CN102482325B - 通过抑制微粒的分泌治疗aids或癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制细胞中微粒释放的新肽。所述肽包含位于N末端的至少一个VGFPV基序并且长度为10-100个氨基酸。本发明还公开了编码所述肽的多核苷酸、携带所述多核苷酸的表达载体以及使用所述新肽治疗AIDS和肿瘤的方法。

Description

通过抑制微粒的分泌治疗AIDS或癌症的组合物和方法
技术领域
本申请要求享有于2009年6月12日提交的编号为61/213,471的美国临时申请和于2010年5月20日提交的编号为12/783,829的美国申请的优先权。前述申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
本发明主要涉及医学疗法，且具体而言，涉及一种通过抑制微粒的分泌治疗AIDS或肿瘤的方法。
背景技术
膜囊泡是球形膜微粒，通常直径小于200nm。该微粒由包含胞质成分的脂双层构成。更具体地，个别的膜囊泡由细胞产生，从胞内区室起通过与细胞的细胞质膜融合，致使它们释放到生物体的胞外生物流体或者到培养细胞的上层清液中。这些小囊泡/微粒可以以多种方式释放。经典分泌途径通过内质网(ER)膜对主要的传统的携带膜信号的受体进行加工(Lee等人，(2004)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.20，87-123)。
将分泌性蛋白质装配成运输小泡，递送到高尔基体，并最终释放到细胞外间隙。
或者，非经典分泌途径存在并介导胞质、非信号携带分子向细胞外间隙的转运(Lippincott-Schwartz等人，(1989)Cell 56，801-813；and Misumi等人，(1986)J Biol.Chem.261，11398-11403)。这些中的两种涉及内吞膜系统的胞内囊泡，如分泌性溶酶体(Muesch等人，(1990)Trends Biochem.Sci.15，86-88)和外来体(Johnstone等人，(1987)J.Biol.Chem.262，9412-9420)，后者为晚期胞内体或多泡体(MVB)的内囊泡。当专门的内吞结构(如细胞毒性T淋巴细胞的分泌性溶酶体)与质膜融合时，溶酶体内含物进入细胞外部。当MVB与质膜融合时，晚期内吞结构的腔内含物被释放到细胞外间隙，导致内部的多囊泡胞内体连同它们的货物分子一起释放到细胞外间隙(称作外来体)。其他的非经典途径包括利用蛋白质传导通道或者称作膜起泡的过程直接运输胞质因子穿过质膜(Nickel，W.(2005)Traffic.6，607-614)。膜起泡的特点是使质膜衍生的微泡流出到细胞外间隙。
已经证实微粒在各种各样的生理环境中从不同类型的细胞中释放。已经证实，肿瘤细胞以携带肿瘤抗原并且能够呈递这些抗原或将它们传递到抗原呈递细胞的有规则方式来分泌微粒(第WO99/03499号专利申请)，如外来体(exosome)；肿瘤细胞源外来体(texosome)，Tex或肿瘤外来体(Yu等人，(2007)J.Immunol.178，6867-6875)。这些微粒由肿瘤细胞释放并且通过杀死免疫细胞或使肿瘤生长的反调节而引起免疫抑制。已发现，这些含有FasL或TNF的外来体的释放成为一种机制，通过这种机制肿瘤促进免疫赦免/免疫抑制的状态。或者，已显示感染HIV的细胞释放含Nef的小囊泡(Guy等人，(1990)Virology176，413-425；and Campbell等人，(2008)Ethn.Dis.18，S2-S9)。我们假定这些小囊泡与HIV使用的类似，它们使免疫系统调节异常从而使HIV存活。最终，有人已提出胞内体运输途径还涉及从受感染细胞中释放病毒体(Sanfridson等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A94，873-878；以及Esser等人，(2001)J Virol.75，6173-6182)。因此，在HIV感染过程中，涉及数个小囊泡释放途径的胞内体途径同时对免疫系统调节和受感染细胞的病毒体释放起到双重作用。获得可用于减轻或抑制微粒/小囊泡释放的有效方法将是特别有意义的。
发明内容
发明概述
本发明的一个方面涉及一种抑制从细胞中释放微粒的新肽。所述肽的长度为10-100个氨基酸并且包含：(1)位于N末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序，或者(2)位于C末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序，或者(3)至少两个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序。
在一个实施方式中，所述肽包含位于N末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序。在另一个实施方式中，所述肽包含位于C末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序。在另一个实施方式中，所述肽包含至少两个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序。在另一个实施方式中，所述肽包含氨基酸序列VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO：2)。在又一个实施方式中，所述肽具有H2N-VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK-OH(SEQ ID NO：3)的序列。
本发明的另一个方面涉及一种编码本发明的新肽的多核苷酸和携带编码本发明的新肽的多核苷酸的表达载体。
本发明的另一个方面涉及一种治疗AIDS或肿瘤的药物组合物。所述药物组合物包含：(1)一种肽或编码这种肽的表达载体，所述肽的长度为10-100个氨基酸并且包含(a)位于N末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序，或者(b)位于C末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序，或者(c)至少两个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序的肽；和(2)可药学可接受载体。
本发明的另一个方面涉及一种治疗AIDS的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的含有至少一个SEQ ID NO：1基序且长度为10-100个氨基酸的肽。
本发明的另一个方面涉及一种治疗肿瘤的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的含有至少一个SEQ ID NO：1基序且长度为10-100个氨基酸的肽。
附图说明
图1为复合图，其显示合成HIV-1 NefSMRwt肽(拮抗物)和HIV-1 NefSMRmt肽(阴性对照)(图A)；表达与GFP融合的HIV-1 NefSMRwt肽或与GFP融合的HIV-1 NefSMRmt肽的载体构建体(图B)；以及在用HIV-1 NefSMRwt肽(图C)或SMRmt肽(图D)转染的MDA-MB-231细胞中乙酰胆碱酯酶(外来体的标记)的数量。未转染的MDA-MB-231细胞用作阴性对照。细胞在无血清培养基中培养48小时。将一毫升上清液在400,000xg下旋转。在PAGE上跑上清液颗粒或给定体积的细胞裂解物，印迹，以及用抗-AchE mAb(乙酰胆碱酯酶-1∶1000稀释；外来体的标记)探测。用抗微管蛋白mAb(1∶4000)再次探测细胞裂解物。通过光密度计测量谱带，针对胞内微管蛋白标准化。在此显示的数据为相对于未转染的对照的百分比。
