KR20210031494A - 핵산 나노입자, 이를 포함하는 약물 조성물, 독소루비신 함유 약물 및 그 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산 나노입자, 이를 포함하는 약물 조성물, 독소루비신 함유 약물 및 그 제조 방법을 제공한다. 상기 핵산 나노입자는 핵산 구조적 도메인을 구비하고, 핵산 구조적 도메인은 a 서열, b 서열 및 c 서열을 포함하며, a 서열은 a1 서열 또는 a1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하고, b 서열은 b1 서열 또는 상기 b1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하며, c 서열은 c1 서열 또는 상기 c1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함한다. 상기 핵산 나노입자는 상기 3 스트랜드 서열 또는 그 변이 서열을 포함하여, 자기조립을 통해 핵산 구조적 도메인을 형성할 수 있을 뿐만 아니라 벡터로 작용할 수도 있다. 벡터로 작용 시 핵산 약물을 탑재 및 전달할 수 있을 뿐만 아니라 화학적 약물 등 다른 생체 활성 물질의 탑재 및 전달에도 마찬가지로 적용될 수 있기에 상대적 보편성을 구비한다.
Description
본 발명은 전달 벡터 분야에 관한 것이고, 구체적으로 핵산 나노입자, 이를 포함하는 약물 조성물, 독소루비신 함유 약물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
암은 인간의 건강을 위협하는 가장 중요한 질병이 되었으며, 세포 표적 약물 투여, 유전자 요법, RNAi 등은 모두 암과의 싸움에서 가장 앞선 연구 분야이다. 그러나 많은 항암제는 물에 잘 녹지 않거나 안정성이 떨어지는 등의 결함이 있다. 예를 들어, 독소루비신 등은 용해도가 낮기 때문에 유기체에서 잘 이용되기가 어렵기에 그 수용성 문제를 해결하는 것이 이러한 약물 제제의 임상 적용의 핵심이다. 또한 종양 치료 및 진단 약물의 작용은 대부분 비 선택적이며 일반적으로 치료 용량에서 정상 조직 및 장기에 큰 독성 부작용이 있다. 많은 단백질계 물질의 전달과 마찬가지로 핵산계 물질이 위장관에서의 분해 및 낮은 생체 이용률은 siRNA의 경구 전달에 대한 주요 장애물이다. 정맥 내 전달의 경우에도 기존의 siRNA는 혈청 인자에 의해 빠르게 분해되어 표적 위치에 도달할 수 없다.
약물의 활성 성분은 종종 병변 부위에 효과적으로 도달하지 못하거나 정상 세포 및 조직에 과도하게 작용하여 치료 목적을 달성하지 못하거나 독성 부작용을 일으킨다. 예를 들어 난소암, 소세포 폐암, 고환암, 두경부 편평 세포암, 자궁 경부암, 비소세포 폐암, 방광암, 흉막중피종, 흑색종 및 자궁내막암의 화학 요법에서 널리 사용되는 백금 약물이 일반적이다. 그러나 백금 기반 약물은 표적화가 좋지 못하고 일반적인 약물 용량으로는 치료 효과를 얻을 수 없으며 과다 복용하면 또 약물이 정상 세포와 조직에 다량 작용하여 화학 요법 후 인체에서 골수 억제, 위장관 반응, 신 독성 및 신경 독성을 유발하여 백금 화학 요법 약물의 사용이 제한된다.
약물의 활성 성분의 표적화가 좋지 않아 생기는 부작용을 완화하기 위해 약물 전달 벡터가 등장했으며, 그 주요 역할은 약물을 탑재하고 활성 성분을 혈액이나 조직 세포로 운반하여 질병을 치료하는 것이다. 예를 들어, 암의 화학 요법 치료에서 전달 벡터는 화학 요법 약물을 암세포 내로 전달하여 약물의 활성 성분이 암세포 내의 DNA와 상호 작용하여 종양에 대한 억제 효과를 갖도록 한다. 현재 일반적으로 사용되는 백금 화학 요법 약물 전달 벡터에는 리포솜, 미셀, 나노 캡슐, 폴리머-백금 접합체 및 탄소 나노 튜브가 포함된다.
또한 다양한 약물의 표적 전달을 달성하기 위한 다양한 방법이 이미 있다. 그것은 유전자 총, 전기 천공기 등과 같은 도구 또는 기기로 실현될 수 있다. 이러한 방법은 유전자 벡터를 사용할 필요가 없지만 일반적으로 형질 감염 효율이 매우 낮고 작업이 복잡하며 조직 손상도 상대적으로 크다. 또한 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 등과 같은 바이러스성 벡터에 의해 개재된다. 바이러스성 벡터는 시험관 내에서 높은 형질 감염 활성을 갖지만 그 면역원성이 돌연변이를 쉽게 일으키는 단점은 생체 내 전달에 큰 안전 위험을 가져온다. 이밖에 비 바이러스성 벡터, 특히 생분해성 고분자 물질도 표적 약물 전달이 가능하다. 비 바이러스성 벡터의 장점은 예상되는 형질 감염 활성을 보장하는 조건에서 바이러스성 벡터에 의해 유발되는 면역원성과 많은 염증 반응을 크게 줄일 수 있다는 것이다.
상기 다중 표적 운반 방법 중 현재 비 바이러스성 벡터 분야에 더 많은 연구가 집중되고 있으며, 일반적으로 벡터 디자인이다. (a) 양이온성 리포솜; (b) 다가 양이온 유전자 벡터 등이다. 현재 더 많은 연구가 다가 양이온성 유전자 벡터와 양이온성 리포솜의 변형에 초점을 맞추고 있으며, 이를 통해 유전 물질의 표적 전달에 적용된다. 양이온성 리포솜은 체내 및 체외에서 높은 형질 감염 활성을 가지고 있지만, 표면의 양전하는 체내 정상 분포에 영향을 미치며, 동시에 양이온성 지질은 동물 실험에서 면역원성과 염증을 일으킬 수 있다. 다가 양이온성 유전자 운반체의 개발은 이미 상대적으로 성숙하지만 구조 설계 상 구조의 표면에 표적 그룹이 존재하는지 확인하기 어렵고 자체 설계 상 독성과 형질 감염 활성 사이에 모순이 존재함과 동시에 생체 내 무독성 분해를 달성하기 어렵다. 그러나 상술한 바와 같이 기존의 비 바이러스성 벡터에 대한 연구는 핵산 약물에 더 초점을 맞추고 있으며, 비 핵산 약물의 전달 효과에 대한 가치있는 보고가 없음을 알 수 있다.
따라서 신뢰할 수 있는 약물 벡터를 제공하는 것은 현재 약물의 제한된 임상 적용을 해결하는 열쇠이다.
본 발명의 주요한 목적은 현재 약물의 제한된 임상 적용을 해결하는 신뢰할 수 있는 약물 베터를 제공하기 위해, 핵산 나노입자, 이를 포함하는 약물 조성물, 독소루비신 함유 약물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면 핵산 나노입자를 제공하고, 이는 핵산 구조적 도메인(nucleic acid structural domain)을 구비하고, 핵산 구조적 도메인은 a 서열, b 서열 및 c 서열을 포함하며, a 서열은 a1 서열 또는 a1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입(base insertion), 결손(deletion) 또는 대체(substitution)가 발생한 서열을 포함하고, b 서열은 b1 서열 또는 b1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하며, c 서열은 c1 서열 또는 c1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하고; a1 서열은 서열번호 1: 5'-CCAGCGUUCC-3' 또는 서열번호 2: 5'-CCAGCGTTCC-3'이며; b1 서열은 서열번호 3: 5'-GGUUCGCCG-3' 또는 서열번호 4: 5'-GGTTCGCCG-3'이고; c1 서열은 서열번호 5: 5'-CGGCCAUAGCGG-3' 또는 서열번호 6: 5'-CGGCCATAGCGG-3'이다.
또한, a1 서열은 서열번호 1이고, b1 서열은 서열번호 3이며, c1 서열은 서열번호 5일 경우, a 서열, b 서열, c 서열 중의 적어도 하나의 서열은 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체된 서열을 포함한다.
또한, 염기 삽입, 결손 또는 대체는
(1) 서열번호 1 또는 서열번호 2 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1, 2, 4 또는 5 부위 염기; 및/또는
(2) 서열번호 1 또는 서열번호 2 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제8 내지 10 부위 염기 사이; 및/또는
(3) 서열번호 3 또는 서열번호 4 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1 내지 3 부위 염기 사이; 및/또는
(4) 서열번호 3 또는 서열번호 4 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제6 내지 9 부위 염기 사이; 및/또는
(5) 서열번호 5 또는 서열번호 6 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1 내지 4 부위 염기 사이; 및/또는
(6) 서열번호 5 또는 서열번호 6 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제9 내지 12 부위 염기 사이에서 발생한다.
또한, a 서열, b 서열 및 c 서열은 자기조립을 거쳐 식 (1)로 표시되는 구조를 이루고,
식에서 W-C는 Watson-Crick 페어링을 지시하고, N 및 N'는 비 Watson-Crick 페어링을 지시하며, 임의의 위치의 W-C는 각각 독립적으로 C-G 또는 G-C에서 선택되고; a 서열에서, 5' 말단으로부터 첫 번째 N은 A이고, 두 번째 N은 G이며, 세 번째 N은 U 또는 T이고, 네 번째 N은 U, T, A, C 또는 G 중 어느 하나이며; b 서열에서, 5' 말단으로부터 첫 번째 N'은 U, T, A, C 또는 G 중 어느 하나이고; 두 번째 N'은 U 또는 T, 세 번째 N'은 C이며; c 서열에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로의 방향에서 NNNN 서열은 CAUA 또는 CATA이다.
또한, a 서열, b 서열 및 c 서열은
(1) a 서열: 5'-GGAGCGUUGG-3',
b 서열: 5'-CCUUCGCCG-3',
c 서열: 5'-CGGCCAUAGCCC-3';
(2) a 서열: 5'-GCAGCGUUCG-3',
b 서열: 5'-CGUUCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCAUAGCGC-3';
(3) a 서열: 5'-CGAGCGUUGC -3',
b 서열: 5'-GCUUCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCAUAGCCG -3';
(4) a 서열: 5'-GGAGCGUUGG -3',
b 서열: 5'-CCUUCGGGG -3',
c 서열: 5'-CCCCCAUAGCCC -3';
(5) a 서열: 5'-GCAGCGUUCG -3',
b 서열: 5'-CGUUCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCAUAGCGC -3';
(6) a 서열: 5'-GCAGCGUUCG -3',
b 서열: 5'-CGUUCGGCC -3',
c 서열: 5'-GGCCCAUAGCGC -3';
(7) a 서열: 5'-CGAGCGUUGC -3',
b 서열: 5'-GCUUCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCAUAGCCG -3';
(8) a 서열: 5'-GGAGCGTTGG-3',
b 서열: 5'-CCTTCGCCG-3',
c 서열: 5'-CGGCCATAGCCC-3';
(9) a 서열: 5'-GCAGCGTTCG-3',
b 서열: 5'-CGTTCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCATAGCGC-3';
(10) a 서열: 5'-CGAGCGTTGC -3',
b 서열: 5'-GCTTCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCATAGCCG -3';
(11) a 서열: 5'-GGAGCGTTGG -3',
b 서열: 5'-CCTTCGGGG -3',
c 서열: 5'-CCCCCATAGCCC -3';
(12) a 서열: 5'-GCAGCGTTCG -3',
b 서열: 5'-CGTTCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCATAGCGC -3';
(13) a 서열: 5'-GCAGCGTTCG -3',
b 서열: 5'-CGTTCGGCC -3',
c 서열: 5'-GGCCCATAGCGC -3';
(14) a 서열: 5'-CGAGCGTTGC -3',
b 서열: 5'-GCTTCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCATAGCCG -3' 중 어느 하나이다.
또한, 핵산 구조적 도메인은 제1 연장 구간을 더 포함하고, 제1 연장 구간은Watson-Crick 페어링의 연장 구간이며, 제1 연장 구간은 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하고; 제1 연장 구간은
(1): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCA-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-UGGG-3'; (2): a 스트랜드 3' 말단: 5'-GGG-3', b 스트랜드 5' 말단: 5'-CCC-3'; (3): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCA-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-UGG-3'; (4): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCG-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-CGGG-3'; (5): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCC-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-GGGG-3'; (6): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCC-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-GGG-3'; (7): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCG-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-CGG-3'; (8): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCA-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-TGGG-3'; (9): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCA-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-TGG-3'에서 선택된다.
또한, 핵산 구조적 도메인은 제2 연장 구간을 더 포함하고, 제2 연장 구간은 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하며, 제2 연장 구간은 Watson-Crick 페어링의 연장 구간이고; 바람직하게는, 제2 연장 구간은 CG 염기쌍의 연장 서열이며; 더 바람직하게는, 제2 연장 구간은 1 내지 10개 CG 염기쌍의 연장 서열이다.
또한, 핵산 구조적 도메인은 제1 그룹: a 스트랜드 5' 말단: 5'-CGCGCG-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-CGCGCG-3'; 제2 그룹: a 스트랜드 3' 말단: 5'-CGCCGC-3', b 스트랜드 5' 말단: 5'-GCGGCG-3'; 제3 그룹: b 스트랜드 3' 말단: 5'-GGCGGC-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-GCCGCC-3' 중 적어도 하나의 제2 연장 구간을 더 포함한다.
또한, 제2 연장 구간은 CG 염기쌍 및 AT/AU 염기쌍의 연장 서열을 동시에 함유하고, 바람직하게는 제2 연장 구간은 2 내지 50개 염기쌍의 연장 서열이다.
또한, 제2 연장 구간은 연속 2 내지 8개 CG 염기쌍의 서열과 연속 2 내지 8개 AT/AU 염기쌍의 서열이 번갈아 형성된 연장 서열이거나; 또는 제2 연장 구간은 1개 CG 염기쌍의 서열과 1개 AT/AU 염기쌍의 서열이 번갈아 형성된 연장 서열이다.
또한, a 서열, b 서열 및 c 서열에서 염기, 리보스 및 인산에스테르는 적어도 하나의 변형 가능 부위(modifiable site)를 구비하고, 임의의 변형 가능 부위는 -F, 메틸기, 아미노기, 이황화물, 카보닐기, 카복실기, 머캅토기 및 알데하이드기(-F, methyl, amino, disulfide, carbonyl, carboxyl, sulfhydryl and formyl) 중 어느 하나의 변형 어댑터(modified adaptor)를 통해 변형되며; 바람직하게는, a 서열, b 서열 및 c 서열 중의 C 또는 U 염기는 2'-F 변형을 구비한다.
또한, 핵산 나노입자는 생체 활성 물질을 더 포함하고, 생체 활성 물질은 핵산 구조적 도메인에 연결된다.
또한, 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량과 생체 활성 물질의 총 상대 분자량 비율 ≥ 1:1이고; 바람직하게는, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인, 간섭 핵산 siRNA, miRNA, 리보자임, 리보스위치, 압타머, RNA 항체, 약물, 단백질, 폴리펩타이드, 플라보노이드, 포도당, 천연 살리실산, 단클론 항체, 비타민, 페놀계 및 레시틴(target head, a fluorescein, an interfering nucleic acid siRNA, a miRNA, a ribozyme, a riboswitch, an aptamer, a RNA antibody, a drug, a protein, a polypeptide, a flavonoid, a glucose, a natural salicylic acid, a monoclonal antibody, a vitamin, an phenol and a lecithin) 중의 하나 또는 다수이다.
또한, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인 및 miRNA이고, 타겟 헤드는 a, b, c 서열에서 임의의 서열에 위치하고, 바람직하게는 a, b, c 중 임의의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 핵산 구조적 도메인에 인터칼레이션된 GC 결합 사이에 위치하며, miRNA는 항 miRNA이고, 플루오레세인은 항 miRNA의 5' 말단 또는 3' 말단에 변형되고, miRNA는 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 위치하며; 바람직하게는, 타겟 헤드는 엽산 또는 비오틴이고, 플루오레세인은 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수이며, 항 miRNA는 항 miR-21이다.
또한, 약물은 간암, 위암, 폐암, 유선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 흑색종, 백혈병, 노인성 치매, 강직성 척추염, 악성 림파종, 기관지암, 류마티스 관절염, HBV B형 간염, 다발성 골수종, 췌장암, 비소세포폐암, 전립선암, 비인두암, 식도암, 구강암, 홍반성 낭창(liver cancer, gastric cancer, lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, melanoma, leukemia, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, malignant lymphoma, bronchial cancer, rheumatoid arthritis, HBV hepatitis B, multiple myeloma, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, oral cancer, lupus erythematosus)을 치료하기 위한 약물이고; 바람직하게는, 두경부암은 뇌암, 신경모 세포종 또는 교모 세포종(glioblastoma multiforme)이다.
또한, 약물은 아미노기 그룹, 하이드록실기 그룹, 카복실기 그룹, 머캅토기 그룹, 벤젠 고리 그룹 및 아세트아미노기 그룹(an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a mercapto group, a benzene ring group and an acetamido group) 중 어느 하나 또는 다수의 그룹을 함유하는 약물이다.
또한, 단백질은 SOD, 서바이빈(Survivin), hTERT, EGFR 및 PSMA의 항체 또는 압타머 중의 하나 또는 다수이고; 비타민은 L-Vc 및/또는 에스테르-C이며; 페놀계는 차 폴리페놀 및/또는 포도 폴리페놀이다.
또한, 생체 활성 물질은 방식 1: 물리적 인터칼레이션; 방식 2: 공유 결합 연결 중 어느 하나의 방식을 통해 핵산 구조적 도메인과 연결된다.
또한, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식으로 연결될 경우, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인은 1 내지 200: 1의 몰비로 물리적 인터칼레이션된다.
또한, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식과 공유 결합 연결 방식으로 연결될 경우, 물리적 인터칼레이션 방식으로 연결된 생체 활성 물질과 공유 결합 연결 방식으로 연결된 약물의 몰비는 1 내지 200: 1이다.
또한, 공유 결합 연결 방식으로 연결된 생체 활성 물질은 용매 공유 결합 연결, 링커 공유 결합 연결 또는 클릭 연결을 진행하고; 바람직하게는, 용매는 파라포름알데하이드, DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 또는 빙초산에서 선택되며; 바람직하게는, 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기(p-phenylazide), 프로파르길 브로마이드(propargyl bromide) 또는 PEG에서 선택되고; 바람직하게는, 클릭 연결은 생체 활성 물질 전구체 및 핵산 구조적 도메인에 대해 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행한 다음 클릭 연결을 진행한다.
또한, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 클릭 연결 방식으로 연결될 경우, 생체 활성 물질 전구체가 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 2'하이드록실기, 카복실기 또는 아미노기에서 선택되고, 핵산 구조적 도메인이 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 G 환외 아미노기, 2'-하이드록실기, A아미노기 또는 2'-하이드록실기에서 선택된다.
또한, 핵산 나노입자의 입경은 1 내지 100㎚, 바람직하게는 5 내지 50㎚; 더 바람직하게는 10 내지 30㎚; 보다 더 바람직하게는 10 내지 15㎚이다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면 상기 핵산 나노입자를 포함하는 약물 조성물을 더 제공한다.
본 발명의 세 번째 측면에 따르면 독소루비신 및 전술한(생체 활성 물질이 탑재되지 않은) 핵산 나노입자를 포함하는 독소루비신 함유 약물을 더 제공한다.
또한, 독소루비신은 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 형식으로 핵산 나노입자에 탑재되고, 독소루비신과 핵산 나노입자 사이의 몰비는 2 내지 300:1, 바람직하게는 10 내지 50:1, 더 바람직하게는 15 내지 25:1이다.
또한, 핵산 나노입자는 생체 활성 물질을 더 포함하고, 생체 활성 물질은 핵산 구조적 도메인에 연결되며, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인, 간섭 핵산 siRNA, miRNA, 리보자임, 리보스위치, 압타머, RNA 항체, 단백질, 폴리펩타이드, 플라보노이드, 포도당, 천연 살리실산, 단클론 항체, 비타민, 페놀계레시틴 및 독소루비신을 제외한 소분자 약물 중의 하나 또는 다수이다.
또한, 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량을 N1라고 하고, 독소루비신과 생체 활성 물질의 총 상대 분자량을 N2라고 하면, N1/N2 ≥ 1:1이다.
또한, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인 및 miRNA 중의 하나 또는 다수이고, 타겟 헤드는 a, b, c 서열에서 임의의 서열에 위치하고, 바람직하게는 a, b, c 중 임의의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 핵산 구조적 도메인에 인터칼레이션된 GC 결합 사이에 위치하며, miRNA는 항 miRNA이고, 플루오레세인은 항 miRNA의 5' 말단 또는 3' 말단에 변형되고, miRNA는 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 위치하며; 바람직하게는, 타겟 헤드는 엽산 또는 비오틴이고, 플루오레세인은 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수이며, 항 miRNA는 항 miR-21이다.
또한, 독소루비신을 제외한 소분자 약물은 아미노기 그룹, 하이드록실기 그룹, 카복실기 그룹, 머캅토기 그룹, 벤젠 고리 그룹 및 아세트아미노기 그룹 중 어느 하나 또는 다수의 그룹을 함유하는 약물이다.
또한, 단백질은 SOD, Survivin, hTERT 및 EGFR, PSMA 중의 하나 또는 다수이고; 비타민은 L-Vc 및/또는 에스테르-C이며; 페놀계는 차 폴리페놀 및/또는 포도 폴리페놀이다.
본 발명의 네 번째 측면에 따르면 독소루비신 함유 약물의 제조 방법을 더 제공하고, 상기 제조 방법은 전술한 임의의(생체 활성 물질이 탑재되지 않은) 핵산 나노입자를 제공하는 단계; 및 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 방식을 통해 독소루비신을 핵산 나노입자에 탑재하여 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함한다.
또한, 물리적 연결 방식을 통해 독소루비신을 탑재하는 단계는, 독소루비신, 핵산 나노입자 및 제1 용매를 혼합 및 교반하여 예비혼합 체계를 얻는 단계; 예비혼합 체계 중의 유리 물질을 제거하여 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 제1 용매는 DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산에서 선택되는 하나 또는 다수이며; 바람직하게는, 예비혼합 체계 중의 유리 물질을 제거하는 단계는, 예비혼합 체계와 무수에탄올을 혼합하고, 10℃보다 낮은 온도 조건에서 독소루비신 함유 약물을 석출하는 단계를 포함하고, 더 바람직하게는, 0 내지 5℃ 온도 조건에서 독소루비신 함유 약물을 석출하는 단계를 포함한다.
또한, 공유 결합 연결 방식을 통해 독소루비신을 탑재하는 단계는, 독소루비신 용액을 준비하는 단계; 독소루비신 용액이 포름알데하이드의 개재 작용에 의해 핵산 나노입자의 G 환외 아미노기와 반응하여 반응 체계를 얻는 단계; 및 반응 체계를 정제하여 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 반응 단계는 독소루비신 용액을 파라포름알데하이드 용액, 핵산 나노입자와 혼합하고 어두운 조건에서 반응시켜 반응 체계를 얻는 단계를 포함하며; 바람직하게는 파라포름알데하이드 용액의 농도는 3.7 내지 4wt%이고, 바람직하게는 파라포름알데하이드 용액은 파라포름알데하이드와 제2 용매가 혼합하여 형성한 용액이며, 제2 용매는 DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산 중의 하나 또는 다수이다.
