-GGCNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3′ 60
N42Ds-09 5′-GGTNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNN-3′ 61
N42Ds-10 5′-CGANNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 62
N42Ds-11 5’-CGGNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3′ 63
N42Ds-12 5’-CGCNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3′ 64
N42Ds-13 5’-CGTNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 65
N42Ds-14 5’-TGGNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 66
N42Ds-15 5′-TGCNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 67
N42Ds-16 5’-ACGNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNN-3′ 68
N42Ds-17 5′-GCANNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNN-3′ 69
N42Ds-18 5’-GCGNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 70
N42Ds-19 5′-GCCNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 71
N42Ds-20 5′-GCTNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 72
N42Ds-21 5′-CCANNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 73
N42Ds-22 5’-CCGNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 74
N42Ds-23 5’-CCCNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 75
N42Ds-24 5’-CCTNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNN-3’ 76
5’-Rev019 5’-ACGACCGTTCTCTAATTTTGACGTT-3’ 77
3’T15-L-Fow026 5′-TTTTTTTTTTTTTTT-C12spacer-ACCAAATTATTGCGATACAGACCCT-3′ 78
3′-Fow026 5’-ACCAAATTATTGCGATACAGACCCT-3’ 79
以上述文库2000pmol为起始，实施针对乳腺癌细胞株MCF7的Cell-SELEX。同样地，关于乳腺癌细胞株T-47D、乳腺癌细胞株MDA-MB-231，以上述文库1000pmol为起始原料实施Cell-SELEX。关于Cell-SELEX的方法，按照非专利文献1中记载的方法实施；关于含有人工碱基的DNA文库的操作，按照WO2013/073602中记载的方法实施。
从第3轮开始，使用来源于非癌性的乳腺上皮性细胞株MCF10A作为对照细胞，按照非专利文献1中记载的方法进行反向筛选。将各细胞中的筛选条件示于表2～4。
[表2]
Figure BDA0001645406220000331
[表3]
Figure BDA0001645406220000341
[表4]
Figure BDA0001645406220000351
对各轮中得到的DNA池的5’末端，利用PCR并用Alexa488进行荧光标记，使用流式细胞仪确认结合序列的富集。具体而言，将25pmol用Alexa488标记的各轮池DNA在D-PBS(-)中95℃加热5分钟，然后在室温下放置20分钟，从而进行折叠。将这些标记DNA与MCF7细胞无酶悬浮液(2.5×105个细胞)在4℃孵育30分钟(0.45％葡萄糖、0.1mg/mL tRNA、1mg/mLBSA、5mM MgCl2/D-PBS(-))。用洗涤缓冲液(0.45％葡萄糖、5mM MgCl2)洗脱未结合细胞的标记DNA，然后用流式细胞仪(S3细胞分选仪，BIO-Rad)对结合各细胞的DNA适配体分析荧光强度的变化。
结果显示，在MCF7Cell-SELEX中，从第5轮开始，荧光强度开始发生变化，该荧光强度增强至第7轮。在MDA-MB231中从第6轮开始发生变化，在第7轮荧光强度进一步增强。用细胞分选仪(S3细胞分选仪，BIO-Rad)分离第7轮的荧光强度变化的群体(荧光标记的DNA与细胞结合的群体)。
<实施例2：确定通过Cell-SELEX获得的DNA的序列>
利用Ion PGM测序仪(赛默飞世尔科技公司)，对从分类的细胞中获得的DNA的核苷酸序列进行确定。MCF7 Cell-SELEX中，从总读段(read)数246,903个序列中选取正确保持两末端引物序列的序列时，结果分析对象为80,592个序列。以选取的序列为基础，在将1个碱基不同的序列视为衍生序列的条件下进行聚类，确认序列的富集程度时，结果举出10个序列作为富集候选物。分别化学合成这些候选序列，并对每一个进行结合能力筛选，缩小至2个序列(14A-MCF7(SEQ ID NO:4)和08B-MCF7(SEQ ID NO:17))。
T-47D Cell-SELEX(第1次)中，从总读段数638,160个序列中选取正确保持两末端引物序列的序列时，结果分析对象为205,801个序列。以选取的序列为基础，在将1个碱基不同的序列视为衍生序列的条件下进行聚类时，结果富集的序列(03-T47D(SEQ ID NO:27))占整体的76％。
