TW202005638A

TW202005638A - 核酸奈米顆粒、包含其的藥物組合物、含阿霉素的藥物及其製備方法

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Publication number: TW202005638A
Application number: TW108124772A
Authority: TW
Inventors: 王力源; 王萌
Original assignee: 大陸商百藥智達（北京）納米生物技術有限公司
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2020-02-01
Also published as: KR20210031494A; KR102656600B1; TWI743518B; AU2019302604A1; EP3821911A4; AU2019302604B2; WO2020011248A1; JP7267416B2; JP2021532175A; US20220409742A1; EP3821911A1

Abstract

本發明提供了一種核酸奈米顆粒、包含其的藥物組合物、含阿霉素的藥物及其製備方法。該核酸奈米顆粒具有核酸結構域，核酸結構域包含a序列、b序列和c序列，a序列包含a1序列或者a1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，b序列包含b1序列或者b1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，c序列包含c1序列或者c1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列。該核酸奈米顆粒通過包含上述三條序列或其變異序列，不僅能夠自組裝形成核酸結構域，而且可以作為載體掛載和遞送藥物。

Description

核酸奈米顆粒、包含其的藥物組合物、含阿霉素的藥物及其製備方法

本發明關於遞送載體領域，具體而言，關於一種核酸奈米顆粒、包含其的藥物組合物、含阿霉素的藥物及其製備方法。

癌症已成為危害人類健康的最主要疾病，藥物治療，包括細胞靶向給藥、基因治療、RNAi等均是攻克癌症的前沿研究領域。然而許多抗癌藥物存在難溶於水或穩定性差等缺陷。如阿霉素等都因溶解度差而難以被生物體很好地利用，解決其水溶性問題是這類藥物製劑臨床應用的關鍵。此外，腫瘤治療和診斷藥物的作用大多是非選擇性的，通常在治療劑量下對正常組織器官的毒副作用大。與許多蛋白類物質的遞送一樣，核酸類物質在胃腸道中的降解和較低的生物利用度是siRNA的口服遞送的主要障礙。即使對於靜脈內遞送，常規siRNA 被血清因子快速降解，從而不能到達其靶位置。

藥物活性成分往往由於無法有效到達病灶部位或過量作用於正常細胞和組織，而無法實現治療目的或產生毒副作用。例如比較典型的有鉑類藥物，其廣泛用於卵巢癌、小細胞肺癌、睾丸癌、頭頸部鱗癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胸膜間皮瘤、黑色素瘤及子宮內膜癌的化療治療。但是鉑類藥物的靶向性差，一般藥物劑量無法達到治療效果，過多劑量又會導致藥物大量作用於正常細胞和組織，造成化療後人體骨髓抑制作、胃腸道反應、腎毒性、神經毒性等不良反應，因而限制了鉑類化療藥物的使用。

為減輕藥物活性成分靶向性差所產生的副作用，藥物遞送載體應運而生，其作用主要是承載藥物活性成分，將活性成分輸送至血液或組織細胞內以治療疾病。例如，在癌症的化療治療中，遞送載體將化療藥物輸送至癌細胞內，使藥物活性成分與癌細胞內DNA 相互作用，對腫瘤產生抑制作用。目前常用的鉑類化療藥物遞送載體包括脂質體、膠束、奈米囊、聚合物-鉑偶聯物和碳奈米管等。

此外，目前已經有多種多樣的方法來實現不同藥物的靶向運輸。有用儀器或器械實現的，比如基因槍、電穿孔儀等。這些方法無需使用基因載體，但是轉染效率普遍很低、操作複雜，對組織的損傷也比較大。也有用病毒載體介導的，如腺病毒、慢病毒等，病毒載體雖然有較高的體外轉染活性，然而，其免疫原性與易導致突變的缺點為體內輸送帶來了巨大的安全隱患。還有非病毒載體，尤其是生物可降解的高分子材料來實現藥物的靶向運輸。非病毒載體的優勢主要在於，在保證預期的轉染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帶來的免疫原性與諸多炎症反應。

上述多種靶向運輸方式中，目前更多的研究集中在非病毒載體領域，且一般為以下幾種載體設計：(a) 陽離子脂質體；(b) 聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主要集中於聚陽離子基因載體與陽離子脂質體的修飾，使之適用於基因物質的靶向輸送。陽離子脂質體具有較高的體內外轉染活性，然而，由於表面的正電荷影響其體內的正常分布，同時，陽離子脂質會在動物試驗中引起免疫原性與炎症反應。聚陽離子基因載體目前發展已經較為成熟，然而在結構設計中難以保證靶向基團在結構的表面，而且存在一個毒性與轉染活性的自身設計矛盾，同時, 其連接難以在體內實現無毒化降解。然而，由上述可知，現有的非病毒載體的研究更多地著眼於核酸藥物，而針對非核酸類的藥物的遞送效果尚無有價值的報導。

因此，如何提供一種可靠的藥物載體是解決目前藥物臨床應用受限的關鍵。

本發明的主要目的在於提供一種核酸奈米顆粒、包含其的藥物組合物、含阿霉素的藥物及其製備方法，以提供一種可靠的藥物載體來解決目前藥物臨床應用受限的問題。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種核酸奈米顆粒，其具有核酸結構域，核酸結構域包含a序列、b序列和c序列，a序列包含a1序列或者a1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，b序列包含b1序列或者b1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，c序列包含c1序列或者c1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列；其中，a1序列為SEQ ID NO:1：5’-CCAGCGUUCC-3’或者SEQ ID NO:2：5’-CCAGCGTTCC-3’；b1序列為SEQ ID NO:3：5’-GGUUCGCCG-3’或者SEQ ID NO:4：5’-GGTTCGCCG-3’；c1序列為SEQ ID NO:5：5’-CGGCCAUAGCGG-3’ 或者SEQ ID NO:6：5’-CGGCCATAGCGG-3’。

進一步地，a1序列為SEQ ID NO:1，b1序列為SEQ ID NO:3，c1序列為SEQ ID NO:5時，a序列、b序列、c序列中的至少一個序列包含至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列。

進一步地，鹼基插入、缺失或替換發生在： (1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的5’端起始的第1、2、4或5位鹼基上；和/或 (2)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的5’端起始的第8~10位鹼基之間；和/或 (3)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列的5’端起始的第1~3位鹼基之間；和/或 (4)SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示的序列的5’端起始的第6~9位鹼基之間；和/或 (5)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的序列的5’端起始的第1~4位鹼基之間；和/或 (6)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的序列的5’端起始的第9~12位鹼基之間。

進一步地，a序列、b序列和c序列自組裝成式(1)所示結構：

………..式(1)，其中，W-C表示Watson-Crick配對，N和N’表示非Watson-Crick配對，任一位置的W-C各自獨立地選自C-G或G-C；在a序列中，從5’端起的第一個N為A，第二個N為G，第三個N為U或T，第四個N為U、T、A、C或G中的任意一個；在b序列中，從5’端起的第一個N’為U、T、A、C或G中的任意一個；第二個N’為U或T，第三個N’為C；在c序列中，沿5’端至3’ 端方向上的NNNN序列為CAUA或CATA。

進一步地，a序列、b序列和c序列為如下任意一組： (1)a序列：5'-GGAGCGUUGG-3'， b序列：5'-CCUUCGCCG-3'， c序列：5'-CGGCCAUAGCCC-3'； (2)a序列：5'-GCAGCGUUCG-3'， b序列：5'-CGUUCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCAUAGCGC-3'； (3)a序列：5'-CGAGCGUUGC -3'， b序列：5'-GCUUCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCAUAGCCG -3'； (4)a序列：5'-GGAGCGUUGG -3'， b序列：5'-CCUUCGGGG -3'， c序列：5'-CCCCCAUAGCCC -3'； (5)a序列：5'-GCAGCGUUCG -3'， b序列：5'-CGUUCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCAUAGCGC -3'； (6)a序列：5'-GCAGCGUUCG -3'， b序列：5'-CGUUCGGCC -3'， c序列：5'-GGCCCAUAGCGC -3'； (7)a序列：5'-CGAGCGUUGC -3'， b序列：5'-GCUUCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCAUAGCCG -3'； (8)a序列：5'-GGAGCGTTGG-3'， b序列：5'-CCTTCGCCG-3'， c序列：5'-CGGCCATAGCCC-3'； (9)a序列：5'-GCAGCGTTCG-3'， b序列：5'-CGTTCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCATAGCGC-3'； (10)a序列：5'-CGAGCGTTGC -3'， b序列：5'-GCTTCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCATAGCCG -3'； (11)a序列：5'-GGAGCGTTGG -3'， b序列：5'-CCTTCGGGG -3'， c序列：5'-CCCCCATAGCCC -3'； (12)a序列：5'-GCAGCGTTCG -3'， b序列：5'-CGTTCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCATAGCGC -3'； (13)a序列：5'-GCAGCGTTCG -3'， b序列：5'-CGTTCGGCC -3'， c序列：5'-GGCCCATAGCGC -3'； (14)a序列：5'-CGAGCGTTGC -3'， b序列：5'-GCTTCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCATAGCCG -3'。

進一步地，核酸結構域中，還包括第一延長段，第一延長段為Watson-Crick配對的延長段，第一延長段位於a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端；較佳地，第一延長段選自如下任意一組：(1)：a鏈5'端：5'-CCCA-3'，c鏈3'端：5'-UGGG-3'；(2)：a鏈3'端：5'-GGG-3'，b鏈5'端：5'-CCC-3'；(3)：b鏈3'端：5'-CCA-3'，c鏈5'端：5'-UGG-3'；(4)：a鏈5'端：5'-CCCG-3'，c鏈3'端：5'-CGGG-3'；(5)：a鏈5'端：5'-CCCC-3'，c鏈3'端：5'-GGGG-3'；(6)：b鏈3'端：5'-CCC-3'，c鏈5'端：5'-GGG-3'；(7)：b鏈3'端：5'-CCG-3'，c鏈5'端：5'-CGG-3'；(8)：a鏈5'端：5'-CCCA-3'，c鏈3'端：5'-TGGG-3'；(9)：b鏈3'端：5'-CCA-3'，c鏈5'端：5'-TGG-3'。

進一步地，核酸結構域還包括第二延長段，第二延長段位於a序列、b序列和c序列中任一序列的5’端和/或3’端，第二延長段為Watson-Crick配對的延長段；較佳地，第二延長段為CG鹼基對的延長序列；更佳，第二延長段為1~10個CG鹼基對的延長序列。

進一步地，核酸結構域還包括如下至少一組第二延長段：第一組：a鏈5’端：5’-CGCGCG-3’，c鏈3’端：5’-CGCGCG-3’；第二組：a鏈3’端：5’-CGCCGC-3’，b鏈5’端：5’-GCGGCG-3’；第三組：b鏈3’端：5’-GGCGGC-3’，c鏈5’端：5’-GCCGCC-3’。

進一步地，第二延長段為同時含有CG鹼基對和AT/AU鹼基對的延長序列，較佳第二延長段為2~50個鹼基對的延長序列。

進一步地，第二延長段為連續2~8個CG鹼基對的序列與連續2~8個AT/AU鹼基對序列交替設置的延長序列；或者，第二延長段為1個CG鹼基對的序列與1個AT/AU鹼基對序列交替設置的延長序列。

進一步地， a序列、 b序列和 c序列中鹼基、核糖和磷酸酯具有至少一個可修飾位點，任一可修飾位點通過以下任意一種修飾接頭進行修飾：-F、甲基、氨基、二硫化物、羰基、羧基、巰基及醛基；較佳地，a序列、b序列和 c序列中的C或U鹼基上具有2’-F修飾。

進一步地，核酸奈米顆粒還包括生物活性物質，生物活性物質與核酸結構域相連。

進一步地，核酸結構域的相對分子量與生物活性物質的總相對分子量之比≥1:1；較佳地，生物活性物質為靶頭、螢光素、干擾核酸siRNA、miRNA、核酶、核糖開關、適體、RNA抗體、藥物、蛋白、多肽、類黃酮、葡萄糖、天然水楊酸、單抗、維生素、酚類以及卵磷脂中的一種或多種。

進一步地，生物活性物質為靶頭、螢光素以及miRNA，其中，靶頭位於a、b、c序列中任一序列上，較佳a、b、c任一序列的5’端或3’端，或嵌插於核酸結構域的GC鍵之間，miRNA為抗miRNA，螢光素修飾於抗miRNA的5’端或3’端，miRNA位於a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置；較佳地，靶頭為葉酸或生物素，螢光素為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種，抗miRNA為抗miR-21。

進一步地，藥物為治療肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、黑色素瘤、白血病、老年癡呆、強直性脊柱炎、惡性淋巴瘤、支氣管癌、類風濕關節炎、HBV乙肝、多發性骨髓瘤、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌、食道癌、口腔癌、紅斑狼瘡的藥物；較佳地，頭頸癌為腦癌、神經母細胞瘤或膠質母細胞瘤。

進一步地，藥物為含有如下任意一種或多種基團的藥物：氨基基團、羥基基團、羧基基團、巰基基團、苯環基團以及乙醯氨基基團。

進一步地，蛋白為SOD、生存素、hTERT、EGFR及PSMA的抗體或適配體中的一種或多種；維生素為左旋C和/或酯化C；酚類為茶多酚和/或葡萄多酚。

進一步地，生物活性物質通過如下任一方式與核酸結構域相連：方式一：物理嵌插；方式二：共價連接。

進一步地，生物活性物質與核酸結構域以物理嵌插方式相連時，生物活性物質與核酸結構域按照1~200：1的莫耳比進行物理嵌插。

進一步地，生物活性物質與核酸結構域以物理嵌插方式與共價連接方式相連時，物理嵌插方式連接的生物活性物質與共價連接方式連接的藥物的莫耳比為1~200：1。

進一步地，共價連接方式連接的生物活性物質通過溶劑共價連接、linker共價連接或點擊鏈接；較佳地，溶劑選自多聚甲醛、DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS或冰醋酸；較佳地，linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG；較佳地，點擊鏈接是在對生物活性物質前體和核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，然後通過點擊鏈接。

進一步地，生物活性物質與核酸結構域以點擊鏈接的方式相連時，生物活性物質前體進行炔基或疊氮修飾的位點選自2’羥基、羧基或氨基，核酸結構域進行炔基或疊氮修飾的位點選自G環外氨基、2’-羥基、A氨基或2’-羥基。

進一步地，核酸奈米顆粒的粒徑為1~100nm，較佳為5~50nm；更佳10~30nm；進一步較佳10~15 nm。

根據本發明的另一方面，還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包括上述的核酸奈米顆粒。

根據本發明的第三個方面，還提供了一種含阿霉素的藥物，該含阿霉素的藥物包括阿霉素及前述的(不掛載生物活性物質的)核酸奈米顆粒。

進一步地，阿霉素通過物理連接和/或共價連接的形式掛載在核酸奈米顆粒上，且阿霉素與核酸奈米顆粒之間的莫耳比為2~300:1，較佳為10~50:1，更佳為15~25:1。

進一步地，核酸奈米顆粒還包括生物活性物質，生物活性物質與核酸結構域相連，生物活性物質為靶頭、螢光素、干擾核酸siRNA、miRNA、核酶、核糖開關、適體、RNA抗體、蛋白、多肽、類黃酮、葡萄糖、天然水楊酸、單抗、維生素、酚類卵磷脂以及除阿霉素以外的小分子藥物中的一種或多種。

進一步地，將核酸結構域的相對分子量記為N₁ ，將阿霉素與生物活性物質的總相對分子量記為N₂ ，N₁ / N₂ ≥1:1。

進一步地，生物活性物質為靶頭、螢光素以及miRNA中的一種或多種，其中，靶頭位於a、b、c序列中任一序列上，較佳a、b、c任一序列的5’端或3’端，或嵌插於核酸結構域的GC鍵之間，miRNA為抗miRNA，螢光素修飾於抗miRNA的5’端或3’端，miRNA位於a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置；較佳地，靶頭為葉酸或生物素，螢光素為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種，抗miRNA為抗miR-21。

進一步地，除阿霉素以外的小分子藥物為含有如下任意一種或多種基團的藥物：氨基基團、羥基基團、羧基基團、巰基基團、苯環基團以及乙醯氨基基團。

進一步地，蛋白為SOD、生存素、hTERT及EGFR、PSMA中的一種或多種；維生素為左旋C和/或酯化C；酚類為茶多酚和/或葡萄多酚。

根據本發明的第四個方面，還提供了一種含阿霉素的藥物的製備方法，該製備方法包括以下步驟：提供權前述任一種(不掛載生物活性物質的)核酸奈米顆粒；通過物理連接和/或共價連接的方式將阿霉素掛載在核酸奈米顆粒上，得到含阿霉素的藥物。

