ES2232956T3

ES2232956T3 - Fragmentos funcionales de la proteina vpr de vih-1 y metodos para usarlos.

Info

Publication number: ES2232956T3
Application number: ES98939404T
Authority: ES
Inventors: Sundarasamy Mahalingam; Velpandi Ayyavoo; Mamata Patel; Thomas Kieber-Emmons; David B. Weiner
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: AU753031B2; EP1012603A1; ATE280947T1; AU8783898A; WO1999009412A1; DE69827284T2; US6087486A; EP1012603B1; DE69827284D1; EP1012603A4; CA2301295A1

Abstract

Una composición conjugada que comprende un fragmento de Vpr de VIH-1 que comprende la secuencia de los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o una proteína no Vpr de VIH-1 que comprende los aminoácidos 17-36 y 59-84 conjugados con un compuesto terapéutico.

Description

Fragmentos funcionales de la proteína Vpr de VIH-1 y métodos para usarlos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a fragmentos de la proteína Vpr de VIH-1 con función en localización nuclear, empaquetamiento de viriones, detención del ciclo celular y/o diferenciación celular. La presente invención se refiere a proteínas no Vpr que comprenden dichos fragmentos de la proteína Vpr de VIH-1. La presente invención también se refiere a métodos para usar dichos fragmentos y proteínas para localizar proteínas en un núcleo celular, en ensayos para identificar compuestos que inhiben el empaquetamiento de viriones, a un método de parar el ciclo celular y a métodos de inducir la diferenciación celular.

Antecedentes de la invención

El gen accesorio vpr del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), aunque es prescindible para la replicación viral en líneas de células T y células mononucleares periféricas primarias activadas (PBMC), se requiere para la replicación eficaz en monocitos/macrófagos primarios.

La proteína Vpr se ha caracterizado en forma de un oligómero. VIH-2 y VIS (virus de la inmunodeficiencia de simios) codifican una segunda proteína, Vpx, que comparte una homología de secuencia considerable con Vpr. Ambas proteínas se empaquetan de manera eficaz en partículas virales de VIH y VIS. Los estudios de localización de viriones sitúan tanto Vpr como Vpx fuera de la estructura central. Aunque Vpr y Vpx no son parte de la poliproteína estructural Gag, su incorporación requiere un anclaje para asociarse con las estructuras que se ensamblan en la cápsida. La porción C-terminal del precursor Gag correspondiente a la proteína p6 parece constituir dicho anclaje a través de un mecanismo desconocido. Además, p6 es esencial para la incorporación tanto de Vpr como de Vpx en las partículas del virus. Un dominio helicoide supuestamente predicho cerca del amino-terminal juega un importante papel en el empaquetamiento de Vpr en viriones y en el mantenimiento de la estabilidad de la proteína. Los análisis mutagénicos del C-terminal sugieren que no es esencial para la incorporación de Vpr en las partículas del virus (Mahalingam et al, Virology, 1995, 214: 647-652).

Se han sugerido varios papeles posibles para Vpr en la replicación de VIH-1. Vpr puede transactivar con moderación LTR de VIH-1 y de este modo puede sobrerregular la expresión génica viral en células recién infectadas antes de la aparición de Tat. Se ha descubierto que potencia la migración nuclear del complejo de preintegración en células recién infectadas que no se están dividiendo. De manera significativa, Vpr induce la diferenciación celular que incluye la activación de la trascripción de genes celulares del hospedador específico y la detención del crecimiento en varias líneas celulares tumorales incluso en ausencia de cualquier otra proteína viral. Esto sugiere que Vpr, por sí mismo, puede ser suficiente para alterar las funciones celulares. Se ha informado de que Vpr bloquea la célula que está en ciclo en la fase G2/M del ciclo celular. Este descubrimiento se ha asociado con un cambio en el estado de fosforilación de la quinasa CDC2. Se ha sugerido que el dominio C-terminal de Vpr se puede requerir para la inhibición de la quinasa CDC2 (Di Marzio et al, J. Virology, 1995, 69(12): 7909,-7916). Además, la expresión de Vpr parece inhibir el establecimiento de la infección crónica. Se ha informado de que Vpr causa la detención del crecimiento y los defectos estructurales en levaduras. Los estudios funcionales han mostrado que Vpr acelera la replicación de VIH-1 en algunas líneas celulares T-linfoides en macrófagos primarios donde los efectos de Vpr son más pronunciados.

También se ha informado de que Vpr tiene una actividad transcelular. Tanto Vpr purificada a partir de plasma de individuos seropositivos al VIH-1 y Vpr recombinantes purificadas eran capaces de inducir células latentes en productores virales de alto nivel cuando se añaden a un medio de cultivo a bajas concentraciones. Por ejemplo, Levy et al (J. Virology, 1995, 69(2): 1243-1252) ha descubierto que la proteína Vpr purificada a bajas concentraciones era activa en forma de una molécula extracelular funcionando para aumentar la replicación de VIH en células T-linfocíticas y células monocíticas. Desde el punto de vista mecanístico, es concebible que esta actividad transcelular esté mediada por los mismos mecanismos que modifican el crecimiento celular y la diferenciación. Se ha informado de que Vpr se localiza principalmente en núcleo cuando se expresa en ausencia de otra proteína de VIH-1. Varios estudios mutagénicos se han dirigido en un intento de identificar las regiones de la proteína Vpr responsables de la localización nuclear (Yao et al, J. Virology, 1995, 69(1): 7032-7044; Lu et al, J. Virology, 67(11); 6542-6550). Aunque se ha identificado claramente una señal de localización nuclear no clásica de Vpr, se ha sugerido que Vpr puede conseguir el acceso al núcleo por interacciones específicas con proteínas nucleares. En este sentido se ha informado de las proteínas que interaccionan con Vpr en células hospedadoras pero no se han clonado de manera molecular. Es interesante observar que una de estas dianas de Vpr, denominada proteína de interacción con Vpr, o RIP-1, parece desplazarse al núcleo después de su interacción con Vpr o provocarse por ligandos del receptor de glucocorticoides (GR), teniendo la vía de GR un posible papel en la función de Vpr.

Todas las composiciones de los documentos WO94/19456, WO95/26361, WO96/08970 y WO96/32494 comprenden la proteína Vpr y fragmentos de la misma que pueden ser útiles en el tratamiento de una diversidad de enfermedades. Sin embargo, aún no se ha definido la relación molecular entre las diferentes funciones de Vpr descritas anteriormente. Hay una necesidad de identificar la actividad funcional de los diversos dominios de la proteína Vpr.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a nuevos fragmentos de la proteína Vpr de VIH-1 y fragmentos de la proteína Vpr no de VIH-1 y sus usos terapéuticos como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A -1D muestran la construcción y la expresión de moléculas Vpr mutantes. La figura 1A muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de Vpr de VIH-1 y 2/VIS y Vpx de VIH-2/VIS. Los números indican posiciones de los restos de aminoácidos para cada secuencia de proteína proporcionada. La figura 1B muestra que los plásmidos de expresión para la síntesis de moléculas Vpr mutantes se generaron por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con solapamiento en los codones indicados. Los fragmentos del gen vpr mutante amplificado por PCR se digirieron con HindIII y XhoI y se ligaron al vector pCDNA3 para producir plásmidos de expresión de mutantes Vpr. La figura 1C muestra que las células HeLa infectadas con el virus vaccinia recombinante (vTF7-3) se transfectaron con los plásmidos de expresión de vpr tipo silvestre y mutante. Las células transfectadas se marcaron con una mezcla de marcaje de proteínas S^{35} durante 2 horas y las proteínas Vpr asociadas a células se inmunoprecipitaron con antisuero anti-Vpr como se describe en Materiales y Métodos. Los inmunoprecipitados se analizaron por PAGE al 12% en SDS. La denominación de los plásmidos Vpr se indica en la parte superior. La figura 1D muestra que la estructura secundaria de Vpr se calculó usando el programa nnpredict (Kneller, D.G. et al., J. Mol. Biol., 1990, 214: 171-182). nnpredict es un programa que predice el tipo de estructura secundaria para cada resto de la secuencia de aminoácidos basado en la predicción de una red neuronal de dos capas unidireccional. H es helicoide, E es extendido y un guión (-) es indefinido. \alphaL-A, L64S, y H71C muestran el mismo perfil secundario como el tipo silvestre de Vpr, sugiriendo la importancia de los restos de Leu en la cara hidrófoba e His en el C-terminal. La introducción de residuos de prolina en E21, E24 y A59 interrumpe los dominios helicoides respectivos.

La figura 2 muestra la incorporación de Vpr en partículas tipo virus dirigidas por Gag de VIH-1. La cotransfección de pCDGag con los plásmidos de expresión de Vpr de tipo silvestre o mutante se realizó usando células HeLa infectadas con vTF7-3 como se describe en Materiales y Métodos. Las células transfectadas se marcaron con una mezcla de marcaje de proteínas S^{35} durante 5 horas, el medio de cultivo de retiró por centrifugación, se concentró usando concentradores Centricon 30 y las partículas tipo virus se resuspendieron con tampón RIPA. La inmunoprecipitación se realizó usando antisuero anti-VIH y anti-Vpr y se analizó por PAGE al 12% en SDS. Las posiciones electroforéticas de Gag y Vpr se muestran a la derecha y los marcadores de peso molecular se muestran a la izquierda en
kilodalton.