MDA-MB-231Cell-SELEX中，从总读段数497,341个序列中选取正确保持两末端引物序列的序列时，结果分析对象为128,607个序列。以选取的序列为基础，在将1个碱基不同的序列视为衍生序列的条件下进行聚类，并确认序列的富集程度时，结果23-MB231(SEQ IDNO:49)36.6％、05-MB231(SEQ ID NO:34)17.5％、07-MB231(SEQ ID NO:42)14.2％这三个序列高度富集。
<实施例3：通过Cell-SELEX获得的DNA适配体的二次筛选>
关于含有在实施例2获得的序列的DNA适配体，按照WO2013/073602的实施例3中记载的方法进行二次筛选(Doped selection，掺杂筛选)，推定各DNA适配体的二级结构。二次筛选中，使用按照经原始一次筛选而获得的原始序列的各碱基组成占55％、其他核苷酸各占15％的比例制备的文库(Doped-14A、Doped-08B、Doped-03-T47D short、Doped-05-MB231、Doped-07-MB231、Doped-23-MB231)，再次进行筛选。
筛选条件为仅使用靶细胞MCF7、T-47D或MDA-MB-231，实施4轮。将各DNA适配体的二次筛选条件示于下述表5～表7。
[表5]
Figure BDA0001645406220000381
[表6]
Figure BDA0001645406220000391
[表7]
Figure BDA0001645406220000401
将通过Cell-SELEX获得的DNA适配体的序列示于图1～6。二次筛选的结果，将一次筛选获得的序列的保留率为85％以上的碱基用圆圈框住。
<实施例4：14A-MCF7适配体的改变>
以在实施例3获得的14A-MCF7(53DsDs)(SEQ ID NO:4)为基础，设计将第17位的Ds置换为A而成的14A-MCF7(53ADs)(SEQ ID NO:5)、将第28位的Ds置换为A而成的14A-MCF7(53DsA)(SEQ ID NO:6)、将第17位和第28位的Ds置换为A而成的14A-MCF7(53AA)(SEQ IDNO:7)、将3’末端侧的凸起部分的AG置换为TT并将茎部的一部分错配部分置换为形成碱基对而成的14A-MCF7(Opt53DsDs)(SEQ ID NO:3)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图7)。
作为阳性对照，也化学合成了表现出结合癌细胞而被报道的以核仁素为靶标的AS1411(SEQ ID NO:81)(本说明书中也简称为“AS1411”)；作为阴性对照，也化学合成了使与核仁素结合能力缺失的AS1411的突变体Cont26(SEQ ID NO:82)(本说明书中也简称为“Cont26”)。使用如上制备的DNA适配体，与实施例1同样地通过荧光强度的变化分析针对各MCF-7细胞的结合性(以25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL进行孵育)。结果确认到14A-MCF7(53ADs)中与原DNA适配体(14A-MCF7(53DsDs))相比活性降低，14A-MCF7(53DsA)中活性消失，由此提示了序列中的两处Ds均与结合有关，尤其是3’末端侧的Ds与结合有很大关系(图8)。此外，在具有凸起部分和茎部发生变更的序列的DNA适配体14A-MCF7(Opt53DsDs)中，确认到与原DNA适配体具有相同程度的活性，这提示了这些部分基本与DNA适配体的结合活性无关。
接着，对能够影响结合的茎部长度进行了研讨。具体而言，以14A-MCF7(53DsDs)为基础，设计了从5’末端和3’末端分别除去8个碱基共16个碱基而成的14A-MCF7(37DsDs)(SEQ ID NO:8)、从14A-MCF7(37DsDs)中再除去由AG组成的凸起结构并将茎部末端的几个碱基置换为GC碱基对而成的14A-MCF7(35DsDs)(SEQ ID NO:9)、在14A-MCF7(35DsDs)的3’末端添加小发夹而成的14A-MCF7mh(44DsDs)(SEQ ID NO:10)、对茎部结构分别除去1对、2对、3对GC碱基对而成的14A-MCF7mh(SEQ ID NO:11)、14A-MCF7mh(40DsDs)(SEQ ID NO:12)、14A-MCF7mh(38DsDs)(SEQ ID NO:13)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图9)。分别在4℃以250nM(25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL)孵育30分钟，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度变化来确定与细胞的结合性。
由该结果可以确认到对于任何MCF7细胞都具有结合性(图10)。这些结果表明，即使缩短末端的茎部结构或在末端添加小发夹，也能保持相同的活性。
<实施例5：08B-MCF7DNA适配体的改变>
在08B-MCF7适配体中也进行了改变。具体而言，以08B-MCF7(51DsDs)(SEQ ID NO:20)为基础，设计了将第18位的Ds置换为A而成的08B-MCF7(51ADs)(SEQ ID NO:21)、将第32位的Ds置换为A而成的08B-MCF7(51DsA)(SEQ ID NO:22)、将第18位和第32位的Ds置换为A而成的08B-MCF7(51AA)(SEQ ID NO:23)、在08B-MCF7(51DsDs)中添加小发夹而成的08B-MCF7mh(SEQ ID NO:24)、将08B-MCF7mh内部的茎环置换为小发夹而成的08B-MCF7mh2(SEQID NO:25)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图11)。
分别在4℃以250nM(25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL)孵育30分钟，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度变化来确定与细胞的结合性。