图2为显示在HEK293细胞中HIV-1 NefSMRwt肽对抗NefGFP释放的图。
图3A和3B为显示在Jurkat细胞中HIV-1 NefSMRwt肽对抗NefGFP释放的图。
图4A为显示在Jurkat细胞(图A)、HEK293细胞(图B)、THP-1单核细胞(图C)和U937单核细胞(图D)中p24浓度的ELISA分析的复合图。图4B为显示在Jurkat细胞中通过SMRwt肽(图A)而不是通过SMRmt肽(图B)阻断p24释放的共焦显微镜照片的复合图。图4C为显示在Jurkat细胞中用R7和SMRwt肽(图A-1)或用R7和SMRmt肽(图B-1)转染后6天病毒颗粒分布的共焦电子显微镜照片的复合图。图4D为显示在Jurkat细胞中用R7和SMRwt肽(图A-2)或用R7和SMRmt肽(图B-2)转染后14天病毒颗粒分布的共焦电子显微镜照片的复合图。图4E为显示在Jurkat细胞中用R7和SMRwt肽(图A-1)或用R7和SMRmt肽(图B-1)转染后6天以及在Jurkat细胞中用R7和SMRwt肽(图A-2)或用R7和SMRmt肽(图B-2)转染后14天Jurkat细胞中亚细胞结构中病毒颗粒分布的共焦电子显微镜照片的复合图。
图5为显示在用R7/SMRwt(图A)或R7/SMRmt(图B)转染的Jurkat细胞中Nef和p24的蛋白质印迹分析(Western blot analysis)的复合图片。
图6为显示在用R7/SMRwt(图A)或R7/SMRmt(图B)转染的HEK293细胞中Nef和p24的蛋白质印迹分析的复合图片。
图7为显示在用R7/SMRwt(图A)或R7/SMRmt(图B)转染的THP-1单核细胞中Nef和p24的蛋白质印迹分析的复合图片。
图8为显示在用R7/SMRwt(图A)或R7/SMRmt(图B)转染的U937单核细胞中Nef和p24的蛋白质印迹分析的复合图片。
图9为在Jurkat细胞(图A)、HEK293细胞(图B)、THP-1单核细胞(图C)和U937单核细胞(图D)中Nef和p24的蛋白质印迹分析的复合图。
图10为用R7病毒DNA/SMRwt肽(图A)或R7病毒DNA/SMRmt肽(图B)转染的Magi/CXCR4细胞的复合图片。
图11为显示在Jurkat细胞(图A)、HEK293细胞(图B)、THP-1单核细胞(图C)和U937单核细胞(图D)中Magi测定病毒侵染性的复合图。图12为显示用SMRwt或SMRmt肽转染的细胞的细胞毒性测定结果的复合图片。图A-1和B-1：用碘化丙啶分别对SMRwt和SMRmt肽转染的细胞染色。图A-2和B-2：用荧光素二乙酸酯分别对SMRwt和SMRmt肽转染的细胞染色。图A-3和B-3：用相差显微镜分别对SMRwt和SMRmt肽转染的细胞成像。
图13为显示用SMRwt或SMRmt肽(图A)的免疫沉淀作用和通过蛋白质印迹识别75kD SMR-特异性蛋白质的复合图片。
图14为显示Mortalin抗体抑制Nef分泌的图。
图15为显示用于监测SMR肽或未知化合物对Nef分泌的影响的共转染测定的图。
图16为显示用于监测SMR肽或未知化合物对肿瘤囊泡分泌的影响的共转染测定的图。
具体实施方式
当本发明可以以许多不同形式体现时，在此更加详细地说明本发明的具体优选的实施方式。这种说明是本发明的原理的范例，而不是将本发明限于所描述的具体的实施方式。
已知细胞运输途径涉及HIV的生命周期和肿瘤发展(Grossman等人，(2002)Nat.Med.8，319-323)。例如，某些肿瘤细胞释放的外来体使宿主的免疫系统调节异常，从而使肿瘤生长和增殖。目前，没有可行的针对微粒运输途径和操纵/抑制微粒从细胞中释放的技术。本发明利用与细胞因子相互作用并操纵运输途径的HIV-Nef序列，以阻断细胞产生微粒的能力。
肽
本发明的一个方面涉及一种新的抑制从细胞中释放微粒的肽。所述肽的长度为10-100个氨基酸并且包含：(1)位于N末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序，或者(2)位于C末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序，或者(3)至少两个VGFPV(SEQ IDNO：1)基序。下文所用术语“微粒”是指细胞运输途径涉及的微载体(microvehicle)。所述微粒通常由含有胞质部分的脂双层组成，并且直径一般小于200nm。微粒的实例包括，但不限于，外来体、肿瘤细胞源外来体，以及Tex或肿瘤外来体。
在一个实施方式中，所述肽包含至少两个SEQ ID NO：1基序。在另一个实施方式中，所述肽包含氨基酸序列VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO：2)。在又一个实施方式中，所述肽具有H2N-VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK-OH(SEQ ID NO：3)的序列。
本发明的肽可以化学合成或者使用重组DNA技术制造(例如，由宿主细胞表达和纯化)。合成肽或使用重组DNA技术制造肽的方法是本领域技术人员众所周知的。
表达载体
本发明的另一个方面涉及一种编码本发明的新肽的多核苷酸和携带编码本发明的新肽的多核苷酸的表达载体。
术语“表达载体”是指以适合在宿主细胞中表达多核苷酸的形式的包含编码本发明的新肽的多核苷酸的非病毒或病毒载体。非病毒载体的一种类型为“质粒”，其包括其中可以连接添加的DNA片段的环状双链DNA环。在本说明书中，由于质粒是载体最常使用的形式，所以“质粒”和“载体”可以交换使用。
表达载体包括一个或多个调节序列，其基于要用于表达的宿主细胞而选择，并可操作地与要表达的多核苷酸序列连接。本领域技术人员将理解的是，表达载体的设计可以取决于如要转化的宿主细胞的选择、目的蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞从而制造蛋白质或肽，例如本发明的新肽。
本文所用术语“控制序列”或“调节序列”是指在特定的宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。术语“控制/调节序列”意欲包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。控制/调节序列包括在许多类型的宿主细胞中定向组成型表达的核苷酸序列和只在某些宿主细胞中定向表达的核苷酸序列(例如，组织特异性的调节序列)。
当核酸序列与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸序列“可操作地连接”所述另一核酸序列。例如，如果多肽的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则将前序列或分泌引导肽的DNA可操作地连接所述多肽的DNA；如果编码序列影响序列的转录，则将启动子或增强子可操作地连接所述编码序列；或者如果设置编码序列是为了促进翻译，则将核糖体的结合位点可操作地连接所述编码序列。通常，“可操作地连接”指的是被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌引导的情况下是连续的且在阅读相中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制酶切位点结合而实现。如果这些位点不存在，则按照常规方法使用合成的寡核苷酸接头或连接体。