進一步地，通過物理連接的方式掛載阿霉素的步驟包括：將阿霉素、核酸奈米顆粒及第一溶劑混合並攪拌，得到預混體系；去除預混體系中的游離物質，得到含阿霉素的藥物；較佳地，第一溶劑選自DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種；較佳地，去除預混體系中的游離物質的步驟包括：將預混體系與無水乙醇混合，在低於10℃的溫度條件下析出含阿霉素的藥物；更佳在0~5℃溫度條件下析出含阿霉素的藥物。

進一步地，通過共價連接的方式掛載阿霉素的步驟包括：配置阿霉素溶液；使阿霉素溶液在甲醛的介導作用下與核酸奈米顆粒的G環外氨基進行反應，得到反應體系；提純反應體系，得到含阿霉素的藥物；較佳地，反應的步驟包括：將阿霉素溶液與多聚甲醛溶液、核酸奈米顆粒混合，在避光條件下進行反應，得到反應體系；其中較佳多聚甲醛溶液的濃度較佳為3.7~4wt%，較佳多聚甲醛溶液為多聚甲醛和第二溶劑混合形成的溶液，且第二溶劑為DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種。

進一步地，上述製備方法還包括製備核酸奈米顆粒的步驟，其包括：通過將前述任一種(不掛載生物活性物質的)核酸奈米顆粒中的核酸結構域對應的單鏈進行自組裝，得到核酸結構域；較佳地，在得到核酸結構域之後，製備方法還包括：將生物活性物質通過物理連接和/或共價連接的方式掛載在核酸結構域上，進而得到核酸奈米顆粒，其中，生物活性物質中的藥物為除阿霉素之外的小分子藥物。

進一步地，通過共價連接的方式掛載生物活性物質的過程中，通過溶劑共價連接、linker共價連接或點擊鏈接進行掛載；較佳地，溶劑共價連接中採用的第三溶劑作為連接介質，且第三溶劑選自多聚甲醛、DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種；較佳地，linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG；較佳地，點擊鏈接是在對生物活性物質前體和核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，然後通過點擊鏈接。

本發明提供的核酸奈米顆粒，通過包含上述三條序列或其變異序列，不僅能夠自組裝形成核酸結構域，而且可以作為載體，在三條鏈的任意5'端和/或3'末端連接siRNA藥物或miRNA藥物，在形成上述奈米顆粒的過程中，由於核酸結構域的存在，減少了核酸酶對所掛載的核酸藥物的降解作用，提高了藥物的遞送的可靠性和穩定性。

需要說明的是，在不衝突的情況下，本發明中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發明。

如先前技術所提到的，先前技術中儘管已有多種提高藥物遞送效率的藥物載體，但仍難以解決藥物在臨床上應用受限的問題。為了改善這一狀況，本發明的發明人對現有所有可用作藥物載體的材料進行了研究，並從載體的細胞/組織靶向性、運輸過程中的穩定性、進入靶細胞的活性和效率、到達靶細胞後的藥物釋放能力以及對細胞的毒性等方面對各種載體進行了深入考察和分析，發現採用新興的DNA和/或RNA分子自組裝形成的奈米結構，比如，DNA樹枝狀大分子的自組裝體系中DNA對核酸酶的降解有顯著的阻礙作用，在基因治療和生物醫學領域有非常重要的應用價值。

通過對現有報導的DNA和RNA自組裝形成的奈米顆粒進行分析發現，相對於比較剛性的DNA奈米顆粒而言，RNA奈米顆粒由於分子內或分子間存在大量的莖-環結構，其具有更大柔性和更強的張力，因而在作為候選藥物載體方面更具優勢。然而，自然狀態的RNA奈米顆粒穩定性相對較差，而目前基於RNA奈米載體應用方面的改進，大多都是圍繞提高其穩定性和可靠性而展開的。目前的研究結果儘管在一定程度上提供了掛載藥物的可能性，但更側重於對核酸藥物，尤其是siRNA藥物或miRNA藥物等掛載的可能性和有效性進行研究。而對於非核酸類的藥物是否同樣有效，目前報導很少。此外，現有的自組裝奈米顆粒，尤其是作為載體應用的自組裝奈米顆粒，目前都是採用RNA鏈進行自組裝成的，極少數採用了RNA鏈和DNA鏈組合的形式進行自組裝的，但卻並沒有採用純粹的DNA鏈來實現自組裝的。

為了提供一種新的可靠性好且能夠自主裝的RNA奈米顆粒載體，發明人對現有的RNA奈米顆粒進行了比較和改進，開發出了一系列新的RNA奈米顆粒，而且，從提高適用性及降低成本角度考慮，進一步嘗試了採用純粹的DNA鏈來進行自組裝，意外發現改為這些DNA單鏈不僅能夠實現自組裝成DNA奈米顆粒，而且性能與RNA奈米顆粒同樣優異。且，DNA奈米顆粒的自組裝還具有價格廉價和易操作的優勢。並經過實驗驗證，發明人所改進的RNA奈米顆粒和DNA奈米顆粒均能夠掛載各種藥物，並能在血清中穩定存在；進一步的實驗驗證，其能攜帶藥物進入細胞，且單獨的載體對細胞無毒性。而攜帶藥物的載體能夠對相應疾病起到緩解和治療作用。

在上述研究結果的基礎上，發明人提出了本發明的技術方案。在一種典型的實施方式中，提供了一種核酸奈米顆粒，該核酸奈米顆粒具有核酸結構域，該核酸結構域包含a序列、b序列和c序列，a序列包含a1序列或者a1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，b序列包含b1序列或者b1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，c序列包含c1序列或者c1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列；其中，a1序列為SEQ ID NO:1：5’-CCAGCGUUCC-3’或者SEQ ID NO:2：5’-CCAGCGTTCC-3’；b1序列為SEQ ID NO:3：5’-GGUUCGCCG-3’或者SEQ ID NO:4：5’-GGTTCGCCG-3’；c1序列為SEQ ID NO:5：5’-CGGCCAUAGCGG-3’ 或者SEQ ID NO:6：5’-CGGCCATAGCGG-3’。

上述核酸奈米顆粒，通過包含上述三條序列或其變異序列，不僅能夠自組裝形成核酸結構域，而且可以作為載體，在三條鏈的任意5'端和/或3'末端連接siRNA藥物或miRNA藥物。在形成上述奈米顆粒的過程中，由於核酸結構域的存在，減少了核酸酶對所掛載的核酸藥物的降解作用，提高了藥物的遞送的可靠性和穩定性。

上述自組裝是指基本結構單元自發形成有序結構的一種技術。在自組裝的過程中，基本結構單元在基於非共價鍵的相互作用下自發地組織或聚集為一個穩定、具有一定規則幾何外觀的結構。自組裝過程並不是大量原子、離子或分子之間弱相互作用力(其中“弱相互作用力”指氫鍵、凡得瓦力、靜電力、疏水作用力等)的簡單疊加，而是若干個體之間同時自發的發生並聯並集合在一起形成一個緊密而又有序的整體，是一種整體的複雜的協同作用。

自組裝的產生需要兩方面的條件：自主裝的動力和導向作用。自組裝的動力指分子間的弱相互作用力的協同作用，它為分子自組裝提供能量。自組裝的導向作用指的是分子在空間的互補性，也就是說自組裝發生需要在空間的尺寸和方向上滿足分子重排的要求。

DNA奈米技術是一種自下而上的分子自組裝模式，由分子構造為起點基於核酸分子的物理和化學性質自發地形成穩定結構，遵循嚴格的核酸鹼基配對原則。多個DNA片段在體外以正確順序連接在一起，通過鹼基互補配對原則，建立亞組裝結構，最終形成複雜的多級結構。與DNA不同，RNA的結構可以超出雙螺旋的限制。RNA可以形成一系列不同的鹼基對，鹼基對之間至少形成兩個氫鍵。不同的鹼基可以分為兩種個類型，包括標準的Waston-Crick鹼基對型和非Waston-Crick鹼基對型，可以使得RNA形成大量和多種類型的循環結構模組，這些模組就是構成折疊RNA三級結構的基本單元。RNA奈米技術可以利用這些天然存在的3D模組及其可以預知的相互作用，其中，很多具有生物學活性的RNA結構都可以具有原子級別的解析度，比如核糖體、各類核酶以及存在於核糖開關內的天然RNA適配體。RNA奈米技術的一個優越特性在於，可以設計出在大小和複雜性上都能夠與天然RNA物質相媲美的結構。還可以對天然RNA複合體內的RNA的獨特組裝性質加以利用。

本發明的上述核酸奈米顆粒中，包含序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示的三條序列或其變異後的序列，或者包含序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的三條序列或其變異後的序列，均以能夠通過自組裝形成核酸奈米顆粒為準，具體變異後的序列可以在SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4 、SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6序列基礎上合理選擇變異位點及其變異類型得到，或者通過延長合適片段得到。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5自組裝形成的奈米顆粒為RNA奈米顆粒，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6自組裝形成的奈米顆粒為DNA奈米顆粒。在一種較佳的實施例中，上述核酸奈米顆粒為RNA奈米顆粒時，且a序列、b序列、c序列中的至少一個序列包含至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列。該RNA奈米顆粒中變異序列的具體位置和鹼基類型可以在能夠實現自組裝的前提下，根據需要改進為提高藥物掛載量或提高穩定性的奈米顆粒。

為了使所製備的核酸奈米顆粒具有相對更高的穩定性，在對上述SEQ ID NO:1/2、SEQ ID NO:3/4和/或SEQ ID NO:5/6所示的序列進行鹼基插入、缺失或替換時，可以在上述序列的某些特定位置的鹼基上進行，一方面使得變異後的序列與原序列一樣，能夠自組裝成奈米顆粒，另一方面變異保留與原序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的同源性，使得其與上述序列自組裝形成的奈米顆粒具有同樣的載藥特性和類似的穩定性，不僅能夠掛載和遞送核酸藥物，同樣適用於化學藥物等其他生物活性物質的掛載和遞送，因而使其具有相對普適性。

在一種較佳的實施例中，上述鹼基插入、缺失或替換發生在：(1)SEQ ID NO:1或2 所示的a序列的5’端起始的第1、2、4和5位鹼基之間；和/或(2)SEQ ID NO:1或2所示的a序列的5’端起始的第8~10位鹼基之間；和/或(3)SEQ ID NO:3或4所示的b序列的5’端起始的第1~3位鹼基之間；和/或(4)SEQ ID NO: 3或4所示的b序列的5’端起始的第6~9位鹼基之間；和/或(5)SEQ ID NO:5或6所示的c序列的5’端起始的第1~4位鹼基之間；和/或(6)SEQ ID NO: 5或6所示的c序列的5’端起始的第9~12位鹼基之間。

上述較佳的實施例中，所限定的發生變異的鹼基位置，是在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6所示的序列形成的奈米結構中的非經典Watson-Crick配對鹼基位置或凸出的未配對鹼基位置，因而不影響這些凸出或loop結構的形成，從而保持了上述序列形成的奈米結構的柔性和張力，有助於維持其作為載體的穩定性。

為了進一步提高上述核酸奈米顆粒的穩定性，在一種較佳的實施例中，a序列、b序列和c序列自組裝成式(1)所示結構：

………..式(1)，其中，W-C表示Watson-Crick配對，N和N’表示非Watson-Crick配對，任一位置的W-C各自獨立地選自C-G或G-C，且a序列、b序列和c序列中至少兩條序列各自的5’端和3’端的兩個鹼基不互補；在a序列中，從5’端起的第一個N為A，第二個N為G，第三個N為U或T，第四個N為U、T、A、C或G中的任意一個；在b序列中，從5’端起的第一個N’為U、T、A、C或G中的任意一個；第二個N’為U或T，第三個N’為C；在c序列中，沿5’端至3’ 端方向上的NNNN序列為CAUA或CATA。

上述較佳的實施例中，a、b、c序列通過自組裝形成具有式(1)所示的核酸結構域，其中，除了N和N’限定的非Watson-Crick配對鹼基外，其餘位置的鹼基均形成的經典的Watson-Crick配對，並且上述Watson-Crick配對的鹼基均選擇G-C或C-G鹼基對。由於G-C或C-G鹼基對間的氫鍵的作用力大於A-U/T或U/T-A鹼基對間的氫鍵的作用力，因而使得該核酸奈米結構更穩定。而非Watson-Crick配對鹼基所形成的凸起或loop結構，為核酸奈米載體帶來更大的張力，使得其對微環境變化的適應性更強，因而該核酸奈米顆粒的穩定性更高。

上述式(1)結構的奈米顆粒中，a序列、b序列和c序列的具體序列組成並無特殊限定，只要能夠形成上述結構即可。從核酸序列自組裝的角度考慮，為了進一步提高上述三條序列自組裝成上述式(1)結構的奈米顆粒的效率，在選擇Watson-Crick配對的鹼基時，不同位置的鹼基選擇最好遵循如下原則：(1)a序列、b序列和c序列，單獨一條序列時並不自我互補配對形成二級結構；(2)a序列、b序列和c序列，任意兩條序列之間一端互補配對形成雙鏈，另一端不互補配對，形成Y型或T型結構。上述鹼基選擇的原則是最大效率地使任意一條鏈的兩端分別與其他兩條鏈的兩端分別互補配對，從而提高自組裝效率。當然，除了Y型或T型結構，也可以是三叉以外的四邊形等替他變形形式，只要滿足任意兩條序列之間一端互補配對形成雙鏈，另一端不互補配對的原則即可。

上述式(1)結構的奈米顆粒中，非Watson-Crick配對鹼基中，a序列中從5’端起的第四個N及b序列中與其配對的從5’端起的第一個N’，可以是非Watson-Crick配對的U-U，也可以是改進後的遵循Watson-Crick配對原則的T、A、C或G。Watson-Crick配對相對提高鏈間的結合力，提高穩定性，而非Watson-Crick配對賦予了奈米顆粒更大的柔性和靈活性，在面對微環境變化的時候，同樣有助於提高奈米顆粒的穩定性。

在一種較佳的實施例中，a序列、b序列和c序列為如下任意一組：(1)a序列(SEQ ID NO：7)：5'-GGAGCGUUGG-3'，b序列(SEQ ID NO：8)：5'-CCUUCGCCG-3'，c序列(SEQ ID NO：9)：5'-CGGCCAUAGCCC-3'；(2)a序列(SEQ ID NO：10)：5'-GCAGCGUUCG-3'， b序列(SEQ ID NO：11)：5'-CGUUCGCCG -3'，c序列(SEQ ID NO：12)：5'-CGGCCAUAGCGC-3'；(3)a序列(SEQ ID NO：13)：5'-CGAGCGUUGC -3'， b序列(SEQ ID NO：14)：5'-GCUUCGCCG -3'，c序列(SEQ ID NO：15)：5'-CGGCCAUAGCCG -3'；(4)a序列(SEQ ID NO：16)：5'-GGAGCGUUGG -3'，b序列(SEQ ID NO：17)：5'-CCUUCGGGG -3'，c序列(SEQ ID NO：18)：5'-CCCCCAUAGCCC -3'；(5)a序列(SEQ ID NO：19)：5'-GCAGCGUUCG -3'， b序列(SEQ ID NO：20)：5'-CGUUCGGCG -3'，c序列(SEQ ID NO：21)：5'-CGCCCAUAGCGC -3'；(6)a序列(SEQ ID NO：22)：5'-GCAGCGUUCG -3'， b序列(SEQ ID NO：23)：5'-CGUUCGGCC -3'，c序列(SEQ ID NO：24)：5'-GGCCCAUAGCGC -3'；(7)a序列(SEQ ID NO：25)：5'-CGAGCGUUGC -3'，b序列(SEQ ID NO：26)：5'-GCUUCGGCG -3'，c序列(SEQ ID NO：27)：5'-CGCCCAUAGCCG -3'；(8)a序列(SEQ ID NO：28)：5'-GGAGCGTTGG-3'，b序列(SEQ ID NO：29)：5'-CCTTCGCCG-3'，c序列(SEQ ID NO：30)：5'-CGGCCATAGCCC-3'；(9)a序列(SEQ ID NO：31)：5'-GCAGCGTTCG-3'，b序列(SEQ ID NO：32)：5'-CGTTCGCCG -3'，c序列(SEQ ID NO：33)：5'-CGGCCATAGCGC-3'；(10)a序列(SEQ ID NO：34)：5'-CGAGCGTTGC -3'，b序列(SEQ ID NO：35)：5'-GCTTCGCCG -3'，c序列(SEQ ID NO：36)：5'-CGGCCATAGCCG -3'；(11)a序列(SEQ ID NO：37)：5'-GGAGCGTTGG -3'，b序列(SEQ ID NO：38)：5'-CCTTCGGGG -3'，c序列(SEQ ID NO：39)：5'-CCCCCATAGCCC -3'；(12)a序列(SEQ ID NO：40)：5'-GCAGCGTTCG -3'，b序列(SEQ ID NO：41)：5'-CGTTCGGCG -3'，c序列(SEQ ID NO：42)：5'-CGCCCATAGCGC -3'；(13)a序列(SEQ ID NO：43)：5'-GCAGCGTTCG -3'，b序列(SEQ ID NO：44)：5'-CGTTCGGCC -3'，c序列(SEQ ID NO：45)：5'-GGCCCATAGCGC -3'；(14)a序列(SEQ ID NO：46)：5'-CGAGCGTTGC -3'，b序列(SEQ ID NO：47)：5'-GCTTCGGCG -3'，c序列(SEQ ID NO：48)：5'-CGCCCATAGCCG -3'。

