KR20180069845A - 암세포에 결합하는 dna 앱타머 - Google Patents

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이치로 히라오
미치코 히라오
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탁시스 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 종래의 앱타머보다 결합능, 특이성 및/또는 안정성이 높은 암세포에 대한 앱타머를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 인공 염기를 포함하는 암세포에 결합하는 DNA 앱타머에 의해 상기 과제를 해결한다.

Description

암세포에 결합하는 DNA 앱타머
본 발명은 인공 염기를 포함하는, 암세포에 결합하는 DNA 앱타머, 이 DNA 앱타머를 포함하는 의약 조성물 및 이 DNA 앱타머를 이용하여 암세포를 검출하는 방법 등에 관한 것이다.
표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 단편은 핵산 앱타머로 불리며 핵산 의약품으로서 의료에 대한 폭넓은 응용이 기대되고 있다. 최근에 저분자 물질이나 단백질뿐만 아니라 세포나 바이러스 자체도 핵산 앱타머의 표적이 될 수 있는 것이 나타나 있다(비특허문헌 1~3). 세포 전체를 표적으로 함으로써 세포 표면에 발현하는 수용체나 당쇄 등 그 세포를 특징짓는 표면 분자를 인식하는 앱타머를 취득할 수 있다.
또한, 최근에 암 치료에 있어서 암 마커의 발현 상태를 지표로 치료 방침을 결정하는 것이 일반적이 되고 있다. 그러나, 이미 알려져 있는 마커의 종류는 아직 부족한 것이 현실이다. 암세포를 표적으로 한 핵산 앱타머의 획득에 의해 다양한 암을 특징지을 수 있는 새로운 마커를 발견할 수 있으면 각종 암의 조기 진단에 도움이 될 수 있다. 또한, 암세포에 특이적으로 표적 결합하는 핵산 앱타머를 얻을 수 있으면 항암제나 약물 수송계(DDS)에 대한 응용도 가능해진다. 그러나, 종래의 핵산 앱타머는 치료 및 진단을 비롯한 의료 분야에 이용하기에 결합능, 특이성 및 안정성 등의 점에서 충분하다고 할 수 있는 것이 아니었다.
비특허문헌 1: Sefah, K. et al., Nature protocols 2010, 5, 6, pp.1169-1185 비특허문헌 2: Acquah, C. et al., Critical Reviews in Biotechnology 2015, early Online(Doi: 10.3109/07388551.2015.1083940) 비특허문헌 3: Meyer, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97, pp.7097-7109.
따라서, 종래의 핵산 앱타머보다 결합능, 특이성 및/또는 안정성이 높은 암세포에 대한 앱타머의 개발이 요구되었다.
본 발명자는 유방암 유래의 3종류의 세포주(MCF7, MDA-MB-231, T-47D) 각각을 표적으로 하여 본 발명자가 개발한 인공 염기를 포함하는 라이브러리를 이용한 Cell-SELEX법(WO2013/073602)을 실시하여 인공 염기를 포함하는 복수의 DNA 앱타머를 얻었다. 각각의 인공 염기 함유 DNA 앱타머는 표적으로 한 세포주에 매우 강고하게 결합되었지만, 비암세포와의 친화성은 거의 인정받지 못하였다. 또한, 얻어진 DNA 앱타머에 대해 더욱 연구를 행한 결과, 대부분의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머와 세포주에 따라 결합능이 다른 DNA 앱타머가 확인되었다. 전자의 DNA 앱타머는 광범위한 암세포를 검출할 수 있는 점에서, 후자의 DNA 앱타머는 암세포의 분류에 이용할 수 있다는 점에서 유용성이 높다고 생각된다.
본 발명은 상기 지견에 기초한 것으로, 이하의 태양을 포함한다.
(1) 이하의 (i) 또는 (ii)의 염기 서열을 포함하는, 암세포에 결합하는 DNA 앱타머:
(i) (a) N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(서열 번호 35)에 나타나는 염기 서열
(서열 중 N1~N5는 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N26은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N30은 N5와, N31은 N4와, N32는 N3과, N33은 N2와, N34는 N1과 염기쌍을 형성함) 또는
(b) (i) (a)에 나타나는 염기 서열의 N26 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열; 및
(ii) (a) N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(서열 번호 28)에 나타나는 염기 서열
(서열 중 N1~N6, N14, N25는 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N13 및 N22는 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N26은 N4와, N29는 N3과, N30은 N2와, N31은 N1과 염기쌍을 형성하고, N27 및 N28은 독립적으로 G, T, A, C 혹은 존재하지 않음) 또는
(b) (ii) (a)에 나타나는 염기 서열의 N13 및 N22 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열.
(2) (i) (a) 또는 (ii) (a)의 염기 서열이 1~5개의 GC쌍을 말단에 더 포함하는, (1)에 기재된 DNA 앱타머.
(3) 상기 염기쌍이 GC쌍인, (1) 또는 (2)에 기재된 DNA 앱타머.
(4) (i) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 35의 1위~5위 또는 30위~34위에서 이루어지는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(5) (ii) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 28의 1위~6위, 14위 또는 25위~31위에서 이루어지는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(6) (i) (a)의 염기 서열이 서열 번호 36, 37 또는 40에 나타나는 서열인, (1) 또는 (2)에 기재된 DNA 앱타머.
(7) (ii) (a)의 염기 서열이 서열 번호 29에 나타나는 서열인, (1) 또는 (2)에 기재된 DNA 앱타머.
(8) 3' 말단에 미니 헤어핀 구조를 더 포함하고,
상기 미니 헤어핀 구조가
5' 말단측에서 3' 말단측으로 향하여 차례대로 연결된 이하의 (A)~(C)의 핵산 영역:
(A) 2~5개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어지는 제1 핵산 영역,
(B) GNA 또는 GNNA(여기서, 각 n은 독립적으로 G, T, A 혹은 C 중 어느 하나임)의 염기 서열로 이루어지는 제2 핵산 영역 및
(C) 제1 핵산 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 제3 핵산 영역으로 이루어지며,
또한, 제1 핵산 영역 및 제3 핵산 영역이 서로 염기 대합한 줄기(stem) 부분과 제2 핵산 영역으로 이루어지는 루프 부분에 의해 구성되는, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(9) 이하의 (I)~(IV) 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는, 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머:
(I) (a) N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(서열 번호 43)에 나타나는 염기 서열
(서열 중 N1~N6, N18, N24, N31 및 N36은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N16은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N29는 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, G, T, A 혹은 C이고, N40은 N6과, N41은 N5와, N42는 N4와, N43은 N3과, N44는 N2와, N45는 N1과 염기쌍을 형성함) 또는
(b) (I) (a)에 나타나는 염기 서열의 N16 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열; 및
(II) (a) N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(서열 번호 2)에 나타나는 염기 서열
(서열 중 N1~N4, N7, N16, N23, N26 및 N31은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N6은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, G, T, A 혹은 C이며, N17은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이고, N27은 N3, N28은 N2와 염기쌍을 형성하며, N29 및 N30은 G, T, A, C 혹은 존재하지 않음) 또는
(b) (II) (a)에 나타나는 염기 서열의 N17 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열;
(III) (a) N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(서열 번호 18)에 나타나는 염기 서열
(서열 중 N1~N3, N13~N17, N19~N22, N33, N46~N48 및 N50은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N10~N12 및 N23~N25는 G, T, A, C 혹은 존재하지 않으며, N18은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, G, T, A 혹은 C 또는 존재하지 않고, N32는 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N49는 N3과, N51은 N1과 염기쌍을 형성하고, N10~N15 중 3개 이상이 N20~N25 중 3개 이상과 염기쌍을 형성함) 또는
(b) (III) (a)에 나타나는 염기 서열의 N32 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열;
(IV) (a) N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(서열 번호 50)에 나타나는 염기 서열
(서열 중 N1~N3, N15, N17, N20~N23, N25~N29, N31~N32, N34 및 N46은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N18 및 N30은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N47은 N3과, N48은 N2와, N49는 N1과 염기쌍을 형성함) 또는
(b) (IV) (a)에 나타나는 염기 서열의 N18 및 N30 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열.
(10) (I) (a), (II) (a), (III) (a) 또는 (IV) (a)의 염기 서열이 1~5개의 GC쌍을 말단에 더 포함하는, (9)에 기재된 DNA 앱타머.
(11) 상기 염기쌍이 GC쌍인, (9) 또는 (10)에 기재된 DNA 앱타머.
(12) (I) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 43의 1위~6위, 18위, 24위, 29위, 31위, 36위 또는 40위~45위에서 이루어지는, (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(13) (II) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 2의 1위~4위, 6~7위, 16위, 23위 또는 26위~31위에서 이루어지는, (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(14) (III) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 18의 1위~3위, 10위~25위, 33위 또는 46위~51위에서 이루어지는, (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(15) (IV) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 50의 1위~3위, 15위, 17위, 20위~23위, 25위~29위, 31위~32위, 34위 또는 46위~49위에서 이루어지는, (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(16) (I) (a)의 염기 서열이 서열 번호 44 또는 46에 나타나는 서열인, (9) 또는 (10)에 기재된 DNA 앱타머.
(17) (II) (a)의 염기 서열이 서열 번호 3~5, 8~9 및 14~16 중 어느 하나에 나타나는 서열인, (9) 또는 (10)에 기재된 DNA 앱타머.
(18) (III) (a)의 염기 서열이 서열 번호 20, 21 및 26 중 어느 하나에 나타나는 서열인, (9) 또는 (10)에 기재된 DNA 앱타머.
(19) (IV) (a)의 염기 서열이 서열 번호 51에 나타나는 서열인, (9) 또는 (10)에 기재된 DNA 앱타머.
(20) 3' 말단에 미니 헤어핀 구조를 더 포함하고,
상기 미니 헤어핀 구조가
5' 말단측에서 3' 말단측으로 향하여 차례대로 연결된 이하의 (A)~(C)의 핵산 영역:
(A) 2~5개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어지는 제1 핵산 영역,
(B) GNA 또는 GNNA(여기서, 각 N은 독립적으로 G, T, A 혹은 C 중 어느 하나임)의 염기 서열로 이루어지는 제2 핵산 영역 및
(C) 제1 핵산 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 제3 핵산 영역으로 이루어지며,
또한, 제1 핵산 영역 및 제3 핵산 영역이 서로 염기 대합한 줄기 부분과 제2 핵산 영역으로 이루어지는 루프 부분에 의해 구성되는, (9) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머.
(21) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머를 포함하는 암 검출제.
(22) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머를 포함하는 암세포 검출용 키트.
(23) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머를 포함하는 의약 조성물.
(24) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 (i) (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 DNA 앱타머로 이루어지는 항암제.
(25) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머와 약제를 포함하는, 약제를 암세포에 송달하기 위한 의약 조성물.
(26) 암세포를 검출하는 방법으로서,
피험체로부터 얻어진 세포를 포함한 샘플을 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
상기 샘플과 상기 DNA 앱타머의 결합에 기초하여 암세포를 검출하는 공정을 포함하는 상기 방법.
(27) 유방암 세포를 검출하는 방법으로서,
피험체로부터 얻어진 세포를 포함한 샘플을 (9) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
상기 샘플과 상기 DNA 앱타머의 결합에 기초하여 유방암 세포를 검출하는 공정을 포함하는 상기 방법.
(28) 피험체로부터 얻어진 암세포를 분류하는 방법으로서,
피험체로부터 얻어진 암세포를 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
상기 암세포와 상기 DNA 앱타머의 결합 유무 또는 강도를 측정하는 공정,
상기 결합 유무 또는 강도에 기초하여 암세포를 분류하는 공정을 포함하는 상기 방법.
(29) 피험체로부터 얻어진 유방암 세포를 분류하는 방법으로서,
피험체로부터 얻어진 유방암 세포를 (9) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
상기 유방암 세포와 상기 DNA 앱타머의 결합 유무 또는 강도를 측정하는 공정,
상기 결합 유무 또는 강도에 기초하여 유방암 세포를 분류하는 공정을 포함하는 상기 방법.
(30) 접촉 공정이 피험체로부터 얻어진 유방암 세포를 (9) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 (I)~(IV)의 4개의 군 중 적어도 2개의 군에서 선택되는 2종 이상의 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정인, (29)에 기재된 방법.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허출원번호 2015-214591호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의해 종래의 핵산 앱타머보다 결합능, 특이성 및/또는 안정성이 높은 암세포에 대한 DNA 앱타머가 제공된다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머에 의해 암에 걸리는 유무의 진단을 보조하는 방법, 암의 검출 방법과 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물 등이 제공된다.
[도 1]은 MCF7 세포에 대한 Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머(14A-MCF7)의 서열(서열 번호 4) 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 세컨드 셀렉션에서 85% 이상의 보존성이 인정된 염기를 동그라미로, 인공 염기인 Ds를 사각으로 나타낸다. 도면 중 굵은 선은 왓슨크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 염기를, 점선은 비왓슨크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 염기를 나타내고, 통상적인 선은 염기가 인산디에스테르 결합을 통해 연결되어 있음을 나타낸다. 굵은 선, 점선, 통상적인 선의 의미는 이하의 도 2~7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 대해 동일하다.
[도 2]는 MCF7 세포에 대한 Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머(08B-MCF7)의 서열(서열 번호 17) 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 세컨드 셀렉션에서 85% 이상의 보존성이 인정된 염기를 동그라미로, Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 3]은 T47D 세포에 대한 Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머(03-T47D)의 서열(서열 번호 27) 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 세컨드 셀렉션에서 85% 이상의 보존성이 인정된 염기를 동그라미로, Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 4]는 MB231 세포에 대한 Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머(05-MB231)의 서열(서열 번호 34) 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 세컨드 셀렉션에서 85% 이상의 보존성이 인정된 염기를 동그라미로, Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 5]는 MB231 세포에 대한 Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머(07-MB231)의 서열(서열 번호 42) 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 세컨드 셀렉션에서 85% 이상의 보존성이 인정된 염기를 동그라미로, Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 6]은 MB231 세포에 대한 Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머(23-MB231)의 서열(서열 번호 49) 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 세컨드 셀렉션에서 85% 이상의 보존성이 인정된 염기를 동그라미로, Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 7]은 실시예 4에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 14A-MCF7(53DsDs)(서열 번호 4)을 기초로 17위의 Ds를 A로 치환한 14A-MCF7(53ADs)(서열 번호 5), 28위의 Ds를 A로 치환한 14A-MCF7(53DsA)(서열 번호 6), 17위와 28위의 Ds를 A로 치환한 14A-MCF7(53AA)(서열 번호 7), 3' 말단측의 벌지 부분의 AG를 TT로 치환하고 줄기 부분의 미스매치 부분의 일부를 염기쌍을 형성하도록 치환한 14A-MCF7(Opt53DsDs)(서열 번호 3)을 설계하였다. Ds를 사각으로, Ds를 A로 치환한 부위를 화살촉으로 나타낸다.