在一个实施方式中，哺乳动物表达载体能够优先地在特定细胞类型(例如，使用组织特异性调节元件表达多核苷酸)中定向表达多核苷酸。组织特异性调节元件是本领域中已知的并且可以包括上皮细胞特异性启动子。适合的组织特异性启动子的其他的非限定性实例包括肝特异性启动子(例如，白蛋白启动子)、淋巴特异性启动子、T细胞受体和免疫球蛋白的启动子、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子)、胰特异性启动子(例如，胰岛素启动子)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子)。发育调节启动子(例如，α-胎儿球蛋白启动子)也包括在内。
在另一个实施方式中，表达载体为病毒载体。病毒载体的实例包括，但不限于，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体和α病毒载体。病毒载体也可为星状病毒、冠状病毒、正粘液病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒病毒载体。
本发明的表达载体可以使用调节表达系统来表达本发明的肽。调节治疗性基因表达的系统已被开发出并已将其并入当前病毒和非病毒基因递送载体。这些系统简要地描述如下：
Tet-开/关系统。Tet系统是基于源自大肠杆菌Tn10转座子的四环素抗性操纵子的两个调节元件：Tet阻遏蛋白(TetR)和与TetR结合的Tet操纵基因DNA序列(tetO)。该系统由两个部件组成，“调节基因”和“报告基因”质粒。“调节基因”质粒编码包含与单纯疱疹病毒的VP16活化域融合的突变型Tet阻遏物(rtetR)的杂化蛋白。“报告基因”质粒包含控制选择的“报告”基因的tet应答元件(TRE)。在四环素的存在下，rtetR-VP16融合蛋白只能与TRE结合，因此激活了“报告”基因的转录。该系统已被引入包括逆转录病毒、腺病毒和AAV的多种病毒载体中。
蜕皮激素系统。蜕皮激素系统是基于在果蝇中发现的蜕皮诱导系统，但是为了在哺乳动物细胞中可诱导地表达而进行了改造。该系统使用果蝇甾类激素蜕皮激素的类似物(muristerone A)通过异二聚核受体激活目的基因的表达。已报道表达水平超过对哺乳动物细胞生理机能没有影响的基础水平200倍。
黄体酮系统。黄体酮受体通常受激结合特异的DNA序列以及通过与其激素配体的相互作用来激活转录。与此相反，黄体酮拮抗物米非司酮(RU486)能够阻断激素诱导的核转运以及随后的DNA结合。能够通过与RU486的相互作用而受激结合的黄体酮受体的突变体形式已经产生。为了产生特异的可调节的转录因子，黄体酮受体的RU486结合域已与酵母转录因子GAL4的DNA结合域和HSV蛋白VP16的反式激活域融合。在没有RU486的情况下，嵌合因子是无活性的。然而，激素的加入诱导了嵌合蛋白质的构象变化，并且这种变化使其结合到GAL4结合位点并激活了包含GAL4结合位点的启动子的转录。
雷帕霉素系统。免疫抑制剂(如FK506和雷帕霉素)通过与特异的细胞蛋白质结合并促进它们的二聚而起作用。例如，雷帕霉素与FK506结合蛋白(FKBP)的结合导致其与另一雷帕霉素结合蛋白FRAP的异二聚，这种现象可以通过除去药物而逆转。通过加入药物使两种蛋白质集合的能力使其能够调节许多生物学过程，包括转录。嵌合DNA结合域已与FKBP融合，从而使融合蛋白能够与特异的DNA结合序列结合。转录激活域也已与FRAP融合。当这两种融合蛋白在相同的细胞中共表达时，可以通过由加入雷帕霉素介导的异二聚而形成全功能转录因子。然后二聚嵌合转录因子可以结合合成的包含合成的DNA结合序列拷贝的启动子序列。该系统已被成功地整合到腺病毒和AAV载体中。在小鼠和狒狒体内已实现了长期的可调节的基因表达。
通过感染(对于病毒载体)、转染(对于非病毒载体)和其他的本领域技术人员众所周知的方法可以实现将本发明的表达载体递送到细胞中。其他递送方法和媒介的实例包括：与死病毒结合或分开的聚阳离子缩合DNA，配体结合的DNA，脂质体，真核细胞递送载体细胞(delivery vehicles cell)，光致聚合的水凝胶材料的沉积，手提式基因转移基因枪，电离辐射，核电荷中和或与细胞膜融合。也可以利用粒子介导的基因转移。简言之，可以将DNA序列插入到包含用于高水平表达的常规控制序列的常规载体中，然而与合成的基因转移分子孵育，合成的基因转移分子例如为与细胞靶向配体(如脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或运铁蛋白)结合的聚合的结合DNA的阳离子(如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)。也可以利用裸露DNA。使用生物可降解的胶乳珠可以提高裸露DNA的吸收效率。通过对所述珠进行处理提高疏水性由此促进内体破裂，并使DNA释放到细胞质中从而可以进一步改进该方法。
在某些实施方式中，将本发明的新肽与一种或多种抑制分泌的其他药物引入到靶细胞中。这些药物的实例包括，但不限于，二甲基氨氯吡咪、H+/Na+和Na+/Ca2+通道的抑制剂以及奥美拉唑、K+/H+ ATP酶抑制剂。
药物组合物
本发明的另一个方面涉及一种治疗AIDS或肿瘤的药物组合物。所述药物组合物包含：(1)一种包含位于N末端的至少一个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序且长度为10-100个氨基酸的肽或编码这种肽的表达载体；和(2)可药用载体。
在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或多种抑制分泌的其他药物。在一个实施方式中，所述的一种或多种其他药物包括二甲基氨氯吡咪或奥美拉唑，或同时包含二者。
本文所用文字“可药用载体”意欲包括与药物施用可配伍的任何及全部溶剂、增溶剂、填料、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控制释放赋形物、稀释剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗吸收延迟剂等。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。会考虑任何常规介质或试剂在组合物中的使用，除非其与活性化合物不相容。还可以向组合物中加入补充的试剂。
本发明的药物组合物配制成与其施用的预定途径相适合。施用途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内、真皮内、皮下，经口(例如，吸入)，经皮(局部的)，经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、真皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括下列成分：无菌稀释剂，例如，注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂，例如，苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如，抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如，乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如，醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如，氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱(例如，盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散剂以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。