结果示于图12。确认到08B-MCF7(51ADs)中活性得以保持，08B-MCF7(51DsA)中活性下降，由此提示了5’侧(第18位)的Ds与细胞结合无关，细胞结合性只依赖于3’侧(第32位)的Ds。由于5’侧的Ds无助于细胞结合，因此合成将5’侧的茎环置换为小发夹而成的08B-MCF7mh2并进行试验，结果其也结合MCF7细胞(图12)。
<实施例6：03-T47D适配体的改变>
在03-T47D适配体中也进行了改变。具体而言，以在03-T47D(SEQ IDNO:27)的末端添加GC碱基对而成的03-T47D(DsDs)(SEQ ID NO:29)为基础，设计了将第24位的Ds置换为A而成的03-T47D(DsA)(SEQ ID NO:30)、将第15位的Ds置换为A而成的03-T47D(ADs)(SEQ IDNO:31)、将第15位和第24位的Ds置换为A而成的03-T47D(AA)(SEQ ID NO:32)、在03-T47D(DsDs)的末端添加小发夹而成的03-T47Dmh(SEQ ID NO:33)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图13)。
分别在4℃以250nM(25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL)孵育30分钟，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度变化来确定与细胞的结合性。
结果示于图14。在03-T47D(DsA)和03-T47D(ADs)两者中确认到结合降低，这提示了序列中的两个Ds都与细胞结合有关。此外，关于在末端添加小发夹而成的DNA适配体(03-T47Dmh)，也确认到与细胞的结合(图14)。
<实施例7：05-MB231适配体的改变>
在05-MB231适配体中也进行了改变。具体而言，以将05-MB231(SEQ ID NO:34)末端的一部分茎部置换为GC碱基对而成的05-MB231(DsDs)(SEQ ID NO:36)为基础，设计了将第44位的Ds置换为A而成的05-MB231(DsA)(SEQ ID NO:37)、将第33位的Ds置换为A而成的05-MB231(ADs)(SEQ ID NO:38)、将第33位和第44位的Ds置换为A而成的05-MB231(AA)(SEQID NO:39)、将05-MB231(DsDs)末端的一部分序列除去并将一部分茎部置换为GC碱基对而成的05-MB231GC(SEQ ID NO:40)，以及在05-MB231GC中添加小发夹而成的05-MB231GCmh(SEQ ID NO:41)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图15)。
分别在4℃以250nM(25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL)孵育30分钟，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度变化来确定与细胞的结合性。
结果示于图16。在05-MB231(ADs)中确认到结合能力降低，但在05-MB231(DsA)中则未确认到结合降低，由此表示3’侧的Ds与结合无关。关于含有将该区域除去后而成的序列(05-MB231GC)和在其末端添加小发夹而成的序列(05-MB231GCmh)的DNA适配体，也确认到结合。
<实施例8：07-MB231适配体的改变>
在07-MB231适配体中也进行了改变。具体而言，以将07-MB231(SEQ ID NO:42)末端的一部分茎部置换为GC碱基对而成的07-MB231(DsDs)(SEQ ID NO:44)为基础，设计了将第28位的Ds置换为A而成的07-MB231(DsA)(SEQ ID NO:46)、将第15位的Ds置换为A而成的07-MB231(ADs)(SEQ ID NO:47)、将第15位和第28位的Ds置换为A而成的07-MB231(AA)(SEQID NO:48)、在07-MB231的末端添加小发夹而成的07-MB231mh(SEQ ID NO:45)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图17)。
分别在4℃以250nM(25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL)孵育30分钟，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度变化来确定与细胞的结合性。
结果示于图18。在07-MB231(DsA)和07-MB231(ADs)中都确认到结合能力降低，在07-MB231(ADs)中确认到更明显的结合能力降低，由此提示了结构中的两个Ds都与细胞结合有关，尤其是5’侧的Ds和与细胞的结合有很大关系。关于含有在末端添加小发夹而成的序列的DNA适配体(07-MB231mh)，也确认到结合。
<实施例9：23-MB231适配体的改变>
在23-MB231适配体中也进行了改变。具体而言，以23-MB231b(SEQ ID NO:51)为基础，设计了在末端添加小发夹而成的23-MB231bmh(SEQ ID NO:52)，并化学合成具有各核苷酸序列的DNA适配体(各核苷酸序列和由掺杂筛选预测的二级结构示于图19)。
分别在4℃以250nM(25pmol Alexa488标记DNA/2.5×105个细胞/100μL)孵育30分钟，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度变化来确定与细胞的结合性。
结果示于图20。关于任何DNA适配体都确认到结合。
<实施例10：DNA适配体的亲和性(KD)研讨>
使用经优化并稳定化的DNA适配体，对比研讨了对于靶细胞株的亲和性。方法是对DNA适配体进行Alexa488标记，并用流式细胞仪分析由细胞结合而产生的荧光强度的变化。
具体而言，将标记DNA适配体连续稀释至100nM、50nM、25nM、10nM、5nM、2.5nM、1nM或0nM的终浓度，并与2.5×105细胞的MCF7的无酶悬浮液在4℃孵育30分钟，洗涤两次后，用流式细胞仪测定荧光强度(重复3次)。基于各浓度下得到的荧光值，用Kaleida Graph计算Kd值。计算公式为y＝m1×M0/(m2+M0)。