Las figuras 3A-3O muestran la localización subcelular de Vpr tipo silvestre y el efecto de las sustituciones en los diferentes dominios estructurales de Vpr. Las células HeLa se infectaron con virus vaccinia recombinantes vTF7-3 y se transfectaron con plásmidos de expresión de Vpr. Después de una transfección durante una noche, las células se fijaron y tiñeron con suero anti-Vpr seguido por IgG de cabra anti-conejo purificado por afinidad conjugado con FITC.

Las figuras 4A-1-4A-4, 4B-1-4B-2 y 4C muestran que la expresión de Vpr de VIH-1 independiente de otros genes virales que inhibe la proliferación celular. Las células RD que expresan Vpr se detienen en el ciclo celular con un contenido de ADN 4N. Las figuras 4A-1-4A-4 muestran el análisis de flujo citométrico de células RD teñidas con yoduro de propidio (PI). Las células RD se transfectaron con el vector solo, Vpr tipo silvestre, y Vpr mutantes. Las figuras 4B-1-4B-2 muestran la morfología de las células RD que expresan Vpr. Las células DR se transfectaron con el vector solo (a), y Vpr tipo silvestre (b). Después de dos días las células se mantuvieron en DMEM que contiene 2 \mum/ml de puromicina. Las células se fotografiaron de 5 a 6 días después. La figura 4C muestra la actividad de detener el ciclo celular de los mutantes Vpr.

La figura 5 muestra los dominios de Vpr requeridos para la incorporación al virión, la localización subcelular, y la detención del ciclo celular/diferenciación. Se muestra la secuencia de aminoácidos de Vpr del clon trófico de macrófago 89.6 con los dominios alfa helicoide, LR y C-terminal indicados. Los restos de aminoácido críticos y los dominios esenciales para las diferentes funciones de Vpr se determinaron por análisis mutacional.

Las figuras 6A-6B muestran un modelo para las diferentes funciones de Vpr de VIH-1. La figura 6A representa un esquema de la incorporación de Vpr en las partículas de virus a través de la infracción con la poliproteína estructural p55Gag. La figura 6B representa la localización nuclear de Vpr y las funciones de detención del ciclo celular que se mediaron por sus interacciones con un cofactor o cofactores celulares.

Descripción de las realizaciones preferidas de la invención

Como se usa en este documento, las expresiones "fragmento de la proteína Vpr de VIH-1" y "fragmento de la proteína Vpr" significan que se refieren a proteínas que son proteínas Vpr no completas de VIH-1 (es decir, proteína Vpr de longitud completa) sino formas truncadas que constan de secuencias de aminoácidos contiguos idénticos a secuencias de aminoácidos contiguos de porciones de la proteína Vpr de VIH-1. Un fragmento de la proteína Vpr puede ser similar a la proteína Vpr de longitud completa. Por ejemplo, una proteína que tiene los aminoácidos 1-95 de la proteína Vpr pero que carece del aminoácido 96 no es idéntica a una proteína Vpr de longitud completa pero es un fragmento de la proteína Vpr.

Como se usa en este texto, la expresión "proteína no Vpr" significa que se refiere a una proteína que no es idéntica a la proteína Vpr de VIH-1. La expresión "proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr" significa que se refiere a una proteína no Vpr que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en parte a la de un fragmento de la proteína Vpr y restos de aminoácidos adicionales que se diferencian de los de la proteína Vpr de modo que la secuencia completa de la proteína Vpr no se proporciona a la proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. Una proteína no Vpr que tiene secuencias de un fragmento de la proteína Vpr puede ser similar a la proteína Vpr. Por ejemplo, una proteína que tiene los aminoácidos 1-95 de la proteína Vpr y el aminoácido 96 que no es idéntico al aminoácido 96 de la proteína Vpr es una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr.

Como se usa en este documento, el término "enfermedades hiperproliferativas" significa que se refiere a esas enfermedades y trastornos caracterizados por hiperproliferación de células. Los ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluyen todas las formas de cáncer y psoriasis.

El término "farmacéutico" se conoce bien y se entiende ampliamente por los especialistas en la técnica. Como se usa en este texto, las expresiones "composiciones farmacéuticas" y "composiciones farmacéuticas inyectables" significan que tienen su significado habitual como se entiende por los especialistas en la técnica. Las composiciones farmacéuticas se requieren para encontrar patrones específicos en relación con la esterilidad, pirógenos, materia particulada así como isotonicidad y pH.

La presente invención surge del descubrimiento de las funciones y actividades de los dominios específicos de la proteína Vpr de VIH-1. Se ha descubierto que el dominio caracterizado por los aminoácidos 19-35 y 74-89 de la proteína Vpr es responsable de la capacidad de la proteína Vpr de detener una célula en el ciclo celular. Se ha descubierto que el domino caracterizado por los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr es responsable de la capacidad de la proteína Vpr de interaccionar con el dominio p6 del producto de traducción p55 Gag. Dicha interacción está implicada en el empaquetamiento de Vpr en las partículas VIH-1. Se ha descubierto que el dominio caracterizado por los aminoácidos 17-36 y 59-84 de la proteína Vpr es responsable de la capacidad de la proteína Vpr de localizarse en el núcleo de células. Estas actividades y funciones de los dominios específicos de la proteína Vpr permiten el uso de los fragmentos de la proteína Vpr y proteínas no Vpr que tienen una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos fragmentos de la proteína Vpr y proteínas no Vpr. Tales moléculas proteicas y de ácido nucleico pueden usarse en métodos para inhibir la proliferación celular, incluyendo la proliferación celular de células de cáncer, en métodos para liberar compuestos conjugados al núcleo de células, en métodos para identificar compuestos que inhiben el ensamblaje de la partícula viral VIH-1, y en métodos para preparar y liberar proteínas de fusión a células. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas proteicas y de ácido nucleico.

Varios aspectos de la invención se refieren al descubrimiento del dominio de la proteína Vpr responsable de la actividad en la que se detiene el avance de la célula a través del ciclo celular. La capacidad de detener la célula en el ciclo celular permite la inhibición de la proliferación celular ya que la célula debe pasar a través del ciclo celular para completar la división celular y, de este modo, proliferar. Pueden usarse los fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 para detener una célula en el ciclo celular e inhibir, de este modo, la proliferación celular. De manera similar, pueden usarse las proteínas no Vpr que tienen una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que consta de los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 de la proteína Vpr para detener una célula en el ciclo celular e inhibir, de este modo, la proliferación celular. Así mismo, puede usarse una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y 74-89 para detener una célula en el ciclo celular e inhibir, de este modo, la proliferación celular, como puede una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y: un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89; una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89; una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89; o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89. Pueden usarse las composiciones farmacéuticas de acuerdo con este aspecto de la invención para tratar individuos que padecen de estas enfermedades asociadas con células hiperproliferativas tales como el cáncer o la psoriasis. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para tratar el cáncer caracterizado por tumores sólidos. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de tratar un individuo que padece de una enfermedad asociada con células hiperproliferativas que comprende la etapa de administrar a dicho individuo una cantidad de una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y: un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácido 19-35 y/o 74-89 de la proteína Vpr; una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89; una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89; o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 de la proteína Vpr. La proteína o el ácido nucleico se captan por la célula. La proteína provoca en la célula la parada del avance a través del ciclo celular. La secuencia nucleotídica de la molécula de ácido nucleico que codifica el fragmento de Vpr o proteína no Vpr se expresa y el producto de traducción resultante provoca en la célula la parada del avance a través del ciclo celular. La interrupción en el ciclo celular da como resultado una interrupción de la división celular y la proliferación. Cuando un individuo que tiene células hiperproliferativas se trata de acuerdo con los métodos de la invención, las células hiperproliferativas se detienen y paran de dividirse. De este modo, por ejemplo, se detiene o ralentiza el crecimiento tumoral.

Pueden producirse fragmentos de la proteína Vpr y proteínas no Vpr que tienen una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprenden un fragmento de la proteína Vpr por un medio habitual usando materiales de partida fácilmente disponibles como se describe anteriormente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Vpr así como la secuencia de aminoácidos de la proteína son bien conocidas. El genoma de VIH completo está publicado. Se informa de las secuencias repetidas terminales largas en Stacich, B. et al., (1985) Science 227:538-540. Se informa de las secuencias nucleotídicas completas en Ratner, L. et al., (1985) Science 313:277-284 y Ratner, L. et al., (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:57-69. La secuencia de ADN de VIH-1/3B está publicada en Fisher, A., 1985 Nature 316:262. La secuencia nucleotídica de la cepa HXB2 de VIH-1 está disponible on-line por el número de acceso de Genbank K03455. La secuencia de ADN del VIH está publicada en Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549. La secuencia es accesible por el número de Genbank M17449.

Las moléculas de ADN que codifican la proteína Vpr están fácilmente disponibles al público. El plásmido pNL-43 que contiene una secuencia de ADN que codifica la cepa MN de VIH-1 que incluye la proteína Vpr y el plásmido pHXB2 que contiene una secuencia de ADN que codifica la cepa VIH-1/3B de VIH ambas están disponibles por el AIDS Research Reference and Reagent Program (ARRRP), Division of AIDS, NIAID, NIH, Bethesda, MD.