또한, 상기 제조 방법은 핵산 나노입자를 제조하는 단계를 더 포함하고, 이는 전술한(생체 활성 물질이 탑재되지 않은) 핵산 나노입자 중의 핵산 구조적 도메인에 대응되는 단일 스트랜드(single strand)를 자기조립하여 핵산 구조적 도메인을 얻는 단계를 포함하며, 바람직하게는, 핵산 구조적 도메인을 얻은 후, 제조 방법은 생체 활성 물질의 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 방식을 통해 핵산 구조적 도메인에 탑재하여 핵산 나노입자를 얻는 단계를 더 포함하고, 생체 활성 물질 중의 약물은 독소루비신을 제외한 소분자 약물이다.
또한, 공유 결합 연결 방식으로 생체 활성 물질을 탑재하는 과정에서, 용매 공유 결합 연결, 링커공유 결합 연결 또는 클릭 연결을 통해 탑재하고; 바람직하게는, 용매 공유 결합 연결에서 사용되는 제3 용매는 연결 매질로 작용하고, 제3 용매는 파라포름알데하이드, DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산에서 선택되는 하나 또는 다수이며; 바람직하게는, 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택되고; 바람직하게는, 클릭 연결은 생체 활성 물질 전구체 및 핵산 구조적 도메인에 대해 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행한 다음 클릭 연결을 진행한다.
또한, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 클릭 연결 방식으로 연결될 경우, 생체 활성 물질 전구체가 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 2'하이드록실기, 카복실기 또는 아미노기에서 선택되고, 핵산 구조적 도메인이 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 G 환외 아미노기, 2'-하이드록실기, A아미노기 또는 2'-하이드록실기에서 선택된다.
본 발명이 제공하는 핵산 나노입자는 상기 3 스트랜드 서열 또는 그 변이 서열을 포함하여, 자기조립을 통해 핵산 구조적 도메인을 형성할 수 있을 뿐만 아니라 벡터로 작용할 수도 있다. 3 스트랜드 스트랜드의 임의의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 siRNA약물 또는 miRNA약물을 연결하고, 상기 나노입자를 형성하는 과정에서, 핵산 구조적 도메인의 존재로 인해 뉴클레아제가 탑재된 핵산 약물에 대한 분해 작용을 감소하여 약물의 전달 신뢰성 및 안정성을 향상시킨다.
본 발명의 일부를 구성하는 명세서 도면은 본 발명을 더 잘 이해하기 위해 제공된다. 본 발명의 예시적 실시예 및 그 설명은 본 발명을 해석하기 위한 것이고 본 발명에 대한 부당한 한정이 아니다. 도면에서
도 1은 본 발명의 실시예 1 중 자기조립을 통해 형성된 RNA 나노입자의 전기 영동 측정 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 중 자기조립을 통해 형성된 DNA 나노입자의 전기 영동 측정 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자의 2% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자의 4% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자의 2% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자의 4% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자의 2% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자의 4% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 일반 서열 DNA 나노입자 D-7의 투사전자현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예 5 중 독소루비신 탑재 산물의 전기 영동 측정 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예 5 중 탑재율 측정 과정에서 사용된 독소루비신 흡광도의 표준 곡선이다.
도 12는 본 발명의 실시예 7 중 상이한 나노입자의 FACS 형광 신호 강도 측정 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 7 중 상이한 나노입자와 HepG2 세포 결합 및 인터널리제이션 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 9중 RNA 나노입자가 Coomassie Blue 프로그램에서 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예 9중 RNA 나노입자가 Stain Free Gel 프로그램에서 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 16은 본 발명의 실시예 10 중 상이한 나노입자의 HepG2 세포 증식 상황 측정결과이다.
도 17은 본 발명의 실시예 11 중 7 그룹의 연장 구간 변형 + 핵심 단 서열 RNA 자기조립 산물의 비변성 PAGE 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 18은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-15의 용해 곡선이다.
도 19는 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-16의 용해 곡선이다.
도 20은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-17의 용해 곡선이다.
도 21은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-18의 용해 곡선이다.
도 22는 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-19의 용해 곡선이다.
도 23은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-20의 용해 곡선이다.
도 24는 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-21의 용해 곡선이다.
도 25는 본 발명의 실시예 12 중 7 그룹의 연장 구간 변형 + 핵심 단 서열 DNA 자기조립 산물의 비변성 PAGE 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 26은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-8의 용해 곡선이다.
도 27은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-9의 용해 곡선이다.
도 28은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-10의 용해 곡선이다.
도 28는 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-11의 용해 곡선이다.
도 30은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-12의 용해 곡선이다.
도 31은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-13의 용해 곡선이다.
도 32는 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-14의 용해 곡선이다.
도 33은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-15를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 34는 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-16을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 35는 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-17을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 36은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-18을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 37은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-19를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 38은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-20을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 39는 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-21을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 40은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-8을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 41은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-9를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 42는 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-10을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 43은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-11을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 44는 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-12를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 45는 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-13을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 46은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-14를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 47a, 도 47b, 도 47c, 도 47d, 도 47e, 도 47f, 도 47g, 도 47h는 각각 본 발명의 실시예 17 중 DMSO 및 원약 독소루비신, D-8 및 D-8-독소루비신, D-9 및 D-9-독소루비신, D-10 및 D-10-독소루비신, D-11 및 D-11-독소루비신, D-12 및 D-12-독소루비신, D-13 및 D-13-독소루비신, D-14 및 D-14-독소루비신에 대응되는 세포 생존율 곡선이다.
도 48은 실시예 18의 탑재율 측정 과정에서 사용된 다우노루비신 흡광도의 표준 곡선이다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 중 자기조립을 통해 형성된 RNA 나노입자의 전기 영동 측정 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 중 자기조립을 통해 형성된 DNA 나노입자의 전기 영동 측정 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자의 2% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자의 4% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자의 2% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자의 4% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자의 2% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 7 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자의 4% 아가로스 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 일반 서열 DNA 나노입자 D-7의 투사전자현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예 5 중 독소루비신 탑재 산물의 전기 영동 측정 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예 5 중 탑재율 측정 과정에서 사용된 독소루비신 흡광도의 표준 곡선이다.
도 12는 본 발명의 실시예 7 중 상이한 나노입자의 FACS 형광 신호 강도 측정 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 7 중 상이한 나노입자와 HepG2 세포 결합 및 인터널리제이션 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 9중 RNA 나노입자가 Coomassie Blue 프로그램에서 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예 9중 RNA 나노입자가 Stain Free Gel 프로그램에서 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 16은 본 발명의 실시예 10 중 상이한 나노입자의 HepG2 세포 증식 상황 측정결과이다.
도 17은 본 발명의 실시예 11 중 7 그룹의 연장 구간 변형 + 핵심 단 서열 RNA 자기조립 산물의 비변성 PAGE 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 18은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-15의 용해 곡선이다.
도 19는 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-16의 용해 곡선이다.
도 20은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-17의 용해 곡선이다.
도 21은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-18의 용해 곡선이다.
도 22는 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-19의 용해 곡선이다.
도 23은 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-20의 용해 곡선이다.
도 24는 본 발명의 실시예 11 중 RNA 나노입자 R-21의 용해 곡선이다.
도 25는 본 발명의 실시예 12 중 7 그룹의 연장 구간 변형 + 핵심 단 서열 DNA 자기조립 산물의 비변성 PAGE 겔 전기 영동 측정 결과이다.
도 26은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-8의 용해 곡선이다.
도 27은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-9의 용해 곡선이다.
도 28은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-10의 용해 곡선이다.
도 28는 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-11의 용해 곡선이다.
도 30은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-12의 용해 곡선이다.
도 31은 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-13의 용해 곡선이다.
도 32는 본 발명의 실시예 12 중 DNA 나노입자 D-14의 용해 곡선이다.
도 33은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-15를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 34는 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-16을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 35는 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-17을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 36은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-18을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 37은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-19를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 38은 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-20을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 39는 본 발명의 실시예 13 중 RNA 나노입자 R-21을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 40은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-8을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 41은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-9를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 42는 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-10을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 43은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-11을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 44는 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-12를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 45는 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-13을 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 46은 본 발명의 실시예 14 중 DNA 나노입자 D-14를 혈청 중에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후의 전기 영동 측정 결과이다.
도 47a, 도 47b, 도 47c, 도 47d, 도 47e, 도 47f, 도 47g, 도 47h는 각각 본 발명의 실시예 17 중 DMSO 및 원약 독소루비신, D-8 및 D-8-독소루비신, D-9 및 D-9-독소루비신, D-10 및 D-10-독소루비신, D-11 및 D-11-독소루비신, D-12 및 D-12-독소루비신, D-13 및 D-13-독소루비신, D-14 및 D-14-독소루비신에 대응되는 세포 생존율 곡선이다.
도 48은 실시예 18의 탑재율 측정 과정에서 사용된 다우노루비신 흡광도의 표준 곡선이다.
설명해야 할 것은, 모순되지 않는 한 본 발명 중의 실시예 및 실시예 중의 특징은 서로 조합 가능하다. 아래 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다.
배경기술에서 언급한 바와 같이 선행기술에서 약물 전달 효율을 높이는 다양한 약물 벡터가 존재하지만 약물이 임상에서의 응용이 제한되는 문제를 해결하기 어렵다. 이 상황을 개선하기 위해 본 발명의 발명자는 기존의 모든 가능한 약물 벡터의 재료를 연구하고 벡터의 세포/조직 표적성, 운반 과정의 안정성, 표적 세포에 들어가는 활성 및 효율, 표적 세포에 도달한 후의 약물 방출 능력 및 세포에 대한 독성 등 방면으로부터 다양한 벡터에 대해 깊이 있는 고찰 및 분석을 진행하여 DNA 및/또는 RNA 분자 자기조립을 통해 형성된 신규 나노구조를 발견하였고, 예를 들면 DNA 가지상태 대분자의 자기조립 체계에서 DNA가 뉴클레아제의 분해에 대해 현저한 저해 작용이 있고 유전자 치료 및 생물 의학 분야에서 중요한 응용 가치가 있다는 것을 발견하였다.
기존에 보도된 DNA 및 RNA 자기조립을 통해 형성된 나노입자는 분석 발견한 결과 강성 DNA 나노입자에 비해 RNA 나노입자는 분자 내 또는 분자 간에 대량의 스템-루프(stem-loop)가 존재하기에 더 큰 연성 및 더 강한 장력을 구비하므로 약물 벡터 선택 방면에서 더 큰 장점이 있다. 그러나 천연 상태의 RNA 나노입자의 안정성이 상대적으로 차하고 현재 RNA 나노 벡터 응용 방면에 대한 개선은 대부분 그 안정성 및 신뢰성 향상에 대한 것이다. 현재 연구 결과는 비록 일정한 정도에서 약물 탑재 가능성을 제공하기는 하나 핵산 약물, 특히 siRNA약물 또는 miRNA약물 등 탑재 가능성 및 유효성에 더 치중하여 연구가 진행되고 있다. 비 핵산 약물이 마찬가지로 유효한지에 대한 연구 결과는 아주 적다. 이밖에 기존의 자기조립 나노입자. 특히 벡터로 응용되는 자기조립 나노입자는 현재 모두 RNA 스트랜드를 사용하여 자기조립하고 RNA 스트랜드 및 DNA 스트랜드 조합 형식을 사용하여 자기조립하는 경우가 극히 적으나 순수 DNA 스트랜드를 사용하여 자기조립을 진행하는 경우는 없다.
신뢰성이 좋고 자기조립이 가능한 RNA 나노입자 벡터를 제공하기 위해, 출원인은 기존의 RNA 나노입자를 비교 및 개선하여 일련의 신규 RNA 나노입자를 개발하였고, 적용성 향상 및 원가 절감 각도에서 순수 DNA 스트랜드를 사용하여 자기조립을 진행하는 것을 시도하다 우연히 이런 DNA 단일 스트랜드가 자기조립을 통해 DNA 나노입자를 형성할 수 있을 뿐만 아니라 성능이 RNA 나노입자와 마찬가지로 우수하다는 것을 발견하였다. 또한 DNA 나노입자의 자기조립은 가격이 저렴하고 작업이 쉬운 장점이 있다. 실험을 통해 발명자는 개선된 RNA 나노입자 및 DNA 나노입자가 모두 다양한 약물을 탑재할 수 있고 혈청에서 안정적으로 존재할 수 있다는 것을 검증하였고, 또한 실험을 통해 이는 약물을 탑재하여 세포에 들어갈 수 있고 단독 벡터가 세포에 대해 독성이 없다는 것을 검증하였다. 약물 탑재 벡터는 상응한 질환에 대해 완화 및 치료 작용을 할 수 있다.
상기 연구 결과를 기반으로 출원인은 본 발명의 과제 해결 수단을 안출하였다. 일 전형적인 실시형태로서 핵산 나노입자를 제공하고, 상기 핵산 나노입자는 핵산 구조적 도메인을 구비하고, 상기 핵산 구조적 도메인은 a 서열, b 서열 및 c 서열을 포함하며, a 서열은 a1 서열 또는 a1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하고, b 서열은 b1 서열 또는 b1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하며, c 서열은 c1 서열 또는 c1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하고; a1 서열은 서열번호 1: 5'-CCAGCGUUCC-3' 또는 서열번호 2: 5'-CCAGCGTTCC-3'이며; b1 서열은 서열번호 3: 5'-GGUUCGCCG-3' 또는 서열번호 4: 5'-GGTTCGCCG-3'이고; c1 서열은 서열번호 5: 5'-CGGCCAUAGCGG-3' 또는 서열번호 6: 5'-CGGCCATAGCGG-3'이다.
상기 핵산 나노입자는 상기 3 스트랜드 서열 또는 그 변이 서열을 포함하여, 자기조립을 통해 핵산 구조적 도메인을 형성할 수 있을 뿐만 아니라 벡터로 작용할 수도 있다. 3 스트랜드 스트랜드의 임의의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 siRNA약물 또는 miRNA약물을 연결하고, 상기 나노입자를 형성하는 과정에서, 핵산 구조적 도메인의 존재로 인해 뉴클레아제가 탑재된 핵산 약물에 대한 분해 작용을 감소하여 약물의 전달 신뢰성 및 안정성을 향상시킨다.
상기 자기조립은 기본 구조 단위가 자발적으로 질서있는 구조를 형성하는 기술을 말한다. 자기조립 과정에서 기본 구조 단위는 비공유 결합을 기반으로 한 상호 작용하에 일정한 규칙적인 기하학적 모양을 가진 안정된 구조로 자발적으로 구성되거나 응집된다. 자기조립 과정은 많은 원자, 이온 또는 분자 사이의 약한 상호 작용력(여기서 "약한 상호 작용력"은 수소 결합, 반데르발스 힘, 정전기력, 소수성 작용력 등을 지시함)의 단순한 중첩이 아니라 여러 개체 사이가 동시에 자발적으로 병렬로 발생하고 함께 모여 치밀하고 질서있는 전체를 형성하는 것으로서 이는 일종의 전반적인 복잡한 시너지 효과이다.
자기조립의 발생에는 자기조립의 힘 및 가이드 작용이라는 두 가지 조건이 필요하다. 자기조립의 힘은 분자 자기 조립을 위한 에너지를 제공하는 분자 간의 약한 상호 작용력의 시너지 효과를 지시한다. 자기조립의 가이드 작용은 공간에서 분자의 상보성을 의미하며, 즉 자기조립이 공간의 크기와 방향에서 분자 재배열의 요구 사항을 충족해야 함을 의미한다.
DNA 나노 기술은 아래에서 위로 분자 자기조립을 진행하는 모드이고, 분자 구조를 기점으로 핵산 분자의 물리적 및 화학적 성질이 자발적으로 안정적인 구조를 형성하여 엄격한 핵산 염기 페어링 원칙을 준수한다. 다수의 DNA 단편이 체외에서 정확한 순서로 하나로 연결되고, 염기 상보 페어링 원칙을 통해 일부조립(subassembly) 구조를 구축하고 최종적으로 복잡한 다단식 구조를 형성한다. DNA와 달리 RNA 구조는 이중 나선의 제한을 벗어날 수 있다. RNA는 일련의 상이한 염기쌍을 형성할 수 있고, 염기쌍 사이는 적어도 2개의 수소 결합을 형성한다. 상이한 염기는 2가지 유형으로 나뉠 수 있고, 표준 Watson-Crick 염기쌍형 및 비 Watson-Crick 염기쌍형을 포함하며, RNA가 대량의 다양한 유형의 순환 구조 모듈을 형성할 수 있도록 하고, 이런 모듈이 바로 중첩 RNA 3급 구조의 기본 구조 단위이다. RNA 나노 기술은 이런 천연적으로 존재하는 3D 모듈 및 그 예기 가능한 상호 작용을 이용할 수 있고, 여기서 생체 활성을 구비하는 많은 RNA 구조는 모두 원자급의 분별력을 구비할 수 있다. 예를 들면 리보스, 여러 유형의 리보자임 및 리보스 위치 내에 존재하는 천연 RNA압타머이다. RNA 나노 기술의 한가지 장점 및 특성은 크기 및 복잡성이 모두 천연 RNA 물질에 견줄만한 구조를 설계할 수 있다는 것이다. 천연 RNA 복합체 내의 RNA의 독특한 조립 성질을 이용할 수도 있다.
본 발명의 상기 핵산 나노입자는 서열서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5로 표시되는 3 스트랜드 서열 또는 그 변이 후의 서열을 포함하거나, 또는 서열서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6로 표시되는 3 스트랜드 서열 또는 그 변이 후의 서열을 포함하며, 모두 자기조립을 통해 형성한 핵산 나노입자를 기준으로 구체적으로 변이 후의 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6 서열의 기초상에서 변이 부위 및 그 변이 유형을 합리적으로 선택하거나 적절한 단편을 연장하여 얻을 수 있다.
서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5자기조립을 통해 형성한 나노입자는 RNA 나노입자이고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6자기조립을 통해 형성한 나노입자는 DNA 나노입자이다. 일 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 나노입자는 RNA 나노입자일 경우, a 서열, b 서열, c 서열 중의 적어도 하나의 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체된 서열을 포함한다. 상기 RNA 나노입자 중 변이서열의 구체적인 위치 및 염기 유형은 자기조립을 실현하는 전제에서 필요에 따라 약물 탑재량 또는 안정성을 향상시키는 나노입자로 개선된다.
제조된 핵산 나노입자가 상대적으로 더 높은 안정성을 구비하도록, 상기 서열번호 1/2, 서열번호 3/4 및/또는 서열번호 5/6로 표시되는 서열에 대해 염기 삽입, 결손 또는 대체를 진행할 경우, 상기 서열의 어느 특정 위치의 염기에 대해 진행하 수 있고, 변이 후의 서열이 원 서열과 마찬가지로 자기조립을 통해 나노입자를 형성하도록 하고, 다른 한편 변이 서열은 원 서열과 최소 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동원성을 구비하여 이가 상기 서열이 자기조립을 통해 형성한 나노입자와 마찬가지로 약물 탑재 특성 및 유사한 안정성을 구비하도록 하며, 핵산 약물을 탑재 및 전달할 수 있을 뿐만 아니라 화학적 약물 등 다른 생체 활성 물질의 탑재 및 전달에도 마찬가지로 적용될 수 있어 상대적 보편성을 구비한다.
일 바람직한 실시예에서, 상기 염기 삽입, 결손 또는 대체는 (1) 서열번호 1 또는 2 로 표시되는 a 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1, 2, 4 및 5 부위 염기 사이; 및/또는 (2) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 a 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제8 내지 10 부위 염기 사이; 및/또는 (3) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 b 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1 내지 3 부위 염기 사이; 및/또는 (4) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 b 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제6 내지 9 부위 염기 사이; 및/또는 (5) 서열번호 5 또는 6로 표시되는 c 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1 내지 4 부위 염기 사이; 및/또는 (6) 서열번호 5 또는 6로 표시되는 c 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제9 내지 12 부위 염기 사이에서 발생한다.
상기 바람직한 실시예에서, 한정된 변이가 발생하는 염기 위치는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 서열이 형성한 나노 구조 중의 비 전형적인 Watson-Crick 페어링 염기 위치 또는 돌출한 비 페어링 염기 위치이기에, 이런 돌출 또는 루프 구조의 형성에 영향을 주지 않으므로, 상기 서열이 형성한 나노 구조의 연성 및 장력을 유지하고 이가 벡터로서의 안정성을 유지한다.
상기 핵산 나노입자의 안정성을 더 높이기 위해, 일 바람직한 실시예에서, a 서열, b 서열 및 c 서열은 자기조립을 거쳐 식 (1)로 표시되는 구조를 이루고:
식에서 W-C는 Watson-Crick 페어링을 지시하고, N 및 N'는 비 Watson-Crick 페어링을 지시하며, 임의의 위치의 W-C는 각각 독립적으로 C-G 또는 G-C에서 선택되고; a 서열, b 서열 및 c 서열에서 적어도 2스트랜드의 서열의 각각의 5' 말단 및 3' 말단의 2개의 염기는 상보적이지 않으며; a 서열에서, 5' 말단으로부터 첫 번째 N은 A이고, 두 번째 N은 G이며, 세 번째 N은 U 또는 T이고, 네 번째 N은 U, T, A, C 또는 G 중 어느 하나이며; b 서열에서, 5' 말단으로부터 첫 번째 N'은 U, T, A, C 또는 G 중 어느 하나이고; 두 번째 N'은 U 또는 T, 세 번째 N'은 C이며; c 서열에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로의 방향에서 NNNN 서열은 CAUA 또는 CATA이다.
상기 바람직한 실시예에서, a, b, c 서열이 자기조립을 통해 형성한 식 (1)로 표시되는 핵산 구조적 도메인에서 N 및 N'로 한정된 비 Watson-Crick 페어링 염기를 제외하고 나머지 위치의 염기는 모두 전형적인 Watson-Crick 페어링을 형성하고, 상기 Watson-Crick 페어링의 염기는 모두 G-C 또는 C-G 염기쌍에서 선택된다. G-C 또는 C-G 염기쌍 간의 수소 결합 작용력이 A-U/T 또는 U/T-A 염기쌍 간의 수소 결합 작용력보다 크기에, 상기 핵산 나노 구조가 더 안정적이다. 비 Watson-Crick 페어링 염기가 형성한 돌출 또는 루프 구조는 핵산 나노 벡터에 더 큰 장력을 가져다 주고 이가 작은 환경 변화에 대한 적응성이 더 강하게 하기에 상기 핵산 나노입자의 안정성이 더 높아진다.