结果示于图21～26和表8。关于来源于08B-MCF7、14A-MCF7、05-MB231和07-MB231的适配体，在基本结构和在末端添加小发夹而成的结构中的任一种中都对于细胞具有数nM程度的非常强的结合能力。关于来源于03-T47D和23-MB231的适配体，具有数十nM～数nM程度的结合能力。
[表8]
表8：各适配体针对靶细胞株的结合亲和性
适配体名称 Kd值
14A-MCF7(37DsDs) 2.1nM±0.1
14A-MCF7mh(44DsDs) 1.9nM±0.2
14A-MCF7mh 2.1nM±0.2
14A-MCF7mh(40DsDs) 2.2nM±0.2
14A-MCF7mh(38DsDs) 2.6nM±0.02
08B-MCF7(51DsDs) 3.2nM±0.3
08B-MCF7mh 2.5nM±0.1
08B-MCF7mh2 2.3nM±0.1
03-T47D(DsDs) 91.6nM±6.7
03-T47Dmh 39.3nM±3.0
05-MB231GC 2.2nM±0.2
05-MB231GCmh 1.6nM±0.1
07-MB231(DsDs) 2.2nM±0.5
07-MB231mh 2.0nM±0.3
23-MB231b 23.3nM±5.6
23-MB231bmh 2.5nM±0.9
<实施例11：Tm值的计算>
来源于14A-MCF7适配体的适配体和来源于08B-MCF7适配体的适配体的Tm值用UV-2450(岛津制作所)进行测定(3次平均)。
具体而言，将各DNA适配体用D-PBS(-)进行稀释，取260pmol/130μL到准备的5ml圆管中。将其在95℃加热3分钟，然后在干燥器中脱气1分钟。将这些样品转移到比色皿中，在15～100℃的温度条件以0.5℃/秒的速度提升温度，测定260nm处的吸光度。数据用IGORpro绘制图表，将进行的3次值平均化后显示出来。
结果示于图27和表9。
[表9]
表9：各适配体的Tm值
适配体名称 Tm值
08B-MCF7(51DsDs) 57.2℃
08B-MCF7mh 59.7℃
08B-MCF7mh2 57.0℃
14A-MCF7(35DsDs) 71.5℃
14A-MCF7mh(44DsDs) 73.0℃
14A-MCF7mh 68.0℃
14A-MCF7mh(40DsDs) 64.7℃
14A-MCF7(38DsDs) 59.9℃
来源于14A-MCF7的适配体在260nm处的吸光度从靠近60℃开始急剧变化，而来源于08B-MCF7的适配体则平缓地变化。这提示了在结构热稳定性方面，来源于14A-MCF7的适配体优于来源于08B-MCF7的适配体。
<实施例12：结合竞争抑制试验>
关于细胞结合能力特别强的4种DNA适配体(14A-MCF7mh、08B-MCF7mh、05-MB231GCmh和07-MB231mh)的细胞结合性，进行竞争实验，对结合靶标的同一性进行研讨。即，对DNA适配体进行Alexa488标记，并用流式细胞仪分析由细胞结合而产生的Kd值浓度附近的荧光强度的变化是否在其他DNA适配体的存在下发生变化。
具体而言，将标记DNA适配体的终浓度设为2.5nM或5nM，将竞争性DNA适配体以0nM、1nM、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM混合。将各DNA适配体与2.5×105细胞的MCF7的无酶悬浮液在4℃孵育30分钟，用洗涤缓冲液(0.45％葡萄糖、5mM MgCl2)洗涤两次后，用流式细胞仪测定荧光强度。此时，作为使用的细胞株，在荧光标记结合物为14A-MCF7mh、08B-MCF7mh时使用MCF7细胞株，在荧光标记结合物为05-MB231GCmh、07-MB231mh时使用MDA-MB-231细胞株。
结果示于表10。14A-MCF7mh表现出与08B-MCF7mh2的结合竞争，而关于05-MB231GCmh和07-MB231mh，在细胞结合方面未受到其他DNA适配体的存在的干扰。这提示了14A-MCF7mh和08B-MCF7mh2具有相同的结合靶标，而05-MB231GCmh和07-MB231mh各具有特异性的结合靶标。
[表10]
08B-MCF7mh2 14A-MCF7mh 05-MB231GCmh 07-MB231mh
14A-MCF7mh + + - -
05-MB231GCmh - - + -
07-MB231mh - - - +
<实施例13：各DNA适配体的细胞结合特异性>
为了确认获得的DNA适配体的结合特异性，对这些Alexa488标记结合物和各种培养癌细胞株进行孵育，与实施例1同样地用流式细胞仪由荧光强度的变化来分析有无结合。使用AS1411作为阳性对照，使用AS1411的突变体Cont26作为阴性对照，根据其荧光强度的变化进行判断。将确认到比Cont26弱的荧光强度者评为-，将确认到比Cont26强的荧光强度者评为+，将确认到比AS1141强的荧光强度者评为++。
结果示于表11。
[表11]
Figure BDA0001645406220000481
如表11所示，14A-MCF7mh、08B-MCF7mh2都只在MCF7细胞株中观察到表示细胞结合的强荧光强度的变化。此外，关于07-MB231mh则观察到针对MDA-MB-231细胞株的特异性结合。另一方面，关于03-T47Dmh和05-MB231GCmh，则观察到其与除非癌细胞以外的基本所有癌细胞株结合。
<实施例14：DNA适配体的细胞内定位的确认>
为了确认各DNA适配体的结合定位，在OPTI-MEM(GibcoBRL)中在4℃或37℃对250nM的Alexa488标记的DNA适配体孵育30分钟。使用为各DNA适配体来源的细胞。在上述培养基中预先添加使晚期内体和溶酶体染色的LysoTracker Red DND-99(MolecularProbes)75nM，用来作为定位细胞内细胞器标志物的指标。将经孵育的细胞用4％多聚甲醛固定，进行DAPI染色并密封，作为样品。关于这些样品，用ECLIPSE Ti(尼康)进行荧光显微镜观察，用FV10i或FV1200(均为奥林巴斯)进行共聚焦显微镜观察。