El suministro de una secuencia de ADN apropiada que codifica una proteína deseada permite la producción de la proteína usando técnicas recombinantes ahora conocidas en la técnica. La secuencia codificante puede obtenerse recuperando la secuencia de ADN a partir de los plásmidos disponibles al público que comprenden ADN que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. La secuencia de ADN también puede obtenerse a partir de otras fuentes de ADN de VIH o puede prepararse químicamente usando una secuencia de nucleótidos sintetizada. Cuando el ADN codificante se prepara sintéticamente, se puede aprovechar la ventaja de las preferencias de codones conocidas del hospedador pretendido cuando el ADN es para expresarlo.

Un especialista en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, obtener una molécula de ADN que codifica la proteína Vpr y modificarla, o sintetizar una molécula de ADN, para codificar un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. La molécula de ADN puede insertarse en un vector de expresión disponible en el mercado para usarlo en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido pSE420 disponible en el mercado (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción en E. coli. El plásmido pYES2 disponible en el mercado (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción en cepas de S. cerevisiae de levaduras. El sistema de expresión de baculovirus completo MaxBac™ disponible en el mercado (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción en células de insecto. El plásmido pcDNA I disponible en el mercado (Invitrogen, San, Diego, CA) puede usarse para la producción células de mamífero tales como células de ovario de Hámster Chino.

Un especialista en la técnica puede usar estos sistemas de vectores de expresión comerciales u otros para producir un fragmento de proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr usando técnicas habituales y materiales de partida fácilmente disponibles.

Un especialista en la técnica puede usar otros vectores y sistemas de expresión disponibles en el mercado o producir vectores usando métodos bien conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control requeridas, tales como promotores y señales de poliadenilación, y preferiblemente potenciadores, están disponibles fácilmente y se conocen en la técnica para una diversidad de hospedadores. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989). De este modo, pueden prepararse las proteínas deseadas tanto en sistemas procarióticos como eucarióticos, dando como resultado un espectro de formas procesadas de la proteína.

El sistema procariótico usado mas habitualmente sigue siendo E. coli., aunque otros sistemas tales como B. subtilis y Pseudomonas también son útiles. Las secuencias de control apropiadas para sistemas procarióticos incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles incluyendo el promotor lac, el promotor trp, promotores híbridos tales como el promotor tac, el promotor P1 del fago lambda. En general, pueden producirse proteínas ajenas en estos hospedadores como proteínas de fusión o maduras. Cuando se producen las secuencias deseadas como proteínas maduras, la secuencia producida puede precedida por una metionina que no se retira necesariamente de manera eficaz. Por consiguiente, los péptidos y las proteínas reivindicadas en este documento pueden estar precedidas por una Met N-terminal cuando se producen en bacterias. Además, pueden hacerse construcciones donde la secuencia codificante para el péptido está precedida por un péptido señal operativo que provoca la secreción de la proteína. Cuando se producen en hospedadores procarióticos en esta materia, la secuencia de señal se retira sobre la secreción.

También están ahora disponibles una amplia diversidad de hospedadores eucarióticos para la producción de proteínas ajenas recombinantes. Como en bacterias, los hospedadores eucarióticos pueden transformarse con sistemas de expresión que producen la proteína deseada directamente, pero más habitualmente se proporcionan secuencias de señal para provocar la secreción de la proteína. Los sistemas eucarióticos tienen la ventaja adicional de que pueden ser capaces de procesar intrones que puede suceder en las secuencias genómicas que codifican las proteínas de organismos superiores. Los sistemas eucarióticos también proporcionan una diversidad de mecanismos de procesamiento que dan como resultado, por ejemplo, glicosilación, amidación del carboxi terminal, oxidación o derivatización de restos de ciertos aminoácidos, control conformacional, y similares.

Los sistemas eucarióticos usados habitualmente incluyen, aunque sin limitación, levaduras, células fúngicas, células de insectos, células de mamífero, células de ave y células de plantas superiores. Están disponibles los promotores apropiados que son compatibles y operativos para el uso en cada uno de estos tipos de hospedadores así como las secuencias de terminación y potenciadores, como por ejemplo, el promotor de la poliedrina de baculovirus. Como antes, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, en sistemas de mamífero, el promotor de la metalotioneína de ratón puede inducirse por la adición de iones de metales pesados.

Los detalles para la construcción de sistemas de expresión apropiados para los hospedadores deseados son conocidos por los especialistas en la técnica. Para la producción recombinante de la proteína, el ADN codificante está ligado apropiadamente al vector de expresión elegido y después se usa para transformar el hospedador compatible que después se cultiva y se mantiene en condiciones en las que tiene lugar la expresión del gen ajeno. La proteína de la presente invención producida de esta manera, se recupera del cultivo, lisando las células o a partir de medio de cultivo de un modo apropiado y conocido por los especialistas en la técnica.

Un especialista en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, asilar los fragmentos de la proteína Vpr o de proteínas no Vpr que comprenden un fragmento de la proteína Vpr producido usando dichos sistemas de expresión.

Además de producir estas proteínas por técnicas recombinantes, también pueden emplearse sintetizadores de aminoácidos automatizados para producir un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. Debería observarse adicionalmente que si las proteínas de este documento se obtienen sintéticamente, también puede hacerse una sustitución por aminoácidos que no se codifican en el gen. Los restos alternativos incluyen, por ejemplo, los aminoácidos \omega de fórmula H_{2}N(CH_{2})_{n}COOH en la que es 2-6. Estos son aminoácidos neutros no polares, como son sarcosina (Sar), t-butilalanina (t-BuAla), t-butilglicina (t-BuGly), N-metil isoleucina (N-Melle), y norleucina (NLeu). La fenilglicina, por ejemplo, puede sustituirse con Trp, Tyr o Phe, un aminoácido neutro aromático; la citrulina (Cit) y el sulfóxido de metionina (MSO) son polares pero neutros, la ciclohexil alanina (Cha) es neutra y no polar, el ácido cisteico (Cya) es ácido, y la ornitina (Orn) es básica. Las propiedades de los restos de prolina de dar conformación, pueden obtenerse si uno o más de estos restos se sustituyen por hidroxiprolina (Hyp).

Puede formularse la composición farmacéutica que comprende un vehículo/diluyente farmacéuticamente aceptable y un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y 74-89 de la proteína Vpr de VIH-1 o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y 74-89 de la proteína Vpr de VIH-1 por un especialista en la técnica con composiciones seleccionadas dependiendo del modo de administración elegido. Los vehículos apropiados farmacéuticamente se describen en la edición mas reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia patrón en este campo.

Para administración parenteral, el fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de proteína Vpr puede, por ejemplo, formularse en forma de una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de dichos vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y albúmina de suero humana al 5%. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijados. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza por técnicas usadas habitualmente. Por ejemplo, una composición parenteral apropiada para la administración por inyección se prepara disolviendo el 1,5% en peso de un ingrediente activo en solución de cloruro sódico al 0,9%.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden administrase en dosis únicas o en dosis múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse como agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los tratamientos de la presente invención pueden combinarse con terapias convencionales, que pueden administrarse secuencial o simultáneamente.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden el fragmento de proteína Vpr o proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr pueden administrase por cualquier medio que permita al agente activo alcanzar el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Como las proteínas están expuestas a digerirse cuando se administran por vía oral, podría usarse habitualmente la administración parenteral, es decir, intravenosa, subcutánea, intramuscular, para optimizar la absorción. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden inyectarse a un sitio de crecimiento hiperproliferativo, o cerca. Por ejemplo, la administración puede ser por inyección directa en una masa de tumor sólido o en el tejido directamente adyacente al mismo. Si el individuo a ser tratado está padeciendo de psoriasis, puede formularse el fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de proteína Vpr con un vehículo tópico farmacéuticamente aceptable y la formulación para administrarse de manera tópica en forma de una crema, loción o pomada, por ejemplo.

La dosificación administrada varia dependiendo de factores tales como: características farmacodinámicas; su modo o vía de administración; edad, salud, y peso del receptor; naturaleza y extensión de los síntomas; tipo del tratamiento simultáneo; y frecuencia del tratamiento. Habitualmente, una dosificación diaria de un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr puede ser aproximadamente de 1\mug a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Habitualmente de 0,5 a 50, y preferiblemente de 1 a 10 miligramos por kilogramo por día dado en dosis divididas de 1 a 6 veces al día o en forma de liberación sostenida, es eficaz para obtener los resultados deseados.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo/diluyente farmacéuticamente aceptable y una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. El material genético que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr puede administrarse a un individuo en una forma expresable. El material genético, ADN o ARN, se capta por las células del individuo y se expresan. El fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que se produce de este modo puede detener las células hiperproliferativas en el ciclo celular, impidiéndolas avanzar a través del mismo e inhibiendo de este modo la división celular y en última instancia la proliferación celular. De este modo, las composiciones farmacéuticas que comprenden material genético que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr son útiles de la misma manera que las composiciones farmacéuticas que comprenden un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr: para tratar un individuo que tiene una patología o afección caracterizada por células por células hiperproliferativas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para tratar el cáncer caracterizado por tumores sólidos.