[도 8]은 도 7에서 나타낸 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 9]는 실시예 4에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 14A-MCF7(53DsDs)을 기초로 5' 말단 및 3' 말단에서 각각 8염기 총 16염기를 제거한 14A-MCF7(37DsDs)(서열 번호 8), 14A-MCF7(37DsDs)에서 AG로 이루어지는 벌지 구조를 더 제거하고 말단의 줄기 중 몇 개를 GC쌍으로 치환한 14A-MCF7(35DsDs)(서열 번호 9), 14A-MCF7(35DsDs)의 3' 말단에 미니 헤어핀을 부가한 14A-MCF7mh(44DsDs)(서열 번호 10), 줄기 구조의 GC쌍을 각각 1쌍, 2쌍 및 3쌍 제거한 14A-MCF7mh(서열 번호 11), 14A-MCF7mh(40DsDs)(서열 번호 12) 및 14A-MCF7mh(38DsDs)(서열 번호 13)를 설계하였다. Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 10]은 도 9에서 나타낸 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 11]은 실시예 5에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 08B-MCF7(51DsDs)(서열 번호 20)을 기초로 18위의 Ds를 A로 치환한 08B-MCF7(51ADs)(서열 번호 21), 32위의 Ds를 A로 치환한 08B-MCF7(51DsA)(서열 번호 22), 18위 및 32위의 Ds를 A로 치환한 08B-MCF7(51AA)(서열 번호 23), 08B-MCF7(51DsDs)에 미니 헤어핀을 부가한 08B-MCF7mh(서열 번호 24), 08B-MCF7mh의 내부의 줄기 루프를 미니 헤어핀으로 치환한 08B-MCF7mh2(서열 번호 25)를 설계하였다. Ds를 사각으로, Ds를 A로 치환한 부위를 화살촉으로, 줄기 루프를 미니 헤어핀으로 치환한 부위를 화살촉을 부여한 사각으로 나타낸다.
[도 12]는 도 11에서 나타낸 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 13]은 실시예 6에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 03-T47D(DsDs)(서열 번호 29)를 기초로 24위의 Ds를 A로 치환한 03-T47D(DsA)(서열 번호 30), 15위의 Ds를 A로 치환한 03-T47D(ADs)(서열 번호 31), 15위 및 24위의 Ds를 A로 치환한 03-T47D(AA)(서열 번호 32), 03-T47D(DsDs)의 말단에 미니 헤어핀을 부가한 03-T47Dmh(서열 번호 33)를 설계하였다. Ds를 사각으로, Ds를 A로 치환한 부위를 화살촉으로 나타낸다.
[도 14]는 도 13에서 나타낸 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 15]는 실시예 7에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 05-MB231(DsDs)(서열 번호 36)을 기초로 44위의 Ds를 A로 치환한 05-MB231(DsA)(서열 번호 37), 33위의 Ds를 A로 치환한 05-MB231(ADs)(서열 번호 38), 33위 및 44위의 Ds를 A로 치환한 05-MB231(AA)(서열 번호 39), 05-MB231(DsDs)의 말단의 서열 일부를 제거하고 줄기의 일부를 GC쌍으로 치환한 05-MB231GC(서열 번호 40) 및 05-MB231GC에 미니 헤어핀을 부가한 05-MB231GCmh(서열 번호 41)를 설계하였다. Ds를 사각으로, Ds를 A로 치환한 부위를 화살촉으로 나타낸다.
[도 16]은 도 15에서 나타낸 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 17]은 실시예 8에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 07-MB231(DsDs)(서열 번호 44)을 기초로 28위의 Ds를 A로 치환한 07-MB231(DsA)(서열 번호 46), 15위의 Ds를 A로 치환한 07-MB231(ADs)(서열 번호 47), 15위 및 28위의 Ds를 A로 치환한 07-MB231(AA)(서열 번호 48), 07-MB231의 말단에 미니 헤어핀을 부가한 07-MB231mh(서열 번호 45)를 설계하였다. Ds를 사각으로, Ds를 A로 치환한 부위를 화살촉으로 나타낸다.
[도 18]은 도 17에서 나타낸 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 19]는 실시예 9에서 이용한 DNA 앱타머의 서열 및 추정 2차 구조를 나타낸다. 23-MB231b(서열 번호 51)를 기초로 말단에 미니 헤어핀을 부가한 23-MB231bmh(서열 번호 52)를 설계하였다. Ds를 사각으로 나타낸다.
[도 20]은 실시예 9에서 이용한 DNA 앱타머와 AS1411 및 Cont26의 세포에 대한 결합능을 플로우 사이토미터에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
[도 21]은 14A-MCF7(37DsDs) 및 그 개변체의, 플로우 사이토미터에 의한 Kd값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 DNA 앱타머의 농도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. A는 14A-MCF7(37DsDs), B는 14A-MCF7mh(44DsDs), C는 14A-MCF7mh, D는 14A-MCF7mh(40DsDs), E는 14A-MCF7mh(38DsDs)의 결과를 나타낸다.
[도 22]는 08B-MCF7(51DsDs) 및 그 개변체의, 플로우 사이토미터에 의한 Kd값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 DNA 앱타머의 농도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. A는 08B-MCF7(51DsDs), B는 08B-MCF7mh, C는 08B-MCF7mh2의 결과를 나타낸다.
[도 23]은 03-T47D(DsDs) 및 그 개변체의, 플로우 사이토미터에 의한 Kd값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 DNA 앱타머의 농도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. A는 03-T47D(DsDs), B는 03-T47Dmh의 결과를 나타낸다.
[도 24]는 05-MB231GC 및 그 개변체의, 플로우 사이토미터에 의한 Kd값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 DNA 앱타머의 농도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. A는 05-MB231GC, B는 05-MB231GCmh의 결과를 나타낸다.
[도 25]는 07-MB231(DsDs) 및 그 개변체의, 플로우 사이토미터에 의한 Kd값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 DNA 앱타머의 농도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. A는 07-MB231(DsDs), B는 07-MB231mh의 결과를 나타낸다.
[도 26]은 23-MB231b 및 그 개변체의, 플로우 사이토미터에 의한 Kd값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 DNA 앱타머의 농도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. A는 23-MB231b, B는 23-MB231bmh의 결과를 나타낸다.
[도 27]은 14A-MCF7(37DsDs) 및 14A-MCF7mh(44DsDs)와 08B-MCF7(51DsDs) 및 08B-MCF7mh의 Tm값의 측정 결과를 나타낸다. 가로축은 온도를 나타낸다. A는 260nm에서의 흡광도의 1차 도함수를, B는 260nm에서의 흡광도를 나타낸다.
[도 28]은 각 DNA 앱타머(08B-MCF7mh2, 14A-MCF7mh, AS1411)의 세포에의 결합 및 세포에서의 국재의 분석 결과를 나타낸다. A는 Alexa488의 형광을, B는 DAPI의 형광을, C는 투과광으로의 관찰 결과를 나타낸다.
[도 29]는 각 DNA 앱타머(05-MB231GCmh, 07-MB231mh, 23-MB231bmh)의 세포에의 결합 및 세포에서의 국재의 분석 결과를 나타낸다. A는 Alexa488의 형광을, B는 DAPI의 형광을, C는 투과광으로의 관찰 결과를 나타낸다.
[도 30]은 14A-MCF7mh(44DsDs) 앱타머의 세포에의 결합 및 세포에서의 국재의 분석 결과를 나타낸다.
[도 31]은 AS1411의 세포에의 결합 및 세포에서의 국재의 분석 결과를 나타낸다.
[도 32a]는 비표지의 08B-MCF7mh, 14A-MCF7mh 및 다른 약제의, 표적 암세포(MCF7)(A, C) 및 비암세포(MCF10A)(B, D)의 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다. FUdR은 플록슈리딘을, PTX는 파클리탁셀을 가리킨다. N.A.(Not available)는 측정하지 않았음을 의미한다.
[도 32b]는 비표지의 05-MB231GCmh, 07-MB231mh 및 다른 약제의, 표적 암세포(MB231)(A, C) 및 비암세포(MCF10A)(B, D)의 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다. FUdR은 플록슈리딘을, PTX는 파클리탁셀을 가리킨다.
[도 32c]는 비표지의 03-T47Dmh 및 다른 약제의, 표적 암세포(T47D)(A) 및 비암세포(MCF10A)(B)의 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다. FUdR은 플록슈리딘을, PTX는 파클리탁셀을 가리킨다.
[도 33a]는 비표지의 05-MB231GCmmh 앱타머 및 다른 약제의, 다양한 암세포(A: MCF7, B: T47D, C: MDA-MB231, D: MDA-MB453)의 증식에 대한 영향을 나타낸다. FUdR은 플록슈리딘을, PTX는 파클리탁셀을 가리킨다.
[도 33b]는 비표지의 05-MB231GCmmh 앱타머 및 다른 약제의, 다양한 암세포(A: MIAPaCa-2, B: PC-3, C: HCT116, D: A549)의 증식에 대한 영향을 나타낸다. FUdR은 플록슈리딘을, PTX는 파클리탁셀을 가리킨다.
[도 33c]는 비표지의 05-MB231GCmmh 앱타머 및 다른 약제의, 암세포(KG-1)(A) 및 비암세포(B: MCF10A, C: HUVEC)의 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다. FUdR은 플록슈리딘을, PTX는 파클리탁셀을 가리킨다.
1. 정의
본 명세서에서 사용하는 일반적인 용어의 정의에 대해 이하 설명한다.
본 명세서에서 「핵산」 또는 「핵산 분자」란 원칙적으로 뉴클레오티드를 구성 단위로 하고 이들이 인산디에스테르 결합에 의해 연결된 생체 고분자를 말한다.
본 명세서에서 「천연형 뉴클레오티드」란 자연계에 존재하는 뉴클레오티드로서, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 중 어느 하나의 천연형 염기를 갖는 디옥시리보 뉴클레오티드로 구성되는 DNA와, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 중 어느 하나의 천연 염기를 갖는 리보뉴클레오티드로 구성되는 RNA 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
본 명세서에서 「비천연형 뉴클레오티드」란 그 염기가 인공 염기로 구성되어 있는 자연계에 존재하지 않는 뉴클레오티드를 말한다. 본 발명에서의 비천연형 뉴클레오티드를 구성하는 인산기 및 당은 천연형 뉴클레오티드의 인산기 및 당과 구조적으로 동일하다.
본 명세서에서 「인공 염기」 또는 「염기 유사체」란 천연형 뉴클레오티드를 구성하는 천연형 염기에 유사한 성질을 갖는 인공적으로 구축된 화학 물질로서, 천연형 염기와 마찬가지로 인공 염기쌍을 형성할 수 있는 상대가 되는 염기 유사체(본 명세서에서는 이후 「상보적 인공 염기」라고 함)를 가진다. 본 명세서에서 「인공 염기 대합」이란 천연형 염기의 아데닌과 티민, 아데닌과 우라실 또는 구아닌과 시토신과 같이 한 쌍의 상보적 인공 염기가 서로 형성하는 염기 대합을 말한다. 인공 염기 대합은 천연형 염기 간의 염기 대합으로 볼 수 있는 수소 결합을 통한 화학적 결합, 인공 염기 간의 분자 구조에 기초한 끼워맞춤을 통한 물리적 결합 및 소수성 상호작용을 통한 스태킹 효과를 포함한다.
인공 염기가 갖는 「천연형 염기에 유사한 성질」에는 인공 염기 대합에 의한 상보성에 의해 핵산의 복제 또는 전사(역전사를 포함함)가 가능한 성질을 포함한다. 인공 염기는 천연형 염기와 마찬가지로 인공 염기 대합에서 배타적 선택성을 가진다. 따라서, 기질 뉴클레오티드에 한 쌍의 상보적 인공 염기를 갖는 비천연형 뉴클레오티드가 존재하면 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이어도 인공 염기 간의 상보성에 의해 천연형 뉴클레오티드와 마찬가지로 정확한 복제나 전사가 가능하다. 그 때문에 비천연형 뉴클레오티드를 포함하면서 PCR 등의 핵산 증폭법에 의한 DNA 분자의 증폭 등이 가능해진다.
상기 인공 염기의 구체예로서 Ds(7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl; 본 명세서에서는 「Ds」라고 함), Pn(2-nitropyrrole-1-yl; 본 명세서에서는 「Pn」이라고 함), Pa(2-formyl-1H-pyrrole-1-yl; 본 명세서에서는 「Pa」라고 함), P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one; 본 명세서에서는 「P」라고 함), Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone; 본 명세서에서는 「Z」라고 함), 5SICS(6-methylisoquinoline-1(2H)-thione; 본 명세서에서는 「5SICS」라고 함), NaM(3-methoxynaphthalen-2-yl; 본 명세서에서는 「NaM」이라고 함) 및 MMO2(2-methoxy-4-methylphenyl; 본 명세서에서는 「MMO2」라고 함)를 들 수 있다. 이들 인공 염기에 있어서, Ds의 상보적 인공 염기로는 Pn 및 Pa를 들 수 있다. P의 상보적 인공 염기로는 Z를 들 수 있다. 5SICS의 상보적 인공 염기로는 NaM 및 MMO2를 들 수 있다.