就静脉内施用而言，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，可注射的组合物应当是无菌的并且应当为能达到到易于溶液注射程度的流体。其在制造和贮藏条件下必须是稳定的并且必须针对如细菌和真菌的微生物污染行为进行防腐。载体可为溶剂或分散介质，例如，包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散的情况下保持所需的粒度或者通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可以实现微生物行为的防止。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过使组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和凝胶)可以使可注射的组合物的延长吸收。
在具有上述列举的成分的一种或组合的适当的溶剂中加入所需量的活性化合物(例如，SRPP片段或抗SRPP抗体)来制备无菌的可注射溶液，根据需要，之后再过滤灭菌。通常，可以通过将活性化合物加入到包含基础分散介质和所需的其他来自上述列举的那些成分中的成分的无菌载体中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这样可以得到活性成分加任何附加的来自其预先过滤灭菌溶液中的所需成分的粉末。
经口的组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装在凝胶胶囊中或者压制成片剂。为了经口治疗施用，可以将活性化合物与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可以使用用作嗽口水的流体载体来制备经口的组合物，其中，流体载体中化合物经口施用、发出嗖嗖声、咳出或吞咽。可以包含药学可配伍的结合剂和/或辅剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含任何下列成分或相似性质的化合物：粘合剂，例如，微晶纤维素、黄蓍树胶或凝胶；赋形剂，例如，淀粉或乳糖；崩解剂，例如，藻酸、淀粉羟乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如，硬脂酸镁或Stertes；助流剂，例如，胶体二氧化硅；甜味剂，例如，蔗糖或糖精；或者调味剂，例如，薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。
为了通过吸入施用，将化合物以来自加压容器或者包含适合的推进剂(例如，如二氧化碳的气体)的分配器或喷雾器中的喷雾剂的形式递送。
也可以通过经粘膜或经皮手段进行全身施用。就经粘膜或经皮施用而言，在制剂中使用适合透入屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域中通常已知的，并且包括，例如，就经粘膜施用而言，清洁剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾或栓剂可以实现经粘膜施用。就经皮施用而言，将生物活性化合物制成本领域中所熟知的软膏剂、油膏剂、凝胶或乳膏剂。
为了直肠递送，还可以将化合物制备成栓剂(例如，含有如可可油和其他甘油酯的常规栓剂主要成分)或保留灌肠剂的形式。
在一个实施方式中，使用防止化合物由身体快速排出的载体(例如，控制释放制剂，包括埋植剂和微囊包埋递送系统)来制备可以包含生物活性化合物的治疗部分。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。对本领域技术人员来说，这些制剂的制备方法将是明显的。还可以商购材料，例如，从Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂质体混悬液(包括靶向受感染细胞的脂质体，其携带有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可用作可药学可接受载体。根据本领域技术人员已知的方法可以制备这些。
为了易于施用和剂量统一，制成以剂量单位形式的经口或肠胃外的组合物是特别有利的。此处所用的剂量单位形式包括适合作为要被治疗的患者的单位剂量的物理上的离散单位；每个单位包含预定量的计算与必须的药物载体结合产生所需治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗效果以及在合成这种用于个体治疗的活性化合物的领域中的固有限制因素规定，或者直接取决于活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗效果以及在合成这种用于个体治疗的活性化合物的领域中的固有限制因素。
在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法可以确定这种化合物的毒性和治疗效能，例如，确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且它可以表示为LD50/ED50比。优选具有大的治疗指数的化合物。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但是为了最小化对未受感染细胞的潜在损害并由此减少副作用，应当注意设计使这种化合物靶向受侵袭组织的部位的递送系统。
中从细胞培养测定和动物实验中得到的数据可以用于配制在人体中使用的剂量的范围。这种化合物的剂量优选处于包括具有很少毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。依据所利用的剂量形式和所采用的施用途径，所述剂量在该范围内可以变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定中最初估计治疗的有效剂量。在动物模型中配制剂量以得到包括在细胞培养中测定的IC50(即达到症状的半最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更加精确地确定人体内的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆水平。
药物组合物可以连同施用说明一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明的另一个方面包括制备调节本发明的肽的表达或活性的药物组合物的方法。该方法包括配制药学可接受载体和调节本发明的肽的表达或活性的药剂。该组合物可进一步包括额外的活性剂。因此，本发明进一步包括通过配制药学可接受载体和调节本发明的肽的表达或活性的药剂和一种或多种额外的生物活性剂制备药物组合物的方法。
治疗AIDS和肿瘤的方法
本发明的另一个方面涉及一种治疗AIDS的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的含有至少一个VGFPV基序且长度为10-100个氨基酸的肽。
在一个实施方式中，所述肽包含至少两个VGFPV(SEQ ID NO：1)基序。在另一个实施方式中，所述肽包含氨基酸序列VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO：2)。在又一个实施方式中，所述肽具有H2N-VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK-OH(SEQ ID NO：3)的序列。