Un individuo que padece de una enfermedad asociada con células hiperproliferativas puede tratarse por administración a dicho individuo de una cantidad de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr unida de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión.

Pueden administrase secuencias de nucleótidos que codifican un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr unido de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo como composiciones farmacéuticas usando estrategias de terapia génica que incluyen, aunque sin limitación, vectores virales tales como vectores de adenovirus o de retrovirus o transferencia directa de ácidos nucleicos. Se ha informado ampliamente de los métodos de administrar ácidos nucleicos que codifican proteínas de interés usando vectores virales. Un vector viral recombinante tal como un vector de retrovirus o un vector de adenovirus se prepara usando métodos y materiales de partida habituales. El vector viral recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. Dicho vector está combinado con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La preparación farmacéutica resultante puede administrase a un individuo. Una vez un individuo se ha infectado con el vector viral, se produce un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr en las células infectadas.

Como alternativa, puede administrarse una molécula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr en forma de una composición farmacéutica sin el uso de vectores infecciosos. La molécula de ácido nucleico puede ser ADN o ARN, preferiblemente ADN. La molécula de ADN puede ser lineal o circular, es preferible un plásmido. La molécula de ácido nucleico se combina con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se han informado de las composiciones y métodos para suministrar proteínas a células por administración directa de ADN usando una diversidad de protocolos. Los ejemplos de dichos métodos se describen en la Patente de EEUU Nº 5.593.972, Patente de EEUU Nº 5.739.118, Patente de EEUU Nº 5.580.859, Patente de EEUU Nº 5.589.466, Patente de EEUU Nº 5.703.055, Patente de EEUU Nº 5.622.712, Patente de EEUU Nº 5.459.127, Patente de EEUU Nº 5.676.954, Patente de EEUU Nº 5.614.503, y el documento WO 96/10038. Las composiciones y métodos para suministrar proteínas a células por administración directa de ADN también se describen en los documentos WO 90/11092, WO 93/17706, WO 93/23552, y WO 94/16737. Además de los protocolos de administración descritos en esas solicitudes, se describen métodos alternativos de administración de ADN en las Patentes de EEUU Nº 4.945.050 y Nº 5.036.006. Los ejemplos de vectores adenovirales recombinantes útiles para administrar secuencias de ácidos nucleicos se describen en las Patentes de EEUU Nº 5.756.283 y Nº 5.707.618. Las moléculas de ácido nucleico también pueden administrarse usando transferencia de ADN mediada por liposomas tal como la que se describe en la Patente de EEUU Nº 4.235.871, Patente de EEUU Nº 4.241.046 y Patente de EEUU Nº 4.394.448.

Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a un individuo a un sitio en dicho cuerpo del individuo por una vía de administración seleccionada entre el grupo compuesto por: vía intramuscular, vía intranasal, vía intraperitoneal, vía subcutánea, vía intradérmica, o vía tópica o por lavado al tejido mucoso seleccionado entre el grupo compuesto por vaginal, rectal, uretral, bucal y sublingual. Algunas vías de administración preferidas incluyen intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, y oral.

El ADN puede ser un plásmido de ADN y los promotores se pueden seleccionar entre el grupo compuesto por: el promotor del Virus de Simio 40 (SV40), del Virus del Tumor de Mama de Ratón (MMTV), del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) tal como el promotor de Repetición Terminal Larga de VIH (LTR), del virus de Moloney, de ALV, de Citomegalovirus (CMV) tales como el promotor temprano inmediato de CMV, del Virus de Epstein Barr (VEB), del Virus del Sarcoma de Rous (RSV) así como promotores de genes humanos tales como de la Actina humana, Miosina humana, Hemoglobina humana, creatina de músculo humana y metalotioneína humana.

La molécula de ADN puede administrarse con una composición que facilita la captación de moléculas de ADN por una célula, o suministrarse a las células conjuntamente con la administración de un co-agente. Los ejemplos de co-agentes se describen en la Patente de EEUU Nº 5.593.972, la Patente de EEUU Nº 5.739.118 y el documento WO 94/16737. Los co-agentes que se administran conjuntamente con moléculas de ácido nucleico, pueden administrarse en forma de una mezcla con la molécula de ácido nucleico o administrarse por separado simultáneamente, antes, o después de la administración de las moléculas de ácido nucleico. En algunas realizaciones, los co-agentes pueden ser lípidos catiónicos, incluyendo aunque sin limitación, los descritos en la Patente de EEUU Nº 5.703.055. Los ejemplos de otros co-agentes incluyen factores de crecimiento, citoquinas y linfoquinas tales como interferón-\alpha, interferón-gamma, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12 así como factor de crecimiento de fibroblastos, agentes activos de superficie tales como complejos de estimulación inmune (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogos de LPS incluyendo monofosforil Lípido A (MPL), toxina del Cólera, toxina de cobra, saponinas, muramilpéptidos, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno, y ácido hialurónico. En algunas realizaciones, puede usarse una proteína inmunomoduladora como co-agente. Las composiciones preferidas que facilitan la captación de la molécula de ADN por una célula se seleccionan entre el grupo compuesto por: lípidos catiónicos, liposomas y anestésicos locales. En algunas realizaciones preferidas, la molécula de ADN se administra con bupivacaína. En algunas realizaciones, se usan co-agentes múltiples. Los co-agentes que se administran conjuntamente con moléculas de ácido nucleico pueden administrarse en forma de una mezcla con la molécula de ácido nucleico o administrarse por separado simultáneamente, antes o después de la administración de las moléculas de ADN.

La composición farmacéutica comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr puede administrase directamente al individuo o suministrarse ex vivo a células retiradas del individuo que se reimplantan después de la administración. Por cualquier vía, el material genético se introduce en las células que están presentes en el cuerpo del individuo. Las vías preferidas de administración incluyen inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Como alternativa, la composición farmacéutica puede introducirse por diversos medios en las células que se retiran del individuo. Dichos medios incluyen, por ejemplo, transfección, electroporación y bombardeo de microproyectiles. Después de que la molécula de ácido nucleico se ha captado por las células, se reimplantan en el individuo.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden aproximadamente de 1 ng a aproximadamente 10.000 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 2000 \mug, 3000 \mug, 4000 \mug o 5000 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 1000 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente de 10 ng a aproximadamente 800 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente de 0,1 a aproximadamente 500 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente de 1 a aproximadamente 350 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente de 25 a aproximadamente 250 \mug de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 \mug de ADN.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con este aspecto de la presente invención se formulan de acuerdo con el modo de administración a usar. Un especialista en la técnica puede formular fácilmente una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. En casos en los que se elige inyección intramuscular como modo de administración, se usa una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. Se pueden usar soluciones isotónicas tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina.

El ADN puede administrarse por inyección intramuscular. La bupivacaína, un compuesto farmacéutico bien conocido y disponible en el mercado, se administra antes de, simultáneamente con o después de la construcción genética. La bupivacaína y la construcción genética pueden formularse en la misma composición. La bupivacaína es particularmente útil en vista de sus muchas propiedades y actividades cuando se administra un tejido. La bupivacaína está relacionada química y farmacológicamente con los anestésicos locales de aminoacil. Es un homólogo de la mepivacaína y está relacionado con la lidocaína. La bupivacaína vuelve el tejido muscular sensible al voltaje por estimulación con sodio e influye en la concentración de iones en las células. Puede encontrarse una completa descripción de las actividades farmacológicas de la bupivacaína en Ritchie, J. M. y N. M. Greene, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds.: Gilman, A.G. et al, 8ª Edición, Capítulo 15: 3111, que se incorpora en este documento como referencia. La bupivacaína y los compuestos que muestran una similitud funcional con la bupivacaína son preferidos en el método de la presente invención.

La bupivacaína-HCl se denomina químicamente como 2-piperidincarboxamida, 1-butil-N-(2,6-dimetilfenil)monoclorhidrato, monohidrato y está ampliamente disponible en el mercado para usos farmacéuticos por muchas fuentes incluyendo Astra Pharmaceutical Products Inc. (Westboro, Mass.) y Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (Nueva York, N.Y.). La bupivacaína está formulada en el mercado con y sin metilparabeno y con o sin epinefrina. Se puede usar cualquiera de dichas formulaciones. Está disponible en el mercado para uso farmacéutico en concentraciones del 0,25%, 0,5%, y 0,75% que pueden usarse en la invención. Pueden prepararse concentraciones alternativas que obtienen efectos deseables, si se desea. De acuerdo con la presente invención, se administran de aproximadamente 250 \mug a aproximadamente 10 mg de bupivacaína. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 250 \mug a aproximadamente 7,5 mg. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 0,50 mg a aproximadamente 5,0 mg. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 3,0 mg. En algunas realizaciones se administran aproximadamente 5,0 mg. Por ejemplo, en algunas realizaciones se administran de aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 2ml, preferiblemente de 50 \mul a aproximadamente 1500 \mul y más preferiblemente aproximadamente 1ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en un vehículo farmacéutico isotónico al mismo sitio que la molécula de ácido nucleico antes, simultáneamente con, o después de administrar la molécula de ácido nucleico. De manera similar, en algunas realizaciones, se administra de aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 2 ml, preferiblemente de 50 \mul a aproximadamente 1500 \mul y mas preferiblemente aproximadamente 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% en un vehículo farmacéutico isotónico al mismo sitio que la molécula de ácido nucleico antes, simultáneamente con, o después de administrar la molécula de ácido nucleico. La bupivacaína y cualquier otro compuesto de acción similar, particularmente los relacionados con la familia de anestésicos locales, pueden administrarse a concentraciones que proporcionan la facilitación deseada de captar las construcciones genéticas por las células.