结果示于图28～31。在任何DNA适配体中，都观察到Alexa488的荧光在细胞表面上呈点状散布，可观察到结合于细胞表面上的状态(图28～29)。此外其中，在使用14A-MCF7mh的共聚焦显微镜观察中，观察到Alexa488的荧光不仅定位于细胞表面，而且还定位于核内体(与LysoTracker共同定位)(图30)。这提示了与细胞膜表面上的某种靶标结合的14A-MCF7mh适配体通过内吞作用被摄入到细胞内，逐渐向核内体(溶酶体)转移。
另一方面，关于用作阳性对照的AS1411，观察到在细胞表面呈点状定位(与LysoTracker的定位不一致)(图31)。这提示了本发明的DNA适配体与AS1141具有不同的细胞摄取系统(即靶标不同)。
<实施例15：各种DNA适配体对培养细胞影响的研讨>
使用各种培养癌细胞株，对获得的各DNA适配体的细胞增殖抑制效果进行验证。将粘壁性的各种癌细胞(MCF7/MEM培养基、T47D/RPMI培养基、MDA-MB-231/DMEM培养基、MDA-MB-453/DMEM培养基、MIAPaca2/RPMI培养基、PC-3/RPMI培养基、HCT-116/DMEM培养基、A549/DMEM培养基)在添加药物前一天以从1×103调整为2.5×103细胞/孔地接种到96孔板上。将来源于髓细胞白血病的细胞株KG-1(RPMI培养基)在添加药物约2小时前按照4×104细胞/mL以90μL/孔进行接种。非癌细胞(MCF10A和HUVEC)以4×103细胞/孔进行接种。
将各DNA适配体用D-PBS(-)稀释至100μM，将其溶液在95℃加热5分钟，然后在室温下放置20分钟以上，从而进行折叠。核酸的对照样品使用AS1411和Cont26，用D-PBS(-)稀释至50μM或100μM，从95℃起以1℃/分的速度逐渐冷却并进行折叠。低分子化合物的对照样品使用现有抗癌药物紫杉醇(西格玛奥德里奇，简称PTX，终浓度为10nM)、氟尿苷(NacalaiTesque公司，简称FUdR，终浓度为10nM)。关于DNA适配体，在分别指定的培养基中以终浓度为1μM、2.5μM、5μM或10μM地进行10倍稀释并通过培养基交换添加(贴壁细胞)，或者将用D-PBS(-)稀释到终浓度的10倍浓度后的样品直接向细胞溶液中添加10μL。关于PTX是用各培养基稀释1000倍再添加细胞，关于FUdR是稀释10倍再添加细胞。此外，关于各溶剂D-PBS(-)、纯DMSO，也作为溶剂对照组设定处理组。添加药物后，培养4天(贴壁细胞)或3天(游离细胞)。使用活细胞数测定试剂(WST-8检测试剂盒，Nacalai Tesque公司)进行检测，用Arvo多标记计数器(珀金埃尔默公司)测定各孔在450nm处的吸光度，将这些结果在只进行了培养基交换的组中进行标准化，评价细胞增殖。
图32-1～32-3表示非荧光标记的各DNA适配体(08B-MCF7mh、14A-MCF7mh、05-MB231GCmh、07-MB231mh、03-T47Dmh)的针对用于获取各DNA适配体的靶标癌细胞(08B-MCF7mh和14A-MCF7mh为MCF7细胞，05-MB231GCmh和07-MB231mh为MB231细胞，03-T47Dmh为T47D细胞)的增殖抑制效果的研讨结果。由此可知，05-MB231GCmh与阳性对照AS1411同样地表现出浓度依赖性的细胞增殖抑制效果，未发现对非癌细胞MCF10A的增殖抑制。还可知除05-MB231GCmh以外的DNA适配体与阴性对照Cont26同样地对靶标癌细胞、非癌细胞的细胞增殖均未产生影响。
图33-1～33-3表示使用针对靶标癌细胞表现出细胞增殖抑制效果的05-MB231GCmh的一个碱基置换物05-MB231GCmm h(SEQ ID NO:80)对针对各种癌细胞的增值抑制效果的研讨结果。结果可知，05-MB231GCmmh与05-MB231GCmh相同，不仅针对靶标癌细胞株MDA-MB231，而且针对各种癌细胞的增殖也具有浓度依赖性的抑制效果。另一方面，与图32-1～32-3相同，对于非癌细胞MCF10A和HUVEC，则基本没有确认到增殖抑制效果。
本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请通过直接引用而并入本说明书。
序列表
<110> 塔古西库斯生物株式会社
<120> 结合癌细胞的DNA适配体
<130> PH-6612-PCT
<150> JP 2015-214591
<151> 2015-10-30
<160> 83
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
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<220>
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<400> 20
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (32)..(32)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 21
ggcccggctg gcatgtaatc atgcctcctg gnctaaggtt tctaaagggc c 51
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (18)..(18)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 22
ggcccggctg gcatgtantc atgcctcctg gactaaggtt tctaaagggc c 51
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
ggcccggctg gcatgtaatc atgcctcctg gactaaggtt tctaaagggc c 51
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (18)..(18)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 24
ggcccggctg gcatgtantc atgcctcctg gnctaaggtt tctaaagggc ccgcgtagcg 60