上述十四組序列所自組裝形成的核酸奈米顆粒，不僅具有更高的穩定性，而且自組裝效率更高。

上述所提到的核酸奈米顆粒不僅能夠自我組裝成型，而且也具備攜帶或掛載藥物的能力。根據上述核酸奈米顆粒中G-C或C-G鹼基對的位置的不同以及所欲掛載的藥物的種類或性質的區別，所掛載的藥物的量也有所差異。同樣，對於核酸類藥物，可以在a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端通過延伸掛載。

根據所掛載的藥物的分子量的大小，或者在掛載時的結構上位阻的差異，為了使上述核酸藥物能夠掛載分子量相對較大的生物活性物質，在一種較佳的實施例中，上述核酸結構域中，還包括第一延長段，第一延長段為Watson-Crick配對的延長段，第一延長段位於a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端。載體與所掛載的物質之間需要一定的匹配關係，當載體的分子量過小而所掛載的物質分子量過大時，從力學角度考慮，載體對掛載物質的攜帶或運輸能力相對降低。因而，通過在前述核酸奈米結構基礎上，通過在a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端增加第一延長段，能夠獲得與掛載物質大小相匹配的載體。

上述第一延長段的具體長度，可以根據所欲掛載的物質的大小而定。在一種較佳的實施例中，第一延長段選自如下任意一組：(1)：a鏈5'端：5'-CCCA-3'，c鏈3'端：5'-UGGG-3'；(2)：a鏈3'端：5'-GGG-3'，b鏈5'端：5'-CCC-3'；(3)：b鏈3'端：5'-CCA-3'，c鏈5'端：5'-UGG-3'；(4)：a鏈5'端：5'-CCCG-3'，c鏈3'端：5'-CGGG-3'；(5)：a鏈5'端：5'-CCCC-3'，c鏈3'端：5'-GGGG-3'；(6)：b鏈3'端：5'-CCC-3'，c鏈5'端：5'-GGG-3'。(7)：b鏈3'端：5'-CCG-3'，c鏈5'端：5'-CGG-3'；(8)：a鏈5'端：5'-CCCA-3'，c鏈3'端：5'-TGGG-3'；(9)：b鏈3'端：5'-CCA-3'，c鏈5'端：5'-TGG-3'；(10)：a鏈5'端： 5'-GCGGCGAGCGGCGA-3'(SEQ ID NO:162)，c鏈3'端：5'-UCGCCGCUCGCCGC-3'(SEQ ID NO:163);(11)：a鏈3'端：5'-GGCCGGAGGCCGG-3'(SEQ ID NO:164)，b鏈5'端：5'-CCGGCCUCCGGCC-3'(SEQ ID NO:165)；(12) b鏈3'端：5'-CCAGCCGCC-3'(SEQ ID NO:166)，c鏈5'端：5'-GGCGGCAGG-3'(SEQ ID NO:167)；(13)：a鏈5'端：5'-GCGGCGAGCGGCGA-3'(SEQ ID NO:168)，c鏈3'端：5'-TCGCCGCTCGCCGC-3'(SEQ ID NO:169);(14)：a鏈3'端：5'-GGCCGGAGGCCGG-3'(SEQ ID NO:170)，b鏈5'端：5'-CCGGCCTCCGGCC-3'(SEQ ID NO:171)。

上述第一延長段不僅增加了形成核酸奈米結構的三條序列中任意一條或多條的長度，而且，GC鹼基組成的第一延長段進一步提高了所形成的奈米顆粒的穩定性。而且，上述序列組成的第一延長段同樣使a序列、b序列和c序列保持了較高的自組裝活性和效率。

從所形成的核酸奈米顆粒的大小及其作為藥物遞送載體在體內運輸時的穩定性考慮，需要能夠在運輸藥物的同時，儘量在達到靶細胞之前不被腎臟過濾出去。在一種較佳的實施例中，核酸結構域還包括第二延長段，第二延長段位於a序列、b序列和c序列中任一序列的5’端和/或3’端，第二延長段為Watson-Crick配對的延長段；更佳地，第二延長段為CG鹼基對的延長序列；進一步較佳地，第二延長段為1~10個CG鹼基對的延長序列。第二延長段是在第一延長段的基礎上進一步添加的延長段。

在一種較佳的實施例中，上述核酸結構域還包括如下至少一組第二延長段：第一組：a鏈5’端：5’-CGCGCG-3’，c鏈3’端：5’-CGCGCG-3’；第二組：a鏈3’端：5’-CGCCGC-3’，b鏈5’端：5’-GCGGCG-3’；第三組：b鏈3’端：5’-GGCGGC-3’，c鏈5’端：5’-GCCGCC-3’。這種第二延長段，使得奈米顆粒不存在免疫原性，而且不存在每條鏈自身折疊結合的二級結構的情況。

需說明的是，上述第一延長段和/或第二延長段中也可以間隔有非配對的鹼基對。

為了使上述核酸奈米顆粒能夠掛載更大分子量的生物活性物質、增載入藥量以及維持必要的穩定性，在一種較佳的實施例中，第二延長段為同時含有CG鹼基對和AT/AU鹼基對的延長序列，較佳第二延長段為2~50個鹼基對的延長序列。此處“AT/AU鹼基”中的“/”是或的關係，具體地，第二延長段為同時含有CG鹼基對和AT鹼基對的延長序列，或者第二延長段為同時含有CG鹼基對和AU鹼基對的延長序列。

更具體地，添加上述第二延長段之後的a、b和c序列可以分別是如下序列： a序列為(SEQ ID NO:49)： 5’-CGCGCG AAAAAA CGCGCG AAAAAA CGCGCG CCCACCAGCGMMCCGGGCGCGCG AAAAAA CGCGCG AAAAAA CGCGCG-3’ ； b序列為(SEQ ID NO:50)： 5’-CGCGCG MMMMMM CGCGCG MMMMMM CGCGCGCCCGGMMCGCCGCCAGCCGCC MMMMMM GCCGCC MMMMMM GCCGCC-3’ ； c序列為(SEQ ID NO:51)： 5’-GGCGGC AAAAAA GGCGGC AAAAAA GGCGGC AGGCGGCAMAGCGG MGGGCGCGCG MMMMMM CGCGCG MMMMMM CGCGCG-3’ ；上述a序列、b序列和c序列中的M為U或T，當M為T時，上述序列的合成成本大大降低。

在實際應用中，可以根據實際需要合理調整上述CG鹼基對以及AT/AU鹼基對的延長序列的具體設置位置。在一種更佳的實施例中，第二延長段為連續2~8個CG鹼基對的序列與連續2~8個AT/AU鹼基對序列交替設置的延長序列；或者第二延長段為1個CG鹼基對的序列與1個AT/AU鹼基對序列交替設置的延長序列。

具體地，如將上述SEQ ID NO:49所示的a序列中的CGCGCG延長段和CGCCGC延長段與AAAAAA延長段的位置互換，將上述SEQ ID NO:50所示的b序列中的GCGGCG延長段和GGCGGC延長段與TTTTTT延長段的位置互換，將上述SEQ ID NO:51所示的c序列中的GCCGCC延長段與AAAAAA延長段互換，同時將CGCCGC延長段與TTTTTT延長段互換。上述序列自組裝形成的核酸奈米顆粒適用於吲哚類分子結構的化學藥物的掛載之用(吲哚類藥物分子較佳與A結合)。

過去多年裡，RNA作為廣泛應用的構建材料所存在的三大挑戰包括：1)RNA酶降解的敏感性；2)全身注射後對解離的敏感性；3)毒性和不良免疫反應。目前，這三大挑戰已經在很大程度上得到了克服：1)核糖-OH基團的2’-氟(2’-F)或者2’-O-甲基(2’-OMe)修飾可以使RNA在血清中化學穩定；2)某些天然存在的連接基序是熱力學穩定的，並且可以保持整個RNA奈米顆粒在超低濃度下完整；3)RNA奈米顆粒的免疫原性是序列和形狀依賴性的，並且可以調節，以使RNA奈米顆粒刺激炎性細胞因子的產生，或使得RNA奈米顆粒在30mg/kg的重複靜脈注射施用時具有非免疫原性和無毒性。

因此，為了進一步降低上述核酸奈米顆粒對RNA酶降解的敏感性，同時提高在運輸過程中的穩定性，在一種較佳的實施例中，a序列、b序列和c序列中鹼基、核糖和磷酸酯具有至少一個可修飾位點，任一可修飾位點通過以下任意一種修飾接頭進行修飾：-F、甲基、氨基、二硫化物、羰基、羧基、巰基及醛基；較佳地，a序列、b序列和c序列中的C或U鹼基上具有2’-F修飾。當修飾接頭為巰基時，屬於硫代修飾，修飾強度較弱，成本低。

本發明所提供的上述核酸奈米顆粒作為載體之用所能掛載的物質可以是任何具有生物活性作用的物質。因而，在一種較佳的實施例中，上述核酸奈米顆粒還包括生物活性物質，生物活性物質與核酸結構域相連。

為了提高核酸奈米顆粒對所掛載的生物活性物質的掛載效率和運載效率，核酸結構域的相對分子量與生物活性物質的總相對分子量最好存在一定的匹配關係。在一種較佳的實施例中，核酸結構域的相對分子量與生物活性物質的總相對分子量之比≥1:1；較佳地，生物活性物質為靶頭、螢光素、干擾核酸siRNA、miRNA、核酶、核糖開關、適體、RNA抗體、藥物(通常解釋為小分子藥物，即化學合成藥物)、蛋白、多肽、類黃酮、葡萄糖、天然水楊酸、單抗、維生素、酚類以及卵磷脂中的一種或多種。

根據具體掛載的生物活性物質的種類的不同，其對本發明的核酸奈米顆粒的性能優化作用並不相同。比如，當生物活性物質為生物素或葉酸時，其所起到的作用是使核酸奈米顆粒具有靶向性，如，特異靶向癌細胞。當生物活性物質為螢光素時，其所起到的作用是使核酸奈米顆粒具有發光示蹤效果。而生物活性物質為某些siRNA、miRNA、藥物(通常解釋為小分子藥物)、蛋白、多肽或RNA抗體時，根據不同生物學功能的不同，可能使得該核酸奈米顆粒成為具有特定治療效果的新產品，比如性能更優異的藥物。此外，根據具體掛載的生物活性物質的種類的不同，其具體較佳使用的是DNA奈米顆粒和RNA奈米顆粒，可以根據實際需要進行合理選擇。比如，當生物活性物質為藥物時，較佳DNA奈米顆粒或RNA奈米顆粒進行掛載，且對組裝形成奈米顆粒的單鏈長度無特殊要求。

在一種較佳的實施例中，生物活性物質為靶頭、螢光素以及miRNA，其中，靶頭位於a、b、c序列中任一序列上，較佳a、b、c任一序列的5’端或3’端，或嵌插於核酸結構域的GC鍵之間，miRNA為抗miRNA，螢光素修飾於抗miRNA的5’端或3’端，miRNA位於a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置；較佳地，靶頭為葉酸或生物素，螢光素為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種，前述抗miRNA為抗miR-21。

上述靶頭可以通過linker共價連接的方式連接於a、b、c序列中的任一序列上，可用的linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG。此處所說的“任一序列上”是a、b、c序列任一序列的任一位置的鹼基上，而連在5’端或3’端更方便，應用更廣泛。葉酸修飾可以是物理嵌插模式連接或者是物理嵌插+共價連接。

上述螢光素可以現有常用的螢光素，較佳為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種。

上述miRNA可以是具有抑癌效果的miRNA，也可以是能夠抑制對應病症的抗miRNA，實際應用中根據醫療需要合理選擇。上述抗miRNA可以合成於上述a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置。當在上述三個位置上均合成有抗miRNA時，抗miRNA對相應miRNA的抑制作用相對更強。

較佳為抗miR-21， miR-21參與多種癌症的起始和進展，是侵襲和轉移的主要致癌基因。抗miR-21能夠有效地同時調節廣泛的靶基因，有利於解決癌症的異質性問題。因而，上述較佳的核酸奈米顆粒中，靶頭，比如葉酸或生物素，能夠特異地靶向癌細胞，與癌細胞結合內化後，抗miR-21以非常高的親和力和特異性與miR-21鹼基互補，從而有效降低致癌miR-21的表達。因此，根據實際需要，上述抗miR-21可以合成於上述a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置。當在上述三個位置上均合成有抗miR-21時，抗miR-21對miR-21的抑制作用相對更強。

上述所能夠掛載的生物活性物質為藥物時，根據不同藥物所能治療的疾病類型，藥物包括但不僅限於治療肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、黑色素瘤、白血病、老年癡呆、強直性脊柱炎、惡性淋巴瘤、支氣管癌、類風濕關節炎、HBV乙肝、多發性骨髓瘤、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌，食道癌，口腔癌，紅斑狼瘡疾病的藥物；較佳地，頭頸癌為腦癌、神經母細胞瘤或膠質母細胞瘤。

上述所能夠掛載的生物活性物質為藥物時，根據藥物的分子結構的不同或者所具有的特徵性基團的不同，藥物包括但不僅限於含有如下任意一種或多種基團的藥物：氨基基團、羥基基團、羧基基團、巰基基團、苯環基團以及乙醯氨基基團。

在一種較佳的實施例中，上述蛋白為SOD(超氧化物歧化酶)、生存素(Survivin)、hTERT(人端粒酶逆轉錄酶)及EGFR(epidermal growth factor receptor)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)的抗體或適配體中的一種或多種；上述維生素為左旋C和/或酯化C；上述酚類為茶多酚和/或葡萄多酚。

根據所掛載的生物活性物質的不同，可以選擇合適的連接方式與上述核酸奈米載體進行連接。在一種較佳的實施例中，上述生物活性物質通過如下任意一種方式與核酸結構域相連：方式一：物理嵌插；方式二：共價連接。

需要說明的是，上述分類並不意味著某種生物活性物質與核酸奈米載體的連接方式僅有一種。而是，有的生物活性物質，既可以通過物理嵌插的方式與核酸奈米載體連接，也可以通過物理嵌插與共價連接的方式與核酸奈米載體連接，同時還可能利用點擊鏈接的方式實現連接。但對某種特定的生物活性物質而言，可能僅有其中一種連接方式，也可能有多種連接方式，但可能其中某種連接效率具有優勢的實用價值。

上述連接方式中，不同藥物在與核酸結構域通過物理嵌插的方式進行連接時，嵌插的結合位點及數目也略有不同。比如，蒽環類、吖啶類藥物在嵌插時，通常嵌插在GC鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上GC鹼基對的數目的不同，按照1~100：1的比例進行嵌插。而萘醯胺藥物在嵌插時，通常嵌插在AA鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上AA鹼基對的數目的不同，吡啶並咔唑類根據AA鹼基對的數目的不同按照1~200：1的比例進行嵌插。

當藥物採用物理嵌插與共價連接兩種方式同時與核酸結構域進行連接時，蒽環類、吖啶類藥物在嵌插時，通常嵌插在GC鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上GC鹼基對的數目的不同，按照1~100：1的比例進行嵌插。而萘醯胺藥物在嵌插時，通常嵌插在AA鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上AA鹼基對的數目的不同，吡啶並咔唑類根據 AA鹼基對的數目的不同按照1~200：1的比例進行嵌插。

具體地，根據生物活性物質種類的不同、核酸奈米顆粒中形成核酸結構域的a、b和c序列的長度以及其中GC互補鹼基對的數目的多少，可以合理選擇生物活性物質與核酸結構域的莫耳比進行物理嵌插。

在一種較佳的實施例中，生物活性物質與核酸結構域以物理嵌插方式相連時，生物活性物質與核酸結構域按照1~200：1的莫耳比進行物理嵌插。該連接方式適用於蒽環類、吖啶類藥物。在該比例範圍內進行物理嵌插既能滿足掛載需求，又能滿足藥效需求。