El individuo puede primero someterse a una inyección de bupivacaína antes de la administración de la molécula de ácido nucleico por inyección intramuscular. Es decir, por ejemplo, se inyecta al individuo primero con bupivacaína hasta aproximadamente una semana a 10 días antes de la administración de la molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, antes de la administración de la molécula de ácido nucleico, se inyecta al individuo con bupivacaína aproximadamente 1 a 5 días antes de la administración de la construcción genética. En algunas realizaciones, antes de la administración de la molécula de ácido nucleico, se inyecta al individuo con bupivacaína aproximadamente 24 horas antes de la administración de la construcción genética. Como alternativa, la bupivacaína puede inyectarse simultáneamente, minutos antes o después de la administración de la molécula de ácido nucleico.

Por consiguiente, la bupivacaína y la construcción genética pueden combinarse e inyectarse simultáneamente en forma de una mezcla. En algunas realizaciones, la bupivacaína se administra después de la administración de la construcción genética. Por ejemplo, se inyecta al individuo con bupivacaína hasta aproximadamente una semana a 10 días después de la administración de la construcción genética. En algunas realizaciones, se inyecta al individuo con bupivacaína aproximadamente 24 horas después de la administración de la molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, se inyecta al individuo con bupivacaína aproximadamente 1 a 5 días después de la administración de la molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, se administra bupivacaína al individuo hasta aproximadamente 1 semana a 10 días después de la administración de la molécula de ácido nucleico.

Se pueden usar anestésicos locales como facilitadores. Además de bupivacaína, mepivacaína, lidocaína, procaína, carbocaína y metilbupivacaína, pueden usarse otros compuestos que funcionan de manera similar.

La presente invención se refiere a un método in vitro para inhibir una célula en proliferación deteniéndola en el ciclo celular. El método comprende la etapa de poner en contacto la célula con una cantidad de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 de la proteína Vpr o una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 19-35 y/o 74-89 de la proteína Vpr suficiente para inhibir la proliferación celular.

Puede administrarse un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr por una diversidad de medios. En algunas realizaciones de la invención, se combina con células en forma de una proteína. En algunas realizaciones, el fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr puede añadirse directamente al medio de cultivo celular. Puede producirse un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr a partir de materiales de partida ampliamente disponibles usando técnicas bien conocidas, tales como las descritas anteriormente. Un intervalo preferido usado de concentración del fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr es de aproximadamente 1 \mug/ml a 1 mg/ml. Como alternativa, puede ponerse en contacto con una célula un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr introduciendo en la célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr. En dichas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico puede introducirse como parte de una partícula VIH, parte de una partícula de sistema de expresión infeccioso recombinante o parte de un vector de expresión tal como un plásmido. Adicionalmente, también puede introducirse ADN o ARN lineal en la célula en una forma expresable. En algunas realizaciones, se usan vectores de expresión u otras moléculas nucleicas diseñadas para producir un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr que tiene una secuencia de un fragmento de la proteína Vpr en células cultivadas. Dicho sistema de expresión puede incluir un sistema de vector para introducir el material genético o puede introducirse la molécula de ácido nucleico por otras técnicas convencionales tales como transfección, electroporación o bombardeo de microproyectiles.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para identificar compuestos in vitro que inhiben la unión de la proteína Vpr a la proteína precursora de longitud completa codificada por el gen gag (p55) y a proteínas más pequeñas específicas generadas cuando se procesa p55 por la proteasa de VIH. En particular, se ha descubierto que la proteína Vpr se une a la proteína Gag del precursor p55 en el dominio que corresponde a la proteína p6 que se produce después de que p55 se procesa por la proteasa de VIH. En particular, los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr de VIH-1 están implicadas en interacciones con el dominio p6 de la proteína p55 de Gag. Los fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 son útiles en ensayos para identificar compuestos que inhiben el ensamblaje viral de VIH-1. De manera similar, las proteínas no Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr son útiles en ensayos para identificar compuestos que inhiben el ensamblaje viral de VIH-1. Dichos compuestos son útiles como agentes anti-VIH.

Los métodos comprenden las etapas de poner en contacto, primero, en ausencia de un compuesto de ensayo, un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 o una proteína no Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr, y una proteína que tiene un dominio que corresponde al dominio p6 de la proteína Gag de VIH-1, de determinar después el nivel de unión y comparar el nivel de unión con el nivel de unión que se produce en ausencia del compuesto de ensayo. En realizaciones preferidas, la proteína que tiene un dominio correspondiente al dominio p6 de la proteína Gag de VIH-1 es p6 o p55, la poliproteína Gag preprocesada de longitud completa. Los compuestos que impiden la unión de los aminoácidos de la proteína Vpr 17-36 y el domino p6 de p55 son útiles para impedir la producción de VIH. Por consiguiente, dichos compuestos son útiles para inhibir la producción de partículas de VIH completamente virulentas; por lo tanto, dichos compuestos serán útiles como productos terapéuticos anti-VIH solos o como parte de un régimen de fármacos anti-VIH multifacetado que incluye otros productos terapéuticos.

Para ensayar estos aspectos de la invención, se ponen en contacto un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 o una proteína no Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr, y una proteína que tiene un domino que corresponde al domino p6 de la proteína Gag de VIH-1 en presencia de un compuesto de ensayo. Se determina el nivel de unión de las proteínas. Se compara el nivel resultante de unión con el nivel conocido de unión que se produce cuando ambas proteínas se ponen en contacto entre si en ausencia de la proteína de ensayo. En ausencia de un compuesto que impida la unión, se unirán las dos proteínas. Como control, se ponen en contacto el fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 o la proteína no Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr, y la proteína que tiene en dominio p6 de la proteína Gag de HIV-1 en ausencia del compuesto de ensayo.

El compuesto de ensayo se proporciona preferiblemente en solución. Se pueden usar diluciones en serie de los compuestos de ensayo en una serie de ensayos. El compuesto de ensayo puede añadirse a concentraciones de 0,01 \muM a 1 M. Un intervalo preferido de concentraciones finales del compuesto de ensayo es de 10 \muM a 100 \muM.

Se describen anteriormente la producción de un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 o una proteína no Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr. Un intervalo de concentración preferido del fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr es aproximadamente de 1 \mug/ml a 1mg/ml. Una concentración preferida de fragmento de proteína Vpr o proteína no Vpr es aproximadamente 50 \mug/ml.

La proteína precursora de longitud completa codificada por el gen gag, p55, puede producirse por un medio habitual usando materiales de partida disponibles fácilmente seguido de los contenidos escritos anteriormente para la producción de la proteína Vpr. Un especialista en la técnica puede, usando las técnicas bien conocidas, obtener una molécula de ADN que codifica la proteína Gag e insertar la molécula de ADN en un vector de expresión disponible en el mercado para usar en los sistemas de expresión bien conocidos. Un especialista en la técnica puede, usando las técnicas bien conocidas, aislar la proteína p55 producida en dichos sistemas de expresión. De manera similar, puede producirse y asilarse p6. Por ejemplo, puede producirse p55 como se describe en este texto y procesarse por un especialista en la técnica usando la proteasa de VIH para producir un aislado de p6 sin experimentación excesiva. Como alternativa, un especialista en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, obtener una molécula de ADN que codifica la proteína p55 e insertar una porción de la molécula de ADN que codifica p6 en un vector de expresión disponible en el mercado para usar en los sistemas de expresión bien conocidos. Un especialista en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, aislar la proteína producida en dichos sistemas de expresión.

Un intervalo preferido usado de concentración de la proteína Gag es de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 1mg/ml.

El medio para detectar la presencia de un producto de proteína es habitual e incluye ensayos enzimáticos y ensayos ELISA. Un especialista en la técnica puede detectar la presencia o ausencia de una proteína usando métodos bien conocidos. Un especialista en la técnica puede apreciar fácilmente la multitud de medios para practicar un ensayo de unión para detectar compuestos que modulan la unión del fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr, y la proteína que comprende el domino p6 de Gag. Por ejemplo, los anticuerpos son útiles para inmunoensayos que detectan o cuantifican el fragmento de proteína Vpr o proteína no Vpr unida a la proteína que comprende el dominio p6 de Gag. El inmunoensayo comprende típicamente la incubación del fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr, y la proteína que comprende el dominio p6 de Gag para permitir una unión proteína-proteína en presencia de un anticuerpo de alta afinidad marcado de manera detectable capaz de unirse selectivamente al fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr, o a la proteína que comprende el domino p6 de Gag, y la detección del anticuerpo marcado que está unido a la proteína. Se describen diversos procedimientos de inmunoensayo en Immunoassays for the 80's, A. Voller et al., Eds., University Park, 1981.