또, 인공 염기는 복제나 전사시 상보적 인공 염기를 갖는 비천연형 뉴클레오티드가 기질에 포함되지 않는 경우에는 상보적 인공 염기와 구조적으로 및/또는 성질적으로 가까운 천연형 염기와 대체적으로 염기 대합할 수 있다. 이 경우 주형이 된 핵산 분자에서의 비천연형 뉴클레오티드는 복제 또는 전사 후에 천연형 뉴클레오티드로 치환되게 된다. 예를 들어 Ds의 경우 A 또는 T로 치환되는 것이 알려져 있다.
본 명세서에서 「수식 염기」란 인공적으로 화학 수식된 염기를 의미한다. 수식 염기로서 예를 들어 수식화 피리미딘(예를 들어 5-히드록시시토신, 5-플루오로우라실, 4-티오우라실, 5-(3-인돌-2-에틸)우라실, 5-(4-히드록시페닐-2-에틸)우라실), 수식화 퓨린(예를 들어 6-메틸아데닌, 6-티오구아노신) 및 다른 복소환 염기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 「DNA 앱타머」란 DNA로 구성되는 앱타머로서, 수소 결합 등을 통한 1본쇄 핵산 분자의 2차 구조, 나아가 3차 구조에 기초하여 형성되는 입체 구조에 의해 표적 분자와 강고하고 특이적으로 결합하는 리간드 분자를 말한다. DNA 앱타머가 표적 분자의 생리 활성 등의 기능을 특이적으로 저해 또는 억제하는 능력을 갖는 경우에는 DNA 앱타머는 표적 분자의 기능 저해제가 될 수 있다. 본 명세서에서 「표적 분자의 기능 저해」란 표적 분자가 갖는 촉매 기능 또는 유전자 발현 제어 기능(전사, 번역, 수송 등의 제어를 포함함), 아포토시스 제어 기능과 같은 생물학적 기능을 저해 또는 억제하는 것을 말한다.
본 명세서에서 「표적 분자」란 DNA 앱타머의 결합 대상이 될 수 있는 물질을 말한다. 표적 분자의 종류는 DNA 앱타머가 결합할 수 있는 생체 물질이면 특별히 제한은 하지 않는다. 예를 들어 펩티드(올리고펩티드 또는 폴리펩티드), 핵산, 지질, 당(당쇄를 포함함), 저분자 화합물, 천연 유래의 물질, 화학 합성 물질, 유전자 재조합 물질, 세포, 바이러스 등 어느 것이어도 되고, 바람직하게는 암세포 또는 암세포에 발현하는 단백질 등의 물질이다.
본 명세서에서 「염기쌍」이란 특별히 명기하지 않는 한 왓슨크릭형의 염기쌍, 즉 AT쌍 또는 GC쌍을 말한다.
본 명세서에서 「미니 헤어핀 구조」는 이하의 제1 핵산 영역, 제2 핵산 영역 및 제3 핵산 영역의 3가지 DNA 핵산 영역이 각각 5' 말단측에서 3' 말단측으로 향하여 차례대로 연결된 구조를 가진다. 미니 헤어핀형 DNA는 핵산 분해 효소에 대한 분해 내성을 높이고/높이거나 DNA 앱타머의 Tm값을 올림으로써 DNA 앱타머의 열안정성을 증가시킬 수 있다.
「제1 핵산 영역」이란 2~5개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어지는 핵산 영역이다. 상기 뉴클레오티드는 구아닌(G), 아데닌(A), 시토신(C) 또는 티민(T)의 염기를 갖는 디옥시리보 뉴클레오티드를 말한다. 본 핵산 영역의 염기는 바람직하게는 구아닌 또는 시토신이다. 이는 후술하는 제3 핵산 영역과의 사이에 줄기 구조를 형성함에 있어서 GC 함량이 많을수록 Tm값도 증가하고 상기 줄기 구조를 안정적으로 유지할 수 있기 때문이다. 따라서, 제1 핵산 영역의 모든 염기 서열이 G 및/또는 C로 구성되어 있는 것이 가장 바람직하다.
「제2 핵산 영역」이란 5'-GNA-3' 또는 5'-GNNA-3'의 염기 서열로 이루어지는 핵산 영역이다. 서열 중의 각 N은 독립적으로 천연형 염기(G, A, T 혹은 C) 중 어느 하나, 예를 들어 T로 이루어진다.
「제3 핵산 영역」이란 제1 핵산 영역에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산 영역이다. 따라서, 제3 핵산 영역의 염기 서열은 제1 핵산 영역의 염기 서열에 의해 정해지고, 제1 핵산 영역과 제3 핵산 영역은 분자 내에서 염기쌍을 형성한다. 그 결과, 제1 핵산 영역과 제3 핵산 영역은 서로 완전히 염기 대합한 줄기 부분을, 제1 핵산 영역과 제3 핵산 영역의 사이에 존재하는 제2 핵산 영역은 루프 부분을 각각 구성하고, 전체적으로 7~14개의 뉴클레오티드로 이루어지는 미니 헤어핀형 DNA가 형성된다. 미니 헤어핀형 DNA의 예로서 CGCGTAGCG(서열 번호 83)에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 들 수 있다.
2. 암세포에 결합하는 DNA 앱타머
일 태양에 있어서, 본 발명은 이하의 (i) (a)~(b) 또는 (ii) (a)~(b)의 염기 서열을 포함하는, 암세포에 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
상기 (i) (a)의 염기 서열은 N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(서열 번호 35)에 나타나는 염기 서열(서열 중 N1~N5는 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N26은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl(본 명세서에서는 이하 단지 「Ds」라고도 표기함)이며, N30은 N5와, N31은 N4와, N32는 N3과, N33은 N2와, N34는 N1과 염기쌍을 형성함)이다. 상기 염기쌍은 GC쌍이어도 된다. 일 실시형태에 있어서, N30은 A이고 N32는 C이며 N33은 G이거나/이고 N34는 T이다. (i) (a)의 염기 서열의 예로서 서열 번호 36, 37 또는 40에 나타나는 서열을 들 수 있다.
상기 (i) (b)의 염기 서열은 (i) (a)에 나타나는 염기 서열의 N26 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열이다. 본 명세서에서 「하나 또는 수 개」란 예를 들어 1~6개, 1~5개, 1~4개, 1~3개 또는 1~2개를 의미한다. 부가, 결실 및/또는 치환은 실시예 3의 세컨드 셀렉션에 의해 보존성이 낮았던 부위 등에서, 예를 들어 서열 번호 35의 1위~5위 또는 30위~34위, 바람직하게는 1위~5위 또는 31위에서 행할 수 있다.
상기 (ii) (a)의 염기 서열은 N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(서열 번호 28)에 나타나는 염기 서열(서열 중 N1~N6, N14, N25는 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N13 및 N22는 Ds이며, N26은 N4와, N29는 N3과, N30은 N2와, N31은 N1과 염기쌍을 형성하고, N27 및 N28은 독립적으로 G, T, A, C 혹은 존재하지 않음)이다. 상기 염기쌍은 GC쌍이어도 된다. 일 실시형태에 있어서, N3은 C이고 N4는 G이며 및/또는 N14는 A이다. (ii) (a)의 뉴클레오티드 서열로서 서열 번호 29에 나타나는 서열을 들 수 있다.
상기 (ii) (b)의 염기 서열은 (ii) (a)에 나타나는 염기 서열의 N13 및 N22 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열이다. 부가, 결실 및/또는 치환은 실시예 3의 세컨드 셀렉션에 의해 보존성이 낮았던 부위 등에서, 예를 들어 서열 번호 28의 1위~6위, 14위 또는 25위~31위, 예를 들어 1위~6위 또는 25위~31위, 바람직하게는 1위~2위, 5위~6위 또는 25~31위에서 행할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, (i) (a) 또는 (ii) (a)의 염기 서열은 그 말단에 염기쌍, 예를 들어 GC쌍을 1~5개, 예를 들어 1~4개, 1~3개, 1~2개 또는 1개 포함한다. (i) (a) 또는 (ii) (a)의 염기 서열은 이들 염기쌍에 더하여 또는 이들 염기쌍 대신에 미니 헤어핀 구조를 형성하는 서열(이하 본 명세서에서는 「미니 헤어핀 서열」이라고도 부름)을 포함해도 된다.
(i) (a)의 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열의 예로서 서열 번호 40에 나타나는 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열 번호 41 또는 서열 번호 80에 나타나는 서열을 들 수 있다. 또한, (ii) (a)의 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열의 예로서 서열 번호 29에 나타나는 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열 번호 33에 나타나는 서열을 들 수 있다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머는 상기 (i) (a)~(b) 또는 (ii) (a)~(b)의 염기 서열 또는 이에 GC쌍 및/또는 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열로 이루어지는 것이어도 된다.
본 발명의 DNA 앱타머가 결합하는 암세포로서 한정하는 것은 아니지만 유방암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 난소암 세포, 대장(예를 들어 결장)암 세포, 위암 세포, 자궁경부암 세포 및 폐암 세포 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 암세포에는 백혈병 세포나 악성 림프종 세포도 포함되는 것으로 한다. 암세포의 유래가 되는 생물종은 불문하지만, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간 및 침팬지 등의 영장류, 래트 및 마우스 등의 실험동물, 돼지, 소, 말, 양 및 염소 등의 가축동물, 개 및 고양이 등의 애완동물, 바람직하게는 인간의 암세포를 들 수 있다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머는 광범위한 암세포에 결합하기 때문에 다양한 암세포 및 암의 검출 또는 치료에 이용할 수 있다. 또한, (i) (a) 또는 (i) (b)에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA 앱타머는 암세포에 결합할 뿐만 아니라 암세포의 증식을 억제할 수 있기 때문에 항암제로서 이용할 수 있다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머의 길이는 예를 들어 150mer 이하, 140mer 이하, 130mer 이하, 120mer 이하, 110mer 이하, 바람직하게는 100mer 이하, 90mer 이하, 80mer 이하, 70mer 이하 또는 60mer 이하이다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머는 Ds에 더하여 임의로 염기 유사체, 다른 인공 염기 또는 다른 수식 염기 등을 포함해도 된다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머는 다른 물질, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG)(예를 들어 약 20~약 60kDa의 PEG 중합체), 아미노산, 펩티드, inverted dT, 지질, 색소, 형광 물질, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 부가함으로써 수식되어 있어도 된다. 이들 물질은 필요에 따라 공지의 링커를 통해 연결해도 된다. 본 명세서에서 링커의 예로서 뉴클레오티드 링커, 펩티드 링커 및 디설파이드 결합을 포함한 링커 등을 들 수 있다. PEG를 연결함으로써 일반적으로 DNA 앱타머의 반감기를 늘릴 수 있는 것이 알려져 있다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머는 암세포에 대해 플로우 사이토미터에 의한 측정에 기초하여 예를 들어 100nM 이하, 90nM 이하, 80nM 이하, 70nM 이하, 60nM 이하, 50nM 이하, 40nM 이하, 30nM 이하, 20nM 이하, 바람직하게는 10nM 이하, 9nM 이하, 8nM 이하, 7nM 이하, 6nM 이하, 5nM 이하, 4nM 이하 또는 3nM 이하의 Kd값을 가진다.
본 발명의 암세포에 결합하는 DNA 앱타머의 제조 방법은 특별히 한정하지 않는다. 본 분야에서 공지의 방법을 이용하면 된다. 예를 들어 본 발명의 DNA 앱타머는 상기의 서열에 기초하여 공지의 고상 합성법에 따라 화학 합성할 수 있다. 핵산의 화학 합성법에 대해서는 예를 들어 Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Section 3을 참조하기 바란다. 또한, 이러한 화학 합성에 대해서는 많은 생명과학계 제조사(예를 들어 다카라 바이오 주식회사, Sigma-Aldrich Corporation 등)가 수탁 제조 서비스를 행하고 있고, 이들을 이용할 수도 있다. DNA 앱타머의 서열에 기초하여 몇 개의 단편을 합성한 후에 분자 내 어닐이나 리가아제에 의한 라이게이션 등에 의해 단편을 연결함으로써 DNA 앱타머를 제작해도 된다.
화학 합성 후 본 발명의 DNA 앱타머는 사용 전에 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 정제하는 것이 바람직하다. 정제 방법으로서는 예를 들어 겔 정제법, 어피니티 칼럼 정제법, HPLC법 등을 들 수 있다.
3. 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머
일 태양에 있어서, 본 발명은 이하의 (I) (a)~(b), (II) (a)~(b), (III) (a)~(b) 또는 (IV) (a)~(b)의 염기 서열을 포함하는, 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
상기 (I) (a)의 염기 서열은 N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(서열 번호 43)에 나타나는 염기 서열(서열 중 N1~N6, N18, N24, N31 및 N36은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N16은 Ds, N29는 Ds, G, T, A 혹은 C, 바람직하게는 Ds이며, N40은 N6과, N41은 N5와, N42는 N4와, N43은 N3과, N44는 N2와, N45는 N1과 염기쌍을 형성함)이다. 일 실시형태에 있어서, N3은 T이고 N18은 C이며 N24는 T이고 N31은 G이고/이거나 N36은 A이다. (I) (a)의 염기 서열로서 예를 들어 서열 번호 44 또는 46에 나타나는 서열을 들 수 있다.
상기 (I) (b)의 염기 서열은 (I) (a)에 나타나는 염기 서열의 N16 이외, 바람직하게는 N16 및 N29 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열이다. 부가, 결실 및/또는 치환은 실시예 3의 세컨드 셀렉션에 의해 보존성이 낮았던 부위 등에서, 예를 들어 서열 번호 43의 1위~6위, 18위, 24위, 29위, 31위, 36위 또는 40위~45위, 예를 들어 1위~6위, 18위, 24위, 31위, 36위 또는 40위~45위, 바람직하게는 1위~6위 또는 40위~45위, 더욱 바람직하게는 1위~2위, 4위~6위 또는 40위~45위에서 행할 수 있다.
상기 (II) (a)의 염기 서열은 N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(서열 번호 2)에 나타나는 염기 서열(서열 중 N1~N4, N7, N16, N23, N26 및 N31은 독립적으로 G, T, A 혹은 C, 바람직하게는 Ds이고, N6은 Ds, G, T, A 혹은 C이며, N17은 Ds이고, N27은 N3, N28은 N2와 염기쌍을 형성하며, N29 및 N30은 G, T, A, C 혹은 존재하지 않음)이다. N23은 N7과, N31은 N1과 염기쌍을 형성해도 된다. 일 실시형태에 있어서, N7은 G이고 N16은 T이며 및/또는 N23은 C이다. (II) (a)의 염기 서열로서 예를 들어 서열 번호 3~5, 8~9 및 14~16 중 어느 하나에 나타나는 서열을 들 수 있다.