상기 식 (1) 구조의 나노입자에서, a 서열, b 서열 및 c 서열의 구체적인 서열 조성은 특별히 한정하지 않고, 상기 구조를 형성할 수 있기만 하면 된다. 핵산 서열 자기조립 각도에서 보면, 상기 3 스트랜드 서열은 자기조립을 거쳐 상기 식 (1) 구조의 나노입자를 형성하는 효율을 더 높이기 위해, Watson-Crick 페어링의 염기를 선택 시 상이한 위치의 염기 선택은 아래 원칙을 준수하는 것이 가장 좋다. (1) a 서열, b 서열 및 c 서열, 단독인 1스트랜드의 서열일 경우에는 자발적인 상보 페어링을 통해 2급 구조를 형성하지 않는다. (2) a 서열, b 서열 및 c 서열, 임의의 2스트랜드의 서열 사이 일단이 상보 페어링을 통해 이중 스트랜드를 형하고, 타단이 상보 페어링일 진행하지 않아 Y형 또는 T형 구조를 형성한다. 상기 염기 선택 원칙은 임의의 한 스트랜드의 스트랜드의 양단에서 각각 다른 2스트랜드의 스트랜드의 양단과 최대 효율로 상보 페어링을 진행하여 자기조립 효율을 높이는 것이다. 물론 Y형 또는 T형 구조를 제외하고 3갈래를 제외한 4각형 등 대체 변형 형식일 수도 있고 임의의 2스트랜드 서열 사이의 일단이 상보 페어링을 통해 이중 스트랜드를 형성하거나 타단이 상보 페어링을 진행하지 않는 원칙을 만족하기만 하면 된다.
상기 식 (1) 구조의 나노입자에서, 비 Watson-Crick 페어링 염기에서, a 서열에서 5' 말단으로부터 시작하여 네 번째 N 및 b 서열에서 그 페어링의 5' 말단으로부터 첫 번째 N'은 비 Watson-Crick 페어링의 U-U일 수 있고, 개선 후 Watson-Crick 페어링 원칙을 준수하는 T, A, C 또는 G일 수도 있다. Watson-Crick 페어링은 스트랜드 간 결합력을 향상시키고 안정성을 향상시키며, 비 Watson-Crick 페어링은 나노입자에 더 큰 연성 및 유연성을 제공하고 작은 환경 변화가 있을 경우에도 마찬가지로 나노입자의 안정성 향상에 유리하다.
일 바람직한 실시예에서, a 서열, b 서열 및 c 서열은 (1) a 서열(서열번호 7): 5'-GGAGCGUUGG-3', b 서열(서열번호 8): 5'-CCUUCGCCG-3', c 서열(서열번호 9): 5'-CGGCCAUAGCCC-3'; (2) a 서열(서열번호 10): 5'-GCAGCGUUCG-3', b 서열(서열번호 11): 5'-CGUUCGCCG -3', c 서열(서열번호 12): 5'-CGGCCAUAGCGC-3'; (3) a 서열(서열번호 13): 5'-CGAGCGUUGC -3', b 서열(서열번호 14): 5'-GCUUCGCCG -3', c 서열(서열번호 15): 5'-CGGCCAUAGCCG -3'; (4) a 서열(서열번호 16): 5'-GGAGCGUUGG -3', b 서열(서열번호 17): 5'-CCUUCGGGG -3', c 서열(서열번호 18): 5'-CCCCCAUAGCCC -3'; (5) a 서열(서열번호 19): 5'-GCAGCGUUCG -3', b 서열(서열번호 20): 5'-CGUUCGGCG -3', c 서열(서열번호 21): 5'-CGCCCAUAGCGC -3'; (6) a 서열(서열번호 22): 5'-GCAGCGUUCG -3', b 서열(서열번호 23): 5'-CGUUCGGCC -3', c 서열(서열번호 24): 5'-GGCCCAUAGCGC -3'; (7) a 서열(서열번호 25): 5'-CGAGCGUUGC -3', b 서열(서열번호 26): 5'-GCUUCGGCG -3', c 서열(서열번호 27): 5'-CGCCCAUAGCCG -3'; (8) a 서열(서열번호 28): 5'-GGAGCGTTGG-3', b 서열(서열번호 29): 5'-CCTTCGCCG-3', c 서열(서열번호 30): 5'-CGGCCATAGCCC-3'; (9) a 서열(서열번호 31): 5'-GCAGCGTTCG-3', b 서열(서열번호 32): 5'-CGTTCGCCG -3', c 서열(서열번호 33): 5'-CGGCCATAGCGC-3'; (10) a 서열(서열번호 34): 5'-CGAGCGTTGC -3', b 서열(서열번호 35): 5'-GCTTCGCCG -3', c 서열(서열번호 36): 5'-CGGCCATAGCCG -3'; (11) a 서열(서열번호 37): 5'-GGAGCGTTGG -3', b 서열(서열번호 38): 5'-CCTTCGGGG -3', c 서열(서열번호 39): 5'-CCCCCATAGCCC -3'; (12) a 서열(서열번호 40): 5'-GCAGCGTTCG -3', b 서열(서열번호 41): 5'-CGTTCGGCG -3', c 서열(서열번호 42): 5'-CGCCCATAGCGC -3'; (13) a 서열(서열번호 43): 5'-GCAGCGTTCG -3', b 서열(서열번호 44): 5'-CGTTCGGCC -3', c 서열(서열번호 45): 5'-GGCCCATAGCGC -3'; (14) a 서열(서열번호 46): 5'-CGAGCGTTGC -3', b 서열(서열번호 47): 5'-GCTTCGGCG -3', c 서열(서열번호 48): 5'-CGCCCATAGCCG -3'에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 14개 그룹 서열이 자기조립을 통해 형성한 핵산 나노입자는 더 높은 안정성을 구비할 뿐만 아니라 자기조립 효과가 더 좋다.
상기 언급된 핵산 나노입자는 자기조립 형성이 가능할 뿐만 아니라 약물을 휴대 또는 탑재할 수 있는 능력도 구비한다. 상기 핵산 나노입자 중 G-C 또는 C-G 염기쌍의 위치가 다르고 탑재된 약물의 종류 또는 성질이 다름에 따라, 탑재된 약물의 량도 차이가 있다. 마찬가지로 핵산 약물은 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단을 연장하여 탑재될 수 있다.
탑재된 약물의 분자량의 크기 또는 탑재 시의 구조의 장해(steric hindrance)에 따라, 상기 핵산 약물이 분자량이 상대적으로 큰 생체 활성 물질을 탑재할 수 있도록 하기 위해, 일 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 구조적 도메인은 제1 연장 구간을 더 포함하고, 제1 연장 구간은Watson-Crick 페어링의 연장 구간이며, 제1 연장 구간은 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한다. 벡터와 탑재된 물질 사이는 일정한 매칭 관계가 있어야 하는데, 벡터의 분자량이 너무 작고 탑재된 물질 분자량이 너무 클 경우, 역학적 각도에서 보면 벡터가 탑재 물질의 휴대 또는 운반 능력이 상대적으로 떨어진다. 따라서 전술한 핵산 나노 구조의 기초상에서 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 제1 연장 구간을 추가하여 탑재 물질의 크기에 매칭되는 벡터를 얻을 수 있다.
상기 제1 연장 구간의 구체적인 길이는 탑재된 물질의 크기에 따라 결정할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서, 제1 연장 구간은 (1): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCA-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-UGGG-3'; (2): a 스트랜드 3' 말단: 5'-GGG-3', b 스트랜드 5' 말단: 5'-CCC-3'; (3): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCA-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-UGG-3'; (4): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCG-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-CGGG-3'; (5): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCC-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-GGGG-3'; (6): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCC-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-GGG-3'.(7): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCG-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-CGG-3'; (8): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCA-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-TGGG-3'; (9): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCA-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-TGG-3'; (10): a 스트랜드 5' 말단: 5'-GCGGCGAGCGGCGA-3'(서열번호 162), c 스트랜드 3' 말단: 5'-UCGCCGCUCGCCGC-3'(서열번호 163);(11): a 스트랜드 3' 말단: 5'-GGCCGGAGGCCGG-3'(서열번호 164), b 스트랜드 5' 말단: 5'-CCGGCCUCCGGCC-3'(서열번호 165); (12) b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCAGCCGCC-3'(서열번호 166), c 스트랜드 5' 말단: 5'-GGCGGCAGG-3'(서열번호 167); (13): a 스트랜드 5' 말단: 5'-GCGGCGAGCGGCGA-3'(서열번호 168), c 스트랜드 3' 말단: 5'-TCGCCGCTCGCCGC-3'(서열번호 169);(14): a 스트랜드 3' 말단: 5'-GGCCGGAGGCCGG-3'(서열번호 170), b 스트랜드 5' 말단: 5'-CCGGCCTCCGGCC-3'(서열번호 171)에서 선택된다.
상기 제1 연장 구간은 핵산 나노 구조를 형성하는 3 스트랜드 서열에서 임의의 한 스트랜드 또는 여러 스트랜드의 길이를 증가할 뿐만 아니라, GC 염기로 이루어진 제1 연장 구간은 형성된 나노입자의 안정성을 더 향상시킨다. 또한 상기 서열로 이루어진 제1 연장 구간은 마찬가지로 a 서열, b 서열 및 c 서열이 높은 자기조립 활성 및 효율을 유지하도록 한다.
형성된 핵산 나노입자의 크기 및 이가 약물 전달 벡터로서 체내에서 운반 시의 안정성을 고려하면, 약물을 운반하는 동시에 표적 세포에 도달하기 전에 신장에 의해 여과되지 말아야 한다. 일 바람직한 실시예에서, 핵산 구조적 도메인은 제2 연장 구간을 더 포함하고, 제2 연장 구간은 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하며, 제2 연장 구간은 Watson-Crick 페어링의 연장 구간이고; 바람직하게는, 제2 연장 구간은 CG 염기쌍의 연장 서열이며; 더 바람직하게는, 제2 연장 구간은 1 내지 10개 CG 염기쌍의 연장 서열이다. 제2 연장 구간은 제1 연장 구간의 기초상에서 더 추가된 연장 구간이다.
일 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 구조적 도메인은 제1 그룹: a 스트랜드 5' 말단: 5'-CGCGCG-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-CGCGCG-3'; 제2 그룹: a 스트랜드 3' 말단: 5'-CGCCGC-3', b 스트랜드 5' 말단: 5'-GCGGCG-3'; 제3 그룹: b 스트랜드 3' 말단: 5'-GGCGGC-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-GCCGCC-3' 중 적어도 한의 제1 연장 구간을 더 포함한다. 이런 제2 연장 구간은 난욉자가 면역원성을 구비하지 않도록 하고 스트랜드 스트랜드마다 자체적으로 접혀 결합한 2급 구조를 형성하는 상황이 존재하지 않도록 한다.
설명해야 할 것은, 상기 제1 연장 구간 및/또는 제2 연장 구간에는 간격을 두고 비 페어링 염기쌍이 있을 수도 있다.
상기 핵산 나노입자가 더 많은 분자량의 생체 활성 물질을 탑재하고 약물 탑재량을 증가하며 필요한 안정성을 유지하도록 하기 위해, 일 바람직한 실시예에서, 제2 연장 구간은 CG 염기쌍 및 AT/AU 염기쌍의 연장 서열을 동시에 함유하고, 바람직하게는 제2 연장 구간은 2 내지 50개 염기쌍의 연장 서열이다. 여기서 “AT/AU 염기” 중의 “/”는 “또는”의 관계이고, 구체적으로, 제2 연장 구간은 CG 염기쌍 및 AT 염기쌍을 동시에 함유하는 연장 서열이거나, 또는 제2 연장 구간은 CG 염기쌍 및 AU 염기쌍을 동시에 함유하는 연장 서열이다.
더 구체적으로, 상기 제2 연장 구간을 추가한 후의 a, b 및 c 서열은 각각 아래와 같은 서열일 수 있다.
a 서열은 (서열번호 49):
5'-CGCGCGAAAAAACGCGCGAAAAAACGCGCGCCCACCAGCGMMCCGGGCGCGCGAAAAAACGCGCGAA
AAAACGCGCG-3';
b 서열은 (서열번호 50):
5'-CGCGCGMMMMMMCGCGCGMMMMMMCGCGCGCCCGGMMCGCCGCCAGCCGCCMMMMMMGCCGCCM
MMMMMGCCGCC-3';
c 서열은 (서열번호 51):
5'-GGCGGCAAAAAAGGCGGCAAAAAAGGCGGCAGGCGGCAMAGCGGMGGGCGCGCGMMMMMMCGCGCGMMMMMMCGCGCG-3';
상기 a 서열, b 서열 및 c 서열 중의 M은 U 또는 T이고, M이 T일 경우 상기 서열의 합성 원가가 크게 절감된다.
실제 응용에서 실제 필요에 따라 상기 CG 염기쌍 및 AT/AU 염기쌍의 연장 서열의의 구체적인 설치 위치를 적절히 조절할 수 있다. 더 바람직한 실시예에서 제2 연장 구간은 연속 2 내지 8개 CG 염기쌍의 서열과 연속 2 내지 8개 AT/AU 염기쌍의 서열이 번갈아 형성된 연장 서열이거나; 또는 제2 연장 구간은 1개 CG 염기쌍의 서열과 1개 AT/AU 염기쌍의 서열이 번갈아 형성된 연장 서열이다.
구체적으로, 예를 들면 상기 서열번호 49로 표시되는 a 서열 중의 CGCGCG 연장 구간 및 CGCCGC 연장 구간과 AAAAAA 연장 구간의 위치를 바꾸고, 상기 서열번호 50로 표시되는 b 서열 중의 GCGGCG 연장 구간 및 GGCGGC 연장 구간과 TTTTTT 연장 구간의 위치를 바꾸며, 상기 서열번호 51로 표시되는 c 서열 중의 GCCGCC 연장 구간과 AAAAAA 연장 구간을 바꾸고, 아울러 CGCCGC 연장 구간과 TTTTTT 연장 구간을 바꾼다. 상기 서열 자기조립을 통해 형성한 핵산 나노입자는 인돌계 분자 구조의 화학적 약물의 탑재 응용(인돌계 약물 분자는 바람직하게는 A와 결합된다)에 적용될 수 있다.
지난 몇 년 간 RNA는 광범위하게 응용되는 구축 재료로서 1) RNA 효소 분해의 민감성; 2) 전신 주사 후 해리에 대한 민감성; 3) 독성 및 불량 면역 반응 등 3가지 도전이 존재하였다. 현재 이 3가지 도전은 큰 정도로 극복되었고, 1) 리보스-OH 그룹의 2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸기(2'-OMe) 변형은 RNA가 혈청 중에서 화학적으로 안정적이게 하고; 2) 일부 천연적으로 존재하는 연결 motif는 열역학적으로 안정하며 전체 RNA 나노입자가 초저 농도에서 완정하도록 하고; 3) RNA 나노입자의 면역원성은 서열 및 형상에 의존하고 조절이 가능하여 RNA 나노입자가 염증성 세포 인자의 발생을 자극하거나 또는 RNA 나노입자가 30mg/kg의 반복 정맥 주사 투여 후 비 면역원성 및 무독성을 구비하도록 한다.
따라서 상기 핵산 나노입자가 RNA 효소 분해에 대한 민감성을 더 낮추기 위해, 일 바람직한 실시예에서, a 서열, b 서열 및 c 서열에서 염기, 리보스 및 인산에스테르는 적어도 하나의 변형 가능 부위를 구비하고, 임의의 변형 가능 부위는 -F, 메틸기, 아미노기, 이황화물, 카보닐기, 카복실기, 머캅토기 및 알데하이드기 중 어느 하나의 변형 어댑터를 통해 변형되며; 바람직하게는, a 서열, b 서열 및 c 서열 중의 C 또는 U 염기는 2'-F 변형을 구비한다. 변형 어댑터가 머캅토기일 경우 포스포티오에이트 변형에 속하고 변형 강도가 약하고 원가가 낮다.
본 발명이 제공하는 상기 핵산 나노입자가 벡터로서 탑재할 수 있는 물질은 임의의 생체 활성 작용을 구비하는 물질일 수 있다. 따라서 일 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 나노입자는 생체 활성 물질을 더 포함하고, 생체 활성 물질은 핵산 구조적 도메인에 연결된다.
핵산 나노입자가 탑재된 생체 활성 물질의 탑재 효율 및 운반 효율을 높이기 위해, 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량과 생체 활성 물질의 총 상대 분자량은 일정한 매칭 관계를 구비하는 것이 좋다. 일 바람직한 실시예에서, 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량과 생체 활성 물질의 총 상대 분자량 비율 ≥ 1:1이고; 바람직하게는, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인, 간섭 핵산 siRNA, miRNA, 리보자임, 리보스위치, 압타머, RNA 항체, 약물(일반적으로 소분자 약물이라고 해석함, 즉 화학적 합성 약물), 단백질, 폴리펩타이드, 플라보노이드, 포도당, 천연 살리실산, 단클론 항체, 비타민, 페놀계 및 레시틴 중의 하나 또는 다수이다.
구체적으로 탑재되는 생체 활성 물질의 종류가 다름에 따라, 이가 본 발명의 핵산 나노입자의 성능에 대한 최적화 작용이 다르다. 예를 들면 생체 활성 물질이 비오틴 또는 엽산일 경우 이가 일으키는 작용은 핵산 나노입자가 표적성을 구비하도록 하는 것이고 즉 암세포를 특이적으로 표적화한다. 생체 활성 물질이 플루오레세인일 경우 이가 일으키는 작용은 핵산 나노입자가 발광 추적 효과를 구비하도록 하는 것이다. 생체 활성 물질이 일부 siRNA, miRNA, 약물(일반적으로 소분자 약물이라고 해석함), 단백질, 폴리펩타이드 또는 RNA 항체일 경우, 상이한 생물학적 기능이 다름에 따라 상기 핵산 나노입자가 특정 치료 효과를 구비하는 신제품일 수 있고 예를 들면 성능이 더 우월한 약물일 수 있다. 이밖에, 구체적으로 탑재되는 생체 활성 물질의 종류가 다름에 따라, 바람직하게는 DNA 나노입자 및 RNA 나노입자를 사용할 수 있고 실제 필요에 따라 합리적으로 선택한다. 예를 들면 생체 활성 물질이 약물일 경우 바람직하게는 DNA 나노입자 또는 RNA 나노입자로 탑재하고 조립을 통해 형성한 나노입자의 단일 스트랜드의 길이에 대해서는 특별한 요구가 없다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인 및 miRNA이고, 타겟 헤드는 a, b, c 서열에서 임의의 서열에 위치하고, 바람직하게는 a, b, c 중 임의의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 핵산 구조적 도메인에 인터칼레이션된 GC 결합 사이에 인터칼레이션되며, miRNA는 항 miRNA이고, 플루오레세인은 항 miRNA의 5' 말단 또는 3' 말단에 변형되고, miRNA는 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 위치하며; 바람직하게는, 타겟 헤드는 엽산 또는 비오틴이고, 플루오레세인은 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수이며, 전술한 항 miRNA는 항 miR-21이다.
상기 타겟 헤드는 링커공유 결합 연결 방식을 통해 a, b, c 서열 중의 임의의 서열에 연결될 수 있고, 사용 가능한 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택된다. 여기서 “임의의 서열”은 a, b, c 서열 중 임의의 서열의 임의의 위치 염기를 지시하고, 5' 말단 또는 3' 말단에 연결되면 더 편리하며 응용이 더 광범위하다. 엽산 변형은 물리적 인터칼레이션 모드 연결 또는 물리적 인터칼레이션 + 공유 결합 연결일 수 있다.
상기 플루오레세인은 기존에 흔히 사용되는 플루오레세인이고, 바람직하게는 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수일 수 있다.
상기 miRNA는 항암 효과를 구비하는 miRNA일 수 있고 대응되는 질병을 억제할 수 있는 항 miRNA일 수도 있으며, 실제 응용에서 의료 수요에 따라 합리적으로 선택한다. 상기 항 miRNA는 상기 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 합성될 수 있다. 상기 3개의 위치에 모두 항 miRNA이 합성될 경우, 항 miRNA가 상응한 miRNA에 대한 억제 작용이 상대적으로 더 강하다.
바람직하게는 항 miR-21, miR-21는 다양한 암의 시작 및 진전에 참여하고 침식 및 전이하는 주요 암유발 유전자이다. 항 miR-21는 광범위한 타겟 유전자를 효과적으로 동시에 조절할 수 있어 암의 이종성 문제를 해결하는데 유리하다. 따라서 상기 바람직한 핵산 나노입자에서 타겟 헤드는 예를 들면 엽산 또는 비오틴이고, 암세포를 특이적으로 표적화하고 암세포와 결합 및 인터널리제이션 후 항 miR-21는 아주 높은 친화력 및 특이성으로 miR-21 염기와 상보함으로써 암 유발 miR-21의 발현을 효과적으로 낮춘다. 따라서 실제 수요에 따라 상기 항 miR-21는 상기 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 합성될 수 있다. 상기 3개의 위치에 모두 항 miR-21이 합성될 경우, 항 miR-21가 miR-21에 대한 억제 작용이 상대적으로 더 강하다.
상기 탑재할 수 있는 생체 활성 물질이 약물일 경우, 상이한 약물이 치료할 수 있는 질병 유형에 따라 약물은 간암, 위암, 폐암, 유선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 흑색종, 백혈병, 노인성 치매, 강직성 척추염, 악성 림파종, 기관지암, 류마티스 관절염, HBV B형 간염, 다발성 골수종, 췌장암, 비소세포폐암, 전립선암, 비인두암, 식도암, 구강암, 홍반성 낭창을 치료하는 약물을 포함하지만 이들로 한정되지 않고; 바람직하게는, 두경부암은 뇌암, 신경모 세포종 또는 교모 세포종이다.
상기 탑재할 수 있는 생체 활성 물질이 약물일 경우, 약물의 분자 구조고 다르거나 구비하는 특이성 그룹이 다름에 따라 약물은 아미노기 그룹, 하이드록실기 그룹, 카복실기 그룹, 머캅토기 그룹, 벤젠 고리 그룹 및 아세트아미노기 그룹 중 하나 또는 다수의 그룹을 함유하는 약물을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
일 바람직한 실시예에서, 상기 단백질은 SOD(초과산화물불균등화효소), Survivin, hTERT(인간 텔로머라아제 역전사 효소) 및 EGFR(epidermal growth factor receptor), PSMA(전립선 특이 항원)의 항체 또는 압타머 중의 하나 또는 다수이고; 상기 비타민은 L-Vc 및/또는 에스테르-C이며; 상기 페놀계는 차 폴리페놀 및/또는 포도 폴리페놀이다.
탑재된 생체 활성 물질이 다름에 따라 적절한 연결 방식을 선택하여 상기 핵산 나노 벡터에 연결할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서, 상기 생체 활성 물질은 방식 1: 물리적 인터칼레이션; 방식 2: 공유 결합 연결 중 어느 하나의 방식을 통해 핵산 구조적 도메인과 연결된다.