在一種較佳的實施例中，生物活性物質與核酸結構域以物理嵌插方式與共價連接方式相連時，物理嵌插方式連接的生物活性物質與共價連接方式連接的藥物的莫耳比為1~200：1。該連接方式適用於蒽環類、吖啶類的藥物。上述不同連接方式連接的藥物比例並不局限於上述範圍，只要能夠滿足高效掛載，對細胞無毒性作用，且在達到靶標後實現藥物的有效釋放即可。

在一種較佳的實施例中，共價連接方式連接的生物活性物質通過溶劑共價連接、linker共價連接或點擊鏈接；較佳地，溶劑選自多聚甲醛、DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS或冰醋酸；較佳地，linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG。較佳地，點擊鏈接是在對生物活性物質前體和核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，然後通過點擊鏈接。

當採用對生物活性物質前體和核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，通過點擊鏈接的方式連接時，隨藥物不同結構的變化選擇不同的點擊連接。且隨著活性物質結構的不同，連接位置也有可能會發生相應改變，這是本領域技術人員能夠理解的。

在一種較佳的實施例中，生物活性物質與核酸結構域以點擊鏈接的方式相連時，生物活性物質前體進行炔基或疊氮修飾的位點選自羥基、羧基、巰基或氨基，核酸結構域進行炔基或疊氮修飾的位點選自氨基、亞氨基或羥基。

需要說明的是，上述核酸結構域與藥物結合時，核酸結構域為水溶性的，多數藥物的水溶性較差，將其與核酸結構域結合後，水溶性提高。當上述藥物為蒽環類時，這些藥物通過核苷酸鳥苷上的-NH鍵(在合適的pH值條件下，該-NH基團的活性比其他可能與藥物發生共價結合的基團的活性高上百倍)與核酸結構域發生共價結合，從而形成掛載藥物的核酸結構域。因而，根據具體藥物分子的大小及具體所設計的核酸結構域上的a序列，b序列和c序列上的GC鹼基對的數量，在結合時，按照理論上1.1~1.3倍的過飽和結合量進行結合反應，一個核酸結構域上最多可結合35~45個藥物。當上述藥物為其他結構時，掛載量與具體藥物的占位情況有關(包括但不僅限於分子結構、形態、形狀及分子量大小)，因此，藥物的活性位點與核酸結構域的核苷酸鳥苷上的-NH鍵的結合條件相對嚴苛，同樣能掛載但比較難以出現過量結合的情況。

在一種較佳的實施例中，核酸奈米顆粒的粒徑為1~100nm，較佳為5~50nm，更佳為10~30nm，進一步較佳為10~15nm。在該範圍內大小合適，既能通過細胞表面受體介導的細胞吞噬現象而進入細胞膜，又避免非特異性的細胞滲透而被腎臟過濾除去，因而，有利的粒徑尺寸有助於改進藥代動力學、藥效學、生物學分布和毒理學的分布。

在第二種典型的實施方式中，還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包括上述任一種核酸奈米顆粒。含有本發明所提供規定上述核酸奈米顆粒的藥物中，核酸結構域可經靶向目的細胞的靶頭修飾而具有良好的靶向性，同時還可以掛載相應的治療性藥物和/或示蹤性分子，從而能夠穩定地遞送治療性藥物和/或示蹤性分子，可靠性很高。

在第三種典型的實施方式中，提供了一種含阿霉素的藥物，該含阿霉素的藥物包括阿霉素及前述任一種(不掛載生物活性物質的)核酸奈米顆粒；或者，該含阿霉素的藥物為前述任一種(掛載生物活性物質的)核酸奈米顆粒，其中，生物活性物質至少為藥物，該藥物包括阿霉素。

上述提供的含阿霉素的藥物中包括核酸奈米顆粒和阿霉素，且阿霉素掛載在核酸奈米顆粒上。該核酸奈米顆粒中，通過包含上述三條序列或其變異序列，不僅能夠自組裝形成核酸結構域，而且可以作為載體，在三條鏈的任意5'端和/或3'末端連接阿霉素，或者能夠使阿霉素穩定地嵌插在核酸結構域的鏈間。本發明提供的含阿霉素的藥物，其核酸結構域經過靶頭修飾後，可具有較好的靶向性，能夠穩定地遞送阿霉素，可靠性很高。

如前述，當生物活性物質為藥物，且藥物為阿霉素時，阿霉素可以通過物理連接和/或共價連接的形式進行掛載。當阿霉素採用物理嵌插與共價連接兩種方式同時與核酸結構域進行連接時，物理嵌插通常是嵌插在GC鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上GC鹼基對的數目的不同，按照1~100：1的比例進行嵌插。而採用共價連接方式進行連接時，阿霉素通常會與G環外氨基發生化學反應形成共價連接。更佳地，阿霉素與核酸奈米顆粒之間的莫耳比為2~300:1，較佳為10~50:1，更佳為15~25:1。

本發明所提供的含阿霉素的藥物中，核酸奈米顆粒是作為阿霉素的遞送載體，除此以外，根據不同的藥物目的，在一種較佳的實施例中，上述核酸奈米顆粒還包括生物活性物質，生物活性物質與核酸結構域相連。生物活性物質為靶頭、螢光素、干擾核酸siRNA、miRNA、核酶、核糖開關、適體、RNA抗體、蛋白、多肽、類黃酮、葡萄糖、天然水楊酸、單抗、維生素、酚類、卵磷脂以及除阿霉素以外的小分子藥物中的一種或多種。

為了提高核酸奈米顆粒對所掛載的生物活性物質的掛載效率和運載效率，核酸結構域的相對分子量與阿霉素及生物活性物質的相對分子量最好存在一定的匹配關係。在一種較佳的實施例中，將核酸結構域的相對分子量記為N1，將阿霉素與生物活性物質的總相對分子量記為N₂ ，N₁ / N₂ ≥1:1。

根據具體掛載的生物活性物質的種類的不同，本發明中含阿霉素的藥物具有不同性能方面的優化。比如，當生物活性物質為生物素或葉酸時，其所起到的作用是使該含阿霉素的藥物具有靶向性，如，特異靶向癌細胞。當生物活性物質為螢光素時，其所起到的作用是使核酸奈米顆粒具有發光示蹤效果。而生物活性物質為某些siRNA、miRNA、蛋白、多肽、RNA抗體、除阿霉素以外的小分子藥物時，根據不同生物學功能的不同，可能使得該含阿霉素的藥物成為具有特定治療效果的新產品，比如性能更優異的藥物。

在一種較佳的實施例中，生物活性物質為靶頭、螢光素以及miRNA，其中，靶頭位於a、b、c序列中任一序列上，較佳a、b、c任一序列的5’端或3’端，或嵌插於核酸結構域的GC鍵之間，miRNA為抗miRNA，螢光素修飾於抗miRNA的5’端或3’端，miRNA位於a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置；較佳地，靶頭為葉酸或生物素，螢光素為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種，所述抗miRNA為抗miR-21。

上述所能夠掛載的生物活性物質為除了阿霉素以外的其他小分子藥物時，根據不同藥物所能治療的疾病類型，藥物包括但不僅限於治療肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、黑色素瘤、白血病、老年癡呆、強直性脊柱炎、惡性淋巴瘤、支氣管癌、類風濕關節炎、HBV乙肝、多發性骨髓瘤、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌，食道癌，口腔癌，紅斑狼瘡疾病的藥物；較佳地，頭頸癌為腦癌、神經母細胞瘤或膠質母細胞瘤。

上述所能夠掛載的生物活性物質為除了阿霉素以外的小分子藥物時，根據藥物的分子結構的不同或者所具有的特徵性基團的不同，其包括但不僅限於含有如下任意一種或多種基團的藥物：氨基基團、羥基基團、羧基基團、巰基基團、苯環基團以及乙醯氨基基團。

根據本發明的第三種典型的實施方式中，還提供了一種上述含阿霉素的藥物的製備方法，其包括以下步驟：提供上述(不掛生物活性物質的)核酸奈米顆粒；通過物理連接和/或共價連接的方式將阿霉素掛載在核酸奈米顆粒上，得到含阿霉素的藥物。

當採用物理連接方式時，阿霉素通常會以物理嵌插形成嵌插在GC鹼基對之間。而採用共價連接方式進行連接時，阿霉素通常會與G環外氨基發生化學反應形成共價連接。利用上述方法製備的含阿霉素的藥物，其經過靶頭修飾後，可具有較好的靶向性，能夠穩定地遞送阿霉素，可靠性很高。

在一種較佳的實施例中，通過物理連接的方式掛載阿霉素的步驟包括：將阿霉素、核酸奈米顆粒及第一溶劑混合並攪拌，得到預混體系；去除預混體系中的游離物質，得到含阿霉素的藥物。具體的阿霉素、核酸奈米顆粒的用量可以根據掛載量的變化進行調整，這是本領域技術人員都能夠理解的，在此不再贅述。

為了提高物理連接的效率和穩定性，較佳每升第一溶劑中添加的阿霉素量為0.1~1g。較佳地，第一溶劑選自DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種。較佳地，去除預混體系中的游離物質的步驟包括：將預混體系與無水乙醇混合，在低於10℃的溫度條件下析出含阿霉素的藥物；更佳在0~5℃溫度條件下析出含阿霉素的藥物。

在一種較佳的實施例中，通過共價連接的方式掛載阿霉素的步驟包括：配置阿霉素溶液；使阿霉素溶液在甲醛的介導作用下與核酸奈米顆粒的G環外氨基進行反應，得到反應體系；提純反應體系，得到含阿霉素的藥物。

通過甲醛介導的形式，可以發生如下反應：

較佳地，反應的步驟包括：將阿霉素溶液與多聚甲醛溶液、核酸奈米顆粒混合，在避光條件下進行反應，得到反應體系。多聚甲醛溶液能夠釋放甲醛小分子，從而參與上述化學反應。為了提高反應效率，較佳多聚甲醛溶液的濃度較佳為3.7~4wt%，較佳多聚甲醛溶液為多聚甲醛和第二溶劑混合形成的溶液，且第二溶劑為DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種。

上述製備方法中，核酸奈米顆粒可以通過自組裝的形式進行製備，比如：(1)將RNA或DNA單鏈a，b，c同時混合溶於DEPC水或TMS緩衝液中；(2)加熱混合溶液至80℃/95℃(其中RNA組裝溫度為80℃，DNA組裝溫度為95℃)，保持5min後以2℃/min的速率緩慢降溫到室溫；(3)將產物上樣到8%(m/v)非變性PAGE凝膠上並在TBM緩衝液中4℃條件下，以100V電泳純化複合體；(4)切下目的條帶並在RNA/DNA洗脫緩衝液中37℃洗脫，之後乙醇沉澱過夜，減壓低溫揮乾，得到自組裝產物，即可得到核酸結構域，進而得到核酸奈米顆粒。

為了使上述含阿霉素的藥物具有其他功能，在一種較佳的實施例中，在得到核酸結構域之後，製備方法還包括：將前文所述的生物活性物質通過物理連接和/或共價連接的方式掛載在所述核酸結構域上，進而得到所述核酸奈米顆粒。生物活性物質的掛載方式同樣可以是物理連接和/或共價連接。共價連接的形式包括但不限於通過溶劑共價連接、linker共價連接或點擊鏈接進行掛載；較佳地，溶劑共價連接中採用的第三溶劑作為連接介質，且第三溶劑選自多聚甲醛、DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種；較佳地，linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG；較佳地，點擊鏈接是在對生物活性物質前體和核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，然後通過點擊鏈接。

需要說明的是，上述分類並不意味著某種生物活性物質與核酸結構域的連接方式僅有一種。而是，有的生物活性物質，既可以通過物理嵌插的方式與核酸結構域連接，也可以通過物理嵌插與共價連接的方式與核酸結構域連接，同時還可能利用點擊鏈接的方式實現連接。但對某種特定的生物活性物質而言，可能僅有其中一種連接方式，也可能有多種連接方式，但可能其中某種連接效率具有優勢的實用價值。

上述連接方式中，不同藥物在與核酸結構域通過物理嵌插的方式進行連接時，嵌插的結合位點及數目也略有不同。比如，蒽環類、吖啶類藥物在嵌插時，通常嵌插在GC鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上GC鹼基對的數目的不同，按照1~100：1的比例進行嵌插。而萘醯胺藥物在嵌插時，通常嵌插在AA鹼基對之間，較佳的嵌插位點數目根據核酸結構域上AA鹼基對的數目的不同，吡啶并咔唑類根據 AA鹼基對的數目的不同按照1~200：1的比例進行嵌插。

需要說明的是，本發明所提供的序列或序列的變形通過自組裝形成的核酸奈米顆粒也可以作為基本結構單元，根據實際應用需要可以進一步聚合形成多聚體，比如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體或七聚體等。

下面將結合具體的實施例來進一步說明本發明的有益效果。

核酸奈米顆粒的組裝

實施例1

一、RNA和DNA奈米顆粒載體：

(1)組成RNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列，具體見表1。

表1：

(2)DNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列。

DNA採用與上述RNA同樣的序列，僅是T替代U。其中，a鏈的分子量為8802.66，b鏈的分子量為8280.33，c鏈的分子量為9605.2。

上述RNA奈米顆粒和DNA奈米顆粒的a、b和c鏈，均是委託生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、自組裝實驗步驟：

(1)按1:1:1的莫耳比將RNA或DNA單鏈a，b，c同時混合溶於DEPC水或TMS緩衝液中；

(2)加熱混合溶液至80℃/95℃(其中RNA組裝溫度為80℃，DNA組裝溫度為95℃)，保持5min後以2℃/min的速率緩慢降溫到室溫；

(3)將產物上樣到8%(m/v)非變性PAGE凝膠上並在TBM緩衝液中4℃條件下，以100V電泳純化複合體；

(4)切下目的條帶並在RNA/DNA洗脫緩衝液中37℃洗脫，之後乙醇沉澱過夜，減壓低溫揮乾，得到自組裝產物；

(5)電泳分析檢測與鐳射掃描觀察。

三、自組裝實驗結果

電泳檢測結果

RNA自組裝產物的電泳檢測結果見圖1。圖1中，泳道1至3從左到右依次為：a鏈、b鏈、RNA自組裝產物。由圖中可知，RNA自組裝產物隨稍有彌散，但明顯可以看出是單一條帶。且由於分子量為組裝後的分子量，較單鏈分子量大，因此條帶位置落後於a鏈和b鏈，實際情況與理論相符，證明了上述RNA單鏈之間經自組裝形成了穩定的複合結構，形成了RNA奈米顆粒。

DNA自組裝產物的電泳檢測結果見圖2。圖2中，泳道1至3從左到右依次為：a鏈、b鏈、DNA自組裝產物。由圖中可知，DNA自組裝產物的條帶明亮清晰，為單一條帶，證明了上述DNA單鏈之間經自組裝形成了穩定的複合結構，形成了DNA奈米顆粒。

該實施例中，通過凝膠電泳驗證了：包括RNA核心序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5在內的a、b、c序列，能夠成功自組裝成RNA奈米顆粒。包括DNA核心序列SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6在內的a、b、c序列，也能夠成功自組裝成DNA奈米顆粒。

上述RNA奈米顆粒和DNA奈米顆粒的a、b、c序列中除了具有形成核酸結構域的核心序列外，還具有各種促進核酸結構域掛載功能的延長序列(包括藥物掛載結合序列)以及與核酸結構域連接的靶頭或螢光素。可見，這些核心序列以外的物質存在並不影響核酸結構域的形成和核酸奈米顆粒的成功自組裝。而所自組裝而成的核酸奈米顆粒在靶頭的引導下，能夠具有靶向型，螢光素能使該核酸奈米顆粒具有可視性和可追蹤性。

實施例2

一、7組短序列RNA奈米顆粒載體：

(1)7組組成RNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列：

表2：R-1：

表3：R-2：

表4：R-3：

表5：R-4：

表6：R-5：

表7：R-6：

表8：R-7：

上述7組短序列RNA奈米顆粒載體的單鏈均是委託生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

二、自組裝實驗步驟：

(1)按1:1:1的莫耳比將RNA單鏈a，b，c同時混合溶於DEPC水或TMS緩衝液中；

(2)加熱混合溶液至80℃，保持5min後以2℃/min的速率緩慢降溫到室溫；

(4)切下目的條帶並在RNA洗脫緩衝液中37℃洗脫，之後乙醇沉澱過夜，減壓低溫揮乾，得到短序列RNA自組裝產物；

(5)電泳分析檢測與鐳射掃描觀察；

(6)電位檢測。

三、自組裝實驗結果

(1)電泳檢測結果

7組短序列RNA自組裝產物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3。圖3中泳道1至7從左到右依次為：短序列R-1、R-2、R-3、R-4、R-5、R-6、R-7。