상기 (II) (b)의 염기 서열은 (II) (a)에 나타나는 염기 서열의 N17 이외, 바람직하게는 N6 및 N17 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열을 포함한다. 부가, 결실 및/또는 치환은 실시예 3의 세컨드 셀렉션에 의해 보존성이 낮았던 부위 등에서, 예를 들어 서열 번호 2의 1위~4위, 6~7위, 16위, 23위 또는 26위~31위, 예를 들어 1위~4위, 7위, 16위, 23위 또는 26위~31위, 바람직하게는 1위~4위, 7위, 23위 또는 26위~31위, 바람직하게는 1위~4위 또는 26위~31위에서 행할 수 있다.
상기 (III) (a)의 염기 서열은 N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(서열 번호 18)에 나타나는 염기 서열(서열 중 N1~N3, N13~N17, N19~N22, N33, N46~N48 및 N50은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N10~N12 및 N23~N25는 G, T, A, C 혹은 존재하지 않으며, N18은 Ds, G, T, A 혹은 C 또는 존재하지 않고, N32는 Ds이며, N49는 N3과, N51은 N1과 염기쌍을 형성하고, N10~N15 중 3개 이상이 N20~N25 중 3개 이상과 염기쌍을 형성함)이다. N50은 N2와 염기 대합하고 있어도 되고, N10~N15와 N20~N25는 완전히 염기 대합하고 있어도 된다. N10~N25는 전체적으로 미니 헤어핀 구조를 형성하고 있어도 된다. 일 실시형태에 있어서, N33은 C이고 N46은 A이며 N47은 G이고 및/또는 N48은 G이다. (III) (a)의 염기 서열의 예로서 예를 들어 서열 번호 20, 21 및 26 중 어느 하나에 나타나는 서열을 들 수 있다.
상기 (III) (b)의 염기 서열은 (III) (a)에 나타나는 염기 서열의 N32 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열이다. 부가, 결실 및/또는 치환은 실시예 3의 세컨드 셀렉션에 의해 보존성이 낮았던 부위 등에서, 예를 들어 서열 번호 18의 1위~3위, 10위~25위, 33위 또는 46위~51위, 예를 들어 1위~3위, 10위~25위 또는 46위~51위, 바람직하게는 1위~3위 또는 46위~51위에서 행할 수 있다.
상기 (IV) (a)의 염기 서열은 N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(서열 번호 50)에 나타나는 염기 서열(서열 중 N1~N3, N15, N17, N20~N23, N25~N29, N31~N32, N34 및 N46은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N18 및 N30은 Ds이며, N47은 N3과, N48은 N2와, N49는 N1과 염기쌍을 형성함)이다. 일 실시형태에 있어서, N1은 C이고 N2는 C이며 N15는 T이고 및/또는 N34는 A이다. (IV) (a)의 염기 서열로서 서열 번호 51에 나타나는 서열을 들 수 있다.
상기 (IV) (b)의 염기 서열은 (IV) (a)에 나타나는 염기 서열의 N18 및 N30 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열이다. 부가, 결실 및/또는 치환은 실시예 3의 세컨드 셀렉션에 의해 보존성이 낮았던 부위 등에서, 예를 들어 서열 번호 50의 1위~3위, 15위, 17위, 20위~23위, 25위~29위, 31위~32위, 34위 또는 46위~49위, 예를 들어 1위~3위 또는 47위~49위, 바람직하게는 3위 또는 47~49위에서 행할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, (I) (a), (II) (a), (III) (a) 또는 (VI) (a)의 염기 서열은 그 말단에 염기쌍, 예를 들어 GC쌍을 1~5개, 예를 들어 1~4개, 1~3개, 1~2개 또는 1개 포함한다.
또한, (I) (a), (II) (a), (III) (a) 또는 (VI) (a)의 염기 서열은 이들 염기쌍에 더하여 또는 이들 염기쌍 대신에 미니 헤어핀 구조를 형성하는 서열을 포함해도 된다. (I) (a)의 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열의 예로서 서열 번호 44에 나타나는 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열 번호 45에 나타나는 서열을 들 수 있다. (II) (a)의 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열의 예로서 서열 번호 9 및 14~16에 나타나는 서열에 미니 헤어핀 서열을 각각 부가한 서열 번호 10 및 서열 번호 11~13에 나타나는 서열을 들 수 있다. (III) (a)의 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열의 예로서 서열 번호 20 및 26에 나타나는 서열에 미니 헤어핀 서열을 각각 부가한 서열 번호 24 및 25에 나타나는 서열을 들 수 있다. (IV) (a)의 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열의 예로서 서열 번호 51에 나타나는 서열에 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열 번호 52에 나타나는 서열을 들 수 있다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머는 Ds에 더하여 임의로 염기 유사체, 다른 인공 염기 또는 수식 염기 등을 포함해도 된다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머는 상기 (I) (a)~(b), (II) (a)~(b), (III) (a)~(b) 또는 (IV) (a)~(b)의 염기 서열 또는 이에 GC쌍 및/또는 미니 헤어핀 서열을 부가한 서열로 이루어지는 것이어도 된다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머는 유방암 세포 이외의 암세포와도 결합할 수 있다. 이러한 암세포로서 한정하는 것은 아니지만 전립선암 세포 및 폐암 세포를 들 수 있다. 암세포의 유래가 되는 생물종은 불문하지만, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간 및 침팬지 등의 영장류, 래트 및 마우스 등의 실험동물, 돼지, 소, 말, 양 및 염소 등의 가축동물, 개 및 고양이 등의 애완동물, 바람직하게는 인간의 암세포를 들 수 있다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머, 특히 (I)~(III)의 DNA 앱타머는 각각 07-MB231 앱타머, 14A-MCF7 앱타머 및 08B-MCF7 앱타머에 유래하고, 이들 DNA 앱타머는 유방암 세포의 세포주에 따라 결합능이 다른 것이 나타나 있기 때문에 유방암 세포의 분류를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어 07-MB231 앱타머는 트리플 네거티브 세포인 MDA-MB-231 세포에만 결합하였기 때문에 07-MB231 앱타머에 유래하는 (I) (a) 또는 (I) (b)의 염기 서열을 포함하는 DNA 앱타머는 유방암 세포가 트리플 네거티브 세포인지 여부의 판단을 가능하게 할 수 있고, 트리플 네거티브 유방암의 진단에 이용할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 트리플 네거티브란 유방암 원인 유전자인 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor: ER), 프로게스테론 수용체(Progesterone Receptor: PR) 및 상피세포 증식 인자 수용체 2형(Human Epidermal growth factor Receptor 2: HER2)의 과잉 발현이 모두 인정되지 않은 타입의 유방암이다. 그 때문에 확립된 치료 방침이 없고 예후불량인 것이 알려져 있으며 그 검출도 어려웠다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머는 다른 물질, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG)(예를 들어 약 20~약 60kDa의 PEG 중합체), 아미노산, 펩티드, inverted dT, 지질, 색소, 형광 물질, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 부가함으로써 수식되어 있어도 된다. 이들 물질은 필요에 따라 공지의 링커를 통해 연결해도 된다. PEG를 연결함으로써 일반적으로 DNA 앱타머의 반감기를 늘릴 수 있는 것이 알려져 있다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머의 길이는 예를 들어 150mer 이하, 140mer 이하, 130mer 이하, 120mer 이하, 110mer 이하, 바람직하게는 100mer 이하, 90mer 이하, 80mer 이하, 70mer 이하 또는 60mer 이하이다.
본 발명의 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머의 제조 방법은 상기 「2. 암세포에 결합하는 DNA 앱타머」에서 기재한 것과 동일하기 때문에 여기서는 기재를 생략한다.
4. DNA 앱타머를 포함하는 의약 조성물
일 태양에 있어서, 본 발명은 상기 2 또는 3에 기재된 DNA 앱타머(본 명세서에서는 단지 이들을 합쳐 「본 발명의 DNA 앱타머」라고도 기재함)를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 앱타머가 갖는 암세포에의 결합능을 잃지 않는 범위에서 다른 약제를 하나 이상 함유할 수도 있다. 예를 들어 항암제를 소정량 함유하고 있어도 된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 DNA 앱타머와 다른 약제를 포함하는, 약제를 암세포에 송달하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 다른 약제는 DNA 앱타머에 결합시켜도 되고, 이에 의해 DNA 앱타머의 암세포에의 결합능을 이용하여 약제를 암세포에 효율적으로 송달하는 것이 가능해진다. DNA 앱타머와 약제의 결합 방법은 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물의 예방 및/또는 치료의 대상이 되는 질환은 암이다. 예를 들어 유방암, 간암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 대장암, 결장암, 위암, 자궁경부암 및 폐암과 백혈병 및 악성 림프종 등을 들 수 있다.
암에 걸린 피험체에 의약 조성물을 투여함으로써 치료 효과가, 암에 걸릴 위험이 있는 피험체에 의약 조성물을 투여함으로써 예방 효과가 기대된다.
본 발명의 의약 조성물은 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 「제약상 허용 가능한 담체」란 제제(製劑) 기술 분야에서 통상 사용하는 의약 조성물의 제제화나 생체에의 적용을 용이하게 하고 그 작용을 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 첨가되는 물질을 말한다. 담체로는 예를 들어 부형제, 결합제, 붕괴제, 충전제, 유화제, 유동 첨가 조절제, 윤활택제 또는 안정화제를 들 수 있다.
「부형제」로서는 예를 들어 단당, 이당류, 시클로덱스트린 및 다당류와 같은 당(구체적으로 한정하지 않지만, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 라피노스, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 덱스트린, 말토덱스트린, 전분 및 셀룰로오스를 포함함), 금속염(예를 들어 인산 나트륨 혹은 인산 칼슘, 황산 칼슘, 황산 마그네슘), 구연산, 주석산, 글리신, 저, 중, 고분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG), 플루로닉 혹은 이들의 조합을 들 수 있다.
「결합제」로서는 예를 들어 옥수수, 밀, 쌀 혹은 감자의 전분을 이용한 전분 풀, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
「붕괴제」로서는 예를 들어 상기 전분이나 카르복시메틸 전분, 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천(agar), 알긴산 혹은 알긴산 나트륨 또는 이들의 염을 들 수 있다.
「충전제」로서는 예를 들어 상기 당 및/또는 인산 칼슘(예를 들어 인산삼칼슘 혹은 인산 수소 칼슘)을 들 수 있다.
「유화제」로서는 예를 들어 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르를 들 수 있다.
「유동 첨가 조절제」 및 「활택제」로서는 예를 들어 규산염, 탈크, 스테아린산염 또는 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다.
「안정화제」로서는 예를 들어 아스코르빈산이나 아황산염 등의 산화 방지제, 트레할로스나 포도당 등의 당류를 들 수 있다.
이러한 담체는 필요에 따라 적절히 사용하면 된다. 본 발명의 의약 조성물은 상기 첨가제 이외에 필요에 따라 교미교취제, 용해 보조제(가용화제), 현탁제, 희석제, 계면활성제, 흡수 촉진제(예를 들어 제4급 암모늄염류, 라우릴 황산 나트륨 등), 증량제, 부습제, 보습제(예를 들어 글리세린, 전분 등), 흡착제(예를 들어 전분, 젖당, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드상 규산 등), 붕괴 억제제(예를 들어 백설탕, 스테아린, 카카오 버터, 수소 첨가유 등), 코팅제, 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제, 완충제, 등장화제, 무통화제, 용해 보조제 등을 포함할 수도 있다.
「계면활성제」로서는 예를 들어 리그노술폰산, 나프탈렌 술폰산, 페놀 술폰산, 디부틸나프탈렌 술폰산의 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염 및 암모늄염, 알킬아릴 술포네이트, 알킬 설페이트, 알킬 술포네이트, 지방 알코올 설페이트, 지방산 및 황산화 지방 알코올글리콜에테르, 나아가 술폰화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌 술폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 에톡실화 이소옥틸페놀, 옥틸페놀, 노닐페놀, 알킬페닐 폴리글리콜에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜에테르, 트리스테아릴페닐 폴리글리콜에테르, 알킬아릴 폴리에테르알코올, 알코올 및 지방 알코올/에틸렌 옥사이드의 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 에톡실화 폴리옥시프로필렌, 라우릴알코올 폴리글리콜에테르아세탈, 소르비톨에스테르, 리그노 아황산 폐액 및 메틸셀룰로오스가 해당한다.
본 실시형태의 의약 조성물은 하나의 의약 조성물 중에 상기 담체를 하나 이상 포함하는 것이 가능하다.
본 발명의 의약 조성물의 제형은 유효 성분을 불활화시키지 않는 형태로서, 투여 후 생체 내에서 그 약리 효과를 발휘할 수 있는 형태이면 특별히 한정하지 않는다. 통상은 투여 방법 및/또는 처방 조건에 따라 다르다.
예를 들어 경구 투여에 적합한 제형으로서는 고형제(정제, 환제, 설하제(舌下劑), 캡슐제, 드롭제, 트로키제를 포함함), 과립제, 분제, 산제(散劑), 액제(液劑) 등을 들 수 있다. 나아가 고형제는 필요에 따라 해당 분야에서 공지의 제피(劑皮)를 실시한 제형, 예를 들어 당의정, 젤라틴 피포정, 장용정, 필름 코팅정, 이중정, 다층정으로 할 수 있다.
비경구 투여는 전신 투여 및 국소 투여로 세분되고, 국소 투여는 조직 내 투여, 경표피 투여, 경점막 투여 및 경직장적 투여로 더 세분되지만, 의약 조성물도 각각의 투여 방법에 적합한 제형으로 할 수 있다. 전신 또는 조직 내 투여에 적합한 제형으로서는 예를 들어 액제인 주사제를 들 수 있다. 경표피 투여 또는 경점막 투여에 적합한 제형으로서는 예를 들어 액제(도포제, 점안제, 점비제, 흡인제를 포함함), 현탁제(유제, 크림제를 포함함), 분제(점비제, 흡인제를 포함함), 페이스트제, 겔제, 연고제, 경고제 등을 들 수 있다. 경직장적 투여에 적합한 제형으로서는 예를 들어 좌제 등을 들 수 있다.