설명해야 할 것은, 상기 분류는 어느 생체 활성 물질과 핵산 나노 벡터의 연결 방식이 하나만 존재한다는 것을 의미하는 것이 아니다. 일부 생체 활성 물질은 물리적 인터칼레이션 방식을 통해 핵산 나노 벡터에 연결될 수 있고 물리적 인터칼레이션과 공유 결합 연결 방식을 통해 핵산 나노 벡터에 연결될 수도 있으며, 아울러 클릭 연결 방식을 통해 연결될 수도 있다. 어느 특정 생체 활성 물질은 한 가지 연결 방식만 있을 수 있고 여러가지 연결 방식이 있을 수도 있으며, 그중 어느 하나의 연결 효과가 우월한 실용 가치를 구비할 수 있다.
상기 연결 방식에서, 상이한 약물이 핵산 구조적 도메인과 물리적 인터칼레이션 방식을 통해 연결 시 인터칼레이션되는 결합 부위와 개수는 약간 다를 수 있다. 예를 들면 안트라사이클린계, 아크리딘계 약물은 인터칼레이션 시 통상적으로 GC 염기쌍 사이에 인터칼레이션되고, 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 GC 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 1 내지 100: 1의 비율로 인터칼레이션을 진행한다. 나프탈이미드 약물을 인터칼레이션할 경우, 일반적으로 AA 염기쌍 사이에 인터칼레이션하고, 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 AA 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 프리도 카르바졸계는 AA 염기쌍의 개수가 다름에 따라 1 내지 200: 1의 비율로 인터칼레이션한다.
약물이 물리적 인터칼레이션과 공유 결합 연결 두가지 방식을 사용하여 동시에 핵산 구조적 도메인에 연결 시, 안트라사이클린계, 아크리딘계 약물은 인터칼레이션 시 통상적으로 GC 염기쌍 사이에 인터칼레이션되고 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 GC 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 1 내지 100: 1의 비율에 따라 인터칼레이션된다. 나프탈이미드 약물을 인터칼레이션할 경우, 일반적으로 AA 염기쌍 사이에 인터칼레이션하고, 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 AA 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 프리도 카르바졸계는 AA 염기쌍의 개수가 다름에 따라 1 내지 200: 1의 비율로 인터칼레이션한다.
구체적으로, 생체 활성 물질의 다양한 종류, 핵산 나노입자에서 핵산 구조적 도메인을 형성하는 a, b 및 c 서열의 길이 및 그중 GC 상보 염기쌍의 개수의 많고 적음에 따라 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인의 몰비를 합리적으로 선택하여 물리적 인터칼레이션을 진행할 수 있다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식을 연결될 경우, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인은 1 내지 200: 1의 몰비로 물리적 인터칼레이션을 진행한다. 상기 연결 방식은 안트라사이클린계, 아크리딘계 약물에 적용된다. 상기 비율 범위 내에서 물리적 인터칼레이션을 진행하면 탑재 요구를 만족할 수 있을 뿐만 아니라 약효 요구도 만족할 수 있다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식과 공유 결합 연결 방식으로 연결될 경우, 물리적 인터칼레이션 방식으로 연결된 생체 활성 물질과 공유 결합 연결 방식으로 연결된 약물의 몰비는 1 내지 200: 1이다. 상기 연결 방식은 안트라사이클린계, 아크리딘계 약물에 적용된다. 상기 상이한 연결 방식으로 연결된 약물 비율은 상기 범위에 한정되는 것이 아니라, 고효율 탑재를 만족할 수 있고 세포에 독성 작용이 없으며 표적에 도달한 후 약물의 유효 방출을 실현할 수 있기만 하면 된다.
일 바람직한 실시예에서, 공유 결합 연결 방식으로 연결된 생체 활성 물질은 용매 공유 결합 연결, 링커 공유 결합 연결 또는 클릭 연결을 진행하고; 바람직하게는, 용매는 파라포름알데하이드, DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 또는 빙초산에서 선택되며; 바람직하게는, 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택되고; 바람직하게는, 클릭 연결은 생체 활성 물질 전구체 및 핵산 구조적 도메인에 대해 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행한 다음 클릭 연결을 진행한다.
생체 활성 물질 전구체 및 핵산 구조적 도메인에 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행하고 클릭 연결 방식 연결을 진행할 경우, 약물의 상이한 구조적 변화에 따라 상이한 클릭 연결을 선택한다. 활성 물질 구조가 다음에 따라 연결 위치도 상응하게 변할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 클릭 연결 방식으로 연결될 경우, 생체 활성 물질 전구체가 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 하이드록실기, 카복실기, 머캅토기 또는 아미노기에서 선택되고, 핵산 구조적 도메인이 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 아미노기, 이미노기 또는 하이드록실기에서 선택된다.
설명해야 할 것은, 상기 핵산 구조적 도메인과 약물 결합 시, 핵산 구조적 도메인은 수용성이고 다수의 약물의 수용성이 차하기에 이와 핵산 구조적 도메인이 결합 후, 수용성이 높아진다. 상기 약물이 안트라사이클린계일 경우 이런 약물은 뉴클레오타이드 구아노신 상의 -NH 결합(적절한 pH 값 조건에서 상기 -NH 그룹의 활성은 약물과 공유 결합을 발생할 수 있는 다른 그룹의 활성보다 100배 높다)을 통해 핵산 구조적 도메인과 공유 결합을 발생함으로써 탑재된 약물의 핵산 구조적 도메인을 형성한다. 따라서 구체적인 약물 분자의 크기 및 구체적으로 설계된 핵산 구조적 도메인 상의 a 서열, b 서열 및 c 서열의 GC 염기쌍의 개수에 따라 결합 시 이론적으로 1.1 내지 1.3 배의 포화 및 결합량으로 결합 반응을 진행하고, 하나의 핵산 구조적 도메인에는 최대 35 내지 45개 약물이 결합될 수 있다. 상기 약물이 다른 구조일 경우 탑재량은 구체적인 약물의 공간 점유 상황과 관련되기에(분자 구조, 형태, 형상 및 분자량 크기를 포함하지만 이들로 한정되지 않음), 약물의 활성 부위와 핵산 구조적 도메인의 뉴클레오타이드 구아노신 상의 -NH 결합의 결합 조건이 상대적으로 엄격하고 탑재는 가능하나 과량 결합 상황이 발생하기 어렵다.
일 바람직한 실시예에서, 핵산 나노입자의 입경은 1 내지 100㎚, 바람직하게는 5 내지 50㎚, 더 바람직하게는 10 내지 30㎚, 보다 더 바람직하게는 10 내지 15㎚이다. 상기 범위 내의 크기가 적절하기에 세포 표면 수용체 개재에 의해 세포 잠식(Phagocyte) 현상을 통해 세포막에 들어갈 수 있고 비특이적 세포 침투에 의해 신장에서 여과되어 제어되는 것을 방지할 수 있다. 따라서 유리한 입경 사이즈는 약물대사 동력학, 약효학, 생물학 분포 및 독성학 분포에 유리하다.
두 번째 전형적인 실시형태에서, 상기 임의의 핵산 나노입자를 포함하는 약물 조성물을 더 제공한다. 본 발명이 제공하는 규정된 상기 핵산 나노입자를 포함하는 약물에서 핵산 구조적 도메인은 표적 세포를 표적화하는 타겟 헤드 변형을 거쳐 우수한 표적성을 구비하는 동시에 상응한 치료 약물 및/또는 추적 분자를 탑재할 수도 있기에, 치료 약물 및/또는 추적 분자의 신뢰도가 아주 높다.
세 번째 전형적인 실시형태에서, 독소루비신 및 전술한 임의의(생체 활성 물질이 탑재되지 않은)핵산 나노입자를 포함하거나; 또는 전술한 임의의 (생체 활성 물질이 탑재되지 않은)핵산 나노입자인 독소루비신 함유 약물을 더 제공하고, 여기서 생체 활성 물질은 적어도 약물이고, 상기 약물은 독소루비신을 포함한다.
상기 제공된 독소루비신 함유 약물은 핵산 나노입자 및 독소루비신을 포함하고, 독소루비신은 핵산 나노입자에 탑재된다. 상기 핵산 나노입자에서 상기 3 스트랜드 서열 또는 그 변이서열을 포함하여, 자기조립을 통해 핵산 구조적 도메인을 형성할 수 있을 뿐만 아니라 벡터로 작용할 수도 있다. 3 스트랜드 스트랜드의 임의의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 독소루비신을 연결하거나고, 또는 독소루비신을 핵산 구조적 도메인의 스트랜드 사이에 안정적으로 인터칼레이션할 수 있다. 본 발명이 제공하는 독소루비신 함유 약물은 그 핵산 구조적 도메인이 타겟 헤드 변형을 거친 후 상대적으로 우수한 표적성을 구비할 수 있고 독소루비신을 안정적으로 전달할 수 있어 신뢰도가 아주 높다.
전술한 바와 같이, 생체 활성 물질이 약물이고 약물이 독소루비신일 경우, 독소루비신은 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 형식을 통해 탑재할 수 있다. 독소루비신은 물리적 인터칼레이션과 공유 결합 연결 두가지 방식을 통해 핵산 구조적 도메인에 연결될 경우 물리적 인터칼레이션은 통상적으로 GC 염기쌍 사이에 인터칼레이션되고, 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 GC 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 1 내지 100: 1의 비율로 인터칼레이션을 진행한다. 공유 결합 연결 방식을 사용하여 연결될 경우 독소루비신은 통상적으로 G 환외 아미노기와 화학 반응을 진행하여 공유 결합 연결을 형성한다. 더 바람직하게는, 독소루비신과 핵산 나노입자 사이의 몰비는 2 내지 300:1, 바람직하게는 10 내지 50:1, 더 바람직하게는 15 내지 25:1이다.
본 발명이 제공하는 독소루비신 함유 약물에서, 핵산 나노입자는 독소루비신의 전달 벡터로 작용하고, 이를 제외하고 다른 약물 목적에 따라 일 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 나노입자는 생체 활성 물질을 더 포함하고, 생체 활성 물질은 핵산 구조적 도메인에 연결된다. 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인, 간섭 핵산 siRNA, miRNA, 리보자임, 리보스위치, 압타머, RNA 항체, 단백질, 폴리펩타이드, 플라보노이드, 포도당, 천연 살리실산, 단클론 항체, 비타민, 페놀계레시틴 및 독소루비신을 제외한 소분자 약물 중의 하나 또는 다수이다.
핵산 나노입자가 탑재된 생체 활성 물질의 탑재 효율 및 운반 효율을 높이기 위해, 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량과 생체 활성 물질의 총 상대 분자량은 일정한 매칭 관계를 구비하는 것이 좋다. 일 바람직한 실시예에서, 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량을 N1라고 하고, 독소루비신과 생체 활성 물질의 총 상대 분자량을 N2라고 하면, N1/N2 ≥ 1:1이다.
구체적으로 탑재되는 생체 활성 물질의 종류가 다름에 따라, 본 발명 중 독소루비신 함유 약물은 상이한 성능 방면에서 최적화될 수 있다. 예를 들면 생체 활성 물질이 비오틴 또는 엽산일 경우 이가 일으키는 작용은 상기 독소루비신 함유 약물이 표적성을 구비하도록 하는 것이고 즉 암세포를 특이적으로 표적화한다. 생체 활성 물질이 플루오레세인일 경우 이가 일으키는 작용은 핵산 나노입자가 발광 추적 효과를 구비하도록 하는 것이다. 생체 활성 물질이 일부 siRNA, miRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 RNA 항체, 독소루비신을 제외한 소분자 약물일 경우, 상이한 생물학적 기능이 다름에 따라 상기 독소루비신 함유 약물이 특정 치료 효과를 구비하는 신제품일 수 있고 예를 들면 성능이 더 우월한 약물일 수 있다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인 및 miRNA이고, 타겟 헤드는 a, b, c 서열에서 임의의 서열에 위치하고, 바람직하게는 a, b, c 중 임의의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 핵산 구조적 도메인에 인터칼레이션된 GC 결합 사이에 인터칼레이션되며, miRNA는 항 miRNA이고, 플루오레세인은 항 miRNA의 5' 말단 또는 3' 말단에 변형되고, miRNA는 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 위치하며; 바람직하게는, 타겟 헤드는 엽산 또는 비오틴이고, 플루오레세인은 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수이며, 전술한 항 miRNA는 항 miR-21이다.
상기 타겟 헤드는 링커공유 결합 연결 방식을 통해 a, b, c 서열 중의 임의의 서열에 연결될 수 있고, 사용 가능한 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택된다. 여기서 “임의의 서열”은 a, b, c 서열 중 임의의 서열의 임의의 위치 염기를 지시하고, 5' 말단 또는 3' 말단에 연결되면 더 편리하며 응용이 더 광범위하다. 엽산 변형은 물리적 인터칼레이션 모드 연결 또는 물리적 인터칼레이션 + 공유 결합 연결일 수 있다.
상기 플루오레세인은 기존에 흔히 사용되는 플루오레세인이고, 바람직하게는 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수일 수 있다.
상기 miRNA는 항암 효과를 구비하는 miRNA일 수 있고 대응되는 질병을 억제할 수 있는 항 miRNA일 수도 있으며, 실제 응용에서 의료 수요에 따라 합리적으로 선택한다. 상기 항 miRNA는 상기 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 합성될 수 있다. 상기 3개의 위치에 모두 항 miRNA이 합성될 경우, 항 miRNA가 상응한 miRNA에 대한 억제 작용이 상대적으로 더 강하다.
바람직하게는 항 miR-21, miR-21는 다양한 암의 시작 및 진전에 참여하고 침식 및 전이하는 주요 암유발 유전자이다. 항 miR-21는 광범위한 타겟 유전자를 효과적으로 동시에 조절할 수 있어 암의 이종성 문제를 해결하는데 유리하다. 따라서 상기 바람직한 핵산 나노입자에서 타겟 헤드는 예를 들면 엽산 또는 비오틴이고, 암세포를 특이적으로 표적화하고 암세포와 결합 및 인터널리제이션 후 항 miR-21는 아주 높은 친화력 및 특이성으로 miR-21 염기와 상보함으로써 암 유발 miR-21의 발현을 효과적으로 낮춘다. 따라서 실제 수요에 따라 상기 항 miR-21는 상기 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 합성될 수 있다. 상기 3개의 위치에 모두 항 miR-21이 합성될 경우, 항 miR-21가 miR-21에 대한 억제 작용이 상대적으로 더 강하다.
상기 탑재할 수 있는 생체 활성 물질이 독소루비신을 제외한 다른 소분자 약물일 경우, 상이한 약물이 치료할 수 있는 질병 유형에 따라 약물은 간암, 위암, 폐암, 유선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 흑색종, 백혈병, 노인성 치매, 강직성 척추염, 악성 림파종, 기관지암, 류마티스 관절염, HBV B형 간염, 다발성 골수종, 췌장암, 비소세포폐암, 전립선암, 비인두암, 식도암, 구강암, 홍반성 낭창을 치료하는 약물을 포함하지만 이들로 한정되지 않고; 바람직하게는, 두경부암은 뇌암, 신경모 세포종 또는 교모 세포종이다.
상기 탑재할 수 있는 생체 활성 물질이 독소루비신을 제외한 소분자 약물일 경우, 약물의 분자 구조고 다르거나 구비하는 특이성 그룹이 다름에 따라 약물은 아미노기 그룹, 하이드록실기 그룹, 카복실기 그룹, 머캅토기 그룹, 벤젠 고리 그룹 및 아세트아미노기 그룹 중 하나 또는 다수의 그룹을 함유하는 약물을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
일 바람직한 실시예에서, 상기 단백질은 SOD(초과산화물불균등화효소), Survivin, hTERT(인간 텔로머라아제 역전사 효소) 및 EGFR(epidermal growth factor receptor), PSMA(전립선 특이 항원)의 항체 또는 압타머 중의 하나 또는 다수이고; 상기 비타민은 L-Vc 및/또는 에스테르-C이며; 상기 페놀계는 차 폴리페놀 및/또는 포도 폴리페놀이다.
일 바람직한 실시예에서, 핵산 나노입자의 입경은 1 내지 100㎚, 바람직하게는 5 내지 50㎚, 더 바람직하게는 10 내지 30㎚, 보다 더 바람직하게는 10 내지 15㎚이다. 상기 범위 내의 크기가 적절하기에 세포 표면 수용체 개재에 의해 세포 잠식(Phagocyte) 현상을 통해 세포막에 들어갈 수 있고 비특이적 세포 침투에 의해 신장에서 여과되어 제어되는 것을 방지할 수 있다. 따라서 유리한 입경 사이즈는 약물대사 동력학, 약효학, 생물학 분포 및 독성학 분포에 유리하다.
셋 번째 전형적인 실시형태에서, 상기 (생체 활성 물질이 탑재되지 않은) 핵산 나노입자를 제공하는 단계; 및 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 방식을 통해 독소루비신을 핵산 나노입자에 탑재하여 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법을 제공한다.
물리적 연결 방식을 사용할 경우 독소루비신은 통상적으로 물리적 인터칼레이션 방식으로 GC 염기쌍 사이에 인터칼레이션된다. 공유 결합 연결 방식을 사용하여 연결될 경우 독소루비신은 통상적으로 G 환외 아미노기와 화학 반응을 진행하여 공유 결합 연결을 형성한다. 상기 방법으로 제조된 독소루비신 함유 약물은 타겟 헤드 변형을 거친 후 상대적으로 우수한 표적성을 구비할 수 있고 독소루비신을 안정적으로 전달할 수 있어 신뢰도가 아주 높다.
일 바람직한 실시예에서, 물리적 연결 방식을 통해 독소루비신을 탑재하는 단계는, 독소루비신, 핵산 나노입자 및 제1 용매를 혼합 및 교반하여 예비혼합 체계를 얻는 단계; 예비혼합 체계 중의 유리 물질을 제거하여 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함한다. 구체적인 독소루비신, 핵산 나노입자의 용량은 탑재량의 변화에 따라 조절할 수 있고 이는 당업자가 이해할 수 있는 것이며 여기서 더이상 설명하지 않는다.
물리적 연결의 효율 및 안정성을 향상시키기 위해 바람직하게는 제1 용매 1리터당 추가되는 독소루비신량은 0.1 내지 1g이다. 바람직하게는, 제1 용매는 DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산에서 선택되는 하나 또는 다수이다. 바람직하게는, 예비혼합 체계 중의 유리 물질을 제거하는 단계는, 예비혼합 체계와 무수에탄올을 혼합하고, 10℃보다 낮은 온도 조건에서 독소루비신 함유 약물을 석출하는 단계를 포함하고, 더 바람직하게는, 0 내지 5℃ 온도 조건에서 독소루비신 함유 약물을 석출하는 단계를 포함한다.
일 바람직한 실시예에서, 공유 결합 연결 방식을 통해 독소루비신을 탑재하는 단계는, 독소루비신 용액을 준비하는 단계; 독소루비신 용액이 포름알데하이드의 개재 작용에 의해 핵산 나노입자의 G 환외 아미노기와 반응하여 반응 체계를 얻는 단계; 및 반응 체계를 정제하여 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함한다.
포름알데하이드 개재 형식을 통해 아래와 같은 반응이 발생할 수 있다.
바람직하게는, 반응 단계는 독소루비신 용액을 파라포름알데하이드 용액, 핵산 나노입자와 혼합하고 어두운 조건에서 반응시켜 반응 체계를 얻는 단계를 포함한다. 파라포름알데하이드 용액은 파라포름알데하이드 소분자를 방출하여 상기 화학 반응에 참여한다. 반응 효율을 높이기 위해 바람직하게는 파라포름알데하이드 용액의 농도는 3.7 내지 4wt%이고, 바람직하게는 파라포름알데하이드 용액은 파라포름알데하이드와 제2 용매가 혼합하여 형성한 용액이며, 제2 용매는 DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산 중의 하나 또는 다수이다.
상기 제조 방법에서, 핵산 나노입자는 자기조립 형식을 통해 제조될 수 있다. 예를 들면 (1) RNA 또는 DNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC수 또는 TMS 완충 용액에 용해시키고; (2) 용액을 80℃/95℃로 가열 혼합하며(그중 RNA 조립 온도는 80℃, DNA 조립 온도는 95℃), 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮추며; (3) 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제하고; (4) 표적 밴드를 절단하고 RNA/DNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시켜 자기조립 산물을 얻으면 핵산 구조적 도메인을 얻을 수 있고 핵산 나노입자도 얻는다.
상기 독소루비신 함유 약물이 다른 기능을 구비하도록, 일 바람직한 실시예에서, 핵산 구조적 도메인을 얻은 후, 제조 방법은 생체 활성 물질의 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 방식을 통해 핵산 구조적 도메인에 탑재하여 핵산 나노입자를 얻는 단계를 더 포함한다. 생체 활성 물질의 탑재 방식은 마찬가지로 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결일 수 있다. 공유 결합 연결 형식은 용매 공유 결합 연결, 링커공유 결합 연결 또는 클릭 연결을 통해 탑재하는 것을 포함하지만 이들로 한정되지 않고; 바람직하게는, 용매 공유 결합 연결에서 사용되는 제3 용매는 연결 매질로 작용하고, 제3 용매는 파라포름알데하이드, DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산에서 선택되는 하나 또는 다수이며; 바람직하게는, 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택되고; 바람직하게는, 클릭 연결은 생체 활성 물질 전구체 및 핵산 구조적 도메인에 대해 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행한 다음 클릭 연결을 진행한다.
설명해야 할 것은, 상기 분류는 어느 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인의 연결 방식이 하나만 존재한다는 것을 의미하는 것이 아니다. 일부 생체 활성 물질은 물리적 인터칼레이션 방식을 통해 핵산 구조적 도메인에 연결될 수 있고 물리적 인터칼레이션과 공유 결합 연결 방식을 통해 핵산 구조적 도메인에 연결될 수도 있으며, 아울러 클릭 연결 방식을 통해 연결될 수도 있다. 어느 특정 생체 활성 물질은 한 가지 연결 방식만 있을 수 있고 여러가지 연결 방식이 있을 수도 있으며, 그중 어느 하나의 연결 효과가 우월한 실용 가치를 구비할 수 있다.
상기 연결 방식에서, 상이한 약물이 핵산 구조적 도메인과 물리적 인터칼레이션 방식을 통해 연결 시 통상적으로 GC 염기쌍 사이에 인터칼레이션되고, 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 GC 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 1 내지 100: 1의 비율로 인터칼레이션을 진행한다. 나프탈이미드 약물을 인터칼레이션할 경우, 일반적으로 AA 염기쌍 사이에 인터칼레이션하고, 바람직한 인터칼레이션 부위 개수는 핵산 구조적 도메인에서 AA 염기쌍의 개수에 따라 다르며, 프리도 카르바졸계는 AA 염기쌍의 개수가 다름에 따라 1 내지 200: 1의 비율로 인터칼레이션한다.