7組短序列RNA自組裝產物的4%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4。圖4中泳道1至7從左到右依次為：短序列R-1、R-2、R-3、R-4、R-5、R-6、R-7。

由圖3和圖4結果可以看出，可以清楚地看出7組短序列自組裝產物中R-2、R-3、R-5、R-7的條帶明亮清晰，R-1、R-4、R-6雖然較為彌散，但仍然可以看出為單一條帶，表明7組短序列均能較好地自組裝成RNA奈米顆粒結構。

(2)電位測定

測定方法：準備好電位樣品(自組裝產物溶於超純水中)放入樣品池中，打開儀器的樣品池蓋，放入儀器；

打開軟體，點擊功能表 MeasUre€ManUal，出現手動測量參數設置對話框；

設置軟體檢測參數；

然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始；

測定結果：7組短序列RNA奈米顆粒的電位檢測結果如下：

表9：

表10：

表11：

表12：

表13：

表13：

表14：

由上述電位檢測資料可知：7組短序列RNA自組裝產物均具有良好的穩定性，進一步表明各短序列RNA自組裝而成的奈米顆粒具有較穩定的自組裝結構。

該實施例表明：不同的a、b、c核心序列組合能夠通過自組裝形成具有核酸結構域的RNA奈米顆粒，且結構穩定。在實施例1的基礎上可知，在這些不同的核心序列組合基礎上增加各種功能延長片段或者連接靶頭、螢光素等，同樣能成功組裝成RNA奈米顆粒，並具有掛載藥物、細胞靶向性及可視可追蹤等性能。

為了進一步驗證這些性能，在實施例2基礎上增加延長片段，具體見實施例3。並在與實施例2的RNA核心序列相對應的DNA核心序列基礎上，增加延長片段，同時連接靶頭或不連接靶頭，具體見實施例4。

實施例3

一、7組常規序列RNA奈米顆粒載體：

(1)7組組成RNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列：

表15：R-8：

表16：R-9：

表17：R-10：

表18：R-11：

表19：R-12：

表20：R-13：

表21：R-14：(下述a鏈中的uGAcAGAuAAGGAAccuGcudTdT為survivin siRNA)

上述7組常規序列RNA奈米顆粒載體的單鏈均是委託蘇州吉瑪公司進行合成，其中R-8至R-14中的a序列、b序列、c序列分別是在R-1至R-7的a序列、b序列、c序列基礎上增加延長段後形成的延展RNA寡核苷酸序列，沒有延展靶向模組片段，並進行了C/U鹼基2’F修飾(增強了抗酶切性和穩定性)。另外，上述RNA奈米顆粒R-14中修飾了一段生存素(Survivin)的siRNA核酸干擾治療片段，具體是在a鏈3’端延展了Survivin siRNA的正義鏈(見a鏈底線部分)，在b鏈的5’端延展連接了反義鏈(見b鏈底線部分)，形成鹼基對互補。

二、自組裝實驗步驟：

(4)切下目的條帶並在RNA洗脫緩衝液中37℃洗脫，之後乙醇沉澱過夜，減壓低溫揮乾；

(5)電泳分析檢測與鐳射掃描觀察；

(6)電位測定。

三、自組裝實驗結果

(1)電泳檢測結果

7組常規序列RNA自組裝產物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖5。圖5中泳道1至7從左到右依次為：常規序列RNA自組裝產物R-8、R-9、R-10、R-11、R-12、R13、R-14。

7組常規序列RNA自組裝產物的4%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖6。圖6中泳道1至7從左到右依次為：常規序列RNA自組裝產物R-8、R-9、R-10、R-11、R-12、R13、R-14。

由圖5和圖6結果可以看出，可以清楚地看出7組常規序列RNA自組裝產物的條帶均為明亮清晰的單一條帶，表明7組常規序列均能自組裝成奈米結構。其中常規序列RNA自組裝產物R-14中修飾了一段Survivin siRNA核酸干擾治療片段後，仍舊具有穩定的自組裝結構，也說明了本發明中核酸奈米顆粒能夠掛載核酸藥，具有核酸藥的遞送載體功能。

(2)電位測定

設置軟體檢測參數；

然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始；

測定結果：7組常規序列RNA奈米顆粒的電位檢測結果如下：

表22：

表23：

表24：

表25：

表26：

表27：

表28：

由上述電位檢測資料可知：7組常規序列RNA自組裝產物均具有良好的穩定性，進一步表明各常規序列RNA自組裝而成的奈米顆粒具有較穩定的自組裝結構。

該實施例表明：在不同組合的RNA核心序列基礎上，添加延長片段同樣能夠成功自組裝成結構穩定的RNA奈米顆粒。同時，添加的延長片段使得RNA奈米顆粒具有優越的藥物掛載性能(具體見實施例5和實施例7)。

實施例4

一、7組常規序列DNA奈米顆粒載體：

(1)7組組成DNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列：

表中部分a鏈中延展了EGFRapt靶頭或PSMAapt(A9L)靶頭： EGFRapt(SEQ ID NO：97)： GCCTTAGTAACGTGCTTTGATGTCGATTCGACAGGAGGC； PSMAapt(A9L，SEQ ID NO：98)： GGGCCGAAAAAGACCTGACTTCTATACTAAGTCTACGTCCC。

表29：D-1：

表30：D-2：

表31：D-3：

表32：D-4：

表33：D-5：

表34：D-6：

表35：D-7：

上述7組常規序列DNA奈米顆粒的單鏈均是委託蘇州泓迅進行合成，其中：

D-1是在前文所述核心序列(8)(a序列：5'-GGAGCGTTGG-3'，b序列：5'-CCTTCGCCG-3'，c序列：5'-CGGCCATAGCCC-3')的基礎上，增加包含EGFRapt靶頭(見底線部分)的延展序列後形成的常規序列DNA奈米顆粒；

D-2是在前文所述核心序列(9)(a序列：5'-GCAGCGTTCG-3'，b序列：5'-CGTTCGCCG -3'，c序列：5'-CGGCCATAGCGC-3')的基礎上，增加包含EGFRapt靶頭(見底線部分)的延展序列後形成的常規序列DNA奈米顆粒；

D-3是在前文所述核心序列(10)(a序列：5'-CGAGCGTTGC -3'，b序列：5'-GCTTCGCCG -3'，c序列：5'-CGGCCATAGCCG -3')的基礎上，增加包含EGFRapt靶頭(見底線部分)的延展序列後形成的常規序列DNA奈米顆粒；

D-4是在前文所述核心序列(11)(a序列：5'-GGAGCGTTGG -3'，b序列：5'-CCTTCGGGG -3'，c序列：5'-CCCCCATAGCCC -3')的基礎上，增加包含PSMAapt靶頭(見底線部分)的延展序列後形成的常規序列DNA奈米顆粒；

D-5是在前文所述核心序列(12)(a序列：5'-GCAGCGTTCG -3'，b序列：5'-CGTTCGGCG -3'，c序列：5'-CGCCCATAGCGC -3')的基礎上，增加包含PSMAapt靶頭(見底線部分)的延展序列後形成的常規序列DNA奈米顆粒；

D-6是在前文所述核心序列(13)(a序列：5'-GCAGCGTTCG -3'，b序列：5'-CGTTCGGCC -3'，c序列：5'-GGCCCATAGCGC -3')的基礎上，增加了不包含靶頭結構的延展序列後；形成的常規序列DNA奈米顆粒；

D-7是在前文所述核心序列(14)(a序列：5'-CGAGCGTTGC -3'，b序列：5'-GCTTCGGCG -3'，c序列：5'-CGCCCATAGCCG -3')的基礎上，增加了不包含靶頭結構的延展序列後；形成的常規序列DNA奈米顆粒。

二、自組裝實驗步驟：

(1)按1:1:1的莫耳比將DNA單鏈a，b，c同時混合溶於DEPC水或TMS緩衝液中；

(2)加熱混合溶液至95℃，保持5min後以2℃/min的速率緩慢降溫到室溫；

(4)切下目的條帶並在DNA洗脫緩衝液中37℃洗脫，之後乙醇沉澱過夜，減壓低溫揮乾，得到常規序列DNA自組裝產物；

(5)電泳分析檢測與鐳射掃描觀察；

(6)電位檢測；

(7)粒徑測量；

(8)透射電鏡觀察。

三、自組裝實驗結果

(1)電泳檢測結果

7組常規序列DNA自組裝產物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖7。圖7中泳道1至7從左到右依次為：常規序列DNA自組裝產物D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7。

7組常規序列DNA自組裝產物的4%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖8。圖8中泳道1至7從左到右依次為：常規序列DNA自組裝產物D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7。

由圖7和圖8結果可以看出，可以清楚地看出7組常規序列DNA自組裝產物的條帶均明亮清晰，表明7組常規序列DNA鏈均完成了自組裝，形成了穩定的奈米顆粒結構。其中 D-6、D-7兩組自組裝結構因為攜帶EGFRapt或PSMAapt靶頭，分子量略低，其條帶位置明顯比其他條帶靠前，實際與理論情況完全符合，進一步證明了自組裝結構的穩定性。

該實施例表明：在這些不同的DNA核心序列組合基礎上增加各種功能延長片段或者同時連接靶頭時，同樣能成功組裝成DNA奈米顆粒，並同樣具有掛載藥物、細胞靶向性及可視可追蹤等性能(具體見實施例6和實施例8)。

(2)電位測定

設置軟體檢測參數；

然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始；

測定結果：3組常規序列DNA奈米顆粒的電位檢測結果如下：

表36：

表37：

表38：

由上述電位檢測資料可知：3組常規序列RNA自組裝產物均具有良好的穩定性，進一步表明各常規序列RNA自組裝而成的奈米顆粒具有較穩定的自組裝結構。

(3)粒徑測量

1.準備好電位樣品(常規序列DNA自組裝產物D-7)放入樣品池中，打開儀器的樣品池蓋，放入儀器；

2.打開軟體，點擊功能表，出現手動測量參數設置對話框；

3.設置軟體檢測參數；

4.然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始，自組裝產物D-7的流體動力學尺寸的DLS測量值結果如下：

表39：

(4)透射電鏡觀察結果

對上述常規序列DNA自組裝產物D-7進行透射電鏡照射，步驟如下：

1、取一滴樣本懸浮在400目覆碳膜銅網上，室溫1分鐘;

2、濾紙吸去液體;

3、2% 醋酸鈾染色 1分鐘;

4、濾紙吸乾，室溫乾燥;

5、JEM -1400 透射電子顯微鏡 120kv 觀察、拍照。

結果如圖9所示，從圖中明顯看出上述常規序列DNA自組裝產物D-7為一個整體結構，且能夠清晰地看出其具有T型結構。

阿霉素(Dox)掛載實驗

實施例5

化學法掛載：

一、實驗材料和實驗方法

1. 實驗材料及試劑： (1)核酸奈米顆粒：來自實施例1中的RNA奈米顆粒。 (2)DEPC水：碧雲天。 (3)PBS緩衝液：cellgro。 (4)4%多聚甲醛 (5)阿霉素(Dox)。 (6)氯仿：北化。 (7)無水乙醇：北化。

2. 實驗方法：

(1)精密稱取阿霉素(5.0 mg，8.6 µmol，40 eq.)溶於DEPC水(1.8 mL)及PBS緩衝液(2.1 mL)，冰水浴冷卻下加入4%多聚甲醛水溶液(0.4 mL)混勻，將此混合液全部與RNA奈米顆粒(215 nmol)混勻，並在避光條件下於4℃反應72 小時。

(2)取反應液10 µL稀釋10倍，以50 µM的阿霉素水溶液及310 ng/µL的RNA奈米顆粒為對照，按等體積進樣進行HPLC分析。根據各組分峰面積比可判斷反應轉化基本完全。

(3)將反應液以氯仿萃取(10 mLx3)，隨後加入10倍體積的無水乙醇，混勻後避光置於4℃使產物充分析出(4小時)。離心，轉移上清，固體產物再次以乙醇洗，於低溫下減壓揮乾溶劑得掛載產物為暗紅色固體。

(4)取少量產物溶於DEPC水，上樣於8%PAGE膠中，在TBM緩衝液中4oC條件下100V電泳1小時，電泳結果見圖10。圖10中，從左至右，泳道1至5分別是1)20bp DNA ladder、2-4)RNA奈米顆粒空白顆粒和5)阿霉素掛載產物。從圖10可以看到阿霉素掛載產物條帶位於RNA奈米顆粒空白顆粒後面一點。

(5)掛載率計算：

配置已知濃度的阿霉素-PBS 標準液：2uM、4uM、6uM、8uM、10uM，各100ul；

將阿霉素掛載產物溶解在 100ul PBS 中；

將標準液與阿霉素掛載產物置於 PCR 板中，於 85℃加熱 5min，隨後冷卻至室溫；

利用酶標儀測量 492nm 處阿霉素的吸光度，繪製標準曲線(如圖11所示)，計算得出掛載產物中阿霉素的莫耳濃度；

利用分光光度計測量 260nm 處 RNA 的吸光度，得到每個樣品中含有阿霉素掛載產物的品質濃度；

6 根據測量得到的阿霉素莫耳濃度及阿霉素掛載產物的品質濃度，計算掛載率。

計算具體過程如下： C_RNAh -1 = 9.5 ug/ul，M_RNAh ≈30000，100ul； C_阿霉素 -1 = 8.033 uM，100ul； C_RNAh -2 = 1.21 ug/ul，M_RNAh ≈30000，100ul； C_阿霉素 -1 = 9.200 uM，100ul；

；

；

取N-1和N-2的平均值得到 RNAh-阿霉素的掛載率約為 24，及表示每一個核酸奈米顆粒載體上能夠掛載約24個阿霉素分子。

物理法掛載： 1)阿霉素與RNA奈米顆粒的質量比為1:1； 2)稱取0.1mg阿霉素原藥溶於50ul DMSO，隨後加入300ul PBS混勻； 3)將RNA顆粒溶於200ul DEPC水中，並加入到阿霉素-PBS混合液中，混勻，調pH約為7.5； 4)將全部溶液置於55℃水浴鍋中，反應3h； 5)反應結束後，直接加入10倍體積的無水乙醇，4℃析出4h； 6)以10倍的無水乙醇洗滌4遍，並轉移至1.5mL EP管中。隨後，進行掛載率的測定，測定方法同上，測定結果為阿霉素掛載率為15.5。

實施例5表明，帶有延長片段、靶頭和螢光素的RNA奈米顆粒(實施例1中的)具有掛載藥物的功能，而且可以通過物理嵌插和共價連接(多聚甲醛—溶劑共價)的方式來實現藥物掛載。

實施例6

根據實施例5的化學法掛載方法(除特殊限定外，方法同實施例5相同)，分別採用前述實施例1中的DNA奈米顆粒、實施例2中的R-1、R-2、R-3、R-4、R-5、R-6、R-7自組裝形成的RNA奈米顆粒、實施例4中D-2、D-6和D-7自組裝形成的DNA奈米顆粒作為阿霉素掛載載體，測得阿霉素掛載率分別如下：

實施例1中的DNA奈米顆粒的阿霉素掛載率為300(該方法中，阿霉素為1.2mg，DEPC水為0.5mg，PBS緩衝液為8.5ml， 4%多聚甲醛水溶液為1ml，DNA奈米顆粒為2.5nmol，DNA奈米顆粒溶於20μl水中)。 RNA奈米顆粒R-1的阿霉素掛載率為3.5； RNA奈米顆粒R-2的阿霉素掛載率為2.4； RNA奈米顆粒R-3的阿霉素掛載率為4.8； RNA奈米顆粒R-4的阿霉素掛載率為3.5； RNA奈米顆粒R-5的阿霉素掛載率為12.5； RNA奈米顆粒R-6的阿霉素掛載率為2.8； DNA奈米顆粒D-2的阿霉素掛載率為14； DNA奈米顆粒D-6的阿霉素掛載率為11； DNA奈米顆粒D-7的阿霉素掛載率為10。

流式細胞儀(FACS)實驗檢測RNA奈米顆粒的細胞結合能力

實施例7

一、實驗材料和實驗方法：

1. 待測樣品見表40：

表40：

註：表中RNAh指的是實施例1中自組裝形成的RNA奈米顆粒中不進行Biotin修飾的對照奈米顆粒，RNAh-Biotine-quasar670指的是在實施例1中自組裝形成的RNA奈米顆粒的5’端修飾quasar670螢光素後形成的奈米顆粒，RNAh-Biotine-quasar670-Dox指的是進一步掛載阿霉素藥物後(實施例5中化學法掛載)形成的奈米顆粒。