또, 상기 각 제형의 구체적인 형상, 크기에 대해서는 모두 각각의 제형에서 해당 분야에서 공지의 제형의 범위 내에 있으면 되고, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물을 제조하려면 원칙적으로 해당 분야에서 공지의 제제화 방법을 응용하면 된다. 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co., Easton, Pa.)에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
예를 들어 주사제의 경우에는 본 발명의 DNA 앱타머를 제약상 허용 가능한 용매에 용해하고, 필요에 따라 제약상 허용 가능한 담체를 더하여 해당 분야에서 관용되고 있는 방법에 의해 제조할 수 있다.
「약학적으로 허용 가능한 용매」로서는 예를 들어 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 에톡시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 들 수 있다. 이들은 필요에 따라 혈액과 등장(等張)으로 조정되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은 목적으로 하는 암 등의 질환의 치료 또는 예방을 위해 제약상 유효한 양을 생체에 투여할 수 있다. 투여하는 대상이 되는 생체는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 의약 조성물은 전신 투여 또는 국소적 투여 중 어느 것이어도 된다. 질환의 종류, 발증 개소 또는 진행도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 발증 개소가 국부적인 질환이면 주사 등에 의해 발증 개소 및 그 주변에 직접 투여하는 국소적 투여가 바람직하다. 치료해야 할 개소(조직 또는 기관)에 본 발명의 DNA 앱타머를 충분량 투여할 수 있어서 다른 조직에 영향을 미치기 어렵기 때문이다. 한편, 치료 개소를 특정할 수 없는 경우나 발증이 전신성 질환인 경우에는 한정되지 않지만 정맥 주사 등에 의한 전신 투여가 바람직하다. 혈류를 통해 본 발명의 DNA 앱타머를 전신에 널리 퍼지게 함으로써 진단으로 발견할 수 없는 병변부에도 투여가 가능해지기 때문이다.
본 발명의 의약 조성물은 유효 성분이 실활되지 않는 여하한 적당한 방법으로 투여할 수 있다. 예를 들어 비경구(예를 들어 주사, 에어로졸, 도포, 점안, 점비) 또는 경구 중 어느 것이어도 된다. 바람직하게는 주사이다.
주사에 의한 투여의 경우 주입 부위는 특별히 한정되지 않는다. 유효 성분인 DNA 앱타머가 표적 물질에 결합할 수 있으면 어떤 부위이어도 된다. 예를 들어 정맥 내, 동맥 내, 간장 내, 근육 내, 관절 내, 골수 내, 골수강 내, 심실 내, 경폐, 경피, 피하, 피내, 복강 내 등을 들 수 있다.
5. DNA 앱타머로 이루어지는 항암제
일 태양에 있어서, 본 발명은 상기 「2. 암세포에 결합하는 DNA 앱타머」의 (i) (a) 또는 (i) (b)에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA 앱타머로 이루어지는 항암제에 관한 것이다. 이 DNA 앱타머의 유래가 된 05-MB231 앱타머는 암세포에 결합할 뿐만 아니라 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것이 나타나 있기 때문에 항암제로서 이용할 수 있다. 또한, 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 DNA 앱타머로 이루어지는 항암제를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다. 의약 조성물의 구성에 대해서는 상기와 같기 때문에 여기서는 기재를 생략한다.
6. DNA 앱타머를 이용하는 치료 방법
일 태양에 있어서, 본 발명은 상기 의약 조성물 또는 항암제를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 의약 조성물의 예방 및/또는 치료의 대상이 되는 질환은 암, 예를 들어 유방암, 간암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 대장암, 결장암, 위암, 자궁경부암 및 폐암과 백혈병 및 악성 림프종 등이다.
본 명세서에서 「피험체」가 될 수 있는 동물종은 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간 및 침팬지 등의 영장류, 래트 및 마우스 등의 실험동물, 돼지, 소, 말, 양 및 염소 등의 가축동물, 개 및 고양이 등의 애완동물, 바람직하게는 인간이다.
7. DNA 앱타머를 포함하는 검출제
일 태양에 있어서, 본 발명은 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 암 검출제에 관한 것이다. 본 발명의 암 검출제는 DNA 앱타머의 암세포에의 결합능을 이용하여 in vivo 또는 in vitro에서 암 또는 암세포를 검출하기 위한 조성물이다. 예를 들어 DNA 앱타머를 미리 형광 시약 등으로 표지하고 이를 투여함으로써 생체 내에서 암세포의 유무를 결정하고, 또한 존재하는 경우에는 그 국재를 조사할 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 이미징 및 조직 염색 등에서 유용하다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 암 검출용 조성물에 관한 것이다. 조성물의 구성에 대해서는 상기 의약 조성물과 동일하기 때문에 여기서는 기재를 생략한다.
일 태양에 있어서, 본 발명은 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 암세포 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 본 발명의 DNA 앱타머에 더하여 버퍼, 표지 시약 및/또는 설명서 등을 포함해도 된다.
본 발명의 암 검출제, 암 검출용 조성물 및 암 검출용 키트는 암에 걸리는 유무의 진단을 보조하는 방법 또는 하기의 암세포 분류 방법에서 이용할 수 있다.
8. 암세포의 검출 방법
일 태양에 있어서, 본 발명은 암세포를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 피험체로부터 얻어진 샘플을 본 발명의 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정 및 샘플과 DNA 앱타머의 결합에 기초하여 암세포를 검출하는 공정을 포함한다. 본 방법에 의해 피험체에서의 암에 걸리는 유무의 진단을 보조하는 것이 가능해질 수 있다.
본 방법에서 이용하는 샘플로서는 조직 및 세포를 포함한 생체 시료를 들 수 있다. 조직의 예로서 병변 부위, 예를 들어 유방, 간장, 췌장, 전립선, 난소, 대장, 결장, 위, 자궁경부 및 폐, 골수, 림프절, 비장 및 흉선 등을 들 수 있고, 예를 들어 이들 조직의 생검 샘플을 이용할 수 있다. 세포의 예로서 예를 들어 말초혈 세포, 세포를 포함한 림프액 및 조직액, 모모 세포, 구강 세포, 비강 세포, 장관 세포, 질내 세포, 점막 세포, 객담(폐포 세포 또는 기간 세포 등을 포함할 수 있음)을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA 앱타머가 암세포에 존재하는 단백질, 지질, 당쇄 등의 마커를 인식하는 경우로서, 이들 마커가 분비, 절단되어 뇨 및 혈액 등의 체액 중에 생기는 경우에는 본 발명의 DNA 앱타머는 체액 중의 이들 마커를 검출하기 위해 이용할 수도 있다.
본 발명의 검출 방법의 검출 공정은 샘플과 DNA 앱타머의 결합을 이용하는 것이면 특별히 한정하지 않고 공지의 방법을 이용하면 된다. 예를 들어 SPR법, 비탁법, 비색법 또는 형광법을 이용할 수 있다.
SPR(표면 플라즈몬 공명)은 금속 박막에 레이저광을 조사하면 특정의 입사 각도(공명각)에서 반사광 강도가 현저히 감쇠하는 현상을 말한다. SPR법은 이 현상을 이용한 측정 방법으로, 센서부인 금속 박막 표면 상의 흡착물을 고감도로 측정할 수 있다. 본 발명에서는 예를 들어 미리 본 발명의 DNA 앱타머를 금속 박막 표면 상에 고정화해 두고, 그 금속 박막 표면 상에 시료를 통과시켜 해당 핵산 분자와 표적 물질의 결합에 의해 생기는 시료 통과 전후의 금속 표면 상의 흡착물 차이를 검출함으로써 시료 중의 표적 물질을 검출할 수 있다. SPR법에는 치환법, 간접 경합법 등이 알려지지만 어느 것을 이용해도 된다.
비탁법은 용액에 광을 조사하고, 용액 중에 부유하는 물질에 의해 산란하는 산란광의 감쇠 또는 그 용액을 통과한 투과광을 비색계 등을 이용하여 광학적으로 계측함으로써 용액 중의 물질량을 측정하는 방법이다. 본 발명에서는 시료 중에 본 발명의 DNA 앱타머를 첨가하기 전후의 흡광도를 계측함으로써 시료 중의 표적 물질을 정량적으로 검출할 수 있다.
또한, 표적 물질에 대한 항체와 병용함으로써 표적 물질을 검출할 수도 있다. 예를 들어 ELISA법의 샌드위치법을 응용한 방법을 이용해도 된다. 이 방법에서는 우선 고상 담체에 본 발명의 DNA 앱타머를 고정해 두고, 다음에 시료를 가하여 시료 중에 존재하는 표적 물질과 상기 DNA 앱타머를 결합시킨다. 이어서, 시료를 씻어내린 후 항표적 물질 항체를 가하여 표적 물질에 결합시킨다. 세정 후, 적당한 표지를 한 2차 항체를 이용하여 항표적 물질 항체를 검출함으로써 시료 중의 표적 물질을 검출할 수 있다. 고상 담체로서는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 라텍스, 젤라틴, 아가로스, 셀룰로오스, 세파로스, 유리, 금속, 세라믹스 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 비즈, 마이크로 플레이트, 시험관, 스틱 또는 시험편 등의 형상의 불용성 담체를 이용할 수 있다.
일 태양에 있어서, 본 발명은 피험체에서 암에 걸리는 유무의 진단을 보조하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 피험체에 본 발명의 DNA 앱타머 또는 본 발명의 암 검출제 또는 암 검출용 조성물을 투여하는 공정 및 DNA 앱타머를 검출하는 공정을 포함한다. 예를 들어 생체 내에서 특정의 부위에서 DNA 앱타머가 고농도로 검출된 경우에는 그 부위에서 암이 발생하였다고 판단할 수 있다. 검출 공정은 공지의 방법을 이용하면 되고, 예를 들어 상기 형광법을 이용할 수 있다.
9. 암세포의 분류 방법
일 태양에 있어서, 본 발명은 피험체로부터 얻어진 암세포를 분류하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 피험체로부터 얻어진 암세포를 본 발명의 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정, 상기 암세포와 상기 DNA 앱타머의 결합 유무 또는 강도를 측정하는 공정, 상기 결합 유무 또는 강도에 기초하여 암세포를 분류하는 공정을 포함한다. 암세포와 DNA 앱타머의 결합 유무 또는 강도를 측정하는 공정에 대해서는 상기 암세포의 검출 방법에서 기재한 것과 동일하기 때문에 여기서는 기재를 생략한다.
본 방법은 본 발명의 DNA 앱타머 중 하나만을 이용하여 행해도 되고, 본 발명의 DNA 앱타머를 복수 이용하여 행해도 된다. 본 발명의 DNA 앱타머를 하나만 이용하는 경우, 형태 관찰, 암 마커의 측정, 염색법 및 종래의 앱타머를 이용하는 방법 등의 종래의 암 분류 방법과 조합함으로써 보다 상세하게 암세포를 분류할 수 있다.
본 발명의 암세포의 분류 방법에서는 암세포와 DNA 앱타머의 결합에 기초하여 암세포의 유래 조직, 서브 타입, 고유의 서브 타입(Intrinsic Subtype), 분화도 및 침윤성 등을 분류할 수 있다. 또한, 암세포의 분류에 기초하여 암세포의 유래가 된 피험체의 임상병기(진행도, 스테이지), 예후 예측 및 치료 계획 작성 등도 가능해질 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 방법에서 분류되는 암세포는 유방암 세포이다. 본 방법에서는 상기 「3. 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머」에 기재된 (I)~(IV)의 4개의 군에서 선택되는 2종 이상의 DNA 앱타머, 예를 들어 (I)~(III) 중 3개의 군에서 선택되는 2종 이상의 DNA 앱타머를 이용하는 것이 바람직하다. (I)~(III) 중 3개의 군의 DNA 앱타머는 각각 07-MB231 앱타머, 14A-MCF7 앱타머 및 08B-MCF7 앱타머에 유래하고, 이들 DNA 앱타머는 유방암 세포의 세포주에 따라 결합능이 다른 것이 나타나 있기 때문이다. 예를 들어 07-MB231 앱타머가 트리플 네거티브 세포인 MDA-MB-231 세포에만 결합하였기 때문에 본 DNA 앱타머에 유래하는 (I) (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함한 DNA 앱타머는 트리플 네거티브 세포인지 여부의 판단을 가능하게 할 수 있고, 트리플 네거티브 유방암의 진단에 이용할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 트리플 네거티브란 유방암 원인 유전자인 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor: ER), 프로게스테론 수용체(Progesterone Receptor: PR) 및 상피세포 증식 인자 수용체 2형(Human Epidermal growth factor Receptor 2: HER2)의 과잉 발현이 모두 인정되지 않은 타입의 유방암이다. 그 때문에 확립된 치료 방침이 없고 예후불량인 것이 알려져 있으며 그 검출도 곤란하였다.
실시예
<실시예 1: Cell-SELEX>
세포주:
실시예에 이용한 세포주의 입수처와 그 배양 배지는 이하와 같다:
인간 유방암 유래 세포주 MCF7(리켄 바이오리소스 센터(BRC), RCB1904, MEM), T-47D(ATCC, HTB-133TM, RPMI1640 배지), MDA-MB-231(ATCC, HTB-26TM, L15 배지, CO2 불요, CO2 환경 하에서는 DMEM 배지), MDA-MB-453(BRC, RCB1192, L15 배지, CO2 불요, CO2 환경 하에서는 DMEM 배지), 인간 유선섬유증 유래 세포주 MCF 10A(ATCC, CRL-10317TM, MEGM 배지), 대장암 유래 세포주 HCT-116(BRC, RCB2979, DMEM 배지), 폐암 유래 세포주 A549(BRC, RCB0098, F12K 배지), 위암 유래 세포주 MKN45(BRC, RCB1001, RPMI1640 배지), 난소암 유래 세포주 NIH: OVCAR-3(BRC, RCB2135, RPMI1640 배지), 전립선암 유래 세포주 PC-3(ATCC, CRL-1435, RPMI1640 배지), 췌장암 유래 세포주 MIAPaca2(토호쿠대학 가령 의학 연구소, TKG0227, RPMI1640 배지), Panc1(토호쿠대학 가령 의학 연구소, TKG0606, RPMI1640 배지), 간암 유래 세포주 PLC/PRT/5(JCRB, JCRB0406, RPMI1640 배지), 자궁경부암 유래 세포주 HeLa(BRC, BRC0007, MEM 배지), 골수성 백혈병 유래 세포주 KG-1(BRC, RCB1166, RPMI1640 배지), 급성 림프성 백혈병 유래 세포주 CCRF-CEM(토호쿠대학 가령 의학 연구소, I-4924, RPMI1640 배지), 인간 제대혈 내피 세포주 Huvec(Lonza, CC-2519, MEG 배지). 특별히 명기하지 않는 한 모든 실시예에서 상기의 세포주를 이용하였다.