本发明的另一个方面涉及一种治疗肿瘤的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的含有位于N末端的至少一个SEQ ID NO：1基序且长度为10-100个氨基酸的肽。
在一个实施方式中，所述肽包含至少两个SEQ ID NO：1基序。在另一个实施方式中，所述肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。在又一个实施方式中，所述肽包含H2N-VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK-OH(SEQ ID NO：3)的序列。
通过下列实施例进一步描述本发明，这些实施例不应构成对本发明的限制。贯穿本申请引用的全部参考文献、专利和公开的专利申请以及附图和表格的内容在此通过引用的方式并入。
实施例1：肿瘤细胞中小囊泡分泌的抑制
1-1.细胞和培养
MDA-MB-231细胞分别源自人胸腺癌和人乳腺癌细胞，并且得自美国典型菌种收藏所(Manassas，VA.)。将细胞维持在补充有链霉素(100U/ml)、青霉素(100U/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和HEPES缓冲盐水溶液(30μM)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Palo Alto，Calif.)中。
1-2.抗体
使用下列抗体：(i)小鼠单克隆(MEM-28)抗CD45抗体(Abcam，Inc，Cambridge，MA)；(ii)鼠科单克隆抗HIV-1 Nef抗体(ImmunoDiagnostic，INC.，Ma.)；(iii)单克隆抗乙酰胆碱酯酶(AchE)抗体，克隆AE-1(CHEMICON，Ca.)；(iv)单克隆抗微管蛋白抗体，克隆B-5-1-2(SIGMA，Mo.)和(v)用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG重链加轻链(H+L)(Pierce，Rockford，Ill)。
1-3.从MDA-MB-231细胞中分离和纯化外来体
通过ChariotTM方法(Active Motif co.，Carlsbad，CA)用SMRwt(H2N-VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK-OH)(SEQ ID NO：3)、SMRmt(H2N-AGFPVAAAGFPVDYKDDDDK-OH)(SEQ ID NO：4)、pQBI-SMRwt-GFP(图1中的图B)或pQBI-SMRmt-GFP(图1中的图B)转染MDA-MB-231细胞(3x105)。两种肽为商业制造(图1中的图A)。SMR序列在肽的N末端重复两次，并且伴有短的二丙氨酸分开重复。接着SMR序列是使我们回收肽的C末端FLAG序列。然而，可以将任何序列插入C末端处。通过在pQBI载体(Qbiogen Inc.)的T7启动子和GFP编码序列之间插入单拷贝的SMR wt序列或SMR mt序列分别产生pQBI-SMRwt-GFP(SEQ ID NO：5)和pQBI-SMRmt-GFP(SEQ ID NO：6)构建体。
简言之，将1μg肽加入到200μl含有10μl Chariot溶液的无血清培养基中，充分混合，并在室温下孵育30min。洗涤细胞培养板。将400μl的ChariotTM/DNA/肽复合物加入到该培养板，接着加入1600μl的无血清培养基。将细胞在37℃、5％CO2条件下孵育1小时。将1ml完全生长培养基加入到培养板中并将该板在37℃、5％CO2条件下孵育48小时。通过在2000xg下离心5min从培养物上清液中移除细胞。然后，将上清液在10,000g下旋转30min以除去细胞碎片。将1ml的10,000g上清液置于离心管中并于4℃在50,000xg、100,000xg和400,000xg下旋转2小时以沉淀外来体。采用从未转染的MDA-MB-231细胞中同样制备的上清液用作阴性对照。
1-4.免疫印迹分析
将沉淀物重悬浮于1x SDS-PAGE加样缓冲液中，通过SDS-PAGE分离。二十微升的各样品在4-20％Tris-HCl标准预制凝胶(Bio-Red Laboratories，Hercules，CA)上通过SDS-PAGE分离，并电泳转移到硝酸纤维素膜上。将该膜在TBS中洗涤5min，而后用含有5％脱脂乳的TTBS(含有0.1％吐温20的TBS)在室温下通过摇动封闭1h，并使用一抗(1∶1000稀释的抗乙酰胆碱酯酶(AchE)mAb)进行免疫印迹，4℃下摇动过夜，接着再加入HRP结合的IgG Ab(H+L)。通过蛋白质印迹鲁米诺试剂(Luminol Reagent)(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)检测蛋白质带。AchE检测后，剥去印迹并用CD45再次杂交。通过蛋白质印迹鲁米诺试剂检测蛋白质带，随后曝光成照相胶片(BioMax film；Fisher Scientific，Pittsburgh，Pa.)。将图像扫描到Adobe Photoshop 6.0，并用Adobe IIIustrator软件(版本8.0；Adobe系统)排列以及使用Scion Image J软件Release Beta 3b(Scion公司，Frederick，MD.)进行光密度计测定。
如图1所示，拮抗物肽(HIV-1 NefSMRwt；图1中图C)降低了MDA-MB-231细胞的胞内和细胞上清液中的AChE(测量肿瘤小囊泡的分泌)。数据还显示了在两个区室中的剂量依赖性。阴性对照(HIV-1 NEfSMRmut，图1中图D)对胞内区室或上清液区室中的AChE均无影响。
以上结果显示，HIV-1 NefSMRwt肽对抗从肿瘤细胞中释放外来体小囊泡。已显示这些小囊泡使癌症患者的免疫系统调节异常，使肿瘤细胞存活并生长旺盛。外来体释放的拮抗作用将使免疫系统自我修复并攻击/杀死肿瘤。
实施例2：HIV-1 NEF转染的细胞中的小囊泡分泌抑制
尽管遗传学研究清楚地显示SMR基序突变消除Nef分泌，但是不清楚这种作用是由于SMR结合位点的破坏，还是只是结构的改变而导致Nef蛋白错折叠。因此，进行一组共转染实验。使用Chariot将HEK293细胞用0.5μg的pQBI-HIV Nef-GFP(表达野生型Nef蛋白)和0.5μg的HIV-1 Nef SMRwt或SMRmut肽或sM1肽(完全随机对照肽，ALAETCQNAWA(SEQ ID NO：7))共转染。简言之，用Chariot试剂在室温下复合野生型Nef-GFP克隆和SMR肽30分钟。将DNA/肽/Chariot复合物加入到无血清培养基中的HEK293细胞中，并将细胞铺板。接着在37℃下孵育2小时，向平皿中加入含血清培养基，并将细胞在37℃下孵育48小时。然后，收集培养基并使用荧光分光光度计对分泌进行测定。使用酶标仪(plate reader)对来自这些培养物中的条件上清液的GFP荧光进行测定。结果显示为相对于NefGFP+sM1肽(阴性对照；100％)的荧光的百分比。
如图2中所示，HIV-1 NefSMRwt肽(从左起第一柱)对抗NefGFP释放到胞外上清液。已经显示，NefGFP在胞外上清液中的外来体样小囊泡中。阴性对照HIV-1 NefSMRmut和sM1对小囊泡释放没有影响。
这些结果证明，拮抗物阻断了HIV-1 Nef转染的细胞的释放。数据说明这些小囊泡，类似于肿瘤细胞释放的那些，破坏免疫系统或使免疫系统调节异常，使HIV生长旺盛并最终导致AIDS发病。外来体释放的拮抗作用将使免疫系统自我修复阻断AIDS进程。