구체적으로, 생체 활성 물질의 다양한 종류, 핵산 나노입자에서 핵산 구조적 도메인을 형성하는 a, b 및 c 서열의 길이 및 그중 GC 상보 염기쌍의 개수의 많고 적음에 따라 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인의 몰비를 합리적으로 선택하여 물리적 인터칼레이션을 진행할 수 있다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식을 연결될 경우, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인은 1 내지 200: 1의 몰비로 물리적 인터칼레이션을 진행한다. 상기 연결 방식은 안트라사이클린계, 아크리딘계 약물에 적용된다. 상기 비율 범위 내에서 물리적 인터칼레이션을 진행하면 탑재 요구를 만족할 수 있을 뿐만 아니라 약효 요구도 만족할 수 있다.
생체 활성 물질 전구체 및 핵산 구조적 도메인에 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행하고 클릭 연결 방식 연결을 진행할 경우, 약물의 상이한 구조적 변화에 따라 상이한 클릭 연결을 선택한다. 활성 물질 구조가 다음에 따라 연결 위치도 상응하게 변할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 활성 물질과 핵산 구조적 도메인이 클릭 연결 방식으로 연결될 경우, 생체 활성 물질 전구체가 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 하이드록실기, 카복실기, 머캅토기 또는 아미노기에서 선택되고, 핵산 구조적 도메인이 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 아미노기, 이미노기 또는 하이드록실기에서 선택된다.
설명해야 할 것은, 본 발명이 제공하는 서열 또는 서열의 변형이 자기조립을 통해 형성한 핵산 나노입자도 기본 구조 단위로 사용할 수 있고, 실제 응용의 필요에 따라 이합체, 삼합체, 사합체, 오합체, 육합체 또는 칠합체 등 다중합체로 중합될 수 있다.
아래 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 유익한 효과를 상세히 설명한다.
핵산 나노입자의 조립
실시예 1
1. RNA 및 DNA 나노입자 벡터:
(1) RNA 나노입자를 구성하는 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열은 구체적으로 표 1과 같다.
(2) DNA 나노입자의 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열
DNA는 상기 RNA와 같은 서열을 사용하고, T만 U로 대체한다. 여기서 a 스트랜드의 분자량은 8802.66, b 스트랜드의 분자량은 8280.33, c 스트랜드의 분자량은 9605.2이다.
상기 RNA 나노입자 및 DNA 나노입자의 a, b 및 c 스트랜드는 모두 sangon생물공학(상하이)주식유한회사에 의뢰하여 합성하였다.
2. 자기조립실험 단계
단계 (1): 1:1:1의 몰비로 RNA 또는 DNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC water 또는 TMS 완충 용액에 용해시킨다.
단계 (2): 용액을 80℃/95℃로 가열 혼합하며(그중 RNA 조립 온도는 80℃, DNA 조립 온도는 95℃), 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮춘다.
단계 (3): 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제한다.
단계 (4): 표적 밴드를 절단하고 RNA/DNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시켜 자기조립 산물을 얻는다.
단계 (5): 전기 영동 분석 측정 및 레이저 스캔 관찰을 진행한다 핵산 구조적 도메인을 얻을 수 있고 핵산 나노입자도 얻는다.
3. 자기조립 실험 결과
전기 영동 측정 결과
RNA 자기조립 산물의 전기 영동 측정 결과는 도 1과 같다. 도 1에서, 레인 1내지 3은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 a 스트랜드, b 스트랜드, RNA 자기조립 산물이다. 도면에서 RNA 자기조립 산물은 약간 확산이 있으나 단일 밴드임이 선명하게 보아낼 수 있다. 분자량이 조립 후의 분자량이고 단일 스트랜드 분자량이 크기에 밴드 위치가 a 스트랜드 및 b 스트랜드에 뒤떨어지고, 실제 상황은 이론에 부합되기에 상기 RNA 단일 스트랜드 사이가 자기조립을 거친 후 안정적인 복합 구조를 형성하였고 RNA 나노입자를 형성하였음을 증명한다.
DNA 자기조립 산물의 전기 영동 측정 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 레인 1 내지3은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 a 스트랜드, b 스트랜드, DNA 자기조립 산물이다. 도면에서 DNA 자기조립 산물의 밴드는 깨끗하고 선명하며 단일 밴드로서, 상기 DNA 단일 스트랜드 사이가 자기조립을 거친 후 안정적인 복합 구조를 형성하였고 DNA 나노입자를 형성하였음을 증명한다.
상기 실시예에서, 겔 전기 영동을 통해 RNA코어 서열서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5를 포함하는 a, b, c 서열이 자기조립을 통해 RNA 나노입자를 성공적으로 형성하였음을 검증하였다. DNA코어 서열서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6을 포함하는 a, b, c 서열도 자기조립을 통해 DNA 나노입자를 성공적으로 형성하였다.
상기 RNA 나노입자 및 DNA 나노입자의 a, b, c 서열은 핵산 구조적 도메인을 형성하는 코어 서열을 제외하고, 핵산 구조적 도메인의 탑재 기능을 촉진하는 다양한 연장 서열(약물 탑재 결합 서열을 포함) 및 핵산 구조적 도메인에 연결되는 타겟 헤드 또는 플루오레세인을 더 구비한다. 보다시피 이런 코어 서열을 제외한 물질의 존재는 핵산 구조적 도메인의 형성 및 핵산 나노입자의 성공적인 자기조립에 영향을 주지 않는다. 자기조립을 통해 형성된 핵산 나노입자는 타겟 헤드의 가이드에 의해 표적성을 구비하고 플루오레세인은 상기 핵산 나노입자가 시각성 및 추적 가능성을 구비하도록 한다.
실시예 2
1. 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자 벡터:
(1) 7 그룹의 RNA 나노입자를 구성하는 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열:
상기 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자 벡터의 단일 스트랜드는 모두 모두 sangon생물공학(상하이)주식유한회사에 의뢰하여 합성하였다.
2. 자기조립실험 단계
단계 (1): 1:1:1의 몰비로 RNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC water 또는 TMS 완충 용액에 용해시킨다.
단계 (2): 용액을 80℃로 가열 혼합하며, 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮춘다.
단계 (3): 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제한다.
단계 (4): 표적 밴드를 절단하고 RNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시켜 단 서열 RNA 자기조립 산물을 얻는다.
단계 (5): 전기 영동 분석 측정 및 레이저 스캔 관찰을 진행한다.
단계 (6): 전위를 측정한다.
3. 자기조립 실험 결과
(1) 전기 영동 측정 결과
7 그룹의 단 서열 RNA 자기조립 산물의 2% 아가로스 겔 전기 영동도는 도 3과 같다. 도 3에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 단 서열 R-1, R-2, R-3, R-4, R-5, R-6, R-7이다.
7 그룹의 단 서열 RNA 자기조립 산물의 4% 아가로스 겔 전기 영동도는 도 4와 같다. 도 4에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 단 서열 R-1, R-2, R-3, R-4, R-5, R-6, R-7이다.
도 3 및 도 4의 결과를 참조하면 7 그룹의 단 서열 자기조립 산물에서 R-2, R-3, R-5, R-7의 밴드는 선명하고 깨끗하고, R-1, R-4, R-6은 비록 확산되기는 하였으나 단일 밴드를 확인할 수 있기에, 7 그룹의 단 서열이 자기조립을 통해 RNA 나노입자 구조를 형성한 효과가 상대적으로 좋다는 것을 보여준다.
(2) 전위 측정
측정 방법: 전위샘플(자기조립 산물을 초순수에 용해)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
소프트웨어를 작동하고 메뉴 MeasUre€ManUal를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작한다.
측정 결과: 7 그룹의 단 서열 RNA 나노입자의 전위 측정 결과는 아래와 같다.
표 13:
상기 전위 측정 데이터를 참조하면, 7 그룹의 단 서열 RNA 자기조립 산물은 모두 우수한 안정성을 구비하고, 이는 각각의 단 서열 RNA가 자기조립을 통해 형성한 나노입자가 안정적인 자기조립 구조를 구비함을 설명한다.
상기 실시예는 상이한 a, b, c코어 서열 조합이 자기조립을 통해 핵산 구조적 도메인을 구비하는 RNA 나노입자를 형성하고 구조가 안정적임을 설명한다. 실시예 1의 기초상에서 이런 상이한 코어 서열 조합에 다양한 기능의 연장 단편을 추가하거나 타겟 헤드, 플루오레세인 등을 연결하면 마찬가지로 RNA 나노입자를 성공적으로 조립할 수 있고 약물 탑재, 세포 표적성 및 시각성 및 추적 가능성 및 성능을 구비할 수 있다.
이런 성능을 더 검증하기 위해, 실시예 2의 기초상에서 연장 단편을 추가하고 구체적으로 실시예 3을 참조하기 바란다. 실시예 2의 RNA 코어 서열에 대응되는 DNA 코어 서열 기초상에서 연장 단편을 추가하는 동시에 타겟 헤드를 연결하거나 연결하지 않을 수 있고 구체적으로 실시예 4에 도시된 바와 같다.
실시예 3
1. 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자 벡터:
(1) 7 그룹의 RNA 나노입자를 구성하는 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열:
상기 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자 벡터의 단일 스트랜드는 모두 수저우 GenePharma에 의뢰하여 합성하였고, 여기서 R-8 내지 R-14 중의 a 서열, b 서열, c 서열은 각각 R-1 내지 R-7의 a 서열, b 서열, c 서열의 기초상에서 연장 구간을 추가한 후 형성한 연장 RNA올리고뉴클레오타이드 서열이고, 표적 모듈 단편을 연장하기 않았으며, C/U 염기2'F 변형을 진행하였다(항 효소 분해성 및 안정성을 강화). 이밖에 상기 RNA 나노입자 R-14 중에서 한 구간의 Survivin의 siRNA 핵산 간섭 치료 단편을 변형시켰고, 구체적으로 a 스트랜드 3' 말단에서 Survivin siRNA의 센스 스트랜드(a스트랜드의 밑줄 친 부분)을 연장하였고, b 스트랜드의 5' 말단에서 안티센스 스트랜드(b 스트랜드의 밑줄 친 부분)을 연장 연결하여 염기쌍 상보를 형성한다.
2. 자기 조립 실험 단계:
단계 (1): 1:1:1의 몰비로 RNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC water 또는 TMS 완충 용액에 용해시킨다.
단계 (2): 용액을 80℃로 가열 혼합하며, 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮춘다.
단계 (3): 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제한다.
단계 (4): 표적 밴드를 절단하고 RNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시킨다.
단계 (5): 전기 영동 분석 측정 및 레이저 스캔 관찰을 진행한다.
단계 (6): 전위를 측정한다.
3. 자기조립 실험 결과
(1) 전기 영동 측정 결과
7 그룹의 일반 서열 RNA 자기조립 산물의 2% 아가로스 겔 전기 영동도는 도 5와 같다. 도 5에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 일반 서열 RNA 자기조립 산물 R-8, R-9, R-10, R-11, R-12, R13, R-14이다.
7 그룹의 일반 서열 RNA 자기조립 산물의 4% 아가로스 겔 전기 영동도는 도 6과 같다. 도 6에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 일반 서열 RNA 자기조립 산물 R-8, R-9, R-10, R-11, R-12, R13, R-14이다.
도 5 및 도 6의 결과를 참조하면 7 그룹의 일반 서열 RNA 자기조립 산물의 밴드는 선명하고 깨끗한 단일 밴드임을 보아낼 수 있다. 이는 7 그룹의 일반 서열이 모두 자기조립을 통해 나노 구조를 형성할 수 있음을 설명한다. 여기서 일반 서열 RNA 자기조립 산물 R-14 중에서 한 구간의 Survivin의 siRNA 핵산 간섭 치료 단편을 변형시킨 후에도 여전히 안정적인 자기조립 구조를 구비하고, 이는 본 발명의 핵산 나노입자가 핵산 약물을 탑재할 수 있고 핵산 약물의 전달 벡터 기능을 구비한다는 것을 설명한다.
(2) 전위 측정
측정 방법: 전위샘플(자기조립 산물을 초순수에 용해)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
소프트웨어를 작동하고 메뉴 MeasUre€ManUal를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작한다.
측정 결과: 7 그룹의 일반 서열 RNA 나노입자의 전위 측정 결과는 아래와 같다.
상기 전위 측정 데이터를 참조하면, 7 그룹의 일반 서열 RNA 자기조립 산물은 모두 우수한 안정성을 구비하고, 이는 각각의 일반 서열 RNA가 자기조립을 통해 형성한 나노입자가 안정적인 자기조립 구조를 구비함을 설명한다.
상기 실시예는 상이한 조합의 RNA 코어 서열 기초상에서 연장 단편을 추가하면 마찬가지로 자기조립을 통해 구조가 안정적인 RNA 나노입자를 성공적으로 형성할 수 있음을 설명한다. 아울러 연장 단편을 추가하면 RNA 나노입자가 우수한 약물 탑재 성능을 구비한다(구체적으로 실시예 5 및 실시예 7을 참조).
실시예 4
1. 7 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자 벡터:
(1) 7 그룹의 DNA 나노입자를 구성하는 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열:
표에서 일부 a 스트랜드는 EGFRapt 타겟 헤드 또는 PSMAapt(A9L) 타겟 헤드를 연장하였다.
EGFRapt(서열번호 97): GCCTTAGTAACGTGCTTTGATGTCGATTCGACAGGAGGC;
PSMAapt(A9L, 서열번호 98):
GGGCCGAAAAAGACCTGACTTCTATACTAAGTCTACGTCCC.
상기 7 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자의 단일 스트랜드는 모두 수저우 GenePharma에 의뢰하여 합성하였고, 여기서
D-1은 전술한 코어 서열(8)(a 서열: 5'-GGAGCGTTGG-3', b 서열: 5'-CCTTCGCCG-3', c 서열: 5'-CGGCCATAGCCC-3')의 기초상에서 EGFRapt 타겟 헤드(밑줄 친 부분 참조)를 포함하는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자;
D-2는 전술한 코어 서열(9)(a 서열: 5'-GCAGCGTTCG-3', b 서열: 5'-CGTTCGCCG -3', c 서열: 5'-CGGCCATAGCGC-3')의 기초상에서 EGFRapt 타겟 헤드(밑줄 친 부분 참조)를 포함하는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자;
D-3은 전술한 코어 서열(10)(a 서열: 5'-CGAGCGTTGC -3', b 서열: 5'-GCTTCGCCG -3', c 서열: 5'-CGGCCATAGCCG -3')의 기초상에서 EGFRapt 타겟 헤드(밑줄 친 부분 참조)를 포함하는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자;
D-4는 전술한 코어 서열(11)(a 서열: 5'-GGAGCGTTGG -3', b 서열: 5'-CCTTCGGGG -3', c 서열: 5'-CCCCCATAGCCC -3')의 기초상에서 PSMAapt 타겟 헤드(밑줄 친 부분 참조)를 포함하는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자;
D-5는 전술한 코어 서열(12)(a 서열: 5'-GCAGCGTTCG -3', b 서열: 5'-CGTTCGGCG -3', c 서열: 5'-CGCCCATAGCGC -3')의 기초상에서 PSMAapt 타겟 헤드(밑줄 친 부분 참조)를 포함하는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자;
D-6은 전술한 코어 서열(13)(a 서열: 5'-GCAGCGTTCG -3', b 서열: 5'-CGTTCGGCC -3', c 서열: 5'-GGCCCATAGCGC -3')의 기초상에서 타겟 헤드 구조를 포함하지 않는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자;
D-7은 전술한 코어 서열(14)(a 서열: 5'-CGAGCGTTGC -3', b 서열: 5'-GCTTCGGCG -3', c 서열: 5'-CGCCCATAGCCG -3')의 기초상에서 타겟 헤드 구조를 포함하지 않는 연장 서열을 추가한 후 형성한 일반 서열 DNA 나노입자이다.
2. 자기 조립 실험 단계:
단계 (1): 1:1:1의 몰비로 DNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC water 또는 TMS 완충 용액에 용해시킨다.
단계 (2): 용액을 95℃로 가열 혼합하며, 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮춘다.
단계 (3): 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제한다.
단계 (4): 표적 밴드를 절단하고 DNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시켜 일반 서열 DNA 자기조립 산물을 얻는다.
단계 (5): 전기 영동 분석 측정 및 레이저 스캔 관찰을 진행한다.
단계 (6): 전위를 측정한다.
단계 (7): 입경을 측정한다.
단계 (8): 투사전자현미경으로 관찰한다.
3. 자기조립실험 결과
(1) 전기 영동 측정 결과
7 그룹의 일반 서열 DNA 자기조립 산물의 2% 아가로스 겔 전기 영동도는 도 7과 같다. 도 7에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 일반 서열 DNA 자기조립 산물D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7이다.
7 그룹의 일반 서열 DNA 자기조립 산물의 4% 아가로스 겔 전기 영동도는 도 8과 같다. 도 8에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 일반 서열 DNA 자기조립 산물D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7이다.
도 7 및 도 8의 결과를 참조하면 7 그룹의 일반 서열 DNA 자기조립 산물의 밴드는 모두 선명하고 깨끗함을 보아낼 수 있다. 이는 7 그룹의 일반 서열 DNA 스트랜드가 모두 자기조립을 통해 안정적인 나노입자 구조를 형성하였음을 설명한다. 여기서 D-6, D-7 2그룹의 자기조립 구조는 EGFRapt 또는 PSMAapt 타겟 헤드를 포함하기에, 분자량이 약간 작고 그 밴드 위치도 다른 밴드보다 현저히 앞에 위치하기에, 실질적으로 이론적인 상황에 완전히 부합되며 자기조립 구조의 안정성을 더 증명한다.
상기 실시예는 상이한 조합의 DNA 코어 서열 기초상에서 다양한 기능의 연장 단편을 추가하거나 타겟 헤드를 동시에 연결하면 마찬가지로 자기조립을 통해 DNA 나노입자를 성공적으로 형성할 수 있고, 마찬가지로 약물 탑재, 세포 표적성 및 시각성 및 추적 가능성 및 성능을 구비할 수 있음을 설명한다(구체적으로 실시예 6 및 실시예 8을 참조).
(2) 전위 측정
측정 방법: 전위샘플(자기조립 산물을 초순수에 용해)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
소프트웨어를 작동하고 메뉴 MeasUre€ManUal를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작한다.
측정 결과: 3 그룹의 일반 서열 DNA 나노입자의 전위 측정 결과는 아래와 같다.
상기 전위 측정 데이터를 참조하면, 3 그룹의 일반 서열 RNA 자기조립 산물은 모두 우수한 안정성을 구비하고, 이는 각각의 일반 서열 RNA가 자기조립을 통해 형성한 나노입자가 안정적인 자기조립 구조를 구비함을 설명한다.
(3) 입경 측정
1. 전위샘플(일반 서열 DNA 자기조립 산물D-7)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
2. 소프트웨어를 작동하고 메뉴를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
3. 소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
4. 확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작하며, 자기조립 산물 D-7의 유체 동역학 사이즈의 DLS 측정값 결과는 아래와 같다.
(4) 투사전자현미경 관찰 결과
상기 일반 서열 DNA 자기조립 산물 D-7를 투사전자현미경으로 조사하며 단계는 아래와 같다.
1. 샘플 한 방울을 취하고 400 메쉬 탄소 코팅 구리 그리드에 실온에서 1 분 동안 현탁한다.
2. 여과지로 액체를 흡수한다.
3. 2 % 우라닐 아세테이트로 1 분 동안 염색한다.
4. 여과지를 흡수하여 건조시키고 실온에서 건조시킨다.
5. JEM -1400 투사 전자 현미경 120kv로 관찰하고 사진을 찍는다.
결과는 도 9와 같고, 도면에서 상기 일반 서열 DNA 자기조립 산물 D-7이 하나의 전체 구조임을 보아낼 수 있으며, 이가 T형 구조임을 똑똑히 보아낼 수 있다.
독소루비신(Dox) 탑재 실험
실시예 5
화학적 탑재:
1. 실험 재료 및 실험 방법
1. 실험 재료 및 시약:
(1) 핵산 나노입자: 실시예 1 중의 RNA 나노입자
(2) DEPC water: Beyotime
(3) PBS 완충 용액: cellgro
(4) 4% 파라포름알데하이드
(5) 독소루비신(Dox)
(6) 클로로포름: 베이징케미칼
(7) 무수에탄올: 베이징케미칼
2. 실험 방법:
(1) 독소루비신(5.0 mg, 8.6 μmol, 40 eq.)을 정확하게 계량하고 DEPC water (1.8㎖)과 PBS 완충 용액(2.1㎖)에 용해시키며 아이스배스로 냉각하고 4 % 파라포름알데하이드 수용액(0.4㎖)에 첨가하여 잘 섞고 이 혼합물을 모두 RNA 나노입자 (215 n㏖)와 섞고 어두운 조건에서 4℃에서 72 시간 동안 반응시킨다.
(2) 반응 용액 10㎕를 취하여 10배로 희석한 후 50μM 독소루비신 수용액과 310 ng/㎕ RNA 나노입자를 대조로 취하여 동일 부피 주입으로 HPLC 분석을 수행한다. 각 성분의 피크 면적 비율에 따라 기본적으로 반응 전환이 완료된 것으로 판단할 수 있다.
(3) 반응 용액을 클로로포름(10㎖x3)으로 추출한 다음 10 배 부피의 무수에탄올을 첨가하고 잘 섞은 후 어두운 곳에서 4℃에 두어 제품이 완전히 석출되도록 한다 (4 시간). 원심 분리하고 상층액을 옮기고 고체 생성물을 에탄올로 다시 세척하고 저온 및 감압 조건에서 용매를 증발시켜 얻은 탐재 산물은 흑적색 고체이다.
(4) 소량의 산물을 DEPC water에 녹여 8 % PAGE gel에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃에서 1 시간 동안 100V 전기 영동을 수행하고 전기 영동 결과는 도 10과 같다. 도 10에서 왼쪽에서 오른쪽으로 레인 1 내지 5는 각각 1) 20bp DNA ladder, 2-4) RNA 나노입자 블랭크 입자, 5) 독소루비신 탑재 제품이다. 도 10에서 독소루비신 탑재 산물 밴드가 RNA 나노입자 블랭크 입자의 약간 뒤에 위치함을 알 수 있다.
(5) 탑재율 계산
1.농도를 이미 알고 있는 독소루비신-PBS 표준액을 준비하고 2uM, 4uM, 6uM, 8uM, 10uM를 각각 100ul 준비한다.
2.독소루비신 탑재 산물을 100ul PBS에 용해시킨다.
3.표준용액과 독소루비신 탑재 산물을 PCR 플레이트에 넣고, 85℃에서 5min 가열한 후 실온까지 냉각한다.
4.효소 표지 장치를 이용하여 492㎚ 부분 독소루비신의 흡광도를 측정하고, 표준 곡선(도 11)을 제작하여 탑재 산물 중 독소루비신의 몰농도를 계산한다.
5.분광 광도계를 이용하여 260㎚ 부분 RNA의 흡광도를 측정하여 각각의 샘플 중 독소루비신 탑재 산물을 함유하는 질량 농도를 얻는다.
6.측정된 독소루비신 몰농도 및 독소루비신 탑재 산물의 질량 농도에 따라 탑재율을 계산한다.
계산 과정은 아래와 같다.