<210> 25
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (25)..(25)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 25
ggcccggctg gcgaagcctc ctggnctaag gtttctaaag ggcccgcgta gcg 53
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
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ggcccggctg gcgaagcctc ctggnctaag gtttctaaag ggcc 44
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<220>
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<220>
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<222> (22)..(22)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 27
ggcgaagatc acnactaggg gncctcgagc c 31
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> n为a、c、g或t
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<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<210> 29
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<220>
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<220>
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<220>
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<211> 33
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<400> 30
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<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 31
gcggcgaaga tcacaactag gggncctcgc cgc 33
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
gcggcgaaga tcacaactag gggacctcgc cgc 33
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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ggctttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agatgtaacg tcangagcc 49
<210> 39
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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ggctttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agatgtaacg tcaagagcc 49
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<211> 36
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
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<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (15)..(15)
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
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ccgcgcagcc tgggatctct tttagtcaag ttcaatcgcg cgg 43
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<223> 合成构建体
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<220>
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<220>
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<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
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<220>
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<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
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<222> (23)..(23)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(45)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(21)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(20)
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<222> (22)..(31)
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<222> (32)..(32)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(45)
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<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(19)
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (4)..(18)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(45)
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
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<223> 合成构建体
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<220>
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (4)..(16)
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<220>
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<220>
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<220>
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cggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (4)..(16)
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<220>
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<222> (30)..(30)
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(16)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
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<220>
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<222> (31)..(31)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(45)
<223> n为a、c、g或t
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gcannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 70
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<222> (29)..(45)
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gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
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<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(19)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(45)
<223> n为a、c、g或t
<400> 71
gccnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 72
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(19)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
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<222> (21)..(28)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(45)
<223> n为a、c、g或t
<400> 72
gctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 73
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(18)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(28)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(45)
<223> n为a、c、g或t
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ccannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 74