在另一个实验中，使用Chariot将Jurkat细胞用500ng HIV-1wtNef-GFP和7.8-500ng的SMRwt肽共转染。如图3A所示，SMRwt肽抑制Jurkat细胞中的小囊泡分泌。图3B为显示SMRwt肽以剂量依赖方式抑制Jurkat细胞中的小囊泡分泌的剂量响应曲线。
实施例3：小囊泡分泌以及从感染HIV的细胞中释放病毒体颗粒的抑制
3.1实验I
I.如下所示将Jurkat细胞共转染：(使用Chariot试剂盒转染效率30-40％)
#1.pNL4-3+Nef SMR wt(拮抗物)         4板
#2.pNL4-3+Nef SMR mt(无功能拮抗物)   4板
#3.pNL4-3+sM1(阴性对照肽)            4板
pNL4-3是含有病毒基因组的克隆。转染到细胞中使病毒基因组表达并且最终病毒形成体并释放。通过p24蛋白(病毒蛋白质)测量胞外上清液中产生的病毒体的数量。在感染后48小时和96小时收集样本。
在感染后48小时取出各组中的两个板并通过以下分析：
a.p24测定
b.Nef测定
c.侵染性测定
在感染后96小时取出各组中的另外两个板并通过以下分析：
a.p24测定
b.Nef测定
c.侵染性测定
如表I所示，96小时时在肽拮抗物(NefSMRwt)存在下病毒产生数量急剧减少，对阴性对照肽(NefSMRmut)没有看出影响。数据说明，拮抗物阻断了受感染细胞中病毒颗粒的产生和/或释放。
表1：实验I的结果
3.2实验II
使用ChariotTM试剂盒将Jurkat细胞、HEK293细胞、THP-1单核细胞和U937单核细胞用R7或Nef SMR wt(拮抗物)或者用R7+Nef SMR mt(无功能拮抗物)共转染。转染效率为30-40％。
R7是含有病毒基因组的克隆。转染到细胞中使病毒基因组表达并且最终病毒形成体并释放。通过p24蛋白(病毒蛋白质)测量胞外上清液中产生的病毒体的数量。
在转染后2小时、3天、6天、9天、13天、15天、17天、20天、23天、27天和36天，从各板中收集0.5ml上清液，与0.5ml新鲜培养基混合并通过p24 ELISA测定分析。从各板中收集1.5ml上清液并在TLA100转子中于400,000xg下旋转1小时以产生沉淀。该沉淀物用于蛋白质印迹分析(用p24 mAb和Nef mAb)。
如图4A所示，在转染后3天，在阴性对照(R7/SMRmt)中Jurkat细胞中的p24浓度增加，但是直到转染后13天在SMRwt(拮抗物)培养物中才增加。在HEK293细胞和在THP-1单核细胞中观察到了相似的结果。在SMRwt转染的U937单核细胞中有很少的p24，说明该细胞不能清除SMRwt拮抗物。这些数据说明，SMRwt对抗病毒生长或病毒从受感染细胞中释放的一些方面。然而，SMRwt的作用似乎是暂时的。看来随着时间的推移，Jurkat和HEK细胞能够降解该肽，而U937单核细胞不能降解该肽。通过使用不可降解的肽(例如，具有硫键的肽或d-对映异构体(d-enatiomer)肽)可以克服肽的暂时性作用的问题。图4B是显示在Jurkat细胞中在转染后3、6、10、14、17天通过R7/SMRwt(图A)而不是通过R7/SMRmt(图B)阻断p24释放的共焦显微镜照片的复合图。结果符合从ELISA/Western/和MAGI分析中获得的数据。蓝染色为核染色，红染色为细胞质染色，以及绿色FITC染色是针对p24蛋白的。与相同图像中的阴性对照处理过的细胞相比，在第3、6、10天的图像中可以看到拮抗物处理过的细胞的细胞质中p24大量聚积。在第14和17天，p24开始像图像中阴性对照处理过的细胞中的那样。这符合在MAGI/Western/ELISA数据中出现p24被释放的事实，正如我们所料，胞内水平的肽被耗尽使病毒开始被释放。
图4C-4E是显示用R7/SMRwt或R7/SMRmt转染的Jurkat细胞的转染后6天(图4C)和14天(图4D)电子显微镜照片。在第6天，可以观察到病毒颗粒或核壳聚积在用R7/SMRwt处理过的细胞内部的细胞质中以及MVB内。在这些细胞的胞外表面上不能观察到病毒颗粒(图4C中图A-1和)。相反，在用R7/SMRmt处理过的细胞内部可以观察到非常少的MVB，观察到的大多数病毒颗粒聚积在细胞的胞外表面上并极化到细胞的南极(图4C中图B-1)。在第14天，可以观察到病毒颗粒聚积在用R7/SMRwt(图4D中图A-2)处理过的细胞的胞外表面上，非极化地贯穿整个膜表面，如在用R7/SMRmt处理过的细胞(阴性对照)中观察到的一样多(图4D中图B-2)。为了显示如上所述聚积的高电子密度‘病毒颗粒’，在下面在第6天和第14天的拮抗物和阴性对照肽图像中显示了更高放大倍数图像(图4E)。如EM所测量，证据显示SMRwt拮抗物延迟了病毒从受感染细胞中的释放。
图5-8中显示了蛋白质印迹分析结果。结果总结于图9中。如图3-9所示，在肽拮抗物(NefSMRwt)的存在下病毒产生的数量急剧减少到0或接近0。阴性对照肽(NefSMRmut)没有观察到影响。细胞裂解物测定显示在全部测定条件下p24的产生是相同的，说明测定条件对病毒蛋白质的表达没有影响。数据说明拮抗物阻断了病毒颗粒从受感染细胞中的释放。这可能是由于向细胞质膜运输病毒成分的拮抗作用。最终，这将(i)切断HIV感染并且(ii)阻断AIDS进程。
3.3实验III
将Magi/CXCR4细胞暴露于来自用R7病毒DNA/SMRwt肽或R7病毒DNA/SMRmt肽转染的Jurkat细胞、HEK293细胞、THP-1单核细胞或U937单核细胞的条件上清液中48小时。然后将这些细胞固定并用X-Gal染色。图10A显示了暴露于来自用R7/SMRwt转染的Jurkat细胞的1ng/ml稀释的p24上清液中的Magi/CXCR4细胞。图10B显示了暴露于来自用R7/SMRmt转染的Jurkat细胞的1ng/ml稀释的p24上清液中的Magi/CXCR4细胞。通过蓝色核染色在光学显微镜检下容易看到有效地感染了R7的细胞。放大倍数x20。注意到，用R7和肽拮抗物(SMRwt)处理过的细胞显示出蓝色染色细胞的数目急剧减少，而用R7和阴性对照肽(SMRmt)处理过的细胞显示出许多蓝色染色细胞。这说明，来自R7/阴性对照肽处理过的细胞的条件上清液中有病毒，而来自R7/拮抗物处理过的细胞的条件上清液中没有病毒。
对这些Magi培养物的蓝色染色细胞定量。数据绘制为转染后时间的函数。如图11中所示，在来自NefSMRwt转染的Jurkat细胞或NefSMRwt转染的THP-1单核细胞的上清液存在下，受感染细胞的数目显著减少。数据表明拮抗物阻断了病毒颗粒从受感染细胞中的释放。这可能是由于向细胞质膜运输病毒成分的拮抗作用。最终，这将切断HIV感染并且阻断AIDS进程。
总之，这些实验证明，这种技术可以用于迫使细胞制造和胞外分泌任何蛋白质或表位，从而可以容易地从细胞中纯化蛋白质或表位。如果小囊泡载有靶向表位(例如，针对肿瘤标志物的抗体表位)和抗肿瘤蛋白或表位，其也可用于化学疗法。此外，利用这种技术，可以将载体转染到患者特定细胞从而使用自体小囊泡(self-vesicle)。
由于蛋白质也位于小囊泡外膜上，它们还可用于诱导免疫反应。因此，例如，可以将流感表位载入载体中并在小囊泡外表上表达以诱导针对流感病毒的免疫反应。
实施例4：分泌拮抗物(HIV NEF SMRWT肽)对HIV-1 GAGWT-GFP-诱导的分泌的影 响
使用Chariot将细胞用0.5μg的pQBI-HIV Gag-GFP(表达野生型Gag蛋白)和0.5μg的HIV-1 Nef SMRwt、SMRmut肽、sM1肽或未转染的对照共转染48小时。使用酶标仪对来自这些培养物的条件上清液进行GFP荧光测定。结果示于表II中。颗粒分泌水平相对于任意地设定为1x的未转染的对照(阴性对照；100％)而显示。