En este aspecto de la invención, puede añadirse el anticuerpo o el fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr, o la proteína que comprende el dominio p6 de Gag, a nitrocelulosa, u otro soporte sólido capaz de inmovilizar las proteínas. Después puede lavarse el soporte con tampones apropiados seguido por el tratamiento con el anticuerpo marcado de manera detectable específico para el fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr, o la proteína que comprende el domino p6 de Gag. Después puede lavarse el soporte en fase sólida con el tampón una segunda vez para retirar el anticuerpo no unido. Después puede detectarse la cantidad de marcador unido en dicho soporte sólido por medios convencionales.

Por "soporte en fase sólida" o "vehículo" se pretende decir cualquier soporte capaz de unir antígeno o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas, y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble hasta cierto punto o insoluble para los propósitos de la presente invención. La configuración del soporte puede ser esférica, como en un lecho, o cilíndrica, como en una superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de un bastoncillo. Como alternativa, la superficie puede ser lisa como tal como una lámina, cinta de ensayo, etc. Los especialistas en la técnica conocerán muchos otros vehículos apropiados para la unión de anticuerpo o antígeno, o serán capaces de establecer el mismo por el uso de experimentación habitual.

La actividad de unión de un lote dado de anticuerpos puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los especialistas en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación habitual.

Pueden realizarse ensayos de control positivo en los que no se añade compuesto de ensayo.

Uno de los medios en que los anticuerpos se pueden marcar de manera detectable es por unión del mismo a una encima y el uso de un inmunoensayo enzimático (EIA), o un ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA). Esta encima, cuando se expone posteriormente a su sustrato, reaccionará con el sustrato generando un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por un medio espectrofotométrico, fluorométrico, o visual. Las encimas que pueden usarse para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen, aunque sin limitación, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, isomerasa delta-5-esteroide, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofostafo deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.

Marcando radiactivamente el anticuerpo, es posible detectarlo a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Work, T.S., et al, Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y., 1978). El isótopo radioactivo puede detectarse por un medio tal como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son: ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S, ^{14}C, y, preferiblemente ^{125}I.

También es posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescente se expone a luz de una longitud de onda apropiada, su presencia entonces puede detectarse debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescentes usados más habitualmente están isocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo también puede marcarse de manera detectable usando metales que emiten fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden acoplarse al anticuerpo específico de TNF usando grupos de quelación de metales tales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA).

El anticuerpo también puede marcarse de manera detectable por acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado de modo quimioluminiscente se determina, a continuación, detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente son luminol, isoluminol, éster de acridinio aromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Así mismo, puede usarse un componente bioluminiscente para marcar el anticuerpo. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcaje son luciferina, luciferasa y acuarina. La detección del anticuerpo específico de Vpr o el anticuerpo que se une a la proteína derivada de Gag puede realizarse por un contador de centelleo, por ejemplo, si el marcaje detectable es un emisor gamma radiactivo, o por un fluorómetro, por ejemplo, si el marcador es un material fluorescente.

En el caso de un marcaje con enzima, la detección puede realizarse por métodos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección también puede realizarse por comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de manera similar.

Como se puede apreciar fácilmente, una de las proteínas virales también puede ser detectable y servir como molécula reportadora en lugar de o además del anticuerpo.

Los componentes del ensayo pueden adaptarse para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo "de dos sitios" o "tipo sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, se une una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que se está ensayando y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado de manera detectable para permitir la detección y/o cuantificación del complejo terciario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno, y el anticuerpo marcado.

Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos incluyen ensayos "directos" en los que el anticuerpo unido a la fase sólida primero se pone en contacto con la primera proteína viral para inmovilizarla. La segunda proteína viral se añade en presencia del compuesto de ensayo. Después de un periodo de incubación apropiado, el soporte sólido se lava para retirar la proteína no unida. Después se añade un segundo anticuerpo que es específico para la segunda proteína viral. El segundo anticuerpo es preferiblemente detectable. Después de un segundo periodo de incubación para permitir al anticuerpo marcado formar un complejo con la segunda proteína viral unida al soporte sólido a través del anticuerpo no marcado y la primera proteína viral, el soporte sólido se lava una segunda vez para retirar el anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo tipo sándwich directo puede ser un ensayo simple "si/no" para determinar si se ha producido la unión o puede hacerse cuantitativo por comparación de la medida de anticuerpo marcado con la obtenida en un control. Dichos ensayos "de dos sitios" o "tipo sándwich" se describen por Wide, Radioimmune Assay Method, Kirkham, Ed., E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970, pag. 199-206).

Otro tipo de ensayos "tipo sándwich" son los llamados ensayos "simultáneos" e "inversos". Un ensayo simultáneo implica una etapa de incubación única en la que el anticuerpo unido al soporte sólido y al anticuerpo marcado, ambas proteínas virales y el compuesto de ensayo se añaden al mismo tiempo. Después de completar la incubación, el soporte sólido se lava para retirar las proteínas que no ha formado complejo. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido se determina después como sería en un ensayo tipo sándwich "directo" convencional.

En el ensayo "inverso", se utiliza primero una adición paso a paso de una solución de anticuerpo marcado a las proteínas virales, seguido por la adición de anticuerpo no marcado o unido a un soporte sólido después de un periodo de incubación apropiado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de un modo convencional para liberarla del residuo de la muestra que se está ensayando y la solución del anticuerpo marcado que no ha reaccionado. La determinación de anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido se determina después como en los ensayos "simultáneos" y "directos". En una realización, se puede usar una combinación de anticuerpos de la presente invención específicos para epítopos separados para construir un ensayo inmunorradiométrico sensible de tres sitios.

En algunas realizaciones preferidas, se fija un anticuerpo anti-Vpr a una fase sólida. La proteína Vpr se pone en contacto con el anticuerpo fijado para formar un complejo. El complejo se pone en contacto con la proteína p6 de Gag en presencia de un compuesto de ensayo. Los anticuerpos que se unen a la proteína que contiene pg6 de Gag se añaden después. La fase sólida se lava para retirar el material no unido. Se realiza un ensayo de control de una manera idéntica excepto en que no se usa el compuesto de ensayo. La detección de los anticuerpos que se unen a la proteína p6 de Gag indican que las proteínas Vpr y Gag son capaces de unirse entre si en presencia del compuesto de ensayo. Por consiguiente, el fallo en detectar los anticuerpos que se unen a la proteína derivada de Vpr indica que el compuesto de ensayo inhibe la unión de proteínas Vpr y Gag. Cuantificar el nivel de unión en presencia y ausencia del compuesto de ensayo permite la medición de la extensión de la modulación que el compuesto de ensayo puede provocar en la unión de Vpr a una proteína derivada de Gag.

En algunas realizaciones preferidas, los anticuerpos que se unen a la proteína derivada de Gag se fijan en una fase sólida. La proteína derivada de Gag se pone en contacto con el anticuerpo fijado para formar un complejo. El complejo se pone en contacto con la proteína derivada de Vpr en presencia de un compuesto de ensayo. Los anticuerpos específicos para la proteína derivada de Vpr se añaden después. La fase sólida se lava para retirar el material no unido. Se realiza un ensayo de control de una manera idéntica excepto en que no se usa el compuesto de ensayo. La detección de los anticuerpos que se unen a la proteína derivada de Vpr indican que las proteínas derivadas de Vpr y derivadas de Gag son capaces de unirse entre si en presencia del compuesto de ensayo. Por consiguiente, el fallo en detectar los anticuerpos que se unen a proteínas derivadas de Vpr indica que el compuesto de ensayo inhibe la unión de proteínas derivadas de Vpr y derivadas de Gag. Cuantificar el nivel de unión en presencia y ausencia del compuesto de ensayo permite la medición de la extensión de la modulación que el compuesto de ensayo puede provocar en la unión de Vpr a una proteína derivada de Gag.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a kits para poner en práctica el método descrito anteriormente de identificar compuestos que inhiben la unión de la proteína Vpr al domino p6 de la proteína Gag. Los kits de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden un primer contenedor que comprende un fragmento de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 o una proteína no Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr, un segundo contenedor que comprende una proteína derivada de Gag que comprenden el dominio p6. Adicionalmente, para poner en práctica el método definido anteriormente, se requiere un medio para distinguir un fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr unida a la proteína derivada de Gag de los fragmentos no unidos de la proteína Vpr o proteínas no Vpr y la proteína derivada de Gag. En una realización preferida de este aspecto de la invención, se proporciona un tercer contenedor que comprende un anticuerpo que se une específicamente el fragmento de la proteína Vpr o una proteína no Vpr o a la proteína derivada de Gag. Al menos uno de los componentes contenidos, preferiblemente el anticuerpo, puede conjugarse con un agente, tal como los descritos anteriormente, que permite detectar su presencia. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, se proporciona un cuarto contenedor que contiene un anticuerpo que se une específicamente al fragmento de la proteína Vpr o proteína no Vpr, o a la proteína derivada de Gag, pero no a la proteína que se une por el anticuerpo en el tercer contenedor. Al menos uno de los componentes contenidos, preferiblemente el anticuerpo, puede conjugarse con un agente, tal como los descritos anteriormente, que permite detectar su presencia.