(Cell-SELEX)
우선 WO2013/073602에 기재된 방법에 준하여 DNA 라이브러리의 조제를 행하였다. DNA 라이브러리는 양 말단의 프라이머 서열(25염기)과 중간부의 45염기의 랜덤 서열로 이루어지는 총 95염기의 서열을 포함한 핵산으로 구성된다. 45염기의 랜덤 서열 중 2군데에는 인공 염기 Ds를 도입하고, 그 도입 위치는 랜덤 서열의 5' 말단의 3염기를 구성하는 서열(태그 서열)로부터 판정할 수 있다. 이들 태그 서열을 갖는 24종의 서브라이브러리를 화학 합성하고 혼합함으로써 DNA 라이브러리(N42Ds3nmix-P003)를 조제하였다(표 1).
Figure pct00001
유방암 세포주 MCF7에 대한 Cell-SELEX를 상기 라이브러리 2000pmol을 출발로 하여 실시하였다. 마찬가지로 유방암 세포주 T-47D, 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대해서는 상기 라이브러리 1000pmol을 출발 재료로 하여 Cell-SELEX를 실시하였다. Cell-SELEX의 방법에 대해서는 비특허문헌 1에 기재된 방법에 준하여 실시하고, 인공 염기를 포함한 DNA 라이브러리의 취급에 대해서는 WO2013/073602에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
3라운드째부터는 대조 세포로서 비암성 유선 유래의 상피성 세포주 MCF10A를 사용하여 비특허문헌 1에 기재된 방법에 준하여 카운터 셀렉션을 행하였다. 각각의 세포에서의 스크리닝 조건을 표 2~4에 나타낸다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
각 라운드에서 얻어진 DNA 풀의 5' 말단을 PCR을 이용하여 Alexa488로 형광 표지하고, 플로우 사이토미터를 사용하여 결합 서열의 농축을 확인하였다. 구체적으로는 25pmol의 Alexa488 표지된 각 라운드 풀 DNA를 D-PBS(-) 중에서 95℃, 5분간 가열을 행한 후 실온에서 20분간 방치함으로써 폴딩하였다. 이들 표지 DNA를 비효소적으로 현탁한 MCF7 세포(2.5×105 cells)와 4℃에서 30분간 인큐베이션을 행하였다(0.45% 글루코오스, 0.1mg/mL tRNA, 1mg/mL BSA, 5mM MgCl2/D-PBS(-)). 세정 버퍼(0.45% 글루코오스, 5mM MgCl2)로 세포에 결합하지 않은 표지 DNA를 씻어 흘린 후, 각각의 세포에 결합한 DNA 앱타머를 형광 강도의 변화로서 플로우 사이토미터(S3 Cell Sorter, BIO-Rad)로 해석하였다.
그 결과, MCF7 Cell-SELEX에서는 5라운드째부터 형광 강도의 변화가 일어나기 시작하고, 그 형광 강도는 7라운드째까지 증강하여 갔다. MDA-MB231에서는 6라운드부터 변화가 일어나기 시작하고, 7라운드에서 형광 강도는 더욱 증강하였다. 7라운드째의 형광 강도가 시프트한 집단(형광 표지한 DNA가 세포에 결합한 집단)을 셀 소터(S3 Cell Sorter, BIO-Rad)로 분취하였다.
<실시예 2: Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA의 서열 결정>
Ion PGM sequencing(Thermo Fisher Scientific)에 의해 소트한 세포로부터 얻어진 DNA의 염기 서열의 특정을 행하였다. MCF7 Cell-SELEX에서는 총 리드(read)수 246,903서열로부터 양 말단의 프라이머 서열을 올바르게 보유하고 있는 서열을 추출한 바, 해석 대상은 80,592서열이었다. 추출한 서열을 기초로 1염기 차이의 서열을 파생 서열로 간주하는 조건으로 클러스터링하고 서열의 농축 정도를 확인한 바, 10서열이 농축 후보로서 올랐다. 이들 후보 서열을 각각 화학 합성하여 개별로 결합능 스크리닝을 실시하고 2서열(14A-MCF7(서열 번호 4) 및 08B-MCF7(서열 번호 17))로 좁혔다.
T-47D Cell-SELEX(1회째)에서는 총 리드수 638,160서열로부터 양 말단의 프라이머 서열을 올바르게 보유하고 있는 서열을 추출한 바, 해석 대상은 205,801서열이었다. 추출한 서열을 기초로 1염기 차이의 서열을 파생 서열로 간주하는 조건으로 클러스터링한 바, 전체의 76%를 차지하는 서열(03-T47D(서열 번호 27))로 농축되었다.
MDA-MB-231 Cell-SELEX에서는 총 리드수 497,341서열로부터 양 말단의 프라이머 서열을 올바르게 보유하고 있는 서열을 추출한 바, 해석 대상은 128,607서열이었다. 추출한 서열을 기초로 1염기 차이의 서열을 파생 서열로 간주하는 조건으로 클러스터링하고 서열의 농축 정도를 확인한 바, 23-MB231(서열 번호 49); 36.6%, 05-MB231(서열 번호 34); 17.5%, 07-MB231(서열 번호 42); 14.2%의 3서열이 고도로 농축되었다.
<실시예 3: Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머의 세컨드 셀렉션>
실시예 2에서 얻어진 서열을 포함한 DNA 앱타머에 대해 WO2013/073602의 실시예 3에 기재된 방법에 준하여 세컨드 셀렉션(Doped selection)을 실시하고, 각각의 DNA 앱타머의 2차 구조의 추정을 행하였다. 세컨드 셀렉션에서는 오리지널의 1st 셀렉션에서 얻어진 오리지널 서열 각각의 염기 조성을 55%, 그 밖에 뉴클레오티드를 각각 15% 포함하는 비율로 조제된 라이브러리(Doped-14A, Doped-08B, Doped-03-T47D short, Doped-05-MB231, Doped-07-MB231, Doped-23-MB231)를 사용하여 재차 셀렉션을 행하였다.
셀렉션 조건은 표적 세포인 MCF7, T-47D 또는 MDA-MB-231만을 이용하여 4라운드를 실시하였다. 각 DNA 앱타머의 세컨드 셀렉션의 조건을 이하의 표 5 ~ 표 7에 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Cell-SELEX에 의해 얻어진 DNA 앱타머의 서열을 도 1~6에 나타낸다. 세컨드 셀렉션의 결과, 1st 셀렉션에서 얻어진 서열의 잔존율이 85% 이상인 염기를 동그라미로 둘러쌌다.
<실시예 4: 14A-MCF7 앱타머의 개변>
실시예 3에서 얻어진 14A-MCF7(53DsDs)(서열 번호 4)을 기초로 17위의 Ds를 A로 치환한 14A-MCF7(53ADs)(서열 번호 5), 28위의 Ds를 A로 치환한 14A-MCF7(53DsA)(서열 번호 6), 17위와 28위의 Ds를 A로 치환한 14A-MCF7(53AA)(서열 번호 7), 3' 말단측의 벌지 부분의 AG를 TT로 치환하고 줄기 부분의 미스매치 부분의 일부를 염기쌍을 형성하도록 치환한 14A-MCF7(Opt53DsDs)(서열 번호 3)을 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 7에 나타낸다).
양성 대상으로서 암세포에의 결합을 나타낸다고 보고되어 있는 뉴클레오린을 표적으로 하는 AS1411(서열 번호 81)(본 명세서에서는 단지 「AS1411」이라고도 표기함) 및 음성 대상으로서 뉴클레오린에의 결합능을 결실한 AS1411의 변이체인 Cont26(서열 번호 82)(본 명세서에서는 단지 「Cont26」이라고도 표기함)도 화학 합성하였다. 상기와 같이 조제한 DNA 앱타머를 이용하여 각각의 MCF-7 세포에 대한 결합성을 실시예 1과 같이 형광 강도의 변화로 해석하였다(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL로 인큐베이션을 행하였다). 그 결과, 14A-MCF7(53ADs)에서는 원래의 DNA 앱타머(14A-MCF7(53DsDs))에 비해 활성의 저하가 인정되고 14A-MCF7(53DsA)에서는 활성의 소실이 인정되었기 때문에 서열 중 Ds의 2군데 모두 결합에 관여하고 있고, 특히 3' 말단측의 Ds가 결합에 크게 관여하고 있는 것이 시사되었다(도 8). 또한, 벌지 부분이나 줄기 부분을 변경한 서열을 갖는 DNA 앱타머 14A-MCF7(Opt53DsDs)에서 원래의 DNA 앱타머와 동일한 정도의 활성이 인정된 것은 이들 부분이 DNA 앱타머의 결합 활성에 거의 관여하지 않음을 시사하고 있다.
이어서, 결합에 영향을 줄 수 있는 줄기 길이의 검토를 행하였다. 구체적으로는 14A-MCF7(53DsDs)을 기초로 5' 말단 및 3' 말단에서 각각 8염기 총 16염기를 제거한 14A-MCF7(37DsDs)(서열 번호 8), 14A-MCF7(37DsDs)에서 AG로 이루어지는 벌지 구조를 더 제거하고 말단의 줄기 중 몇 개를 GC쌍으로 치환한 14A-MCF7(35DsDs)(서열 번호 9), 14A-MCF7(35DsDs)의 3' 말단에 미니 헤어핀을 부가한 14A-MCF7mh(44DsDs)(서열 번호 10), 줄기 구조의 GC쌍을 각각 1쌍, 2쌍, 3쌍 제거한 14A-MCF7mh(서열 번호 11), 14A-MCF7mh(40DsDs)(서열 번호 12), 14A-MCF7mh(38DsDs)(서열 번호 13)를 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 9에 나타낸다). 각각 250nM(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL)에서 4℃, 30분의 인큐베이션을 행하고, 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도 시프트에 의한 세포에의 결합성을 확인하였다.
그 결과, 모두 MCF7 세포에 대해 결합성을 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 이들 결과에 의해 말단의 줄기 구조를 단축화하거나 말단에 미니 헤어핀을 부가해도 동등한 활성이 유지되는 것이 나타났다.
<실시예 5: 08B-MCF7DNA 앱타머의 개변>
08B-MCF7 앱타머에서도 개변을 행하였다. 구체적으로는 08B-MCF7(51DsDs)(서열 번호 20)을 기초로 18위의 Ds를 A로 치환한 08B-MCF7(51ADs)(서열 번호 21), 32위의 Ds를 A로 치환한 08B-MCF7(51DsA)(서열 번호 22), 18위 및 32위의 Ds를 A로 치환한 08B-MCF7(51AA)(서열 번호 23), 08B-MCF7(51DsDs)에 미니 헤어핀을 부가한 08B-MCF7mh(서열 번호 24), 08B-MCF7mh의 내부의 줄기 루프를 미니 헤어핀으로 치환한 08B-MCF7mh2(서열 번호 25)를 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 11에 나타낸다).
각각 250nM(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL)에서 4℃, 30분의 인큐베이션을 행하고, 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도 시프트에 의한 세포에의 결합성을 확인하였다.
결과를 도 12에 나타낸다. 08B-MCF7(51ADs)에서는 활성이 유지되고 08B-MCF7(51DsA)에서는 활성의 저하가 인정되었기 때문에 5'측(18위)의 Ds는 세포 결합에는 관여하지 않고 3'측(32위)의 Ds에만 세포 결합성이 의존하는 것이 시사되었다. 5'측의 Ds가 세포 결합에 기여하지 않기 때문에 5'측의 줄기 루프를 미니 헤어핀으로 치환한 08B-MCF7mh2를 합성하여 시험한 바 이것도 MCF7 세포에 결합하였다(도 12).
<실시예 6: 03-T47D 앱타머의 개변>
03-T47D 앱타머에서도 개변을 행하였다. 구체적으로는 03-T47D(서열 번호 27)의 말단에 GC쌍을 부가한 03-T47D(DsDs)(서열 번호 29)를 기초로 24위의 Ds를 A로 치환한 03-T47D(DsA)(서열 번호 30), 15위의 Ds를 A로 치환한 03-T47D(ADs)(서열 번호 31), 15위 및 24위의 Ds를 A로 치환한 03-T47D(AA)(서열 번호 32), 03-T47D(DsDs)의 말단에 미니 헤어핀을 부가한 03-T47Dmh(서열 번호 33)를 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 13에 나타낸다).
각각 250nM(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL)에서 4℃, 30분의 인큐베이션을 행하고, 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도 시프트에 의한 세포에의 결합성을 확인하였다.
결과를 도 14에 나타낸다. 03-T47D(DsA) 및 03-T47D(ADs) 둘 다에서 결합의 저하가 인정된 것은 서열 중 2개의 Ds는 모두 세포 결합에 관여하고 있는 것을 시사한다. 또한, 말단에 미니 헤어핀을 부가한 DNA 앱타머(03-T47Dmh)에 대해서도 세포에의 결합을 확인하였다(도 14).