表II：荧光酶标仪测定分泌(相对于未转染的细胞)的提高
x-exp条件/UT；
y-SMRmt/SMRwt
已经显示从Gag-转染的细胞中分泌Gag，其称作‘病毒样颗粒’。这些病毒样颗粒非常像小囊泡。已有人提出病毒(已被描述为Gag型小囊泡)是通过外来体途径从细胞中释放的。分泌拮抗物SMRwt对Gag病毒样颗粒的释放没有影响。这说明Gag运输途径和Nef运输途径至少在一点上不同。这一点就是拮抗物操纵途径中的因子。
实施例5：在WTNEF蛋白存在下分泌拮抗物(HIV NEF SMRWT肽)对HIV-1  GAGWT-GFP-诱导的分泌的影响
使用Chariot将细胞用pQBI-HIV Gag-GFP构建体、wtNef-RFP和拮抗物(SMRwt肽)、阴性对照SMRmt肽或随机肽sM1转染48小时。使用酶标仪对来自这些培养物的条件上清液的GFP荧光进行测定。结果示于表III中。颗粒分泌水平相对于任意地设定为1x的未转染的对照(阴性对照；100％)而显示。
表III：荧光酶标仪测定分泌(相对于未转染的细胞)的抑制
如表III中所示，在wtNef-RFP存在下，SMRwt拮抗物肽阻断了Gag病毒样颗粒的释放。这些结果显示，当细胞中单独有Gag时SMRwt没有对抗Gag VLP的形成和释放，而当细胞中同时有Gag和Nef时SMRwt确实对抗Gag VLP的形成和释放。说明Nef指导Gag释放的途径与当细胞中单独有Gag时的途径不同。这还解释了为什么SMRwt肽能够阻断HIV病毒的释放但是不能阻断Gag病毒样颗粒的释放(当只有Gag存在时)。
如表III中所示，在wtNef-RFP存在下，SMRwt拮抗物肽的确阻断了在wtNef-RFP存在下的Gag病毒样颗粒的释放。
实施例6：SMRWT肽的细胞毒性测定
使用Chariot将SMRwt或SMRmut(阴性对照)肽单独转染到Jurkat细胞中。使转染的细胞生长48小时。通过荧光素二乙酸酯(FD；被活细胞吸收并转化为FITC以使细胞发绿色荧光)和碘化丙锭(PI；扩散穿过死细胞的多孔膜以使那些细胞内部发红色荧光)测定细胞的细胞毒性。
如图12所示，在SMRwt转染的细胞中检测到只有非常少数目的死细胞(＜2％)(图A-1)。此外，在SMRwt转染的细胞中的死细胞的数目与在SMRmut转染的细胞中看到的细胞的数目(图B-1)相似。这些结果说明SMRwt拮抗物在Jurkat细胞中具有非常小的细胞毒性或者没有细胞毒性。
实施例7：与拮抗物相互作用的细胞因子的识别
A：结合SMRwt肽和调节分泌的细胞因子的识别
为了拉下(pulldown)与SMRwt拮抗物相互作用而不与SMRmt阴性对照相互作用的细胞因子，结合FLAG免疫沉淀对Jurkat细胞裂解物使用SMRwt肽对SMRmt肽。通过FLAG IP测定来分析与拮抗物相互作用的细胞因子。简言之，将细胞裂解物与连接有FLAG-标签SMR肽的AminoLink Plus树脂结合。SMR特异性细胞蛋白质(ROY)与树脂上的SMR肽结合。洗掉树脂上的非特异性杂质(G BIV)并通过离心去除。洗脱和收集SMR特异性细胞蛋白质(ROY)。一些强力结合的杂质(V)也被洗脱和收集。
在SDS PAGE上分离这些拉下产物(图13中图A)。将在SMRwt泳道中而不是在SMRmt泳道中出现的带切下来并纯化。按照这种方式识别和纯化五条带(图13中图A)。MALDI TOF MS/MS和LC/MS/MS用于识别这些蛋白质产物并发现其为Mortalin/GRP75；肌球蛋白10(Myosin 10)；波形蛋白(Vimentin)；GRP78；HSC70。在这些蛋白质中，Mortalin/GRP75是分子伴侣Hsp70家族的成员。其同时位于线粒体和细胞质中，并且涉及多种功能，包括应激响应、胞内运输、抗原加工和细胞增殖、分化的控制以及致肿瘤发生。Mortalin与p53相互作用，并且显示参与细胞凋亡和小囊泡运输(MAC复合物)。还在肿瘤细胞释放的微泡中发现它。
用α-Mortalin抗体蛋白质印迹探测凝胶。在包含细胞裂解物、拮抗洗脱物以及拮抗物亲合树脂的泳道(图13中B，泳道1、3和5)中而不是在阴性对照或阴性对照肽洗脱物的泳道(图13中图B，泳道2和4)中检测到分子量为～75kDa的蛋白质。
Mortalin抗体抑制小囊泡分泌
为了观察对Nef诱导的分泌的影响，使用wtNefGFP对照向Jurkat细胞中Chariot转染Mortalin/GRP75抗体用于敲减(knockdown)内源性Mortalin/GRP75蛋白(图14)。将a-微管蛋白抗体Chariot转染到相配的细胞中作为阴性对照。我们观察到，Mortalin/GFP75抗体阻断了Nef诱导的分泌，而a-微管蛋白抗体对Nef诱导的分泌没有影响。这显示Mortalin在Nef诱导的外来体的分泌中是重要的。使Mortalin抗体杂交以洗脱带。
Mortalin也称葡萄糖调节蛋白75(GRP75)或肽结合蛋白74(PBP74)。Mortalin为679个氨基酸长，是热休克蛋白70家族中的不可诱导的成员。其与其他家族成员(包括大肠杆菌DnaK)具有高度同一性。尽管Mortalin的晶体结构还没有被推出，基于Hsp70家族内的进化保守性，预期其具有两个主要的结构域，通过蛋白酶敏感位点结合的N末端ATP酶核苷酸结合域(NBD)和C末端底物结合域(SBD)。NBD在整个家族中是高度保守的，而SBD显示出明显的多样性，可能的解释是在Hsp70家族成员中底物特异性的变化。其分子伴侣活性密切地与ATP水解作用密切相关。
已发现，Mortalin定位于线粒体以及各种细胞质囊泡，包括早期细胞内小泡(参见，例如，Kanai等人，GenesCells，2007，12：797-810；Kaul等人，Exp.Gerontol.，2002，37：1157-1164；Singh等人，Exp Cell Res，1997，234：205-216和Van Buskirk等人，J Immunol.1991，146：500-506)。Mortalin直接与几种蛋白质(例如，p53和FGF-1)结合并通过非经典途径(即外来体途径)调节它们的胞内运输(参见，例如，Kaul等人，J Biol Chem，2005，280：39373-39379；Mizukoshi等人，Biochem Biophys Res Commun，2001，280：1203-1209；Mizukoshi等人，Biochem J，1999，343：461-466；和Prudovsky等人，J Cell Biochem，2008，103：1327-1343)。在宿主免疫系统攻击下的细胞通过Mortalin表达释放膜囊泡，并且在那些小囊泡中发现了Mortalin(Pilzer等人，Int Immunol，2005，17：1239-1248)。还在不同的肿瘤细胞释放的外来体中发现了Mortalin(Choi等人，J Proteome Res，2007，6：4646-4655；Staubach等人，Proteomics，2009)。
已发现，Mortalin在细胞中行使多个主要功能(在Kaul等人，Exp Ger ontol，2007，42：263-274中综述)。其在蛋白质的输入和输出的细胞转运系统中行使主要家务管理功能。尽管不是通过热诱导的，但是温和的应激响应诱导Mortalin使其成为对抗应激和细胞凋亡的保护者。Mortalin的表达下降，或者Mortalin突变体形式的表达，导致细胞衰老，而Mortalin的表达提高导致了其异常形式为癌症的细胞的不死性。