CRNAh-1 = 9.5 ug/ul, MRNAh 
30000, 100ul; C 독소루비신-1 = 8.033 uM, 100ul;
CRNAh-2 = 1.21 ug/ul, MRNAh 
30000, 100ul; C 독소루비신-1 = 9.200 uM, 100ul;
N-1 및 N-2의 평균값을 취하여 얻은 RNAh-독소루비신의 탑재율은 약 24이고, 각각의 핵산 나노입자 벡터에 약 24개의 독소루비신 분자가 탑재될 수 있음을 의미한다.
물리적 탑재
1)독소루비신과 RNA 나노입자의 질량비는 1:1이다.
2) 0.1mg독소루비신 원약을 계량하여 50ul DMSO에 용해시킨 다음 300ul PBS에 첨가하여 잘 섞는다.
3) RNA입자를 200ul DEPC water에 용해시키고, 독소루비신-PBS 혼합액에 첨가하며 잘 섞어 pH를 약 7.5로 조절한다.
4) 모든 용액을 55℃ 서모 스탯 워터 배스에 넣고 3h 동안 반응시킨다.
5) 반응이 끝난 후 10개 부피의 무수에탄올을 직접 첨가하고 4℃에서 4h 석출시킨다.
6) 10배 무수에탄올로 4번 세척하고, 1.5mL EP튜브에 전이시킨다. 다음 탑재율을 측정하고 측정 방법은 전술한 바와 같으며 측정 결과 독소루비신 탑재율은 15.5이다.
실시예 5는 연장 단편, 타겟 헤드 및 플루오레세인을 구비하는 RNA 나노입자(실시예 1)가 약물 탑재 기능을 구비하고, 물리적 인터칼레이션 및 공유 결합 연결(파라포름알데하이드 - 용매 공유) 방식을 통해 약물 탑재를 실현할 수 있음을 보여준다.
실시예 6
실시예 5의 화학적 탑재 방법(특별한 한정이 없는 한 방법은 실시예 5와 같음)으로 각각 전술한 실시예 1 중 DNA 나노입자, 실시예 2 중의 R-1, R-2, R-3, R-4, R-5, R-6, R-7이 자기조립을 통해 형성한 RNA 나노입자, 실시예 4 중 D-2, D-6 및 D-7이 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자를 독소루비신 탑재 벡터로 하여 독소루비신 탑재율을 측정한 결과는 각각 아래와 같다.
실시예 1 중의 DNA 나노입자의 독소루비신 탑재율은 300(상기 방법에서 독소루비신은 1.2mg, DEPC water는 0.5mg, PBS 완충 용액은 8.5ml, 4% 파라포름알데하이드 수용액은 1ml, DNA 나노입자는 2.5n㏖, DNA 나노입자는 20㎕ 물에 욕해)이다.
RNA 나노입자 R-1의 독소루비신 탑재율은 3.5;
RNA 나노입자 R-2의 독소루비신 탑재율은 2.4;
RNA 나노입자 R-3의 독소루비신 탑재율은 4.8;
RNA 나노입자 R-4의 독소루비신 탑재율은 3.5;
RNA 나노입자 R-5의 독소루비신 탑재율은 12.5;
RNA 나노입자 R-6의 독소루비신 탑재율은 2.8;
DNA 나노입자 D-2의 독소루비신 탑재율은 14;
DNA 나노입자 D-6의 독소루비신 탑재율은 11;
DNA 나노입자 D-7의 독소루비신 탑재율은 10이다.
유세포 분석기(FACS) 실험을 통해 RNA 나노입자의 세포 결합 능력을 측정
실시예 7
1. 실험 재료 및 실험 방법:
1. 피측정 샘플은 표 40과 같다.
주: 표에서 RNAh는 실시예 1 중 자기조립을 통해 형성된 RNA 나노입자 중 Biotin변형을 진행하지 않은 대조 나노입자이고, RNAh-Biotine-quasar670은 실시예 1 중 자기조립을 통해 형성된 RNA 나노입자의 5' 말단을 quasar670 플루오레세인 변형 후 형성한 나노입자이며, RNAh-Biotine-quasar670-Dox는 독소루비신약물을 탑재한 후(실시예 5에서 화학적 탑재) 형성한 나노입자이다.
2. 사용된 실험 시약 및 그 기원은 아래와 같다.
RPMI-1640 배지(Gibco, C11875500BT-500㎖); 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)(ExCell Bio, FNA500-500㎖); 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin, PS) (Gibco, 15140-122-100㎖); PBS 완충 용액(Gibco, C20012500BT-500㎖); Trypsin-EDTA(Stemcell, 07901-500㎖); DMSO(Sigma, D5879-1 L).
3. 사용된 실험 장치는 아래와 같다.
도립 현미경(Inverted Microscope) (Olympus IX71, TH4-200); 유세포 분석기(Flow Cytometer) (Life Science, Attune NxT).
4. 실험 방법:
(1) RPMI1640 + 10% FBS + 1% PS 배지를 사용하고, 37℃ 및 5% CO2에서 HepG2 세포를 배양한다.
(2) 판크레아틴으로 HepG2 세포를 소화시키고 PBS로 한 번 세척한다.
(3) 각각 2×105개 세포와 RNAh, RNAh-Biotin-quasar670, RNAh-Biotin-quasar670-Dox 나노입자를 함께 37 ℃ 및 5% CO2에서 1 h 인큐베이션하고, 각각의 샘플은 각각 200nM 및 400nM 2개의 농도를 구비하고 각 농도에서 각 샘플은3번 반복된다.
(4) 세포는 PBS로 세척한 후 PBS 완충 용액으로 재현탁 시키고 FACS 장치로 측정한다.
(5) 데이터를 수집하고 통계 분석한다.
2. 실험 결과
실험 결과는 표 41, 도 12 및 도 13과 같다.
도 12에서, A는 HepG2 세포 대조군에 해당되고, B는 200nM 농도의 RNAh 대조 나노입자에 해당되며, C는 200nM 농도의 RNAh-Biotin-quasar670 나노입자에 해당되고, D는 200nM 농도의 RNAh-Biotin-quasar670-Dox 나노입자에 해당되며, E는 400nM 농도의 RNAh 대조 나노입자에 해당되고, F는 400nM 농도의 RNAh-Biotin-quasar670 나노입자에 해당되며, G는 400nM 농도의 RNAh-Biotin-quasar670-Dox 나노입자에 해당된다. 표 41 및 도 12을 참조하면, 단순한 타겟 헤드 변형을 진행하지 않은 RNA 나노입자는 세포 표적성을 구비하지 않고, 비오틴 탑재 후 HepG2 세포와 결합할 수 있다. 이밖에 도 12의 FACS 결과는 RNAh-Biotin-quasar670 및 RNAh-Biotin-quasar670-Dox 나노입자가 HepG2 세포와의 결합 능력이 강함을 보여준다(P< 0.0001).
도 13은 현미경으로 측정한 나노입자와 HepG2 세포 결합 및 인터널리제이션 결과이다. 세포 결합 및 인터널리제이션 실험 결과에 따르면, RNAh-Biotin-quasar670 및 RNAh-Biotin-quasar670-Dox 나노입자는 모두 HepG2 세포와 세포 결합 및 인터널리제이션할 수 있다(여기서 독소루비신이 탑재된 나노입자 RNAh-Biotin-quasar670-Dox와 HepG2 세포가 공동 인큐베이션 후 세포가 현저히 빨갛게 물들고, RNAh-Biotin-quasar670-Dox 나노입자 농도 및 시간이 증가됨에 따라 색깔이 짙어진다. 약물 탑재 RNA 나노입자와 HepG2 세포 결합 및 인터널리제이션 능력이 강함을 보아낼 수 있다. RNAh-Bio-quasar670도 마찬가지로 HepG2 세포와 결합 및 인터널리제이션하는 능력을 구비하지만 Dox를 함유하지 않기에 빨갛게 물들지 않는다).
실시예 8
1. 실험 재료 및 실험 방법:
1. 피측정 샘플은 표 42와 같다.
주: DOX-D-1-EGFR는 전술한 실시예 4 중 자기조립을 통해 형성된 DNA 나노입자 D-1에 독소루비신 탑재(탑재 단계는 실시예 5과 같고 이하 동일) 후 형성한 나노입자이고(D-1 자체에 EGFR이 탑재되고 여기서 DOX-D-1-EGFR라고 표시하는 이유는 타겟 헤드 유형 및 독소루비신의 탑재를 명확히 하기 위함임, 이하 동일); DOX-D-2-EGFR는 전술한 실시예 중 자기조립을 통해 형성된 DNA 나노입자 D-2에 독소루비신 탑재 후 형성한 나노입자이며; DOX-D-5-PSMA는 전술한 실시예 중 자기조립을 통해 형성된 DNA 나노입자 D-5에 독소루비신 탑재후 형성한 나노입자이다.
2. 세포 정보는 표 43과 같다.
3. 사용된 실험 시약 및 그 기원
RPMI-1640 배지 (YY0167-500Ml);
MEM(YS4150-500㎖);
MEM NEAA (100×) (GBICO, Cat#1872982);
FBS소태아 혈청 (GBICO, Cat#10099141).
4. 사용된 실험 장치는 아래와 같다.
유세포 분석기Guava EasyCyte 8HT (Millipore);
SpectraMax다기능 마이크로플레이트 측정기, MD, 2104-0010A.
5. 실험 방법:
5.1 세포 배양
a)
세포를 대응되는 배지에 동결해지하고, 37℃, 5% CO2 세포 배양 박스에서 배양한다.
b)
세포를 T75 세포 배양 플라스크에 넣고 대수성장기에 도달하면(약 80% 합류도) 원 배지를 엽산 및 비오틴을 함유하지 않는 배지로 교체한다.
5.2 결합 실험
a) 첫 날 세포를 수집하고 계수를 진행하며 2×105 cell/well의 밀도로 24 웰 플레이트에 플레이팅한다.
b) 두 번째 날 PBS를 사용하여 샘플을 희석한다. PBS를 사용하여 모든 샘플을 100μM로 희석하고, 1μM 용액을 제조하며, 효소 표지 장치에서 형광 그룹(독소루비신: Ex=480㎚, Em=580㎚)의 정상 발광 여부를 측정한다.
c) PBS로 세포를 2번 세척한다.
d) 배지에 용해되는 나노입자를 첨가하고, 37℃의 CO2 배양 박스에서 세포를 16h 동안 인큐베이션한다. 나노입자 농도는 2μM이고, 샘플 순서는 아래 표 44와 같다.
e) PBS로 세포를 2번 세척한다.
f) 트립신 소화 세포를 수집하고 PBS로 세포를 2번 세척한다.
g) PBS로 세척한 세포를 400uL PBS에 재현탁시키, 하나의 5㎖ 유세포 튜브에 전이시킨다.
h) 유세포 분석기에 로딩 전 샘플은 빛으 보지 말아야 한다.
i) 유세포 분석기로 측정한다. 독소루비신이 Ex=480㎚, Em=580㎚(황색 레인)에서 세포 형광 강도가 측정되었다.
j) FlowJo 소프트웨어로 FACS 데이터를 분석한다.
k) 세포 블랭크 배경 형광 강도 수사적 물음에 따라, 각 DNA 나노입자와 세포 결합 비율을 분석한다.
2. 실험 결과
실험 결과는 표 45, 46 및 47과 같다.
상기 표 46, 47의 데이터 결과를 참조하면, DOX-D-1-DNAh-EGFR와 U87MG 세포의 세포의 결합 능력이 아주 강하고 투여 농도가 2uM, 투여 시간이 16h일 경우 결합 효율이 100%이다. DOX-D-2-EGFR와 MDA-MB-231 세포의 결합 능력이 아주 강하고, 투여 농도가 2uM, 투여 시간이 16h일 경우 결합 효율이 100%이다. DOX-D-3-EGFR와 HCC-78 세포의 결합 능력이 아주 강하고, 투여 농도가 2uM, 투여 시간이 16h일 경우 결합 효율이 100%이다. 다른 핵산 나노입자(RNA 나노입자 및 나머지 DNA 나노입자를 포함)는 모두 EGFRapt 또는 PSMAapt를 포함하거나 연장 구간을 추가하는 방식을 통해 DOX-D-1-DNAh-EGFR, DOX-D-2-EGFR 또는 DOX-D-5-PSMA와 동일한 타겟 헤드 EGFRapt 또는 PSMAapt를 포함하기에, 상응한 세포에 해당되는 결합 효율을 구비한다. 이밖에, DOX-D-1-DNAh-EGFR, DOX-D-2-EGFR 또는 DOX-D-5-PSMA와 동일한 약물 탑재 서열(GC 탑재 부위 서열)을 포함하기에 상응한 약물 탑재 기능을 구비한다.
핵산 나노입자가 혈청에서의 안정성 측정
실시예 9
1. 실험 재료 및 실험 방법
1. 피측정 샘플: PBS 용액에 용해된 실시예 1에서 제조된 RNA 나노입자.
2. 실험 시약:
RPMI-1640 배지 (Gibco, C11875500BT-500㎖); 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) (ExCell Bio, FNA500-500㎖); 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin, PS) (Gibco, 15140-122-100㎖); PBS 완충 용액 (Gibco, C20012500BT-500㎖); Novex™ Tris-Glycine Native Sample Buffer (2X) (Invitrogen, LC2673-20㎖); Novex™ 8% Tris-Glycine Mini Gels (Invitrogen, XP00080BOX-1.0 mm); Tris-Glycine Native Running buffer (10x) (Life science, LC2672-500㎖); G250 염색약 (Beyotime, P0017-250㎖).
3. 실험 장치:
분광 광도계(Spectrophotometer) (Thermo, ND2000C); Mini Gel Tank (Invitrogen, PS0301); 이미징 시스템(Imaging System) (Bio-Rad, ChemiDoc MP).
4. 실험 방법:
(1) 350㎕ PBS를 취하여 RNA 나노입자 샘플에 넣고 충분히 혼합한다.
(2) 2μM의 RNA 나노입자를 10% 혈청 함유 RPMI 1640 배지에서 인큐베이션한다.
(3) 37℃에서 10 min, 1 h, 12 h, 36 h동안 인큐베이션한 후 각각 샘플링한다.
(4) NanoDrop 정량 후, 200 ng의 RNA 나노입자를 취하고 같은 부피의 Tris-Glycine SDS 샘플 완충 용액(2X)을 첨가하여 충분히 혼합한다.
(5) Novex™ 8% Tris-Glycine Mini gel 한 덩어리를 취하고 순서에 따라 로딩하며 프로그램을 200 V, 30 min로 설정하고 전기 영동을 시작한다.
(6) 전기 영동이 끝나면 G250 염색을 진행하고 수평 진동대에 30 min-1h 두었다가 촬영하여 이미징을 진행한다.
2. 실험 결과
전기 영동 측정 결과는 도 14 및 도 15와 같다. 여기서 도 14는 8% 비변성 겔의 전기 영동 결과(Coomassie Blue 프로그램)를 보여주고, 도 15는 8% 비변성 겔의 전기 영동 결과(Stain Free Gel 프로그램)를 보여준다. RNA 나노입자의 혈청 안정성 시험 결과에 따르면, 10 min, 1 h, 12 h 및 36 h의 비변성 겔 결과는(도 14 및 도 15), 상이한 시간에 RNA 나노입자 샘플 밴드가 현저한 차이가 없고 이는 RNA 나노입자가 10% FBS의 1640배지에서 비교적 안정적이고 유의적인 분해가 없다는 것을 설명한다.
RNA 나노입자가 HepG2 세포에서의 세포 독성 연구
실시예 10
1. 실험 재료 및 실험 방법
1. 피측정 샘플은 실시예 7 중의 3개의 샘플이다.
2. 실험 시약:
RPMI-1640 배지 (Gibco, C11875500BT-500㎖); 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) (ExCell Bio, FNA500-500㎖); 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin, PS) (Gibco, 15140-122-100㎖); PBS 완충 용액 (Gibco, C20012500BT-500㎖); Trypsin-EDTA (Stemcell, 07901-500㎖); DMSO (Sigma, D5879-1 L); Dox (HISUN Pharm, H33021980-10 mg); CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (CTG) (Promega, G7572-100㎖).
3. 실험 장치:
도립 현미경(Inverted Microscope) (Olympus IX71, TH4-200); 96웰 플레이트 리더기(96-well Plate Reader)(Molecular Devices, Flexstation 3).
4. 실험 방법:
(1) RPMI1640 + 10% FBS + 1% PS 배지를 사용하고, 37℃ 및 5% CO2에서 HepG2 세포를 배양한다.
(2) 판크레아틴으로 HepG2 세포를 소화시키고 웰당 5000개 세포 100㎕를 96웰 플레이트에 접종하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하고 하룻밤 지새운다.
(3) 두 번째 날 세포 상청을 제거하고, 배지를 사용하여 피측정 샘플을 희석하며, 각각 200nM의 RNAh, RNAh-Biotine, RNAh-Dox 및 Dox를 첨가하고, 각 100㎕를 세포 플레이팅하고 각각의 샘플은 4번 반복한다.
(4) 72 h배양 후 웰당 CTG시약 100㎕를 첨가하고, 2min 진탕하며 실온에서 10min 동안 정치하며 전체 과정은 빛이 없는 조건에서 수행된다.
(5) 마지막으로 Soft Max Pro5 소프트웨어를 사용하여 수치를 판독한다.
2. 실험 결과:
실험 결과는 표 49 및 도 16과 같고, 도 16에서, a는 PBS의 세포 증식 결과에 해당되고, b는 DMSO의 세포 증식 결과에 해당되며, c는 Dox(독소루비신)의 세포 증식 결과에 해당되고, d는 RNAh의 세포 증식 결과에 해당되며, e는 RNAh-Biotin-quasar670의 세포 증식 결과에 해당되고, f는 RNAh-Biotin-quasar670-Dox의 세포 증식 결과에 해당된다.
표 49 및 도 16를 참조하면 CTG 결과에 따르면 200nM 약물 탑재 나노입자 RNAh-Biotine-Dox는 HepG2 세포에 대해 현저한 세포 독성이 있고(P< 0.0001), 200nM RNAh-Biotine는 HepG2 세포에 대해 세포 독성이 없다.
핵산 나노입자의 조립
실시예 11
1. 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자 벡터:
(1)7 그룹 구성 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자의 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열:
2. 자기조립 시험 단계:
단계 (1): 1:1:1의 몰비로 RNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC water 또는 TMS 완충 용액에 용해시킨다.
단계 (2): 용액을 80℃로 가열 혼합하며, 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮춘다.
단계 (3): 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제한다.
단계 (4): 표적 밴드를 절단하고 RNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시킨다.
단계 (5): 전기 영동 분석 측정 및 레이저 스캔 관찰을 진행한다.
단계 (6): 전위를 측정한다.
단계 (7): 입경을 측정한다.
단계 (8): Tm 값을 측정한다.
3. 자기조립 시험 결과
(1)전기 영동 측정
주요 시약 및 장치는 아래와 같다.
② 처리 후의 샘플 10㎕(500ng)과 2㎕ 6×DNA Loading Buffer를 취하여 균일하게 혼합하고 얼음 위에서 조작하며 라벨링을 잘해둔다.
③ 8% 비변성 PAGE 겔을 취하고 인큐베이션 시간이 다른 샘플에 겔 조각을 놓고 12㎕ 처리된 샘플 전부를 로딩하며, 겔이 100V에서 40 min 동안 작동하도록 프로그램을 설정한다.
④ 전기 영동이 끝나면 염색을 진행하고 수평 진동대에서 30 min간 천천히 진탕시키고 촬영하여 이미징을 진행한다.
측정 결과:
7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 자기조립 산물의 비변성 PAGE 겔의 전기영동 결과는 도 17과 같다. 도 17에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 자기조립 산물 R-15, R-16, R-17, R-18, R-19, R-20, R-21이다.
도 17의 결과를 참조하면, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 자기조립 산물의 밴드가 모두 선명하고 깨끗하며, 이는 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 스트랜드가 모두 자기조립을 완료하여 안정적인 나노입자 구조를 형성했음을 설명한다.
(2) 전위 측정
측정 방법: 전위샘플(자기조립 산물을 초순수에 용해)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
소프트웨어를 작동하고 메뉴 MeasUre€ManUal를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작한다.
측정 결과: 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자의 25℃ 전위 측정 결과는 아래와 같다.
상기 전위 측정 데이터를 참조하면, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자는 모두 우수한 안정성을 구비하고, 이는 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA가 자기조립을 통해 형성한 나노입자가 안정적인 자기조립 구조를 구비함을 설명한다.
(3) 입경 측정
1. 전위샘플(7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
2. 소프트웨어를 작동하고 메뉴를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
3. 소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
4. 확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작하며, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA의 유체 동역학 사이즈의 DLS 측정값 결과는 아래와 같다.
(4) TM 값 측정
용해 곡선법을 사용하여 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자의 TM 값을 측정하고 샘플은 전위 샘플과 같다.
시약 및 장치는 아래와 같다.
단계:
① 샘플은 초순수로 희석한 후 5㎍의 희석을 거쳐 얻은 샘플과 2㎕ SYBR Green I염료(1:200 희석)를 혼합하여 최종 부피가 20㎕이고, 희석 농도는 아래와 같다.
② 실온에서 어두운 조건에서 30 min 동안 인큐베이션한다.
③ 장치에 넣어 측정하고 프로그램을 설정하여 20℃에서 시작하고 초당 0.1℃로 승온하며 95℃까지 승온하고 5s에 한 번 수치를 판독한다.
측정 결과:
7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자의 TM 값은 아래와 같다. R-15의 용해도 곡선은 도 18에 도시된 바와 같고, R-16의 용해도 곡선은 도 19에 도시된 바와 같으며, R-17의 용해도 곡선은 도 20에 도시된 바와 같고, R-18의 용해도 곡선은 도 21에 도시된 바와 같으며, R-19의 용해도 곡선은 도 22에 도시된 바와 같고, R-20의 용해도 곡선은 도 23에 도시된 바와 같으며, R-21의 용해도 곡선은 도 24에 도시된 바와 같다. RNA 샘플 특이성으로 인해 금번 측정은 20 내지 90℃ 범위 내에서 1/2 RFUmax 값에 대응되는 온도가 샘플 Tm 값이다.
7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자의 TM 값이 모두 상대적으로 높고 이는 자기조립 산물이 우수한 구조적 안정성을 구비함을 설명한다.
실시예 12
1. 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자 벡터:
(1) 7 그룹의 구성된 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자의 3 스트랜드 폴리뉴클레오타이드 염기 서열:
2. 자기조립 시험 단계:
단계 (1): 1:1:1의 몰비로 DNA 단일 스트랜드 a, b, c를 동시에 혼합하여 DEPC water 또는 TMS 완충 용액에 용해시킨다.
단계 (2): 용액을 95℃로 가열 혼합하며, 5min 유지 후 2℃/min의 속도로 천천히 실온까지 온도를 낮춘다.
단계 (3): 산물을 8%(m/v) 비변성 PAGE 겔에 로딩하고 TBM 완충 용액에서 4℃ 조건에서 100V 전기 영동을 통해 복합체로 정제한다.