2. 所用到的實驗試劑及其來源如下：

RPMI-1640 培養基 (Gibco, C11875500BT-500 mL)；胎牛血清(Fetal bovine serum ，FBS) (ExCell Bio, FNA500-500 mL)；盤尼西林/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin ，PS) (Gibco, 15140-122-100 mL)；PBS緩衝液 (Gibco, C20012500BT-500 mL)；Trypsin-EDTA (Stemcell, 07901-500 mL)；DMSO (Sigma, D5879-1 L)。

3. 所用到的實驗儀器如下：

倒置顯微鏡(Inverted Microscope) (Olympus IX71, TH4-200)；流式細胞儀(Flow Cytometer) (Life Science, Attune NxT)。

4. 實驗方法:

(1)用RPMI1640+10%FBS+1%PS培養基，於37℃和5%CO₂ 中培養HepG2細胞。

(2)胰酶消化HepG2細胞，並用PBS洗一遍。

(3)分別將2x105個細胞與RNAh、RNAh-Biotin-quasar670、RNAh-Biotin-quasar670-Dox奈米顆粒一起於37 ℃和5%CO₂ 中培養1 h，每個樣品分別有200 nM和400 nM兩個濃度，每個濃度下每個樣品有3次重複。

(4)細胞用PBS洗滌後，再用PBS緩衝液重懸，並用FACS儀器檢測。

(5)收集收據並統計分析。

二、實驗結果

實驗結果見表41、圖12和圖13。

表41：螢光陽性HepG2細胞(%) Mean ± SEM (n = 3)

圖12中，A對應HepG2細胞對照組，B對應200 nM 濃度的RNAh對照奈米顆粒，C對應200 nM 濃度的RNAh-Biotin-quasar670奈米顆粒，D對應200 nM 濃度的RNAh-Biotin-quasar670-Dox奈米顆粒，E對應400 nM 濃度的RNAh對照奈米顆粒，F對應400 nM 濃度的RNAh-Biotin-quasar670奈米顆粒，G對應400 nM 濃度的RNAh-Biotin-quasar670-Dox奈米顆粒。

從表41和圖12中可以看出，單純的不修飾靶頭的RNA奈米顆粒不具備細胞靶向性，當掛載生物素之後能夠與HepG2細胞結合。此外，圖12的FACS結果顯示，RNAh-Biotin-quasar670和RNAh-Biotin-quasar670-Dox奈米顆粒與HepG2細胞結合能力較強(P> 0.0001)。

圖13顯示的是顯微鏡檢測奈米顆粒與HepG2細胞結合和內化結果。細胞結合和內化實驗結果顯示，RNAh-Biotin-quasar670和RNAh-Biotin-quasar670-Dox奈米顆粒均能夠與HepG2細胞結合並內化(其中，掛載阿霉素的奈米顆粒RNAh-Biotin-quasar670-Dox與HepG2細胞共培養後，細胞明顯被染紅，並且隨著RNAh-Biotin-quasar670-Dox奈米顆粒濃度和時間的增加而顏色加深，可以看出，載藥RNA奈米顆粒與HepG2細胞結合和內化能力較強。RNAh-Bio-quasar670同樣具有與HepG2細胞結合和內化的能力，只因不含Dox，因而不能被染成紅色)。

實施例8

一、實驗材料和試驗方法：

1. 待測樣品見表42：

表42：

註：DOX-D-1-EGFR指的是前述實施例4中自組裝形成的DNA奈米顆粒D-1掛載阿霉素(掛載步驟同實施例5，下同)後形成的奈米顆粒(D-1中本身掛載有EGFR，此處表述為DOX-D-1-EGFR是為了明晰靶頭類型和阿霉素掛載，下同)；DOX-D-2-EGFR指的是前述實施例中自組裝形成的DNA奈米顆粒D-2掛載阿霉素後形成的奈米顆粒；DOX-D-5-PSMA指的是前述實施例中自組裝形成的DNA奈米顆粒D-5掛載阿霉素後形成的奈米顆粒。

2. 細胞資訊見表43：

表43：

3. 所用到的實驗試劑及其來源如下： RPMI-1640 培養基 (YY0167-500Ml)； MEM(YS4150-500mL)； MEM NEAA (100×) ( GBICO, Cat#1872982)； FBS胎牛血清 (GBICO, Cat#10099141)。

4. 所用到的實驗儀器如下：流式細胞儀Guava EasyCyte 8HT (Millipore)； SpectraMax多標記微孔板檢測儀，MD，2104-0010A。

5. 實驗方法：

5.1細胞培養

a) 細胞復蘇至對應的培養基中，於37℃、5% CO₂ 細胞培養箱中培養。

b) 細胞在T75細胞培養瓶中達到對數生長期時(約80%匯合率)，更換原培養基為不含葉酸和生物素的培養基。

5.2 結合實驗

a) 第一天收集細胞並計數，以2×105 cell/well的密度鋪至24孔板中。

b) 第二天，使用PBS稀釋樣品。使用PBS將所有樣品稀釋至100μM，配製1μM溶液，在酶標儀上檢測螢光基團(阿霉素：Ex=480nm、Em=580nm；)是否正常發光。

用PBS洗滌細胞2次。

d) 加入溶於培養基的奈米顆粒，37℃的CO₂ 培養箱中培養細胞16h。奈米顆粒濃度為2μM，樣品順序如下表44。

表44：

e) 用PBS洗滌細胞2次。

f) 收集胰蛋白酶消化的細胞並用PBS洗滌細胞2次。

g) PBS洗滌過的細胞重懸於400uLPBS，轉移到一個5mL 的流式細胞管中。

h) 流式細胞儀上樣之前樣品需要避光。

i) 流式細胞儀檢測。阿霉素在Ex=480nm、Em=580nm(黃色通道)檢測細胞螢光強度。

j) 用FlowJo軟體分析FACS資料。

k) 根據空白細胞組本底螢光強度設門，分析各DNA奈米顆粒與細胞結合比例。

二、實驗結果

實驗結果見表45、46和47

表45：樣品酶標儀螢光檢測結果

表46：流式檢測樣品與細胞結合率

表47：流式檢測MFI

由上述表46、47的資料結果可知：DOX-D-1-DNAh-EGFR與U87MG細胞的結合能力很強，當給藥濃度為2uM，給藥時間為16h時結合效率為100%。DOX-D-2-EGFR與MDA-MB-231細胞的結合能力很強，當給藥濃度為2uM，給藥時間為16h時結合效率為100%。DOX-D-3-EGFR與HCC-78細胞的結合能力很強，當給藥濃度為2uM，給藥時間為16h時結合效率為100%。

關於其他核酸奈米顆粒(包括RNA奈米顆粒及剩餘DNA奈米顆粒)，由於均攜帶或可以通過增加延長段的方式使其攜帶與DOX-D-1-DNAh-EGFR、DOX-D-2-EGFR或DOX-D-5-PSMA相同的靶頭EGFRapt或PSMAapt，因而也都具有與相應細胞相當的結合效率。此外，均攜帶與DOX-D-1-DNAh-EGFR、DOX-D-2-EGFR或DOX-D-5-PSMA相同的藥物掛載序列(GC掛載位點序列)，因而也都具有相當的藥物掛載功能。

檢測核酸奈米顆粒在血清中的穩定性

實施例9

一、實驗材料和實驗方法

1. 待測樣品：溶解在PBS溶液中的實施例1中製備的RNA奈米顆粒。

2. 實驗試劑：

RPMI-1640 培養基 (Gibco, C11875500BT-500 mL)；胎牛血清(Fetal bovine serum ，FBS) (ExCell Bio, FNA500-500 mL)；盤尼西林/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin ，PS) (Gibco, 15140-122-100 mL)；PBS緩衝液 (Gibco, C20012500BT-500 mL)； Novex™ Tris-Glycine Native Sample Buffer (2X) (Invitrogen, LC2673-20 mL)；Novex™ 8% Tris-Glycine Mini Gels (Invitrogen, XP00080BOX-1.0 mm)；Tris-Glycine Native Running buffer (10x) (Life science, LC2672-500 mL)；G250染色液 (Beyotime, P0017-250 mL)。

3. 實驗儀器：

分光光度計(Spectrophotometer) (Thermo, ND2000C)；Mini Gel Tank (Invitrogen, PS0301)；成像系統(Imaging System) (Bio-Rad, ChemiDoc MP)。

4. 實驗方法：

(1)吸取350μl PBS加到RNA奈米顆粒樣品中，充分混勻。

(2)將2μM的RNA奈米顆粒置於含10%血清的RPMI 1640培養基中培養。

(3)在37℃培養10 min、1 h、12 h、36 h後分別取樣。

(4)採用NanoDrop定量後，取200 ng的RNA奈米顆粒，加入相同體積的Tris-Glycine SDS 樣品緩衝液(2X)，充分混勻。

(5)取一塊Novex™ 8% Tris-Glycine Mini gel，按照順序上樣，設置程式200 V，30 min，開始電泳。

(6)電泳結束，進行G250染色，置於水準搖床30 min-1 h，拍照成像。

二、實驗結果

表48：RNA定量結果及上樣體積

電泳檢測結果見圖14和圖15。其中，圖14示出了8%非變性膠的電泳結果(Coomassie Blue程式)，圖15示出了8%非變性膠的電泳結果(Stain Free Gel程式)。RNA奈米顆粒的血清穩定性試驗結果顯示：10 min、1 h、12 h和36 h的非變性膠結果顯示(圖14和圖15)，不同時間RNA奈米顆粒樣品條帶無明顯差別，表明RNA奈米顆粒在10%FBS的1640培養基中比較穩定，無明顯降解。

研究RNA奈米顆粒在HepG2細胞中的細胞毒性

實施例10

一、實驗材料和實驗方法

1. 待測樣品為實施例7中的三個樣品。

2. 實驗試劑:

RPMI-1640 培養基 (Gibco, C11875500BT-500 mL)；胎牛血清(Fetal bovine serum ，FBS) (ExCell Bio, FNA500-500 mL)；盤尼西林/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin ，PS) (Gibco, 15140-122-100 mL)；PBS緩衝液 (Gibco, C20012500BT-500 mL)；Trypsin-EDTA (Stemcell, 07901-500 mL)；DMSO (Sigma, D5879-1 L)；Dox (HISUN Pharm, H33021980-10 mg)；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (CTG) (Promega, G7572-100 mL)。

3. 實驗儀器:

倒置顯微鏡(Inverted Microscope) (Olympus IX71, TH4-200)；96孔板閱讀儀(96-well Plate Reader )(Molecular Devices, Flexstation 3)。

4. 實驗方法:

(2)胰酶消化HepG2細胞，以每孔5000個細胞100µL接種在96孔板中，於37℃和5%CO₂ 中培養過夜。

(3)第二天去除細胞上清，使用培養基稀釋待測樣品，分別加入200nM 的RNAh、RNAh-Biotine、RNAh-Dox和Dox，各100µL至鋪板細胞中，每個樣品4次重複。

(4)培養72 h後，每孔加入CTG試劑100µL，振盪2min，室溫靜置10min，全程避光。

(5)最後使用Soft Max Pro5軟體讀數。

二、實驗結果:

表49： HepG2細胞增殖(%) Mean ± SEM (n = 4)

實驗結果見表49和圖16，圖16中，a對應PBS的細胞增殖結果，b對應DMSO的細胞增殖結果，c對應Dox(阿霉素)的細胞增殖結果，d對應RNAh的細胞增殖結果，e對應RNAh-Biotin-quasar670的細胞增殖結果，f對應RNAh-Biotin-quasar670-Dox的細胞增殖結果。

從表49和圖16中可以看出，CTG結果顯示，200 nM載藥奈米顆粒RNAh-Biotine-Dox對於HepG2細胞有明顯細胞毒性(P> 0.0001)，而200 nM RNAh-Biotine對於HepG2細胞無細胞毒性。

核酸奈米顆粒的組裝

實施例11

一、7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒載體：

(1)7組組成延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列：

表50：R-15：

表51：R-16：

表52：R-17：

表53：R-18：

表54：R-19：

表55：R-20：

表56：R-21：

二、自組裝試驗步驟：

(5)電泳分析檢測與鐳射掃描觀察；

(6)電位測定；

(7)粒徑測量；

(8)Tm值測定。

三、自組裝試驗結果

(1)電泳檢測

主要試劑和儀器如下：

表57：

表58：

步驟：

① 將RNA奈米顆粒按下表59方法採用超純水進行稀釋。

表59：

② 取處理後的樣品 10μL(500ng)與2μL 6×DNA Loading Buffer混勻，冰上操作，做好標記。

③ 取8%非變性PAGE凝膠，將不同培養時間的樣品上一塊膠，將12μL處理的樣品全部上樣，設置程式100V 跑膠40min。

④ 跑膠結束，進行染色，置於水準搖床30 min，拍照成像。

檢測結果：

7組延長段變形+核心短序列RNA自組裝產物的非變性PAGE膠跑膠結果見圖17。圖17中泳道1至7從左到右依次為：7組延長段變形+核心短序列RNA自組裝產物R-15、R-16、R-17、R-18、R-19、R-20、R-21。

由圖17結果可以清楚地看出7組延長段變形+核心短序列RNA自組裝產物的條帶均明亮清晰，表明7組延長段變形+核心短序列RNA鏈均完成了自組裝，形成了穩定的奈米顆粒結構。

(2)電位測定

設置軟體檢測參數；

然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始；

測定結果：7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒的25℃電位檢測結果如下：

表60：

表61：

表62：

表63：

表64：

表65：

表66：

由上述電位檢測資料可知：7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒均具有良好的穩定性，進一步表明各延長段變形+核心短序列RNA自組裝而成的奈米顆粒具有較穩定的自組裝結構。

(3)粒徑測量

1.準備好電位樣品(7組延長段變形+核心短序列RNA)放入樣品池中，打開儀器的樣品池蓋，放入儀器；

2.打開軟體，點擊功能表，出現手動測量參數設置對話框；

3.設置軟體檢測參數；

4.然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始，7組延長段變形+核心短序列RNA的流體動力學尺寸的DLS測量值結果分別如下：

表67：

(4)TM值檢測

採用溶解曲線法，對7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒的TM值進行檢測，樣品與電位樣品一致。

試劑和儀器如下：

表68：

表69：

步驟：

樣品採用超純水進行稀釋後，將5μg稀釋所得樣品與2μL SYBR Green I染料(1:200稀釋)進行混合，終體積20μL，稀釋濃度如下：

表70：

② 室溫避光培養30 min；

③ 上機檢測，程式設置為20℃開始，每秒升溫0.1℃至95℃，每5s讀數一次。

檢測結果：

7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒的TM值如下，R-15的溶解曲線圖見圖18，R-16的溶解曲線圖見圖19，R-17的溶解曲線圖見圖20，R-18的溶解曲線圖見圖21，R-19的溶解曲線圖見圖22，R-20的溶解曲線圖見圖23，R-21的溶解曲線圖見圖24。因RNA樣本特殊性，本次檢測以20~90℃範圍內1/2 RFUmax值所對應的溫度為樣本Tm值。

表71：

7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒的TM值均較高，表明自組裝產物具有良好的結構穩定性。

實施例12

一、7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒載體：

(1)7組組成延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒的三條多核苷酸鹼基序列：

表72：D-8：

表73：D-9：

表74：D-10：

表75：D-11：

表76：D-12：

表77：D-13：

表78：D-14：

二、自組裝試驗步驟：

(4)切下目的條帶並在DNA洗脫緩衝液中37℃洗脫，之後乙醇沉澱過夜，減壓低溫揮乾，得到DNA自組裝產物；

(5)電泳分析檢測與鐳射掃描觀察；

(6)電位檢測；

(7)粒徑檢測；

(8)TM值檢測。

三、自組裝試驗結果

(1)電泳檢測

主要試劑和儀器如下：

表79：

表80：

步驟：

將DNA奈米顆粒按下表81方法採用超純水進行稀釋。

表81：

④ 跑膠結束，進行染色，置於水準搖床30 min，拍照成像。

檢測結果：

7組延長段變形+核心短序列DNA自組裝產物的非變性PAGE膠跑膠結果見圖25。圖25中泳道1至7從左到右依次為：7組延長段變形+核心短序列DNA自組裝產物D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13、D-14。

由圖37結果可以清楚地看出7組延長段變形+核心短序列DNA自組裝產物的條帶均明亮清晰，表明7組延長段變形+核心短序列DNA鏈均完成了自組裝，形成了穩定的奈米顆粒結構。