<실시예 7: 05-MB231 앱타머의 개변>
05-MB231 앱타머에서도 개변을 행하였다. 구체적으로는 05-MB231(서열 번호 34)의 말단의 줄기 일부를 GC쌍으로 치환한 05-MB231(DsDs)(서열 번호 36)을 기초로 44위의 Ds를 A로 치환한 05-MB231(DsA)(서열 번호 37), 33위의 Ds를 A로 치환한 05-MB231(ADs)(서열 번호 38), 33위 및 44위의 Ds를 A로 치환한 05-MB231(AA)(서열 번호 39), 05-MB231(DsDs)의 말단의 서열 일부를 제거하고 줄기의 일부를 GC쌍으로 치환한 05-MB231GC(서열 번호 40) 및 05-MB231GC에 미니 헤어핀을 부가한 05-MB231GCmh(서열 번호 41)를 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 15에 나타낸다).
각각 250nM(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL)에서 4℃, 30분의 인큐베이션을 행하고, 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도 시프트에 의한 세포에의 결합성을 확인하였다.
결과를 도 16에 나타낸다. 05-MB231(ADs)에서는 결합능의 저하가 인정되었지만 05-MB231(DsA)에서 결합의 저하가 인정되지 않았기 때문에 3' 측의 Ds가 결합에 관여하지 않는 것이 나타났다. 이 영역을 제거한 서열(05-MB231GC) 및 이에 말단에 미니 헤어핀을 부가한 서열(05-MB231GCmh)을 포함하는 DNA 앱타머에 대해서도 결합을 확인하였다.
<실시예 8: 07-MB231 앱타머의 개변>
07-MB231 앱타머에서도 개변을 행하였다. 구체적으로는 07-MB231(서열 번호 42)의 말단의 줄기 일부를 GC쌍으로 치환한 07-MB231(DsDs)(서열 번호 44)을 기초로 28위의 Ds를 A로 치환한 07-MB231(DsA)(서열 번호 46), 15위의 Ds를 A로 치환한 07-MB231(ADs)(서열 번호 47), 15위 및 28위의 Ds를 A로 치환한 07-MB231(AA)(서열 번호 48), 07-MB231의 말단에 미니 헤어핀을 부가한 07-MB231mh(서열 번호 45)를 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 17에 나타낸다).
각각 250nM(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL)에서 4℃, 30분의 인큐베이션을 행하고, 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도 시프트에 의한 세포에의 결합성을 확인하였다.
결과를 도 18에 나타낸다. 07-MB231(DsA) 및 07-MB231(ADs) 모두 결합능의 저하가 인정되고 07-MB231(ADs)에서 보다 현저하게 결합능의 저하가 인정되었기 때문에 구조 중 2개의 Ds 모두가 세포 결합에 관여하고, 특히 5'측의 Ds가 세포에의 결합에 크게 관여하는 것이 시사되었다. 말단에 미니 헤어핀을 부가한 서열을 포함하는 DNA 앱타머(07-MB231mh)에 대해서도 결합을 확인하였다.
<실시예 9: 23-MB231 앱타머의 개변>
23-MB231에서도 개변을 행하였다. 구체적으로는 23-MB231b(서열 번호 51)를 기초로 말단에 미니 헤어핀을 부가한 23-MB231bmh(서열 번호 52)를 설계하고, 각각의 염기 서열을 갖는 DNA 앱타머를 화학 합성하였다(각각의 염기 서열과 Doped selection로부터 예측되는 2차 구조를 도 19에 나타낸다).
각각 250nM(25pmol Alexa488 표지 DNA/2.5×105cells/100μL)에서 4℃, 30분의 인큐베이션을 행하고, 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도 시프트에 의한 세포에의 결합성을 확인하였다.
결과를 도 20에 나타낸다. 모든 DNA 앱타머에 대해 결합을 확인하였다.
<실시예 10: DNA 앱타머의 어피니티(KD) 검토>
최적화, 안정화를 행한 DNA 앱타머를 이용하여 표적 세포주에 대한 친화성을 비교 검토하였다. 방법은 DNA 앱타머에 Alexa488 표지를 행하고 세포 결합에 의해 생기는 형광 강도의 변화를 플로우 사이토미터로 해석하였다.
구체적으로는 표지 DNA 앱타머를 종농도 100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1 또는 0nM로 단계 희석을 행하고, 2.5×105 세포가 비효소적으로 현탁한 MCF7과 4℃에서 30분의 인큐베이션을 행하고 2회 세정 후 플로우 사이토미터로 형광 강도를 측정하였다(3반복). 각각의 농도로 얻어진 형광값을 기초로 Kaleida Graph로 Kd값을 산출하였다. 계산식은 y=m1×M0/(m2+M0)이다.
결과를 도 21~26 및 표 8에 나타낸다. 08B-MCF7, 14A-MCF7, 05-MB231 및 07-MB231에 유래하는 앱타머에 대해서는 기본 구조 및 말단에 미니 헤어핀을 부가한 구조 모두에서 세포에 대해 수nM 레벨의 매우 강한 결합능을 가졌다. 03-T47D 및 23-MB231에 유래하는 앱타머에 대해서는 수10nM~수nM 레벨의 결합능을 가지고 있었다.
Figure pct00008
<실시예 11: Tm값의 산출>
14A-MCF7 앱타머에 유래하는 앱타머 및 08B-MCF7 앱타머에 유래하는 앱타머의 Tm값을 UV-2450(시마즈 제작소)으로 측정하였다(3회 평균).
구체적으로는 각각의 DNA 앱타머를 D-PBS(-)로 희석을 하여 260pmol/130μL를 5ml 라운드 튜브에 준비하였다. 이들을 95℃에서 3분간 가열한 후, 데시케이터 중에서 1분간 탈기를 행하였다. 이들 샘플을 큐벳으로 옮기고 15~100℃의 온도 조건으로 0.5℃/초씩 온도를 상승시켜 260nm의 흡광도를 측정하였다. 데이터는 IGOR pro로 그래프화를 행하고, 3회 행한 값을 평균하여 나타내었다.
결과를 도 27 및 표 9에 나타낸다.
Figure pct00009
14A-MCF7에 유래하는 앱타머의 260nm의 흡광도가 60℃ 부근에서 급격히 변화하는 것에 반해, 08B-MCF7에 유래하는 앱타머에서는 완만하게 추이하였다. 이는 14A-MCF7에 유래하는 앱타머가 08B-MCF7에 유래하는 앱타머보다 구조적으로 열안정성이 우수한 것을 시사하고 있다.
<실시예 12: 결합 경합 저해 시험>
세포 결합능이 특히 강한 4종의 DNA 앱타머(14A-MCF7mh, 08B-MCF7mh, 05-MB231GCmh 및 07-MB231mh)의 세포 결합성에 대해 경합 실험을 행하고 결합 표적의 동일성을 검토하였다. 즉, DNA 앱타머에 Alexa488 표지를 행하고 세포 결합에 의해 생기는 Kd값 농도 부근의 형광 강도의 변화가 다른 DNA 앱타머의 존재 하에서 변화하는지 어떤지를 플로우 사이토미터로 해석하였다.
구체적으로는 표지 DNA 앱타머를 종농도 2.5 혹은 5nM로 설정하고, 경합시키는 DNA 앱타머를 0, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100nM로 혼재시켰다. 각각을 2.5×105 세포가 비효소적으로 현탁한 MCF7과 4℃에서 30분의 인큐베이션을 행하고, 세정 버퍼(0.45% 글루코오스, 5mM MgCl2)에 의한 2회 세정 후 플로우 사이토미터로 형광 강도를 측정하였다. 이 때 사용하는 세포주로서는 형광 표지체가 14A-MCF7mh, 08B-MCF7mh인 경우에는 MCF7 세포주를 이용하고, 05-MB231GCmh, 07-MB231mh인 경우에는 MDA-MB-231 세포주를 사용하였다.
결과를 표 10에 나타낸다. 14A-MCF7mh는 08B-MCF7mh2와 결합 경합을 나타내었지만, 05-MB231GCmh 및 07-MB231mh에 대해서는 세포 결합에 관해 다른 DNA 앱타머의 존재에 간섭받는 일은 없었다. 이는 14A-MCF7mh와 08B-MCF7mh2가 동일한 결합 표적을 갖는 것에 반해 05-MB231GCmh 및 07-MB231mh는 각각 특이적인 결합 표적을 갖는 것을 시사하고 있다.
Figure pct00010
<실시예 13: 각 DNA 앱타머의 세포 결합 특이성>
취득한 DNA 앱타머의 결합 특이성을 확인하기 위해 이들 Alexa488 표지체와 여러 가지의 배양 암세포주를 인큐베이션하고, 결합의 유무를 실시예 1과 같이 플로우 사이토미터로 형광 강도의 시프트로 해석하였다. 양성 대조로서 AS1411을, 음성 대조로서 AS1411의 변이체 Cont26을 이용하여 그 형광 강도의 시프트로부터 판단하였다. Cont26보다 약한 형광 강도가 인정된 것을 -, Cont26보다 강한 형광 강도가 인정된 것을 +, AS1141보다 강한 형광 강도가 인정된 것을 ++로 평가하였다.
결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00011
표 11에 나타나는 바와 같이 14A-MCF7mh, 08B-MCF7mh2는 모두 MCF7 세포주에만 세포 결합을 나타내는 강한 형광 강도의 시프트가 관찰되었다. 또한, 07-MB231mh에서는 MDA-MB-231 세포주에 대한 특이적 결합이 관찰되었다. 한편, 03-T47Dmh 및 05-MB231GCmh에서는 비암세포 이외의 대부분의 암세포주에 결합하는 것이 관찰되었다.
<실시예 14: DNA 앱타머의 세포 내재성의 확인>
각 DNA 앱타머의 결합 국재를 확인하기 위해 250nM의 Alexa488 표지를 실시한 DNA 앱타머를 OPTI-MEM(GibcoBRL) 중에서 4℃ 또는 37℃에서 30분 인큐베이션을 행하였다. 세포는 각 DNA 앱타머의 유래가 되는 세포를 이용하였다. 상기 배지에는 후기 엔도솜 및 리소좀을 염색하는 LysoTracker Red DND-99(Molecular Probes)를 75nM 첨가해 두고 세포 내 오르가넬라 마커로서 국재의 지표에 이용하였다. 인큐베이션을 행한 세포는 4% 파라포름알데히드로 고정하고 DAPI 염색을 실시하여 봉입하여 샘플로 하였다. 이들 샘플에 대해 ECLIPSE Ti(니콘)로 형광 현미경 관찰을, FV10i 혹은 FV1200(모두 올림푸스) 공초점 현미경 관찰을 실시하였다.
결과를 도 28~31에 나타낸다. 모든 DNA 앱타머에서 Alexa488의 형광은 세포 표면 상에 도트 형상으로 점재되어 있는 것이 관찰되고 세포 표면 상에 결합되어 있는 모습을 볼 수 있었다(도 28~29). 또한, 이들 중에서 14A-MCF7mh를 사용한 공초점 현미경 관찰에서는 Alexa488의 형광이 세포 표면뿐만 아니라 엔도솜(LysoTracker와 공국재되어 있음)에 국재되어 있는 것이 관찰되었다(도 30). 이는 세포막 표면 상의 어떠한 표적에 결합한 14A-MCF7mh 앱타머가 엔도사이토시스로 세포 내에 도입되어 서서히 엔도솜(리소좀)으로 이행해 가는 것을 시사하고 있다.
한편, 양성 대조로서 이용한 AS1411에서는 세포 표면에 도트 형상으로 국재되어 있는 것이 관찰되었다(LysoTracker의 국재와는 일치하지 않음)(도 31). 이는 본 발명의 DNA 앱타머와 AS1141이 세포에의 도입 시스템을 다르게 하는(즉, 표적이 다른) 것을 시사하고 있다.
<실시예 15: 각종 DNA 앱타머의 배양 세포에 대한 영향의 검토>
여러 가지의 배양 암세포주를 이용하여 취득한 각 DNA 앱타머의 세포 증식 억제 효과를 검증하였다. 접착성의 여러 가지 암세포(MCF7/MEM 배지, T47D/RPMI 배지, MDA-MB-231/DMEM 배지, MDA-MB-453/DMEM 배지, MIAPaca2/RPMI 배지, PC-3/RPMI 배지, HCT-116/DMEM 배지, A549/DMEM 배지)는 약제 첨가 전날에 1×103에서 2.5×103cells/well이 되도록 96구멍 플레이트에 파종하였다. 골수성 백혈병 유래 세포주 KG-1(RPMI 배지)은 약제 첨가 약 2시간 전에 4×104cells/mL로 90μL/well이 되도록 파종하였다. 비암세포(MCF10A 및 HUVEC)는 4×103cells/well이 되도록 파종하였다.
각 DNA 앱타머를 100μM가 되도록 D-PBS(-)로 희석하고, 그 용액을 95℃에서 5분 가열 후 실온에서 20분 이상 방치함으로써 폴딩을 행하였다. 핵산의 대조 샘플로는 AS1411 및 Cont26을 이용하여 50μM 또는 100μM가 되도록 D-PBS(-)로 희석하고, 95℃에서 1℃/분으로 서냉하여 폴딩을 행하였다. 저분자 화합물의 대조 샘플로는 기존 항암제인 파클리탁셀(시그마 알드리치, 약칭 PTX, 종농도 10nM), 플록슈리딘(나칼라이 테스크, 약칭 FUdR, 종농도 10nM)을 이용하였다. DNA 앱타머에 대해서는 각각 지정된 배지에서 종농도가 1, 2.5, 5 또는 10μM가 되도록 10배 희석하여 배지 교환에 의해 첨가(접착 세포)하거나, 혹은 종농도의 10배 농도로 D-PBS(-)로 희석한 샘플을 세포 용액에 직접 10μL 첨가하였다. PTX에 대해서는 각 배지에서 1000배 희석, FUdR에 대해서는 10배 희석하여 세포 첨가를 행하였다. 또한, 각각의 용매인 D-PBS(-), DMSO 단체(單體)에 대해서도 용매 컨트롤로서 처리군의 설정을 행하였다. 약제 첨가 후 4일간(접착 세포) 또는 3일간(부유 세포) 배양을 행하였다. 생세포수 측정 시약(WST-8 어세이, 나칼라이 테스크)을 이용하여 어세이를 행하고, Arvo multilabel counter(Perkin Elmer)에서 각 웰의 450nm에서의 흡광도를 측정하고, 이들 결과를 배지 교환만 행한 군으로 표준화하여 세포 증식을 평가하였다.