Algunos aspectos de la invención se refieren a composiciones farmacéuticas, sistemas de administración de fármacos y métodos para administrar específicamente proteínas de fusión que incluyen las secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidos a una proteína biológicamente activa. Pueden producirse partículas virales que comprenden proteínas de envuelta específicas de célula y p24 unidas a proteínas de fusión que incluyen las secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa. Dichas partículas suministrarán a las células las proteínas de fusión que incluyen las secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa por las que la envuelta es específica. De este modo se suministra a las células las proteínas de fusión que incluyen las secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa, y, de este modo, la proteína biológicamente activa. La presente invención se refiere a composiciones útiles para suministrar proteínas de fusión que incluyen secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa en células diana específicas. La composición comprende proteínas de fusión que incluyen las secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa, p24 y una proteína de cubierta específica de tipo celular ensamblada como una partícula que es una partícula de liberación de fármaco que puede suministrar específicamente proteínas de fusión que incluyen las secuencias de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa a células a las que se une la proteína de cubierta. La presente invención se refiere a las partículas, a las composiciones farmacéuticas que comprenden las partículas y vehículos farmacéuticamente aceptables, a las moléculas de ácido nucleico que codifican los componentes, a los vectores de expresión y las células hospedadoras que contienen las moléculas de ácido nucleico y a los métodos para producir y usar las composiciones.

Para preparar una partícula de liberación de fármaco de la invención, se elige la proteína de envuelta (Env) de un retrovirus basado en el tipo celular que dicho retrovirus infecta. Son bien conocidas las proteínas de envuelta específicas de célula. Las células se cotransfectan con una molécula de ácido nucleico que codifica la Env deseada, una molécula de ácido nucleico que codifica proteínas de fusión que incluyen la secuencia de los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr unidas a una proteína biológicamente activa, una molécula de ácido nucleico que codifica p24 o una molécula de ácido nucleico que codifica el precursor Gag de longitud completa más la proteasa de VIH. La expresión de estas secuencias dará como resultado las proteínas codificadas de este modo que se producen y el ensamblaje de la partícula de liberación de fármaco. El ARN no codificante también puede proporcionarse por seguridad, ya que la partícula de ensamblaje empaquetara el ARN.

Las proteínas biológicamente activas que pueden usarse en proteínas de fusión incluyen citoquinas, linfoquinas, proteínas estructurales tales como distrofinas, otras proteínas terapéuticas y proteínas que son útiles como dianas inmunes.

Otro aspecto de la invención surge de la identificación de los aminoácidos 17-36 y 59-84 de la proteína Vpr de VIH-1 como implicada en la localización nuclear de la proteína Vpr en células infectadas por VIH-1. De acuerdo con la invención, los fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 pueden conjugarse en compuestos para administrar dichos compuestos al núcleo de una célula. En algunas realizaciones, los compuestos son una proteína o péptido y el compuesto conjugado es una proteína de fusión. De manera similar, las proteínas no Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 de la proteína Vpr pueden conjugarse en compuestos para administrar dichos compuestos al núcleo de una célula.

Es deseable la localización nuclear de compuestos, por ejemplo, cuando dichos compuestos están asociados con la expresión de ADN. Por consiguiente, la eficacia de los compuestos que modulan la expresión de ADN incluyendo los compuestos que unen ADN, polimerasas e inhibidores de polimerasa, factores de transcripción, operadores, represores, activadores y similares puede aumentarse por su administración en combinación con Vpr, fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84. Se aumenta la eficacia debido a un aumento en la administración de dichos compuestos al núcleo de la célula, el sitio donde los compuestos son activos. De manera similar, los compuestos pueden ser compuestos antisentido tales como oligonucleotidos antisentido que, cuando se administran al núcleo, pueden inhibir la transcripción de genes que se están expresando en el núcleo. De acuerdo con otra realización de la invención, el compuesto es una molécula de ADN, tal como un plásmido, que incluye secuencias codificantes unidas de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión génica. Conjugándolo a Vpr, a los fragmentos de la proteína Vpr que comprende los aminoácidos 17-36 y/o 59-34 o a proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84, la molécula de ADN se administra a los núcleos donde se pueden expresar las secuencias codificantes. En los protocolos de transferencia de ADN, tales como los incorporados en este documento como referencia anteriormente, las vacunas basadas en ADN y los productos terapéuticos génicos se liberan como agentes activos. En dichos protocolos, se administra al núcleo y se expresa una fracción del ADN total administrado y captado por las células. La conjugación de dichas moléculas de ADN como agente activo con Vpr, fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84, da como resultado una proporción mayor de moléculas de ADN desplazadas al
núcleo.

La conjugación de compuestos con Vpr, fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84, puede realizarse por los especialistas en la técnica de manera habitual. Por ejemplo, Vpr, fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-37 y/o 59-84 pueden comprender adicionalmente secuencias de aminoácidos policatiónicos tales como cabezas o colas de polilisina. Las secuencias de aminoácidos policatiónicos pueden estar unidos de manera covalente a Vpr, fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-34, y unidos a las moléculas de ADN a través de enlaces iónicos entre los grupos policatiónicos y la estructura aniónica del ADN. Por consiguiente, la presente invención proporciona una tecnología de administración de ADN mejorada proporcionando moléculas de ADN asociadas con Vpr, fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o proteínas no Vpr que comprenden fragmentos de la proteína Vpr que comprenden los aminoácidos 17-36 y/o 59-84.

Aunque las porciones de la descripción de este documento que se refieren a composiciones terapéuticas y métodos se refieren principalmente a productos terapéuticos y métodos para tratar humanos, estas composiciones y métodos pueden aplicarse también a usos médicos veterinarios, incluyendo el tratamiento de todos los animales, particularmente especies de mamíferos incluyendo la especie humana, ovina, porcina, equina, canina y felina.

Ejemplo

Sumario

El producto del gen vpr del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es una proteína asociada al virión que es esencial para la replicación viral eficaz en monocitos/macrófagos. Vpr se localiza principalmente en el núcleo cuando se expresa en ausencia de otras proteínas virales. Vpr se empaqueta eficazmente en partículas virales a través de interacciones con el dominio p6 de la poliproteína p55 gag precursora de Gag. Se desarrolló un panel de vectores de expresión que codifican moléculas de Vpr mutadas en el domino helicoide amino-terminal, el dominio leucina-isoleucina (LR) y, el dominio carboxi-terminal para mapear los diferentes dominios funcionales y definir las relaciones entre las funciones de Vpr de incorporación al virión, la localización nuclear, detención del ciclo celular, y diferenciación. Se observó que las mutaciones de sustitución en el dominio N-terminal de Vpr dañan tanto la localización nuclear como el empaquetamiento del virión, sugiriendo que la estructura helicoide puede jugar un papel vital en la modulación de estas dos propiedades biológicas. Se descubrió que el dominio LR que estaba implicado en la localización nuclear de Vpr. En contraste, parece que la detención de ciclo celular está controlada en gran medida por el dominio C-terminal de Vpr. Los dominios LR y C-terminal parecen no ser esenciales para la incorporación de Vpr al virión. Es interesante observar que se descubrió que dos mutantes de Vpr que albergan sustituciones de un único aminoácido (A30L y G75A) conservan la capacidad de desplazarse al núcleo pero están dañados en la función de detención del ciclo celular. En contraste, la mutación de Leu68 a Ser (L68S) dio como resultado una proteína que se localiza en el citoplasma aunque conserva la capacidad de detener la proliferación celular del hospedador. Se especula que las funciones de Vpr de localización nuclear y detención del ciclo celular no están interrelacionadas y que estas funciones de Vpr están mediadas por dominios funcionales putativos de Vpr.

Introducción

Para definir la interrelación entre las diferentes funciones de Vpr se creó un panel de vectores de expresión que codifican moléculas de Vpr mutantes. Se ensayó un panel de mutantes de Vpr para su capacidad de detener el ciclo celular, localizarse en el núcleo, influir en la diferenciación celular, y empaquetarse en partículas tipo virus. Los estudios indican que las mutaciones en el dominio ácido amino-terminal de Vpr con un dominio alfa-helicoide predicho reduce el empaquetamiento de Vpr en el virión, y altera su localización nuclear. Se postula que estos daños se deben probablemente a la reducida estabilidad de la proteína y/o la conformación estructural de las proteínas Vpr mutantes. Además, también se identificaron restos de aminoácidos localizados en el motivo LR que parecen controlar la localización nuclear. Finalmente, el dominio C-terminal parece controlar la actividad de Vpr de detención del ciclo celular. En gran medida, estos estudios demuestran que la localización nuclear y la detención del ciclo celular parecen ser funciones separables de Vpr.

Materiales y métodos Células, Virus, y Plásmidos de Expresión

Se usó el virus vaccinia recombinante vTF7-3, que sintetiza la ARN polimerasa T7 en células infectadas para los estudios de impresión (Fuerst, T.R. et al., Mol. Cell. Biol., 1987, 7: 2538-2544). Se clonaron los genes que codifican la poliproteína Gag y Vpr de VIH-1 cadena abajo del promotor T7 en pCDNA3 (Invitrogen) para generar plásmidos de expresión de pCDGag y pCDVpr, respectivamente (Macreadie, I.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 2770-2774.). Se usaron células HeLa y de rabdomiosarcoma embrionario humano (RD) para experimentos de transfección y se mantuvieron como cultivos monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS).