(2)電位測定

設置軟體檢測參數；

然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始；

測定結果：7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒的25℃電位檢測結果如下：

表82：

表83：

表84：

表85：

表86：

表87：

表88：

由上述電位檢測資料可知：7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒均具有良好的穩定性，進一步表明各延長段變形+核心短序列DNA自組裝而成的奈米顆粒具有較穩定的自組裝結構。

(3)粒徑測量

① 準備好電位樣品(7組延長段變形+核心短序列DNA)放入樣品池中，打開儀器的樣品池蓋，放入儀器；

② 打開軟體，點擊功能表，出現手動測量參數設置對話框；

③ 設置軟體檢測參數；

④ 然後點擊確定完畢設置，出現測量對話框，點擊Start 開始，7組延長段變形+核心短序列RNA的流體動力學尺寸的DLS測量值結果分別如下：

表89：

(4)TM值檢測

採用溶解曲線法，對7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒的TM值進行檢測，樣品與電位樣品一致。

試劑和儀器如下：

表90：

表91：

步驟：

表92：

② 室溫避光培養30 min；

檢測結果：

7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒的TM值如下，D-8的溶解曲線圖見圖26，D-9的溶解曲線圖見圖27，D-10的溶解曲線圖見圖28，D-11的溶解曲線圖見圖29，D-12的溶解曲線圖見圖30，D-13的溶解曲線圖見圖31，D-14的溶解曲線圖見圖32。

表93：

由圖26至32可知，7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒的溶解曲線的TM值均較高，表明樣本純度較高且自組裝結構穩定。

檢測核酸奈米顆粒在血清中的穩定性

實施例13

採用非變性PAGE法對7組延長段變形+核心短序列RNA奈米顆粒在血清中的穩定性進行表徵。

主要試劑和儀器如下：

表94：

表95：

步驟：

將RNA奈米顆粒配製為下表濃度，然後將配製後的樣品按下表中的方法進行稀釋，稀釋5管，稀釋後樣品37℃水浴不同時間(0、10min、1h、12h、36h)；

表96：

② 取處理後的樣品 10μL與2μL 6×DNA Loading Buffer混勻，冰上操作，做好標記；

③ 取8%非變性PAGE凝膠，將不同培養時間的樣品上一塊膠，將12μL處理的樣品全部上樣，設置程式100V 跑膠40min；

④ 跑膠結束，進行染色，置於水準搖床緩慢振盪30 min，拍照成像。

R-15的電泳檢測結果見圖33，R-16的電泳檢測結果見圖34，R-17的電泳檢測結果見圖35，R-18的電泳檢測結果見圖36，R-19的電泳檢測結果見圖37，R-20的電泳檢測結果見圖38，R-21的電泳檢測結果見圖39。圖33至39中，從左到右的泳道分別為M：marker；1：36h；2：12h；3：1h；4：10min；5：0min。從血清穩定性試驗結果可知：10 min、1 h、12 h和36 h的非變性膠結果顯示，不同時間RNA奈米顆粒樣品條帶無明顯差別，表明RNA奈米顆粒R-15至R-21在50%FBS的1640培養基中比較穩定，無明顯降解。

實施例14

採用非變性PAGE法對7組延長段變形+核心短序列DNA奈米顆粒在血清中的穩定性進行表徵。

主要試劑和儀器如下：

表97：

表98：

步驟：

將DNA奈米顆粒配製為下表濃度，然後將配製後的樣品按下表中的方法進行稀釋，稀釋5管，稀釋後樣品37℃水浴不同時間(0、10min、1h、12h、36h)；

表99：

② 取處理後的樣品 5μL與1μL 6×DNA Loading Buffer混勻，冰上操作，做好標記；

③ 取8%非變性PAGE凝膠，將不同培養時間的樣品上一塊膠，將6μL處理的樣品全部上樣，設置程式100V 跑膠40min；

D-8的電泳檢測結果見圖40，D-9的電泳檢測結果見圖41，D-10的電泳檢測結果見圖42，D-11的電泳檢測結果見圖43，D-12的電泳檢測結果見圖44，D-13的電泳檢測結果見圖45，D-14的電泳檢測結果見圖46。圖40至46中，從左到右的泳道分別為M：marker；1：36h；2：12h；3：1h；4：10min；5：0min。從血清穩定性試驗結果可知：10 min、1 h、12 h和36 h的非變性膠結果顯示，不同時間DNA奈米顆粒樣品條帶無明顯差別，表明DNA奈米顆粒D-8至D-14在50%FBS的1640培養基中比較穩定，無明顯降解。

核酸奈米顆粒掛載藥物試驗

實施例15

阿霉素掛載實驗：

根據實施例5的化學法掛載方法(除特殊限定外，方法同實施例5相同)，分別採用前述實施例11中R-15、R-16、R-17、R-18、R-19、R-20和R-21自組裝形成的RNA奈米顆粒、實施例12中D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13和D-14自組裝形成的DNA奈米顆粒作為阿霉素掛載載體，測得阿霉素掛載率分別如下： RNA奈米顆粒R-15的阿霉素掛載率為20.5； RNA奈米顆粒R-16的阿霉素掛載率為29.4； RNA奈米顆粒R-17的阿霉素掛載率為30.9； RNA奈米顆粒R-18的阿霉素掛載率為34.1； RNA奈米顆粒R-19的阿霉素掛載率為27.1； RNA奈米顆粒R-20的阿霉素掛載率為30.2； RNA奈米顆粒R-21的阿霉素掛載率為20.1； DNA奈米顆粒D-8的阿霉素掛載率為28.0； DNA奈米顆粒D-9的阿霉素掛載率為27.9； DNA奈米顆粒D-10的阿霉素掛載率為18.9； DNA奈米顆粒D-11的阿霉素掛載率為26.8； DNA奈米顆粒D-12的阿霉素掛載率為27.6； DNA奈米顆粒D-13的阿霉素掛載率為31.8； DNA奈米顆粒D-14的阿霉素掛載率為32。

流式細胞儀(FACS)實驗檢測DNA奈米顆粒及載體藥的細胞結合能力

實施例16

一、細胞資訊

HepG2(來源協和細胞庫)，培養基為DMEM+10%FBS+1%雙抗(gibco，15140-122)，培養條件為37℃，5%CO₂ ，飽和濕度。

二、待測物

空白載體：前述實施例12中D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13和D-14自組裝形成的DNA奈米顆粒載體。

載體藥：根據實施例5的化學法掛載方法(除特殊限定外，方法同實施例5相同)，採用前述實施例12中D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13和D-14自組裝形成的DNA奈米顆粒掛載阿霉素，分別記為D-8-阿霉素、D-9-阿霉素、D-10-阿霉素、D-11-阿霉素、D-12-阿霉素、D-13-阿霉素和D-14-阿霉素。

三、主要設備、耗材

表100：

四、主要試劑

表101：

五、實驗方法：

1. 調整細胞狀態到對數生長期，更換培養基為無生物素無葉酸的培養基，置於37°C培養箱中培養過夜；

2. 培養結束後，胰酶消化收集細胞懸液，1000rmp離心5min，調整濃度後，取2×10⁵ -5×10⁵ 細胞/EP管，用1 mL/管 1%BSA-PBS洗2次，觀察管底細胞，以防被吸走。

3. 溶解待測物，稀釋待測物到使用濃度；

4. 將細胞上清液吸淨，每管按順序加入100 μL相應樣品，避光，37°C培養2h；

5. 用1%BSA-PBS洗2次；1000rmp離心5min；

6. 最後用300 μL PBS重懸細胞沉澱，流式上機檢測(本實施例所用的空白載體是由Quasar 670標記的，而載體藥中的阿霉素自帶螢光，因此可以分別通過FL4-APC和FL2-PE進行檢測)；

7. 資料分析。

六、實驗結果

1. 實驗結果見下表：

表102：

2. 結論

1. HepG2細胞與D-8-阿霉素(載體藥)及D-8(空白載體)培養後，均有很高(93.1%~98.4%)的結合率。

2. HepG2細胞與D-9-阿霉素(載體藥)及D-9(空白載體)培養後，均有很高(88.6%~98.1%)的結合率。

3. HepG2細胞與D-10-阿霉素(載體藥)及D-10(空白載體)培養後，均有很高(89.4%~98.3%)的結合率。

4. HepG2細胞與D-11-阿霉素(載體藥)及D-11(空白載體)培養後，均有很高(89.3%~97.8%)的結合率。

5. HepG2細胞與D-12-阿霉素(載體藥)及D-12 (空白載體)培養後，均有很高(94.6%~97.1%)的結合率。

6. HepG2細胞與D-13-阿霉素(載體藥)及D-13(空白載體)培養後，均有很高(89.6%~98.2%)的結合率。

7. HepG2細胞與D-14-阿霉素(載體藥)及D-14(空白載體)培養後，均有很高(90.3%~98.3%)的結合率。

研究DNA奈米顆粒及載體藥在HepG2細胞中的細胞毒性

實施例17

採用CCK8法檢測DNA奈米顆粒及載體藥對HepG2的毒性。

一、主要試劑

表103：

二、主要耗材和儀器

表104：

三、細胞資訊

四、實驗材料

1. 待測樣品

空白載體：前述實施例12中D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13和D-14自組裝形成的DNA奈米顆粒載體，分別記作：D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13和D-14。

原藥阿霉素。

DMSO。

五、實驗步驟

1. 取對數生長期的HepG2細胞，使用台盼藍染色計數細胞活率為98.3%，以5000個Cell/孔進行鋪板，體積為100µL/孔，鋪8個96孔板，每板57個孔，37℃培養過夜。

2. 按照下表稀釋待測樣品並加入：去除原有培養基，加入100µL不同濃度待測樣品的培養基，每組3個複孔。

表105：

C8孔中樣品的配製方法是：完全培養基324µL，然後從C9孔中吸取

在本實施例中，掛載藥和空白載體分別先用PBS配製成100µM的原液，再用完全培養基(無生物素DMEM)進行稀釋。原藥阿霉素先用DMSO配製成100µM的原液，再用完全培養基(無生物素DMEM)進行稀釋。DMSO直接用完全培養基(無生物素DMEM)進行稀釋。

3. 加待測樣品後將96孔板放入37℃ 5%CO₂ 培養箱中培養72h。

4. 將試劑盒取出室溫融化，每孔加入10µL CCK-8溶液，也可將CCK8溶液與培養基以1:9混合，然後以100µL/孔的量加入孔中。

5. 在細胞培養箱內繼續培養4h，時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定。

6. 用酶標儀在450nm處測定吸光度。

7. 計算：細胞活力(%)=(OD實驗組-OD空白組)×100%/(OD對照組-OD空白組)，由GraphPad Prism 5.0計算得到IC50。

六、實驗結果

表106：

結論：

從上表和圖47a、圖47b、圖47c、圖47d、圖47e、圖47f、圖47g、圖47h中可以看出，原藥阿霉素及掛載藥D-8-阿霉素、D-9-阿霉素、D-10-阿霉素、D-11-阿霉素、D-12-阿霉素、D-13-阿霉素和D-14-阿霉素作用於HepG2細胞的IC50分別為0.2725µM、0.05087µM、0.0386、0.03955、0.04271、0.02294、0.03017和0.03458；DMSO作用於HepG2細胞的IC50為>0.1%；D-8(空白載體)、D-9(空白載體)、D-10(空白載體)、D-11(空白載體)、D-12(空白載體)、D-13(空白載體)和D-14(空白載體)作用於HepG2細胞的IC50均>1µM。說明針對HepG2細胞系而言，相比單純的空白載體D-8、D-9、D-10、D-11、D-12、D-13和D-14，小分子藥物原藥阿霉素及掛載藥D-8-阿霉素、D-9-阿霉素、D-10-阿霉素、D-11-阿霉素、D-12-阿霉素、D-13-阿霉素和D-14-阿霉素都對HepG2細胞有毒性，且掛載藥D-8-阿霉素、D-9-阿霉素、D-10-阿霉素、D-11-阿霉素、D-12-阿霉素、D-13-阿霉素和D-14-阿霉素相對於原藥阿霉素有明顯的增效作用。

柔紅霉素掛載實驗

實施例18

根據實施例5的化學法掛載方法(除特殊限定外，方法同實施例5相同)，採用前述實施例12中D-10和D-14自組裝形成的DNA奈米顆粒作為柔紅霉素掛載載體。利用酶標儀測量 492nm 處柔紅霉素的吸光度，繪製標準曲線(如圖48所示)。

測得柔紅霉素掛載率分別如下：

DNA奈米顆粒D-10的柔紅霉素掛載率為24.0；

DNA奈米顆粒D-14的柔紅霉素掛載率為25.1。

從以上的描述中，可以看出，本發明上述的實施例實現了如下技術效果：本發明提供了一系列具有熱力學穩定性、化學穩定性、高負載率以及多價組合模組的核酸奈米顆粒載體。對該類載體進行獨特的模組化設計的，得到既保持天然相容的親和力，又具有高度穩定性質和多樣組合特徵的核心模組結構。該結構可以靈活高效的集成各種功能性模組，包括靶向模組、成像和探針模組、治療模組和其它複合智慧模組，從而能夠用於體內靶向投送，實現精準診療。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

無。

構成本發明的一部分的說明書圖式用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在圖式中：

圖1示出了本發明實施例1中自組裝形成的RNA奈米顆粒的電泳檢測結果；

圖2示出了本發明實施例1中自組裝形成的DNA奈米顆粒的電泳檢測結果；

圖3示出了本發明實施例2中自組裝形成的7組短序列RNA奈米顆粒的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

圖4示出了本發明實施例2中自組裝形成的7組短序列RNA奈米顆粒的4%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

圖5示出了本發明實施例3中自組裝形成的7組常規序列RNA奈米顆粒的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

圖6示出了本發明實施例3中自組裝形成的7組常規序列RNA奈米顆粒的4%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

圖7示出了本發明實施例4中自組裝形成的7組常規序列DNA奈米顆粒的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

圖8示出了本發明實施例4中自組裝形成的7組常規序列DNA奈米顆粒的4%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

圖9示出了本發明實施例4中自組裝形成的常規序列DNA奈米顆粒D-7的透射電鏡照片；

圖10示出了本發明實施例5中的阿霉素掛載產物的電泳檢測結果；

圖11示出了本發明實施例5中掛載率檢測過程中採用的阿霉素吸光度的標準曲線；

圖12示出了本發明實施例7中不同奈米顆粒的FACS螢光訊號強度檢測結果；

圖13示出了本發明實施例7中不同奈米顆粒與HepG2細胞結合和內化結果；

圖14示出了本發明實施例9中RNA奈米顆粒在Coomassie Blue程式下，在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖15示出了本發明實施例9中RNA奈米顆粒在Stain Free Gel程式下，在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖16示出了本發明實施例10中不同奈米顆粒的HepG2細胞增殖情況檢測結果；

圖17示出了本發明實施例11中7組延長段變形+核心短序列RNA自組裝產物的非變性PAGE膠電泳檢測結果；

圖18示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-15的溶解曲線；

圖19示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-16的溶解曲線；

圖20示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-17的溶解曲線；

圖21示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-18的溶解曲線；

圖22示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-19的溶解曲線；

圖23示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-20的溶解曲線；

圖24示出了本發明實施例11中RNA奈米顆粒R-21的溶解曲線；

圖25示出了本發明實施例12中7組延長段變形+核心短序列DNA自組裝產物的非變性PAGE膠電泳檢測結果；

圖26示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-8的溶解曲線；

圖27示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-9的溶解曲線；

圖28示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-10的溶解曲線；

圖28示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-11的溶解曲線；

圖30示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-12的溶解曲線；

圖31示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-13的溶解曲線；

圖32示出了本發明實施例12中DNA奈米顆粒D-14的溶解曲線；

圖33示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-15在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖34示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-16在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖35示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-17在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖36示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-18在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖37示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-19在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖38示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-20在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖39示出了本發明實施例13中RNA奈米顆粒R-21在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖40示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-8在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖41示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-9在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖42示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-10在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖43示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-11在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖44示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-12在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖45示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-13在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖46示出了本發明實施例14中DNA奈米顆粒D-14在血清中培養不同時間後的電泳檢測結果；

圖47a、圖47b、圖47c、圖47d、圖47e、圖47f、圖47g、圖47h分別示出了本發明實施例17中DMSO和原藥阿霉素、D-8和D-8-阿霉素、D-9和D-9-阿霉素、D-10和D-10-阿霉素、D-11和D-11-阿霉素、D-12和D-12-阿霉素、D-13和D-13-阿霉素、D-14和D-14-阿霉素所對應的細胞存活率曲線；