단계 (4): 표적 밴드를 절단하고 RNA 용출 완충 용액에서 37℃로 용출한 다음 에탄올로 침전시켜 하룻밤 지난 후 감압 및 저온 조건에서 휘발 건조시켜 DNA 자기조립 산물을 얻는다.
단계 (5): 전기 영동 분석 측정 및 레이저 스캔 관찰을 진행한다.
단계 (6): 전위를 측정한다.
단계 (7): 입경을 측정한다.
단계 (8): Tm 값을 측정한다.
3. 자기조립 시험 결과
(1)전기 영동 측정
주요 시약 및 장치는 아래와 같다.
단계: ① DNA 나노입자를 아래 표 81의 방법으로 초순수로 희석한다.
② 처리 후의 샘플 10㎕(500ng)과 2㎕ 6×DNA Loading Buffer를 취하여 균일하게 혼합하고 얼음 위에서 조작하며 라벨링을 잘해둔다.
③ 8% 비변성 PAGE 겔을 취하고 인큐베이션 시간이 다른 샘플에 겔 조각을 놓고 12㎕ 처리된 샘플 전부를 로딩하며, 겔이 100V에서 40 min 동안 작동하도록 프로그램을 설정한다.
④ 전기 영동이 끝나면 염색을 진행하고 수평 진동대에서 30 min간 천천히 진탕시키고 촬영하여 이미징을 진행한다.
측정 결과:
7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 자기조립 산물의 비변성 PAGE 겔의 전기영동 결과는 도 25와 같다. 도 25에서 레인 1 내지 7은 왼쪽에서 오른쪽까지 순차적으로 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 자기조립 산물D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13, D-14이다.
도 37의 결과를 참조하면, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 자기조립 산물의 밴드가 모두 선명하고 깨끗하며, 이는 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 스트랜드가 모두 자기조립을 완료하여 안정적인 나노입자 구조를 형성했음을 설명한다.
(2) 전위 측정
측정 방법: 전위샘플(자기조립 산물을 초순수에 용해)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
소프트웨어를 작동하고 메뉴 MeasUre€ManUal를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작한다.
측정 결과: 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자의 25℃ 전위 측정 결과는 아래와 같다.
상기 전위 측정 데이터를 참조하면, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자는 모두 우수한 안정성을 구비하고, 이는 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA가 자기조립을 통해 형성한 나노입자가 안정적인 자기조립 구조를 구비함을 설명한다.
(3) 입경 측정
①. 전위샘플(7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA)을 샘플 풀에 넣어 준비하고 장치의 샘플 풀 뚜껑을 열고 샘플을 넣는다.
②. 소프트웨어를 작동하고 메뉴를 클릭하면 수동 측정 파라미터 설정 다이얼로그 박스가 표시된다.
③. 소프트웨어 측정 파라미터를 설정한다.
④. 확인을 클릭하여 설정을 완료하면 측정 다이얼로그 박스가 표시되고 Start를 클릭하여 시작하며, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA의 유체 동역학 사이즈의 DLS 측정값 결과는 아래와 같다.
(4) TM 값 측정
용해 곡선법을 사용하여 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자의 TM 값을 측정하고 샘플은 전위 샘플과 같다.
시약 및 장치는 아래와 같다.
단계:
① 샘플은 초순수로 희석한 후 5㎍의 희석을 거쳐 얻은 샘플과 2㎕ SYBR Green I염료(1:200 희석)를 혼합하여 최종 부피가 20㎕이고, 희석 농도는 아래와 같다.
② 실온에서 어두운 조건에서 30 min 동안 인큐베이션한다.
③ 장치에 넣어 측정하고 프로그램을 설정하여 20℃에서 시작하고 초당 0.1℃로 승온하며 95℃까지 승온하고 5s에 한 번 수치를 판독한다.
측정 결과:
7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자의 TM 값은 아래와 같다. D-8의 용해도 곡선은 도 26에 도시된 바와 같고, D-9의 용해도 곡선은 도 27에 도시된 바와 같으며, D-10의 용해도 곡선은 도 28에 도시된 바와 같고, D-11의 용해도 곡선은 도 29에 도시된 바와 같으며, D-12의 용해도 곡선은 도 30에 도시된 바와 같고, D-13의 용해도 곡선은 도 31에 도시된 바와 같고, D-14의 용해도 곡선은 도 32에 도시된 바와 같다.
도 26 내지 도 32를 참조하면, 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자의 용해 곡선의 TM 값이 모두 상대적으로 높고 이는 샘플의 순도가 높고 자기조립 구조가 안정적임을 설명한다.
핵산 나노입자가 혈청에서의 안정성 측정
실시예 13
비변성 PAGE 법을 사용하여 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 RNA 나노입자가 혈청에서의 안정성을 특성화한다.
주요 시약 및 장치는 아래와 같다.
단계:
① RNA 나노입자를 아래 표의 농도로 제조한 다음 제조 후의 샘플을 아래 표 중의 방법으로 희석하고 5개의 튜브를 희석하며, 희석 후 샘플을 37℃ 워터 배스에 상이한 시간동안 넣어둔다(0, 10min, 1h, 12h, 36h).
② 처리 후의 샘플 10㎕과 2㎕ 6×DNA Loading Buffer를 취하여 균일하게 혼합하고 얼음 위에서 조작하며 라벨링을 잘해둔다.
③ 8% 비변성 PAGE 겔을 취하고 인큐베이션 시간이 다른 샘플에 겔 조각을 놓고 12㎕ 처리된 샘플 전부를 로딩하며, 겔이 100V에서 40 min 동안 작동하도록 프로그램을 설정한다.
④ 전기 영동이 끝나면 염색을 진행하고 수평 진동대에서 30 min간 천천히 진탕시키고 촬영하여 이미징을 진행한다.
R-15의 전기 영동 측정 결과는 도 33에 도시된 바와 같고, R-16의 전기 영동 측정 결과는 도 34에 도시된 바와 같으며, R-17의 전기 영동 측정 결과는 도 35에 도시된 바와 같고, R-18의 전기 영동 측정 결과는 도 36에 도시된 바와 같으며, R-19의 전기 영동 측정 결과는 도 37에 도시된 바와 같고, R-20의 전기 영동 측정 결과는 도 38에 도시된 바와 같으며, R-21의 전기 영동 측정 결과는 도 39에 도시된 바와 같다. 도 33 내지 도 39에서 왼쪽에서 오른쪽까지 레인은 각각 M: marker; 1: 36h; 2: 12h; 3: 1h; 4: 10min; 5: 0min이다. 혈청 안정성 시험 결과를 참조하면, 10 min, 1 h, 12 h 및 36 h의 비변성 겔 결과에 따르면 시간이 다른 RNA 나노입자 샘플 밴드는 현저한 차이가 없고 이는 RNA 나노입자 R-15 내지 R-21가 50% FBS의 1640배지에서 비교적 안정적이고 유의적인 분해가 없다는 것을 설명한다.
실시예 14
비변성 PAGE 법을 사용하여 7 그룹의 연장 구간 변형 + 코어 단 서열 DNA 나노입자가 혈청에서의 안정성을 특성화한다.
주요 시약 및 장치는 아래와 같다.
단계:
① DNA 나노입자를 아래 표의 농도로 제조한 다음 제조 후의 샘플을 아래 표 중의 방법으로 희석하고 5개의 튜브를 희석하며, 희석 후 샘플을 37℃ 워터 배스에 상이한 시간동안 넣어둔다(0, 10min, 1h, 12h, 36h).
② 처리 후의 샘플 5㎕과 1㎕ 6×DNA Loading Buffer를 취하여 균일하게 혼합하고 얼음 위에서 조작하며 라벨링을 잘해둔다.
③ 8% 비변성 PAGE 겔을 취하고 인큐베이션 시간이 다른 샘플에 겔 조각을 놓고 6㎕ 처리된 샘플 전부를 로딩하며, 겔이 100V에서 40 min 동안 작동하도록 프로그램을 설정한다.
④ 전기 영동이 끝나면 염색을 진행하고 수평 진동대에서 30 min간 천천히 진탕시키고 촬영하여 이미징을 진행한다.
D-8의 전기 영동 측정 결과는 도 40에 도시된 바와 같고, D-9의 전기 영동 측정 결과는 도 41에 도시된 바와 같으며, D-10의 전기 영동 측정 결과는 도 42에 도시된 바와 같고, D-11의 전기 영동 측정 결과는 도 43에 도시된 바와 같으며, D-12의 전기 영동 측정 결과는 도 44에 도시된 바와 같고, D-13의 전기 영동 측정 결과는 도 45에 도시된 바와 같으며, D-14의 전기 영동 측정 결과는 도 46에 도시된 바와 같다. 도 40 내지 도 46에서 왼쪽에서 오른쪽까지 레인은 각각 M: marker; 1: 36h; 2: 12h; 3: 1h; 4: 10min; 5: 0min이다. 혈청 안정성 시험 결과를 참조하면, 10 min, 1 h, 12 h 및 36 h의 비변성 겔 결과에 따르면 시간이 다른 DNA 나노입자 샘플 밴드는 현저한 차이가 없고 이는 DNA 나노입자 D-8 내지 D-14가 50% FBS의 1640배지에서 비교적 안정적이고 유의적인 분해가 없다는 것을 설명한다.
핵산 나노입자 탑재 약물 실험
실시예 15
독소루비신 탑재 실험:
실시예 5의 화학적 탑재 방법(특별한 한정이 없는 한 방법은 실시예 5와 같음)으로 각각 전술한 실시예 11 중 R-15, R-16, R-17, R-18, R-19, R-20 및 R-21가 자기조립을 통해 형성한 RNA 나노입자, 실시예 12 중 D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14가 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자를 독소루비신 탑재 벡터로 하여 독소루비신 탑재율을 측정한 결과는 각각 아래와 같다.
RNA 나노입자 R-15의 독소루비신 탑재율은 20.5;
RNA 나노입자 R-16의 독소루비신 탑재율은 29.4;
RNA 나노입자 R-17의 독소루비신 탑재율은 30.9;
RNA 나노입자 R-18의 독소루비신 탑재율은 34.1;
RNA 나노입자 R-19의 독소루비신 탑재율은 27.1;
RNA 나노입자 R-20의 독소루비신 탑재율은 30.2;
RNA 나노입자 R-21의 독소루비신 탑재율은 20.1;
DNA 나노입자 D-8의 독소루비신 탑재율은 28.0;
DNA 나노입자 D-9의 독소루비신 탑재율은 27.9;
DNA 나노입자 D-10의 독소루비신 탑재율은 18.9;
DNA 나노입자 D-11의 독소루비신 탑재율은 26.8;
DNA 나노입자 D-12의 독소루비신 탑재율은 27.6;
DNA 나노입자 D-13의 독소루비신 탑재율은 31.8;
DNA 나노입자 D-14의 독소루비신 탑재율은 32이다.
유세포 분석기(FACS) 실험을 통해 DNA 나노입자 및 벡터 약물의 세포 결합 능력을 측정
실시예 16
1. 세포 정보
HepG2(협화 세포은행), 배지는 DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신(gibco, 15140-122), 배양조건은 37℃, 5% CO2, 포화 습도이다.
2. 피측정물
블랭크 벡터: 전술한 실시예 12 중 D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14가 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자 벡터
벡터 약물: 실시예 5의 화학적 탑재 방법(특별한 한정이 없는 한 방법은 실시예 5와 같음)으로 전술한 실시예 12 중 D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14가 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자를 사용하여 독소루비신을 탑재하고, 각각 D-8-독소루비신, D-9-독소루비신, D-10-독소루비신, D-11-독소루비신, D-12-독소루비신, D-13-독소루비신 및 D-14-독소루비신이라고 한다.
3. 주요 기기, 재료
4. 주요 시약
5. 실험 방법:
1. 세포 상태를 대수성장기로 조절하고 배지를 비오틴 및 엽산을 함유하지 않는 배지로 교체하며, 37℃ 배양 박스에서 인큐베이션하고 하룻밤 지새운다.
2. 인큐베이션이 끝난 후, 판크레아틴 소화를 거쳐 세포 현탁액을 수집하고, 1000rmp으로 5min동안 원심분리하며, 농도를 조절한 후 2×105-5×105 세포/EP 튜브를 취하고 1㎖/튜브 1% BSA-PBS로 2번 세척하고 튜브 바닥 세포가 흡입되지 않도록 관찰한다.
3. 피측정물을 용해시키고 피측정물을 사용 농도로 희석한다.
4. 세포 상청액을 흡입하고, 튜브마다 순서에 따라 100 ㎕ 상응한 샘플을 첨가하며 어두운 조건에서 37℃ 온도로 2h 동안 인큐베이션한다.
5. 1% BSA-PBS로 2번 세척하고 1000rmp으로 5min동안 원심분리한다.
6. 마지막으로 300 ㎕ PBS로 세포를 재현탁하여 침전시키고, 유세포 분석기에 로딩하여 측정한다(본 실시예에서 사용된 블랭크 벡터는 Quasar 670로 표지되고, 벡터 약물 중 독소루비신은 자체적으로 형광을 구비하기에 각각 FL4-APC 및 FL2-PE을 통해 측정할 수 있음).
7. 데이터 분석
6. 실험 결과
1. 실험 결과는 아래 표와 같다.
2. 결론
1. HepG2 세포와 D-8-독소루비신(벡터 약물) 및 D-8(블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (93.1% 내지 98.4%) 결합률을 구비한다.
2. HepG2 세포와 D-9-독소루비신(벡터 약물) 및 D-9(블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (88.6% 내지 98.1%) 결합률을 구비한다.
3. HepG2 세포와 D-10-독소루비신(벡터 약물) 및 D-10(블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (89.4% 내지 98.3%) 결합률을 구비한다.
4. HepG2 세포와 D-11-독소루비신(벡터 약물) 및 D-11(블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (89.3% 내지 97.8%) 결합률을 구비한다.
5. HepG2 세포와 D-12-독소루비신(벡터 약물) 및 D-12 (블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (94.6% 내지 97.1%) 결합률을 구비한다.
6. HepG2 세포와 D-13-독소루비신(벡터 약물) 및 D-13(블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (89.6% 내지 98.2%) 결합률을 구비한다.
7. HepG2 세포와 D-14-독소루비신(벡터 약물) 및 D-14(블랭크 벡터)는 인큐베이션 후 모두 아주 높은 (90.3% 내지 98.3%) 결합률을 구비한다.
DNA 나노입자 및 벡터 약물이 HepG2 세포에서의 세포 독성 연구
실시예 17
CCK8법으로 DNA 나노입자 및 벡터 약물이 HepG2에 대한 독성을 측정한다.
1. 주요 시약
2. 주요 재료 및 장치
3. 세포 정보
HepG2(협화 세포은행), 배지는 DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신(gibco, 15140-122), 배양조건은 37℃, 5% CO2, 포화 습도이다.
4. 실험 재료
1. 피측정 샘플
블랭크 벡터: 전술한 실시예 12 중 D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14가 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자 벡터, 각각 D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14라고 한다.
벡터 약물: 실시예 5의 화학적 탑재 방법(특별한 한정이 없는 한 방법은 실시예 5와 같음)으로 전술한 실시예 12 중 D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14가 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자를 사용하여 독소루비신을 탑재하고, 각각 D-8-독소루비신, D-9-독소루비신, D-10-독소루비신, D-11-독소루비신, D-12-독소루비신, D-13-독소루비신 및 D-14-독소루비신이라고 한다.
원약 독소루비신.
DMSO.
5. 실험 단계
1. 대수성장기의 HepG2 세포를 취하고, 트리판 블루로 염색하고 계수하며 세포 생존율은 98.3%이다. 5000개 Cell/웰로 플레이팅하며, 부피는 100㎕/웰이고, 8개의 96웰 플레이트를 플레이팅하며 플레이트당 57개 웰이며 37℃에서 인큐베이션하고 하룻밤 지내운다.
2. 아래 표에 따라 피측정 샘플을 희석하고 첨가하며, 원 배지를 제거하고 100㎕ 상이한 농도의 피측정 샘플의 배지를 첨가하며 그룹 당 3개의 홀을 복수 배치한다.
C8 웰 중 샘플의 제조 방법은 완전 324㎕인 다음 C9웰에서 흡수한다.
본 실시예에서, 약물 탑재 및 블랭크 벡터는 각각 우선 PBS로 100μM 원액을 제조하고, 완전 배지(비오틴을 함유하지 않은 DMEM)를 사용하여 희석한다. 원약 독소루비신은 우선 DMSO로 100μM 원액을 제조하고, 완전 배지(비오틴을 함유하지 않은 DMEM)로 희석한다. DMSO는 직접 완전 배지(비오틴을 함유하지 않은 DMEM)를 사용하여 희석한다.
3. 피측정 샘플을 추가한 후 96웰 플레이트를 37℃ 5% CO2 배양 박스에 넣고 72h동안 인큐베이션한다.
4. 키트를 실온에 꺼내 융화시키고 웰당 10㎕ CCK-8 용액을 첨가하며, CCK8 용액과 배지를 1:9로 혼합할 수도 있으며, 다음 100㎕/웰의 량으로 웰에 첨가한다.
5. 세포 배양 박스 내에서 계속하여 4h 인큐베이션하고, 시간의 길고 짧음은 세포의 유형 및 세포의 밀도 등 실험 상황에 따라 결정한다.
6. 효소 표지 장치로 450㎚ 부분에서 흡광도를 측정한다.
7. 계산: 세포 활력(%) = (OD실험군-OD 블랭크군) × 100%/(OD 대조군-OD 블랭크군), GraphPad Prism 5.0로 IC50를 계산한다.
6. 실험 결과
결론:
상기 표 및 도 47a, 도 47b, 도 47c, 도 47d, 도 47e, 도 47f, 도 47g, 도 47h를 참조하면, 원약 독소루비신 및 약물 탑재 D-8-독소루비신, D-9-독소루비신, D-10-독소루비신, D-11-독소루비신, D-12-독소루비신, D-13-독소루비신 및 D-14-독소루비신이 HepG2 세포에 작용하는 IC50는 각각 0.2725μM, 0.05087μM, 0.0386, 0.03955, 0.04271, 0.02294, 0.03017 및 0.03458이고; DMSO가 HepG2 세포에 작용하는 IC50 > 0.1%이며; D-8(블랭크 벡터), D-9(블랭크 벡터), D-10(블랭크 벡터), D-11(블랭크 벡터), D-12(블랭크 벡터), D-13(블랭크 벡터) 및 D-14(블랭크 벡터)가 HepG2 세포에 작용하는 IC50는 약 >1μM이다. HepG2 세포계에 있어서, 단순한 블랭크 벡터D-8, D-9, D-10, D-11, D-12, D-13 및 D-14에 비해, 소분자 약물원약 독소루비신 및 약물 탑재 D-8-독소루비신, D-9-독소루비신, D-10-독소루비신, D-11-독소루비신, D-12-독소루비신, D-13-독소루비신 및 D-14-독소루비신이 모두 HepG2 세포에 독성이 있고, 약물 탑재 D-8-독소루비신, D-9-독소루비신, D-10-독소루비신, D-11-독소루비신, D-12-독소루비신, D-13-독소루비신 및 D-14-독소루비신이 원약 독소루비신에 비해 유의적인 효과 증강 작용이 있다.
다우노루비신 탑재 실험
실시예 18
실시예 5의 화학적 탑재 방법(특별한 한정이 없는 한 방법은 실시예 5와 같음)으로 각각 전술한 실시예 12 중 D-10 및 D-14가 자기조립을 통해 형성한 DNA 나노입자를 다우노루비신 탑재 벡터로 한다. 효소 표지 장치를 사용하여 492㎚ 부분 다우노루비신의 흡광도를 측정하고 표준 곡선을 제작한다(도 48).
측정한 다우노루비신 탑재율은 각각 아래와 같다.
DNA 나노입자 D-10의 다우노루비신 탑재율은 24.0;
DNA 나노입자 D-14의 다우노루비신 탑재율은 25.1이다.
상기 설명으로부터, 본 발명에 따른 실시예가 다음과 같은 기술적 효과를 달성함을 알 수 있다. 본 출원은 열역학적 안정성, 화학적 안정성, 높은 로딩 속도 및 다가 조합 모듈을 갖는 일련의 핵산 나노입자 벡터를 제공한다.. 이러한 유형의 벡터의 고유한 모듈화 설계는 자연스럽게 호환되는 친화성을 유지할뿐만 아니라 높은 안정성과 다양한 조합 특성을 가진 코어 모듈식 구조를 구비한다. 이 구조는 표적 모듈, 이미징 및 프로브 모듈, 치료 모듈 및 기타 복합 지능형 모듈을 포함한 다양한 기능 모듈을 유연하고 효율적으로 통합할 수 있으므로 정확한 진단 및 치료를 달성하기 위해 생체 내 표적 전달에 사용할 수 있다.