도 32a~c에 비형광 표지의 각 DNA 앱타머(08B-MCF7mh, 14A-MCF7mh, 05-MB231GCmh, 07-MB231mh, 03-T47Dmh)의, 각 DNA 앱타머 취득에 사용한 표적 암세포(08B-MCF7mh 및 14A-MCF7mh에 대해서는 MCF7 세포, 05-MB231GCmh 및 07-MB231mh에 대해서는 MB231 세포, 03-T47Dmh에 대해서는 T47D 세포)에 대한 증식 억제 효과를 조사한 결과를 나타낸다. 05-MB231GCmh는 양성 대조인 AS1411과 같이 농도 의존적으로 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것을 알 수 있고, 비암세포인 MCF10A에의 증식 억제는 보이지 않는 것을 알 수 있었다. 05-MB231GCmh 이외의 DNA 앱타머는 음성 대조인 Cont26과 같이 표적 암세포, 비암세포 어느 것에도 세포 증식에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.
도 33a~c에 표적 암세포에 대해 세포 증식 억제 효과가 보인 05-MB231GCmh의 1염기 치환체인 05-MB231GCmmh(서열 번호 80)를 이용하여 다양한 암세포에 대한 증식 억제 효과를 조사한 결과를 나타낸다. 05-MB231GCmmh는 05-MB231GCmh와 같이 표적으로 이용한 암세포주 MDA-MB231뿐만 아니라 다양한 암세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 한편으로 도 32a~c와 같이 비암세포인 MCF10A나 HUVEC에 대해서는 증식 억제 효과는 거의 인정받지 못하였다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.
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(15)..(15) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 29 gcggcgaaga tcacnactag gggncctcgc cgc 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 30 gcggcgaaga tcacnactag gggacctcgc cgc 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 31 gcggcgaaga tcacaactag gggncctcgc cgc 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 32 gcggcgaaga tcacaactag gggacctcgc cgc 33 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 33 gcggcgaaga tcacnactag gggncctcgc cgccgcgtag cg 42 <210> 34 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 34 aattttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agntgtaacg tcangaatt 49 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(34) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 nnnnnagggg tgtttgtgcc gtgagntgtn nnnn 34 <210> 36 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 36 ggctttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agntgtaacg tcangagcc 49 <210> 37 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 37 ggctttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agntgtaacg tcaagagcc 49 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 38 ggctttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agatgtaacg tcangagcc 49 <210> 39 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 39 ggctttgacg ttaggggtgt ttgtgccgtg agatgtaacg tcaagagcc 49 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 40 ggcgccaggg gtgtttgtgc cgtgagntgt ggcgcc 36 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 41 ggcgccaggg gtgtttgtgc cgtgagntgt ggcgcccgcg tagcg 45 <210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 42 cctaggcagc ctgggntctc ttttagtcna gttcaatcgc ctagg 45 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 nnnnnncagc ctgggntntc tttnagtcna nttcantcgn nnnnn 45 <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 44 ccgcgcagcc tgggntctct tttagtcnag ttcaatcgcg cgg 43 <210> 45 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 45 ccgcgcagcc tgggntctct tttagtcnag ttcaatcgcg cggcgcgtag cg 52 <210> 46 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 46 ccgcgcagcc tgggntctct tttagtcaag ttcaatcgcg cgg 43 <210> 47 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 47 ccgcgcagcc tgggatctct tttagtcnag ttcaatcgcg cgg 43 <210> 48 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 48 ccgcgcagcc tgggatctct tttagtcaag ttcaatcgcg cgg 43 <210> 49 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 49 ccctcttaag tttatagntg tcttttggtn cctagggcgt tttaaaggg 49 <210> 50 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(23) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (46)..(49) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 nnntcttaag tttananntn nnntnnnnnn nntngggcgt tttaannnn 49 <210> 51 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 51 ccctcttaag tttatagntg tcttttggtn cctagggcgt tttaaaggg 49 <210> 52 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 52 ccctcttaag tttatagntg tcttttggtn cctagggcgt tttaaagggc gcgtagcg 58 <210> 53 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 gagnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 54 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(23) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 gacnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(22) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 cagnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (23)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 cacnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 57 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (22)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 aggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 58 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (21)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 ggannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 59 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 gggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 60 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 ggcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 61 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 61 ggtnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 62 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(23) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 62 cgannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 63 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 cggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 64 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (27)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 cgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 65 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 cgtnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 66 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 tggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 tgcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(29) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 acgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 69 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (32)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 gcannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 70 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (22)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 70 gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 71 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (21)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 gccnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 72 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (21)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 gctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 73 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 73 ccannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 74 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(29) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 75 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(29) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 75 cccnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 76 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (4)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <220> <221> misc_feature <222> (32)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 cctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 45 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 77 acgaccgttc tctaattttg acgtt 25 <210> 78 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is Spacer C12 CE Phosphoramidite <400> 78 tttttttttt tttttnacca aattattgcg atacagaccc t 41 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 79 accaaattat tgcgatacag accct 25 <210> 80 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> N=7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl <400> 80 ggcgccaggg gtgtttgtgc cgtgagntgt ggcgcccgcg aagcg 45 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 81 ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26 <210> 82 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 82 cctcctcctc cttctcctcc tcctcc 26 <210> 83 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 83 cgcgtagcg 9

Claims (30)

  1. 이하의 (i) 또는 (ii)의 염기 서열을 포함하는, 암세포에 결합하는 DNA 앱타머:
    (i) (a) N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(서열 번호 35)에 나타나는 염기 서열
    (서열 중 N1~N5는 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N26은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N30은 N5와, N31은 N4와, N32는 N3과, N33은 N2와, N34는 N1과 염기쌍을 형성함) 또는
    (b) (i) (a)에 나타나는 염기 서열의 N26 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열; 및
    (ii) (a) N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(서열 번호 28)에 나타나는 염기 서열
    (서열 중 N1~N6, N14, N25는 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N13 및 N22는 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N26은 N4와, N29는 N3과, N30은 N2와, N31은 N1과 염기쌍을 형성하고, N27 및 N28은 독립적으로 G, T, A, C 혹은 존재하지 않음) 또는
    (b) (ii) (a)에 나타나는 염기 서열의 N13 및 N22 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열.
  2. 청구항 1에 있어서,
    (i) (a) 또는 (ii) (a)의 염기 서열이 1~5개의 GC쌍을 말단에 더 포함하는 DNA 앱타머.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 염기쌍이 GC쌍인 DNA 앱타머.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 35의 1위~5위 또는 30위~34위에서 이루어지는 DNA 앱타머.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    (ii) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 28의 1위~6위, 14위 또는 25위~31위에서 이루어지는 DNA 앱타머.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    (i) (a)의 염기 서열이 서열 번호 36, 37 또는 40에 나타나는 서열인 DNA 앱타머.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    (ii) (a)의 염기 서열이 서열 번호 29에 나타나는 서열인 DNA 앱타머.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    3' 말단에 미니 헤어핀 구조를 더 포함하고,
    상기 미니 헤어핀 구조가
    5' 말단측에서 3' 말단측으로 향하여 차례대로 연결된 이하의 (A)~(C)의 핵산 영역:
    (A) 2~5개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어지는 제1 핵산 영역,
    (B) GNA 또는 GNNA(여기서, 각 n은 독립적으로 G, T, A 혹은 C 중 어느 하나임)의 염기 서열로 이루어지는 제2 핵산 영역 및
    (C) 제1 핵산 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 제3 핵산 영역으로 이루어지며,
    또한, 제1 핵산 영역 및 제3 핵산 영역이 서로 염기 대합한 줄기 부분과 제2 핵산 영역으로 이루어지는 루프 부분에 의해 구성되는 DNA 앱타머.
  9. 이하의 (I)~(IV) 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는, 유방암 세포에 결합하는 DNA 앱타머:
    (I) (a) N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(서열 번호 43)에 나타나는 염기 서열
    (서열 중 N1~N6, N18, N24, N31 및 N36은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N16은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N29는 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, G, T, A 혹은 C이고, N40은 N6과, N41은 N5와, N42는 N4와, N43은 N3과, N44는 N2와, N45는 N1과 염기쌍을 형성함) 또는
    (b) (I) (a)에 나타나는 염기 서열의 N16 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열; 및
    (II) (a) N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(서열 번호 2)에 나타나는 염기 서열
    (서열 중 N1~N4, N7, N16, N23, N26 및 N31은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N6은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, G, T, A 혹은 C이며, N17은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이고, N27은 N3과, N28은 N2와 염기쌍을 형성하며, N29 및 N30은 G, T, A, C 혹은 존재하지 않음) 또는
    (b) (II) (a)에 나타나는 염기 서열의 N17 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열;
    (III) (a) N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(서열 번호 18)에 나타나는 염기 서열
    (서열 중 N1~N3, N13~N17, N19~N22, N33, N46~N48 및 N50은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N10~N12 및 N23~N25는 G, T, A, C 혹은 존재하지 않으며, N18은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, G, T, A 혹은 C 또는 존재하지 않고, N32는 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N49는 N3, N51은 N1과 염기쌍을 형성하고, N10~N15 중 3개 이상이 N20~N25 중 3개 이상과 염기쌍을 형성함) 또는
    (b) (III) (a)에 나타나는 염기 서열의 N32 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열;
    (IV) (a) N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(서열 번호 50)에 나타나는 염기 서열
    (서열 중 N1~N3, N15, N17, N20~N23, N25~N29, N31~N32, N34 및 N46은 독립적으로 G, T, A 혹은 C이고, N18 및 N30은 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl이며, N47은 N3, N48은 N2, N49는 N1과 염기쌍을 형성함) 또는
    (b) (IV) (a)에 나타나는 염기 서열의 N18 및 N30 이외의 위치에서 하나 또는 수 개의 뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 치환된 염기 서열.
  10. 청구항 9에 있어서,
    (I) (a), (II) (a), (III) (a) 또는 (IV) (a)의 염기 서열이 1~5개의 GC쌍을 말단에 더 포함하는 DNA 앱타머.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    상기 염기쌍이 GC쌍인 DNA 앱타머.
  12. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 43의 1위~6위, 18위, 24위, 29위, 31위, 36위 또는 40위~45위에서 이루어지는 DNA 앱타머.
  13. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    (II) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 2의 1위~4위, 6~7위, 16위, 23위 또는 26위~31위에서 이루어지는 DNA 앱타머.
  14. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    (III) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 18의 1위~3위, 10위~25위, 33위 또는 46위~51위에서 이루어지는 DNA 앱타머.
  15. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    (IV) (b)의 부가, 결실 및/또는 치환이 서열 번호 50의 1위~3위, 15위, 17위, 20위~23위, 25위~29위, 31위~32위, 34위 또는 46위~49위에서 이루어지는 DNA 앱타머.
  16. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    (I) (a)의 염기 서열이 서열 번호 44 또는 46에 나타나는 서열인 DNA 앱타머.
  17. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    (II) (a)의 염기 서열이 서열 번호 3~5, 8~9 및 14~16 중 어느 하나에 나타나는 서열인 DNA 앱타머.
  18. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    (III) (a)의 염기 서열이 서열 번호 20, 21 및 26 중 어느 하나에 나타나는 서열인 DNA 앱타머.
  19. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    (IV) (a)의 염기 서열이 서열 번호 51에 나타나는 서열인 DNA 앱타머.
  20. 청구항 9 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    3' 말단에 미니 헤어핀 구조를 더 포함하고,
    상기 미니 헤어핀 구조가
    5' 말단측에서 3' 말단측으로 향하여 차례대로 연결된 이하의 (A)~(C)의 핵산 영역:
    (A) 2~5개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어지는 제1 핵산 영역,
    (B) GNA 또는 GNNA(여기서, 각 N은 독립적으로 G, T, A 혹은 C 중 어느 하나임)의 염기 서열로 이루어지는 제2 핵산 영역 및
    (C) 제1 핵산 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 제3 핵산 영역으로 이루어지며,
    또한, 제1 핵산 영역 및 제3 핵산 영역이 서로 염기 대합한 줄기 부분과 제2 핵산 영역으로 이루어지는 루프 부분에 의해 구성되는 DNA 앱타머.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머를 포함하는 암 검출제.
  22. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머를 포함하는 암세포 검출용 키트.
  23. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머를 포함하는 의약 조성물.
  24. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 기재된 (i) (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 DNA 앱타머로 이루어지는 항암제.
  25. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머와 약제를 포함하는, 약제를 암세포에 송달하기 위한 의약 조성물.
  26. 암세포를 검출하는 방법으로서,
    피험체로부터 얻어진 세포를 포함한 샘플을 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
    상기 샘플과 상기 DNA 앱타머의 결합에 기초하여 암세포를 검출하는 공정을 포함하는 상기 방법.
  27. 유방암 세포를 검출하는 방법으로서,
    피험체로부터 얻어진 세포를 포함한 샘플을 청구항 9 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
    상기 샘플과 상기 DNA 앱타머의 결합에 기초하여 유방암 세포를 검출하는 공정을 포함하는 상기 방법.
  28. 피험체로부터 얻어진 암세포를 분류하는 방법으로서,
    피험체로부터 얻어진 암세포를 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
    상기 암세포와 상기 DNA 앱타머의 결합 유무 또는 강도를 측정하는 공정,
    상기 결합 유무 또는 강도에 기초하여 암세포를 분류하는 공정을 포함하는 상기 방법.
  29. 피험체로부터 얻어진 유방암 세포를 분류하는 방법으로서,
    피험체로부터 얻어진 유방암 세포를 청구항 9 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정,
    상기 유방암 세포와 상기 DNA 앱타머의 결합 유무 또는 강도를 측정하는 공정,
    상기 결합 유무 또는 강도에 기초하여 유방암 세포를 분류하는 공정을 포함하는 상기 방법.
  30. 청구항 29에 있어서,
    접촉 공정이 피험체로부터 얻어진 유방암 세포를 청구항 9 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 기재된 (I)~(IV)의 4개의 군 중 적어도 2개의 군에서 선택되는 2종 이상의 DNA 앱타머와 접촉시키는 공정인 방법.
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