圖48示出了實施例18的掛載率檢測過程中採用的柔紅霉素吸光度的標準曲線。

Claims

一種核酸奈米顆粒，所述核酸奈米顆粒具有核酸結構域，所述核酸結構域包含a序列、b序列和c序列；所述a序列包含a1序列或者所述a1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，所述b序列包含b1序列或者所述b1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列，所述c序列包含c1序列或者所述c1序列發生至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列；其中，所述a1序列為SEQ ID NO:1：5’-CCAGCGUUCC-3’或者SEQ ID NO:2：5’-CCAGCGTTCC-3’；所述b1序列為SEQ ID NO:3：5’-GGUUCGCCG-3’或者SEQ ID NO:4：5’-GGTTCGCCG-3’；所述c1序列為SEQ ID NO:5：5’-CGGCCAUAGCGG-3’ 或者SEQ ID NO:6：5’-CGGCCATAGCGG-3’。
如請求項1所述之核酸奈米顆粒，其中，所述a1序列為SEQ ID NO:1，所述b1序列為SEQ ID NO:3，所述c1序列為SEQ ID NO:5時，所述a序列、所述b序列、所述c序列中的至少一個序列包含至少一個鹼基插入、缺失或替換的序列。
如請求項1或2所述之核酸奈米顆粒，其中，所述鹼基插入、缺失或替換發生在： (1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的5’端起始的第1、2、4或5位鹼基上；和/或 (2)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的5’端起始的第8~10位鹼基之間；和/或 (3)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列的5’端起始的第1~3位鹼基之間；和/或 (4)SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示的序列的5’端起始的第6~9位鹼基之間；和/或 (5)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的序列的5’端起始的第1~4位鹼基之間；和/或 (6)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的序列的5’端起始的第9~12位鹼基之間。
如請求項1或2所述之核酸奈米顆粒，其中，所述a序列、b序列和c序列自組裝成式(1)所示結構：
………..式(1)，其中，W-C表示Watson-Crick配對，N和N’表示非Watson-Crick配對，任一位置的W-C各自獨立地選自C-G或G-C；在所述a序列中，從5’端起的第一個N為A，第二個N為G，第三個N為U或T，第四個N為U、T、A、C或G中的任意一個；在所述b序列中，從5’端起的第一個N’為U、T、A、C或G中的任意一個；第二個N’為U或T，第三個N’為C；在所述c序列中，沿5’端至3’ 端方向上的NNNN序列為CAUA或CATA。
如請求項4所述之核酸奈米顆粒，其中，所述a序列、b序列和c序列為如下任意一組： (1) a序列：5'-GGAGCGUUGG-3'， b序列：5'-CCUUCGCCG-3'， c序列：5'-CGGCCAUAGCCC-3'； (2) a序列：5'-GCAGCGUUCG-3'， b序列：5'-CGUUCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCAUAGCGC-3'； (3) a序列：5'-CGAGCGUUGC -3'， b序列：5'-GCUUCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCAUAGCCG -3'； (4) a序列：5'-GGAGCGUUGG -3'， b序列：5'-CCUUCGGGG -3'， c序列：5'-CCCCCAUAGCCC -3'； (5) a序列：5'-GCAGCGUUCG -3'， b序列：5'-CGUUCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCAUAGCGC -3'； (6) a序列：5'-GCAGCGUUCG -3'， b序列：5'-CGUUCGGCC -3'， c序列：5'-GGCCCAUAGCGC -3'； (7) a序列：5'-CGAGCGUUGC -3'， b序列：5'-GCUUCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCAUAGCCG -3'； (8) a序列：5'-GGAGCGTTGG-3'， b序列：5'-CCTTCGCCG-3'， c序列：5'-CGGCCATAGCCC-3'； (9) a序列：5'-GCAGCGTTCG-3'， b序列：5'-CGTTCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCATAGCGC-3'； (10) a序列：5'-CGAGCGTTGC -3'， b序列：5'-GCTTCGCCG -3'， c序列：5'-CGGCCATAGCCG -3'； (11) a序列：5'-GGAGCGTTGG -3'， b序列：5'-CCTTCGGGG -3'， c序列：5'-CCCCCATAGCCC -3'； (12) a序列：5'-GCAGCGTTCG -3'， b序列：5'-CGTTCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCATAGCGC -3'； (13) a序列：5'-GCAGCGTTCG -3'， b序列：5'-CGTTCGGCC -3'， c序列：5'-GGCCCATAGCGC -3'； (14) a序列：5'-CGAGCGTTGC -3'， b序列：5'-GCTTCGGCG -3'， c序列：5'-CGCCCATAGCCG -3'。
如請求項4所述之核酸奈米顆粒，其中，所述核酸結構域還包括第一延長段，所述第一延長段為Watson-Crick配對的延長段，所述第一延長段位於所述a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端；較佳地，所述第一延長段至少選自如下任意一組： (1)：a鏈5'端：5'-CCCA-3'，c鏈3'端：5'-UGGG-3'； (2)：a鏈3'端：5'-GGG-3'，b鏈5'端：5'-CCC-3'； (3)：b鏈3'端：5'-CCA-3'，c鏈5'端：5'-UGG-3'； (4)：a鏈5'端：5'-CCCG-3'，c鏈3'端：5'-CGGG-3'； (5)：a鏈5'端：5'-CCCC-3'，c鏈3'端：5'-GGGG-3'； (6)：b鏈3'端：5'-CCC-3'，c鏈5'端：5'-GGG-3'； (7)：b鏈3'端：5'-CCG-3'，c鏈5'端：5'-CGG-3'； (8)：a鏈5'端：5'-CCCA-3'，c鏈3'端：5'-TGGG-3'； (9)：b鏈3'端：5'-CCA-3'，c鏈5'端：5'-TGG-3'。
如請求項1至6中任一項所述之核酸奈米顆粒，其中，所述核酸結構域還包括第二延長段，所述第二延長段位於所述a序列、b序列和c序列中任一序列的5’端和/或3’端，所述第二延長段為Watson-Crick配對的延長段；較佳地，所述第二延長段為CG鹼基對的延長序列；更佳，所述第二延長段為1~10個CG鹼基對的延長序列。
如請求項7所述之核酸奈米顆粒，其中，所述核酸結構域還包括如下至少一組第二延長段：第一組：a鏈5’端：5’-CGCGCG-3’，c鏈3’端：5’-CGCGCG-3’；第二組：a鏈3’端：5’-CGCCGC-3’，b鏈5’端：5’-GCGGCG-3’；第三組：b鏈3’端：5’-GGCGGC-3’，c鏈5’端：5’-GCCGCC-3’。
如請求項7所述之核酸奈米顆粒，其中，所述第二延長段為同時含有CG鹼基對和AT/AU鹼基對的延長序列，較佳所述第二延長段為2~50個鹼基對的延長序列。
如請求項9所述之核酸奈米顆粒，其中，所述第二延長段為連續2~8個CG鹼基對的序列與連續2~8個AT/AU鹼基對序列交替設置的延長序列；或者所述第二延長段為1個CG鹼基對的序列與1個AT/AU鹼基對序列交替設置的延長序列。
如請求項1至10中任一項所述之核酸奈米顆粒，其中，所述a序列、b序列和c序列中鹼基、核糖和磷酸酯具有至少一個可修飾位點，任一所述可修飾位點通過以下任意一種修飾接頭進行修飾：-F、甲基、氨基、二硫化物、羰基、羧基、巰基及醛基；較佳地，所述a序列、b序列和c序列中的C或U鹼基上具有2’-F修飾。
如請求項1至11中任一項所述之核酸奈米顆粒，其中，所述核酸奈米顆粒還包括生物活性物質，所述生物活性物質與所述核酸結構域相連。
如請求項12所述之核酸奈米顆粒，其中，所述核酸結構域的相對分子量與所述生物活性物質的總相對分子量之比≥1:1；較佳地，所述生物活性物質為靶頭、螢光素、干擾核酸siRNA、miRNA、核酶、核糖開關、適體、RNA抗體、藥物、蛋白、多肽、類黃酮、葡萄糖、天然水楊酸、單抗、維生素、酚類以及卵磷脂中的一種或多種。
如請求項13所述之核酸奈米顆粒，其中，所述生物活性物質為所述靶頭、所述螢光素以及所述miRNA，其中，所述靶頭位於所述a序列、所述b序列、所述c序列中任一序列上，較佳所述a序列、所述b序列、所述c序列中任一序列的5’端或3’端，或嵌插於所述核酸結構域的GC鍵之間，所述miRNA為抗miRNA，所述螢光素修飾於所述抗miRNA的5’端或3’端，所述miRNA位於所述a序列的3’端、所述c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置；較佳地，所述靶頭為葉酸或生物素，所述螢光素為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種，所述抗miRNA為抗miR-21。
如請求項13所述之核酸奈米顆粒，其中，所述藥物為治療肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、黑色素瘤、白血病、老年癡呆、強直性脊柱炎、惡性淋巴瘤、支氣管癌、類風濕關節炎、HBV乙肝、多發性骨髓瘤、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌、食道癌、口腔癌、紅斑狼瘡的藥物；較佳地，所述頭頸癌為腦癌、神經母細胞瘤或膠質母細胞瘤。
如請求項13所述之核酸奈米顆粒，其中，所述藥物為含有如下任意一種或多種基團的藥物：氨基基團、羥基基團、羧基基團、巰基基團、苯環基團以及乙醯氨基基團。
如請求項13所述之核酸奈米顆粒，其中，所述蛋白為SOD、生存素、hTERT、 EGFR及PSMA的抗體或適配體中的一種或多種；所述維生素為左旋C和/或酯化C；所述酚類為茶多酚和/或葡萄多酚。
如請求項12所述之核酸奈米顆粒，其中，所述生物活性物質通過如下任一方式與所述核酸結構域相連：方式一：物理嵌插；方式二：共價連接。
如請求項18所述之核酸奈米顆粒，其中，所述生物活性物質與所述核酸結構域以物理嵌插方式相連時，所述生物活性物質與所述核酸結構域按照1~200：1的莫耳比進行物理嵌插。
如請求項19所述之核酸奈米顆粒，其中，所述生物活性物質與所述核酸結構域以物理嵌插方式與共價連接方式相連時，所述物理嵌插方式連接的生物活性物質與所述共價連接方式連接的藥物的莫耳比為1~200：1。
如請求項18所述之核酸奈米顆粒，其中，所述共價連接方式連接的生物活性物質通過溶劑共價連接、linker共價連接或點擊鏈接；較佳地，所述溶劑選自多聚甲醛、DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS或冰醋酸；較佳地，所述linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG；較佳地，所述點擊鏈接是在對生物活性物質前體和所述核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，然後通過點擊鏈接。
如請求項21所述之核酸奈米顆粒，其中，所述生物活性物質與所述核酸結構域以點擊鏈接的方式相連時，所述生物活性物質前體進行炔基或疊氮修飾的位點選自2’羥基、羧基或氨基，所述核酸結構域進行炔基或疊氮修飾的位點選自G環外氨基、2’-羥基、A氨基或2’-羥基。
如請求項1所述之核酸奈米顆粒，其中，所述核酸奈米顆粒的粒徑為1~100nm，較佳為5~50nm；更佳10~30nm；進一步較佳10~15 nm。
一種藥物組合物，所述藥物組合物包括請求項1至23中任一項所述之核酸奈米顆粒。
一種含阿霉素的藥物，所述含阿霉素的藥物包括阿霉素及請求項1至12中任一項或請求項23所述之核酸奈米顆粒。
如請求項25所述之含阿霉素的藥物，其中，阿霉素通過物理連接和/或共價連接的形式掛載在所述核酸奈米顆粒上，且阿霉素與所述核酸奈米顆粒之間的莫耳比為2~300:1，較佳為10~50:1，更佳為15~25:1。
如請求項25所述之含阿霉素的藥物，其中，所述核酸奈米顆粒還包括生物活性物質，所述生物活性物質與所述核酸結構域相連，所述生物活性物質為靶頭、螢光素、干擾核酸siRNA、miRNA、核酶、核糖開關、適體、RNA抗體、蛋白、多肽、類黃酮、葡萄糖、天然水楊酸、單抗、維生素、酚類卵磷脂以及除阿霉素以外的小分子藥物中的一種或多種。
如請求項27所述之含阿霉素的藥物，其中，將所述核酸結構域的相對分子量記為N₁ ，將阿霉素與所述生物活性物質的總相對分子量記為N₂ ，N₁ / N₂ ≥1:1。
如請求項27所述之含阿霉素的藥物，其中，所述生物活性物質為所述靶頭、所述螢光素以及所述miRNA中的一種或多種，其中，所述靶頭位於所述a序列、所述b序列、所述c序列中任一序列上，較佳所述a序列、所述b序列、所述c序列中任一序列的5’端或3’端，或嵌插於所述核酸結構域的GC鍵之間，所述miRNA為抗miRNA，所述螢光素修飾於所述抗miRNA的5’端或3’端，所述miRNA位於所述a序列的3’端、所述c序列的5’端和3’端中的任意一個或多個位置；較佳地，所述靶頭為葉酸或生物素，所述螢光素為FAM、CY5及CY3中的任意一種或多種，所述抗miRNA為抗miR-21。
如請求項27所述之含阿霉素的藥物，其中，所述除阿霉素以外的小分子藥物為含有如下任意一種或多種基團的藥物：氨基基團、羥基基團、羧基基團、巰基基團、苯環基團以及乙醯氨基基團。
如請求項27所述之含阿霉素的藥物，其中，所述蛋白為SOD、生存素、hTERT及EGFR、PSMA中的一種或多種；所述維生素為左旋C和/或酯化C；所述酚類為茶多酚和/或葡萄多酚。
一種含阿霉素的藥物的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：提供請求項1至12中任一項所述之核酸奈米顆粒；及通過物理連接和/或共價連接的方式將阿霉素掛載在所述核酸奈米顆粒上，得到所述含阿霉素的藥物。
如請求項32所述之製備方法，其中，通過物理連接的方式掛載阿霉素的步驟包括：將阿霉素、所述核酸奈米顆粒及第一溶劑混合並攪拌，得到預混體系；去除所述預混體系中的游離物質，得到所述含阿霉素的藥物；較佳地，所述第一溶劑選自DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種；較佳地，去除所述預混體系中的游離物質的步驟包括：將所述預混體系與無水乙醇混合，在低於10℃的溫度條件下析出所述含阿霉素的藥物；更佳在0~5℃溫度條件下析出所述含阿霉素的藥物。
如請求項32所述之製備方法，其中，通過共價連接的方式掛載阿霉素的步驟包括：配置阿霉素溶液；使所述阿霉素溶液在甲醛的介導作用下與所述核酸奈米顆粒的G環外氨基進行反應，得到反應體系；提純所述反應體系，得到所述含阿霉素的藥物；較佳地，所述反應的步驟包括：將所述阿霉素溶液與多聚甲醛溶液、所述核酸奈米顆粒混合，在避光條件下進行反應，得到所述反應體系；其中較佳所述多聚甲醛溶液的濃度較佳為3.7~4wt%，較佳所述多聚甲醛溶液為多聚甲醛和第二溶劑混合形成的溶液，且所述第二溶劑為DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種。
如請求項32至35中任一項所述之製備方法，其中，所述製備方法還包括製備所述核酸奈米顆粒的步驟，其包括：通過將請求項1至12中任一項所述之核酸奈米顆粒中的所述核酸結構域對應的單鏈進行自組裝，得到所述核酸結構域；較佳地，在得到所述核酸結構域之後，所述製備方法還包括：將請求項13至17中任一項所述之生物活性物質通過物理連接和/或共價連接的方式掛載在所述核酸結構域上，進而得到所述核酸奈米顆粒，其中，所述生物活性物質中的藥物為除阿霉素之外的小分子藥物。
如請求項34所述之製備方法，其中，通過共價連接的方式掛載所述生物活性物質的過程中，通過溶劑共價連接、linker共價連接或點擊鏈接進行掛載；較佳地，所述溶劑共價連接中採用的第三溶劑作為連接介質，且所述第三溶劑選自多聚甲醛、DCM、DCC、DMAP、Py、DMSO、PBS及冰醋酸中的一種或多種；較佳地，所述linker選自二硫鍵、對苯疊氮基、溴丙炔或PEG；較佳地，所述點擊鏈接是在對生物活性物質前體和所述核酸結構域同時進行炔基或疊氮修飾，然後通過點擊鏈接。
如請求項35所述之製備方法，其中，所述生物活性物質與所述核酸結構域以點擊鏈接的方式相連時，所述生物活性物質前體進行炔基或疊氮修飾的位點選自2’羥基、羧基或氨基，所述核酸結構域進行炔基或疊氮修飾的位點選自G環外氨基、2’-羥基、A氨基或2’-羥基。