상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 당업자는 본 발명에 대해 다양한 개선 및 변화를 진행할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 진행한 모든 수정, 등가 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BAI YAO ZHI DA (BEIJING) NANOBIO TECHNOLOGY CO., LTD
<120> NUCLEIC ACID NANOPARTICLES, PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME, DRUG COMPRISING DOXORUBICIN AND PREPARATION METHOD THEREFOR
<130> WO/2020/011248
<140> PCT/CN2019/095766
<141> 2019-07-12
<150> CN 201810766003.4
<151> 2018-07-12
<150> CN 201810765976.6
<151> 2018-07-12
<160> 171
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
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<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
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<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<223> Artificial Sequence
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
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<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
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<223> b sequcence
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> b sequcence
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(75)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(75)
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<210> 51
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(78)
<223> c sequcence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(78)
<223> M is U or T
<400> 51
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cgcgcgmmmm mmcgcgcg 78
<210> 52
<211> 29
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> modified_base
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<212> RNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> modified_base
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
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<212> RNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
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<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> b strand
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> c strand
<400> 63
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<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> a strand
<400> 64
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<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> b strand
<400> 65
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<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> c strand
<400> 66
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<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> a strand
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<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> b strand
<400> 68
cguucggcgy 10
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<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
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<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> a strand
<400> 70
gcagcguucg 10
<210> 71
<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> b strand
<400> 71
cguucggccy 10
<210> 72
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> c strand
<400> 72
ggcccauagc gc 12
<210> 73
<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> a strand
<400> 73
cgagcguugc 10
<210> 74
<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> b strand
<400> 74
gcuucggcgy 10
<210> 75
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> a strand
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cgcgcgccca ggagcguugg cgggcggcg 29
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<212> RNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> b strand
<400> 77
cgccgcccgc cuucgccgcc agccgcc 27
<210> 78
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> c strand
<400> 78
ggcggcaggc ggccauagcc cugggcgcgc g 31
<210> 79
<211> 29
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> a strand
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<220>
<223> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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caggaggc 68
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<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> a strand
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
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<223> a strand
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<220>
<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
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<212> RNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
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gcggcgagcg gcgagcagcg uucgggccgg aggccgg 37
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
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ccggccuccg gcccguucgg ccccagccgc c 31
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
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ggcggcaggg gcccauagcg cucgccgcuc gccgc 35
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<211> 37
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
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gcggcgagcg gcgacgagcg uugcggccgg aggccgg 37
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
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<212> RNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
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ccggccuccg gccgcuucgg cgccagccgc c 31
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<212> RNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
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gcggcgagcg gcgaggagcg ttggggccgg aggccgg 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
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ccggcctccg gccccttcgg ggccagccgc c 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 143
ggcggcaggc ccccatagcc ctcgccgctc gccgc 35
<210> 144
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
<400> 144
gcggcgagcg gcgagcagcg ttcgggccgg aggccgg 37
<210> 145
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
<400> 145
ccggcctccg gcccgttcgc cgccagccgc c 31
<210> 146
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 146
ggcggcaggc ggccatagcg ctcgccgctc gccgc 35
<210> 147
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
<400> 147
gcggcgagcg gcgaggagcg ttggggccgg aggccgg 37
<210> 148
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
<400> 148
ccggcctccg gccccttcgc cgccagccgc c 31
<210> 149
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 149
ggcggcaggc ggccatagcc ctcgccgctc gccgc 35
<210> 150
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
<400> 150
gcggcgagcg gcgagcagcg ttcgggccgg aggccgg 37
<210> 151
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
<400> 151
ccggcctccg gcccgttcgg cgccagccgc c 31
<210> 152
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 152
ggcggcaggc gcccatagcg ctcgccgctc gccgc 35
<210> 153
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
<400> 153
gcggcgagcg gcgagcagcg ttcgggccgg aggccgg 37
<210> 154
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
<400> 154
ccggcctccg gcccgttcgg ccccagccgc c 31
<210> 155
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 155
ggcggcaggg gcccatagcg ctcgccgctc gccgc 35
<210> 156
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
<400> 156
gcggcgagcg gcgacgagcg ttgcggccgg aggccgg 37
<210> 157
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
<400> 157
ccggcctccg gccgcttcgc cgccagccgc c 31
<210> 158
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 158
ggcggcaggc ggccatagcc gtcgccgctc gccgc 35
<210> 159
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> a strand
<400> 159
gcggcgagcg gcgacgagcg ttgcggccgg aggccgg 37
<210> 160
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> b strand
<400> 160
ccggcctccg gccgcttcgg cgccagccgc c 31
<210> 161
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> c strand
<400> 161
ggcggcaggc gcccatagcc gtcgccgctc gccgc 35
<210> 162
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> first elongating fragment
<400> 162
gcggcgagcg gcga 14
<210> 163
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> first elongating fragment
<400> 163
ucgccgcucg ccgc 14
<210> 164
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> first elongating fragment
<400> 164
ggccggaggc cgg 13
<210> 165
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> first elongating fragment
<400> 165
ccggccuccg gcc 13
<210> 166
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> first elongating fragment
<400> 166
ccagccgccy 10
<210> 167
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> y is not exist,just for completing the sequence listing.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> first elongating fragment
<400> 167
ggcggcaggy 10
<210> 168
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> first elongating fragment
<400> 168
gcggcgagcg gcga 14
<210> 169
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> first elongating fragment
<400> 169
tcgccgctcg ccgc 14
<210> 170
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> first elongating fragment
<400> 170
ggccggaggc cgg 13
<210> 171
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first elongating fragment
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> first elongating fragment
<400> 171
ccggcctccg gcc 13
Claims (37)
- 핵산 나노입자에 있어서,
상기 핵산 나노입자는 핵산 구조적 도메인을 구비하고, 상기 핵산 구조적 도메인은 a 서열, b 서열 및 c 서열을 포함하되,
상기 a 서열은 a1 서열 또는 상기 a1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하고, 상기 b 서열은 b1 서열 또는 상기 b1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하며, 상기 c 서열은 c1 서열 또는 상기 c1 서열이 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체가 발생한 서열을 포함하고;
상기 a1 서열은 서열번호 1: 5'-CCAGCGUUCC-3' 또는 서열번호 2: 5'-CCAGCGTTCC-3'이며;
상기 b1 서열은 서열번호 3: 5'-GGUUCGCCG-3' 또는 서열번호 4: 5'-GGTTCGCCG-3'이고;
상기 c1 서열은 서열번호 5: 5'-CGGCCAUAGCGG-3' 또는 서열번호 6: 5'-CGGCCATAGCGG-3'인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항에 있어서,
상기 a1 서열은 서열번호 1이고, 상기 b1 서열은 서열번호 3이며, 상기 c1 서열은 서열번호 5일 경우, 상기 a 서열, 상기 b 서열, 상기 c 서열 중의 적어도 하나의 서열은 적어도 하나의 염기 삽입, 결손 또는 대체된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 염기 삽입, 결손 또는 대체는
(1) 서열번호 1 또는 서열번호 2 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1, 2, 4 또는 5 부위 염기; 및/또는
(2) 서열번호 1 또는 서열번호 2 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제8 내지 10 부위 염기 사이; 및/또는
(3) 서열번호 3 또는 서열번호 4 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1 내지 3 부위 염기 사이; 및/또는
(4) 서열번호 3 또는 서열번호 4 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제6 내지 9 부위 염기 사이; 및/또는
(5) 서열번호 5 또는 서열번호 6 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제1 내지 4 부위 염기 사이; 및/또는
(6) 서열번호 5 또는 서열번호 6 표시되는 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 제9 내지 12 부위 염기 사이에서 발생하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 a 서열, b 서열 및 c 서열은 자기조립을 거쳐 식 (1)로 표시되는 구조를 이루고,
………식 (1)
상기 식에서 W-C는 Watson-Crick 페어링을 지시하고, N 및 N'는 비 Watson-Crick 페어링을 지시하며, 임의의 위치의 W-C는 각각 독립적으로 C-G 또는 G-C에서 선택되고;
상기 a 서열에서, 5' 말단으로부터 첫 번째 N은 A이고, 두 번째 N은 G이며, 세 번째 N은 U 또는 T이고, 네 번째 N은 U, T, A, C 또는 G 중 어느 하나이며;
상기 b 서열에서, 5' 말단으로부터 첫 번째 N'은 U, T, A, C 또는 G 중 어느 하나이고; 두 번째 N'은 U 또는 T, 세 번째 N'은 C이며;
상기 c 서열에서, 5' 말단에서 3' 말단으로의 방향에서 NNNN 서열은 CAUA 또는 CATA인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제4항에 있어서,
상기 a 서열, b 서열 및 c 서열은
(1) a 서열: 5'-GGAGCGUUGG-3',
b 서열: 5'-CCUUCGCCG-3',
c 서열: 5'-CGGCCAUAGCCC-3';
(2) a 서열: 5'-GCAGCGUUCG-3',
b 서열: 5'-CGUUCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCAUAGCGC-3';
(3) a 서열: 5'-CGAGCGUUGC -3',
b 서열: 5'-GCUUCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCAUAGCCG -3';
(4) a 서열: 5'-GGAGCGUUGG -3',
b 서열: 5'-CCUUCGGGG -3',
c 서열: 5'-CCCCCAUAGCCC -3';
(5) a 서열: 5'-GCAGCGUUCG -3',
b 서열: 5'-CGUUCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCAUAGCGC -3';
(6) a 서열: 5'-GCAGCGUUCG -3',
b 서열: 5'-CGUUCGGCC -3',
c 서열: 5'-GGCCCAUAGCGC -3';
(7) a 서열: 5'-CGAGCGUUGC -3',
b 서열: 5'-GCUUCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCAUAGCCG -3';
(8) a 서열: 5'-GGAGCGTTGG-3',
b 서열: 5'-CCTTCGCCG-3',
c 서열: 5'-CGGCCATAGCCC-3';
(9) a 서열: 5'-GCAGCGTTCG-3',
b 서열: 5'-CGTTCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCATAGCGC-3';
(10) a 서열: 5'-CGAGCGTTGC -3',
b 서열: 5'-GCTTCGCCG -3',
c 서열: 5'-CGGCCATAGCCG -3';
(11) a 서열: 5'-GGAGCGTTGG -3',
b 서열: 5'-CCTTCGGGG -3',
c 서열: 5'-CCCCCATAGCCC -3';
(12) a 서열: 5'-GCAGCGTTCG -3',
b 서열: 5'-CGTTCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCATAGCGC -3';
(13) a 서열: 5'-GCAGCGTTCG -3',
b 서열: 5'-CGTTCGGCC -3',
c 서열: 5'-GGCCCATAGCGC -3';
(14) a 서열: 5'-CGAGCGTTGC -3',
b 서열: 5'-GCTTCGGCG -3',
c 서열: 5'-CGCCCATAGCCG -3' 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제4항에 있어서,
상기 핵산 구조적 도메인은 제1 연장 구간을 더 포함하고, 상기 제1 연장 구간은 Watson-Crick 페어링의 연장 구간이며, 상기 제1 연장 구간은 상기 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하고;
바람직하게는, 상기 제1 연장 구간은 적어도
(1): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCA-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-UGGG-3';
(2): a 스트랜드 3' 말단: 5'-GGG-3', b 스트랜드 5' 말단: 5'-CCC-3';
(3): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCA-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-UGG-3';
(4): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCG-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-CGGG-3';
(5): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCC-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-GGGG-3';
(6): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCC-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-GGG-3';
(7): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCG-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-CGG-3';
(8): a 스트랜드 5' 말단: 5'-CCCA-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-TGGG-3';
(9): b 스트랜드 3' 말단: 5'-CCA-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-TGG-3'에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 구조적 도메인은 제2 연장 구간을 더 포함하고, 상기 제2 연장 구간은 상기 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 임의의 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하며, 상기 제2 연장 구간은 Watson-Crick 페어링의 연장 구간이고;
바람직하게는, 상기 제2 연장 구간은 CG 염기쌍의 연장 서열이며;
더 바람직하게는, 상기 제2 연장 구간은 1 내지 10개 CG 염기쌍의 연장 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제7항에 있어서,
상기 핵산 구조적 도메인은
제1 그룹: a 스트랜드 5' 말단: 5'-CGCGCG-3', c 스트랜드 3' 말단: 5'-CGCGCG-3';
제2 그룹: a 스트랜드 3' 말단: 5'-CGCCGC-3', b 스트랜드 5' 말단: 5'-GCGGCG-3';
제3 그룹: b 스트랜드 3' 말단: 5'-GGCGGC-3', c 스트랜드 5' 말단: 5'-GCCGCC-3' 중 적어도 하나의 제2 연장 구간을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제7항에 있어서,
상기 제2 연장 구간은 CG 염기쌍 및 AT/AU 염기쌍의 연장 서열을 동시에 함유하고, 바람직하게는 상기 제2 연장 구간은 2 내지 50개 염기쌍의 연장 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제9항에 있어서,
상기 제2 연장 구간은 연속 2 내지 8개 CG 염기쌍의 서열과 연속 2 내지 8개 AT/AU 염기쌍의 서열이 번갈아 형성된 연장 서열이거나; 또는
상기 제2 연장 구간은 1개 CG 염기쌍의 서열과 1개 AT/AU 염기쌍의 서열이 번갈아 형성된 연장 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 a 서열, b 서열 및 c 서열에서 염기, 리보스 및 인산에스테르는 적어도 하나의 변형 가능 부위를 구비하고, 임의의 상기 변형 가능 부위는 -F, 메틸기, 아미노기, 이황화물, 카보닐기, 카복실기, 머캅토기 및 알데하이드기 중 어느 하나의 변형 어댑터를 통해 변형되며;
바람직하게는, 상기 a 서열, b 서열 및 c 서열 중의 C 또는 U 염기는 2'-F 변형을 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 나노입자는 생체 활성 물질을 더 포함하고, 상기 생체 활성 물질과 상기 핵산 구조적 도메인은 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제12항에 있어서,
상기 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량과 상기 생체 활성 물질의 총 상대 분자량 비율 ≥ 1:1이고;
바람직하게는, 상기 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인, 간섭 핵산 siRNA, miRNA, 리보자임, 리보스위치, 압타머, RNA 항체, 약물, 단백질, 폴리펩타이드, 플라보노이드, 포도당, 천연 살리실산, 단클론 항체, 비타민, 페놀계 및 레시틴 중의 하나 또는 다수인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제13항에 있어서,
상기 생체 활성 물질은 상기 타겟 헤드, 상기 플루오레세인 및 상기 miRNA이고,
상기 타겟 헤드는 상기 a, b, c 서열에서 임의의 서열에 위치하고, 바람직하게는 a, b, c 중 임의의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 상기 핵산 구조적 도메인에 인터칼레이션된 GC 결합 사이에 위치하며,
상기 miRNA는 항 miRNA이고, 상기 플루오레세인은 상기 항 miRNA의 5' 말단 또는 3' 말단에 변형되고, 상기 miRNA는 상기 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 위치하며;
바람직하게는, 상기 타겟 헤드는 엽산 또는 비오틴이고, 상기 플루오레세인은 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수이며, 상기 항 miRNA는 항 miR-21인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제13항에 있어서,
상기 약물은 간암, 위암, 폐암, 유선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 흑색종, 백혈병, 노인성 치매, 강직성 척추염, 악성 림파종, 기관지암, 류마티스 관절염, HBV B형 간염, 다발성 골수종, 췌장암, 비소세포폐암, 전립선암, 비인두암, 식도암, 구강암, 홍반성 낭창을 치료하기 위한 약물이고; 바람직하게는, 상기 두경부암은 뇌암, 신경모 세포종 또는 교모 세포종인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제13항에 있어서,
상기 약물은 아미노기 그룹, 하이드록실기 그룹, 카복실기 그룹, 머캅토기 그룹, 벤젠 고리 그룹 및 아세트아미노기 그룹 중 어느 하나 또는 다수의 그룹을 함유하는 약물인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제13항에 있어서,
상기 단백질은 SOD, 서바이빈, hTERT, EGFR 및 PSMA의 항체 또는 압타머 중의 하나 또는 다수이고; 상기 비타민은 L-Vc 및/또는 에스테르-C이며; 상기 페놀계는 차 폴리페놀 및/또는 포도 폴리페놀인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제12항에 있어서,
상기 생체 활성 물질은
방식 1: 물리적 인터칼레이션;
방식 2: 공유 결합 연결 중 어느 하나의 방식을 통해 상기 핵산 구조적 도메인과 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제18항에 있어서,
상기 생체 활성 물질과 상기 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식으로 연결될 경우, 상기 생체 활성 물질과 상기 핵산 구조적 도메인은 1 내지 200: 1의 몰비로 물리적 인터칼레이션되는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제19항에 있어서,
상기 생체 활성 물질과 상기 핵산 구조적 도메인이 물리적 인터칼레이션 방식과 공유 결합 연결 방식으로 연결될 경우, 상기 물리적 인터칼레이션 방식으로 연결된 생체 활성 물질과 상기 공유 결합 연결 방식으로 연결된 약물의 몰비는 1 내지 200: 1인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제18항에 있어서,
상기 공유 결합 연결 방식으로 연결된 생체 활성 물질은 용매 공유 결합 연결, 링커 공유 결합 연결 또는 클릭 연결을 진행하고;
바람직하게는, 상기 용매는 파라포름알데하이드, DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 또는 빙초산에서 선택되며;
바람직하게는, 상기 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택되고;
바람직하게는, 상기 클릭 연결은 생체 활성 물질 전구체 및 상기 핵산 구조적 도메인에 대해 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행한 다음 클릭 연결을 진행하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제21항에 있어서,
상기 생체 활성 물질과 상기 핵산 구조적 도메인이 클릭 연결 방식으로 연결될 경우, 상기 생체 활성 물질 전구체가 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 2'하이드록실기, 카복실기 또는 아미노기에서 선택되고, 상기 핵산 구조적 도메인이 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 G 환외 아미노기, 2'-하이드록실기, A아미노기 또는 2'-하이드록실기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항에 있어서,
상기 핵산 나노입자의 입경은 1 내지 100㎚, 바람직하게는 5 내지 50㎚; 더 바람직하게는 10 내지 30㎚; 보다 더 바람직하게는 10 내지 15㎚인 것을 특징으로 하는 핵산 나노입자. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 핵산 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
- 독소루비신 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항 또는 제23항에 따른 핵산 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물.
- 제25항에 있어서,
독소루비신은 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 형식으로 상기 핵산 나노입자에 탑재되고, 독소루비신과 상기 핵산 나노입자 사이의 몰비는 2 내지 300:1, 바람직하게는 10 내지 50:1, 더 바람직하게는 15 내지 25:1인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물. - 제25항에 있어서,
상기 핵산 나노입자는 생체 활성 물질을 더 포함하고, 상기 생체 활성 물질은 상기 핵산 구조적 도메인에 연결되며, 상기 생체 활성 물질은 타겟 헤드, 플루오레세인, 간섭 핵산 siRNA, miRNA, 리보자임, 리보스위치, 압타머, RNA 항체, 단백질, 폴리펩타이드, 플라보노이드, 포도당, 천연 살리실산, 단클론 항체, 비타민, 페놀계레시틴 및 독소루비신을 제외한 소분자 약물 중의 하나 또는 다수인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물. - 제27항에 있어서,
상기 핵산 구조적 도메인의 상대 분자량을 N1라고 하고, 독소루비신과 상기 생체 활성 물질의 총 상대 분자량을 N2라고 하면, N1/N2 ≥ 1:1인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물. - 제27항에 있어서,
상기 생체 활성 물질은 상기 타겟 헤드, 상기 플루오레세인 및 상기 miRNA 중의 하나 또는 다수이고,
상기 타겟 헤드는 상기 a, b, c 서열에서 어느 하나의 서열에 위치하고, 바람직하게는 a, b, c 중 어느 하나의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 상기 핵산 구조적 도메인에 인터칼레이션된 GC 결합 사이에 위치하며,
상기 miRNA는 항 miRNA이고, 상기 플루오레세인은 상기 항 miRNA의 5' 말단 또는 3' 말단에 변형되고, 상기 miRNA는 상기 a 서열의 3' 말단, c 서열의 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 하나 또는 다수 위치에 위치하며;
바람직하게는, 상기 타겟 헤드는 엽산 또는 비오틴이고, 상기 플루오레세인은 FAM, CY5 및 CY3 중 어느 하나 또는 다수이며, 상기 항 miRNA는 항 miR-21인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물. - 제27항에 있어서,
상기 독소루비신을 제외한 소분자 약물은 아미노기 그룹, 하이드록실기 그룹, 카복실기 그룹, 머캅토기 그룹, 벤젠 고리 그룹 및 아세트아미노기 그룹 중 어느 하나 또는 다수의 그룹을 함유하는 약물인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물. - 제27항에 있어서,
상기 단백질은 SOD, 서바이빈, hTERT 및 EGFR, PSMA 중의 하나 또는 다수이고; 상기 비타민은 L-Vc 및/또는 에스테르-C이며; 상기 페놀계는 차 폴리페놀 및/또는 포도 폴리페놀인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 핵산 나노입자를 제공하는 단계; 및
물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 방식을 통해 독소루비신을 상기 핵산 나노입자에 탑재하여 상기 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법. - 제32항에 있어서,
물리적 연결 방식을 통해 독소루비신을 탑재하는 단계는,
독소루비신, 상기 핵산 나노입자 및 제1 용매를 혼합 및 교반하여 예비혼합 체계를 얻는 단계;
상기 예비혼합 체계 중의 유리 물질을 제거하여 상기 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함하고,
바람직하게는, 상기 제1 용매는 DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산에서 선택되는 하나 또는 다수이며;
바람직하게는, 상기 예비혼합 체계 중의 유리 물질을 제거하는 단계는,
상기 예비혼합 체계와 무수에탄올을 혼합하고, 10℃보다 낮은 온도 조건에서 상기 독소루비신 함유 약물을 석출하는 단계를 포함하고,
더 바람직하게는, 0 내지 5℃ 온도 조건에서 상기 독소루비신 함유 약물을 석출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법. - 제32항에 있어서,
공유 결합 연결 방식을 통해 독소루비신을 탑재하는 단계는,
독소루비신 용액을 준비하는 단계;
상기 독소루비신 용액이 포름알데하이드의 개재 작용에 의해 상기 핵산 나노입자의 G 환외 아미노기와 반응하여 반응 체계를 얻는 단계; 및
상기 반응 체계를 정제하여 상기 독소루비신 함유 약물을 얻는 단계를 포함하고,
바람직하게는, 상기 반응 단계는
상기 독소루비신 용액을 파라포름알데하이드 용액, 상기 핵산 나노입자와 혼합하고 어두운 조건에서 반응시켜 상기 반응 체계를 얻는 단계를 포함하며; 바람직하게는 상기 파라포름알데하이드 용액의 농도는 3.7 내지 4wt%이고, 바람직하게는 상기 파라포름알데하이드 용액은 파라포름알데하이드와 제2 용매가 혼합하여 형성한 용액이며, 상기 제2 용매는 DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산 중의 하나 또는 다수인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법. - 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제조 방법은 상기 핵산 나노입자를 제조하는 단계를 더 포함하되, 이는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 핵산 나노입자 중의 상기 핵산 구조적 도메인에 대응되는 단일 스트랜드를 자기조립하여 상기 핵산 구조적 도메인을 얻는 단계를 포함하며,
바람직하게는, 상기 핵산 구조적 도메인을 얻은 후, 상기 제조 방법은
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 생체 활성 물질의 물리적 연결 및/또는 공유 결합 연결 방식을 통해 상기 핵산 구조적 도메인에 탑재하여 상기 핵산 나노입자를 얻는 단계를 더 포함하고,
상기 생체 활성 물질 중의 약물은 독소루비신을 제외한 소분자 약물인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법. - 제34항에 있어서,
공유 결합 연결 방식으로 상기 생체 활성 물질을 탑재하는 과정에서, 용매 공유 결합 연결, 링커공유 결합 연결 또는 클릭 연결을 통해 탑재하고;
바람직하게는, 상기 용매 공유 결합 연결에서 사용되는 제3 용매는 연결 매질로 작용하고, 상기 제3 용매는 파라포름알데하이드, DCM, DCC, DMAP, Py, DMSO, PBS 및 빙초산에서 선택되는 하나 또는 다수이며;
바람직하게는, 상기 링커는 이황화 결합, p-페닐아자이드기, 프로파르길 브로마이드 또는 PEG에서 선택되고;
바람직하게는, 상기 클릭 연결은 생체 활성 물질 전구체 및 상기 핵산 구조적 도메인에 대해 알키닐기 또는 아자이드 변형을 동시에 진행한 다음 클릭 연결을 진행하는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법. - 제35항에 있어서,
상기 생체 활성 물질과 상기 핵산 구조적 도메인이 클릭 연결 방식으로 연결될 경우, 상기 생체 활성 물질 전구체가 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 2'하이드록실기, 카복실기 또는 아미노기에서 선택되고, 상기 핵산 구조적 도메인이 알키닐기 또는 아자이드 변형을 진행하는 부위는 G 환외 아미노기, 2'-하이드록실기, A아미노기 또는 2'-하이드록실기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 약물의 제조 방법.
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