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(18)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(29)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(45)
<223> n为a、c、g或t
<400> 74
ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 75
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(16)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(29)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(45)
<223> n为a、c、g或t
<400> 75
cccnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 76
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(17)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(30)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n为7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(45)
<223> n为a、c、g或t
<400> 76
cctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45
<210> 77
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 77
acgaccgttc tctaattttg acgtt 25
<210> 78
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n为间隔子C12 CE亚磷酰胺(Spacer C12 CE Phosphoramidite)
<400> 78
tttttttttt tttttnacca aattattgcg atacagaccc t 41
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 79
accaaattat tgcgatacag accct 25
<210> 80
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基
<400> 80
ggcgccaggg gtgtttgtgc cgtgagntgt ggcgcccgcg aagcg 45
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
cctcctcctc cttctcctcc tcctcc 26
<210> 83
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
cgcgtagcg 9

Claims (10)

1.结合癌细胞的DNA适配体，其由核苷酸序列组成，其中
当所述癌选自乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、白血病和肺癌时，所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO：33和41；
当所述癌选自乳腺癌、前列腺癌和肺癌时，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：45；或
当所述癌是乳腺癌时，所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO：8、10、11、12、13、20、24、25、29、40、44、51、52、33、41和45。
2.根据权利要求1所述的DNA适配体，其中所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。
3.根据权利要求1所述的DNA适配体，其中所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO：33和SEQID NO：41。
4.根据权利要求1所述的DNA适配体，其中所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：45。
5.癌检测用试剂，其含有权利要求1～4中任一项所述的DNA适配体。
6.癌细胞检测用试剂盒，其含有权利要求1～4中任一项所述的DNA适配体。
7.用于将抗癌药物递送至癌细胞的药物组合物，其含有权利要求1～4中任一项所述的DNA适配体和所述药物。
8.由选自SEQ ID NO：33和41的核苷酸序列组成的一种或多种DNA适配体用于制造下列产品的用途：
癌检测用试剂、
癌细胞检测或分类用试剂盒、或
用于将抗癌药物递送至癌细胞的药物组合物，
其中所述癌选自：乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、白血病和肺癌。
9.由SEQ ID NO：45的核苷酸序列组成的DNA适配体用于制造下列产品的用途：
癌检测用试剂、
癌细胞检测或分类用试剂盒、或
用于将抗癌药物递送至癌细胞的药物组合物，
其中所述癌选自：乳腺癌、前列腺癌和肺癌。
10.由选自SEQ ID NO：8、10、11、12、13、20、24、25、29、40、44、51、52、33、41和45的核苷酸序列组成的一种或多种DNA适配体用于制造下列产品的用途：
癌检测用试剂、
癌细胞检测或分类用试剂盒、或
用于将抗癌药物递送至癌细胞的药物组合物，
其中所述癌是乳腺癌。
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