证据清楚地指明Mortalin涉及正常细胞向癌细胞转化的过程中以及那些细胞的化学疗法抗性的过程中。已发现Mortalin在不同起源的肿瘤细胞中过表达(Wadhwa等人，Int JCancer，2006，118：2973-2980)。已发现鼠科的Mortalin的亚细胞位置从正常细胞中的线粒体定改变为癌性细胞中的胞质溶液(Wadhwa等人，J Biol Chen 1998，273：29586-29591)。已发现Mortalin与p53相互作用。进一步地，这种相互作用促使p53在细胞质中隐匿，从而抑制其核活动(Kaul等人，Supra 2007，42：263-274；Yi等人，Mol Cell Proteomics，2008，7：315-325；Czarnecka等人，Cancer Biol Ther，2006，5：714-720)，诱导了一些肿瘤对放射疗法和化学疗法产生抗性。最后，如上所讨论的，Mortalin与胞内运输有关导致了外来体释放，并且已显示存在于外来体小囊泡中(Pilzer等人pringer Semin Immunopathol，2005，27：375-387；Choi等人，J Proteome Res，2007，6：4646-4655；Staubach等人，Proteomics，2009)。已发现肿瘤细胞(例如，乳腺肿瘤)以有规则的方式分泌携带肿瘤抗原并且能够呈递这些抗原或将它们传送到抗原呈递细胞的外来体(Yu等人，J Immunol，2007，178：6867-6875)。这些肿瘤外来体通过杀死免疫细胞或使免疫细胞调节异常来引起免疫抑制，从而促进使肿瘤生长的免疫赦免状态。因此，肿瘤通过多种机制操纵Mortalin增强其自身适应性。
已发现，热休克70家族蛋白质与乳癌有关。它们与乳癌中的低分化、淋巴结转移、细胞增殖提高、细胞凋亡阻断以及较高临床分期具有明确的联系。所有这些形态都是不良的临床结果的标志(Calderwood等人，Int J Hyperthermia，2008，24：31-39；Calderwood等人，Trends Biochem Sci，2006，31：164-172；Ciocca等人，Cell Stress Chaperones，2005，10：86-103)。此外，已经清楚地显示，Mortalin的过表达会促使许多细胞类型中的致癌作用(特别是已经在乳癌细胞中观察到)(Wadhwa等人，Int J Cancer，2006，118：2973-2980)。
从文献中清楚地得出，Mortalin是癌免疫疗法的潜在靶子，有许多研究正在致力于开发治疗法(Wadhwa等人，Cancer Therapy，2010，1：173-178；Walker等人，Am J Pathol，2006，168：1526-1530；Deocaris等人，Cancer Lett，2007，252：259-269；Pilzer等人，Int J Cancer，2009；Parolini等人，J Biol Chem，2009)。例如，MKT-077是引起癌细胞选择性死亡的线粒体探寻非定域阳离子染料(mitochondrion-seeking delocalized cationic dye)(Deocaris等人，CancerLett，2007，252：259-269)。它的细胞靶子包括致癌的Ras、F-肌动蛋白、端粒末端转移酶和Mortalin(hmot-2)/mthsp70(Parolini等人，J Biol Chem，2009)。MKT-077与Mortalin的核苷酸结合域(NBD)结合并引起蛋白质的三级结构改变，使其分子伴侣功能钝化并诱导人肿瘤细胞系的衰老。尽管现有一些证据显示较低剂量可以产生较小毒性，但是在临床试验中，发现该分子会引起肾脏毒性。
实施例8：抑制小囊泡/病毒释放的其他药物
在其他条件下，可以将HIV Nef SMRwt肽与经FDA批准并且已证实在阻断病毒释放以及小囊泡释放方面具有功效的药物联合使用。这种药物的实例为：二甲基氨氯吡咪和奥美拉唑。
已开发了可用于筛选阻断分泌的药剂的共转染测定。在方法一(图15)中，将连有任何荧光标签连的NefGFP、NefRFP或Nef转染到细胞系中，并在48小时孵育阶段将细胞用药剂或化学品处理。然后，在转染后48小时，测定条件上清液的荧光分子(通过各种技术)。在方法二(图16)中，将细胞用荧光标记(如会标记内源性产生的外来体的N-Rh-PE)处理。在化学品或小的肽拮抗物的存在下或者在没有化学品或小的肽肽拮抗物的存在下孵育细胞至少24小时。然后测定条件上清液的N-Rh-PE标记的微泡/外来体(通过各种技术)。条件上清液中荧光标签的缺乏表示化学剂已经阻断了外来体分泌途径，阻断了那个途径的Nef诱导。应该能够将该方法改进从而开发出用于筛选阻断分泌的试剂的高通量测定方法。
以上说明是为了教导本领域普通技术人员如何实践本发明，而不是意欲详述本发明所有那些显而易见的改进和变化，本领域技术人员一旦阅读了说明书，那些显而易见的改进和变化就将变得明显。然而，所有这些显而易见的改进和变化意欲包含在由所附权利要求所限定的本发明的实施方式的范围内。除非上下文具体指定相反，权利要求书意欲覆盖有效地实现本发明预期目的的任何顺序的要求保护的成分和步骤。

Claims (14)

1.一种抑制细胞中微粒释放的肽，其中，所述肽由VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO:2)或VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的肽，其中，所述肽由VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列组成。
3.权利要求1所述的肽，其中，所述肽由VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列组成。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的肽的多核苷酸。
5.一种表达载体，其包含可操作地连接调节序列的权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种药物组合物，其包含：
(1)肽，所述肽由VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO:2)或VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列组成；和
(2)药学可接受载体。
7.权利要求6所述的药物组合物，其中，所述肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
8.权利要求6所述的药物组合物，其中，所述肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
9.一种肽或编码所述肽的多核苷酸在制备用于治疗AIDS的药物中的用途，其中，所述肽由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
10.权利要求9所述的用途，其中，所述肽由SEQ ID NO:2的序列组成。
11.权利要求9所述的用途，其中，所述肽由SEQ ID NO:3的序列组成。
12.一种肽或编码所述肽的多核苷酸在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其中，所述肽由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
13.权利要求12所述的用途，其中，所述肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
14.权利要求12所述的用途，其中，所述肽由SEQ ID NO:3的序列组成。
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