Mutagénesis Mediada por PCR

Se usó extensión por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) solapada (Ho, et al., Gene, 1989, 77:51-59) para introducir mutaciones específicas de sitio en el gen vpr de VIH-1. Brevemente, se realizaron dos reacciones de PCR usando ADN proviral de VIH-1 como molde. Los productos de amplificación de la primera ronda solapan en el sitio de mutación. Después se realizó una segunda ronda de amplificación usando un par cebador más externo y una mezcla de los dos primeros productos de reacción como molde para generar un producto que contiene la mutación de sustitución de aminoácido deseada. Los productos de PCR se digirieron con HindIII y XhoI (sitios por los que se incorporaron secuencias de reconocimiento en los pares cebadores más externos), se clonaron en pCDNA3, y se secuenciaron para verificar las mutaciones y asegurar la integridad del gen vpr.

Infección y Transfección

Las células HeLa (1 x 10^{6}) crecidas en platos de 35 mm se infectaron con vTF7-3 a un valor de m.o.i. de 10 durante una hora en CO_{2} al 5% a 37ºC con balanceo cada 15 minutos. Al final del periodo de incubación, se retiró el inoculo de virus y se lavaron las células una vez con PBS antes de la transfección. Se añadieron de tres a seis \mug de ADN plasmídico y 10 \mul de Lipofectina (BRL) para separar tubos de poliestireno que contienen 0,1 ml de Opti-MEM libre de suero y después se combinaron. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, se suplementó con 0,6 ml de Opti-MEM nuevo, y se puso en capas sobre células infectadas durante 3 horas. A las 3 horas después de la transfección, se añadieron 0,8 ml de DMEM que contenía FBS inactivado por calor al 10% a los cultivos y se continuó la incubación durante 12 horas adicionales.

La transfección de células RD con plásmidos de expresión tipo silvestre y mutante y el examen de la distribución del ciclo celular se realizó como se describió previamente (Mahalingham, S. et al., DNA Cell Biol., 1997, 16: 137-143). Brevemente, las células RD se cotransfectaron con plásmidos de expresión de Vpr tipo silvestre y mutante diferentes y pBabepuro (un vector que expresa resistencia a puromicina). Dos días después, se añadió puromicina a una concentración de 2 \mug/ml para eliminar las células no transfectadas y, de siete a diez días después de la transfección, se tiñeron los núcleos de las células RD con yoduro de propidio para el análisis del contenido de ADN por citometría de flujo.

Marcaje Metabólico e Inmunoprecipitación

Las células HeLa transfectadas se lavaron dos veces con PBS, se privaron de alimento durante una hora en suero carente de DMEM, metionina y cisteína, y después se marcaron con 200 \muCi/ml (1.200 CI/mmol) de mezcla de marcaje de proteínas ^{35}S (NEN/Dupont). Las células marcadas se lisaron en 0,5 ml de tampón RIPA (TrisHCl 50 mM a pH7,6; NaCl 150 mM; Triton X-100 al 0,2%; ácido desoxicólico al 0,2%; SDS al 0,1% y PMSF 1mM) en hielo y después se aclararon por centrifugación a 1500 r.p.m durante 10 minutos. Los lisados aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Vpr o anticuerpo anti-VIH-1 durante 90 minutos en hielo. Se añadió proteína A sepharose a los complejos antígeno-anticuerpo y se mezclaron por agitación a 4ºC durante 90 minutos. Se resuspendió el precipitado de proteínas en 50 \mul de tampón de muestra 1x y se calentó a 100ºC durante 3-5 minutos después de un extenso lavado en tampones que contenían alto contenido salino y BSA. Se analizó una fracción de la muestra de proteínas por PAGE al 12% en SDS. Para fluorografía, se mojaron los geles en salicilato sódico IM que contenía glicerol al 10% durante 15 minutos, se secaron y se autorradiografiaron usando una película Kodak X-omat-AR.

Análisis de la incorporación de Vpr en partículas tipo virus dirigidas por gag de VIH-1

Las células HeLa infectadas con virus vaccinia recombinantes se transfectaron con el vector de expresión de Gag de VIH-1 (pCDGag) junto con los plásmidos de expresión de Vpr de tipo silvestre o mutante como se describió anteriormente. Después de una incubación durante una noche, las células se marcaron con 200 \muCi/ml de mezcla de marcaje de proteínas ^{35}S. Se recogió el medio de cultivo y se aclaró por centrifugación a 15000 r.p.m. durante 15 minutos después de cinco horas de marcaje continuo. Se cargó el medio aclarado en concentradores Centricon-70 (Amicon) que tienen una barrera de exclusión de tamaño de peso molecular de 30.000 y se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 25 minutos. Se resuspendieron las partículas tipo virus acopladas al filtro con 0,5 ml de tampón RIPA. La inmunoprecipitación se realizó usando antisuero anti-Vpr solo, anticuerpo anti-VIH-1 solo, o ambos anticuerpos para determinar la presencia de Vpr en las partículas tipo virus.

Ensayo de Inmunofluorescencia

Las células HeLa se mantuvieron en DMEM que contenía FBS al 10% y se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina a una densidad de 1 x 10^{6} células por un plato (35 mm). Las células se infectaron con vTF7-3 y se transfectaron como se describió anteriormente después de 24 horas. De 16 a 24 horas después de la transfección, se lavaron las células con PBS y se fijaron con metanol a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se lavaron las células con PBS y se incubaron durante 90 minutos con antisuero primario (1:50). Después del lavado con PBS se incubaron los cubreobjetos durante 90 minutos con el fragmento F(ab)'2 de IgG de cabra anti-conejo purificado por afinidad conjugado con FITC (ICN Biochemicals; CA) y se lavaron seis veces con PBS. Los cubreobjetos se tiñeron con colorante de contraste durante 5 minutos con Azul de Evans (0,02% en PBS; Sigma; St. Louis) después se volvieron a lavar antes de montarlos en portaobjetos de vidrio usando medio de montaje resistente a la decoloración (Citiflour; Inglaterra). Todas las incubaciones se realizaron a 37ºC en una cámara de humidificación.

Resultados Construcción de los mutantes de Vpr

Para identificar el dominio o dominios de Vpr implicados en las funciones de incorporación al virión, localización nuclear, diferenciación, y de detención de ciclo celular, se construyó una serie de versiones mutadas de moléculas Vpr. En el diseño de estos mutantes, se fijaron como blanco tres regiones estructurales putativas en la secuencia de Vpr: i) el dominio ácido N-terminal que contiene una hélice-\alpha putativa (aminoácidos 17-34); ii) la región rica en leucina-isoleucina (dominio LR); y iii) dominio carboxi-terminal. Se descubrió que las mutaciones de sustitución diseñadas para influir en los restos de aminoácidos específicos estaban conservados altamente entre las secuencias de Vpr de diferentes aislados de VIH-1 (Figura 1A). El dominio amino-terminal contiene cinco restos cargados negativamente (posiciones de los aminoácidos 17, 21, 24, 25, y 29) que están altamente conservados. Los análisis estructurales de las secuencias de los aminoácidos en esta región predicen fuertemente una hélice-\alpha anfipática. Las estructuras similares han mostrado estar implicadas en interacciones proteína-proteína e incorporación al virión de proteínas virales en otros virus. Se utilizaron mutaciones específicas de sitio de estos restos que podrían interrumpir la estructura predicha. Dos de estos residuos (ácido glutámico 21 y 24) se sustituyeron por prolina, que tiene un bajo potencial para mantener una estructura de hélice-\alpha (Figura 1B).

Para investigar la importancia de la alanina altamente conservada (Ala30) se reemplazó esta alanina no polar por un resto polar voluminoso de leucina y un aminoácido hidroxilo de serina para generar mutantes A30L y A30S, respectivamente. Además, se generó otro mutante de helicoide de Vpr reemplazando las cuatro leucinas polares hidrófobas (posiciones de los aminoácidos 20, 22, 23 y 26) con alaninas no polares pequeñas (\alphaL-A). Para investigar el papel de una segunda hélice, se generó un mutante A59P de Vpr cambiando la alanina en la posición del aminoácido 59 a prolina. Se construyeron 3 mutantes Vpr que llevan sustituciones de leucina a estireno en las posiciones de los aminoácidos 64, 67, y 68 (L64S, L67S, y L68S) para introducir mutaciones en el domino LR (Figura 1B).

La histidina71, glicina75, y cisteína76 en el C-terminal de Vpr están altamente conservadas entre diferentes asilados de VIH-1, y tanto en Vpr como en Vpx de VIH-2/VIS. La cisteína ha mostrado jugar un papel principal en la estabilización de proteínas y en las interacciones proteína-proteína (Chae, H.Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 7022-7026; Creighton, T.E., Disulfide bonds and protein stability, BioEssays, 1998, 8: 57-63; y Doig, A.J. y D.H. Williams, J. Mol. Biol., 1991, 217: 389-398). Se fijaron como objetivo restos de His, Gly, y Cys para mutagénesis para evaluar el papel de este motivo en las funciones de Vpr de VIH-1 de expresión, empaquetamiento en el virión, localización subcelular, y detención del ciclo celular (Figura 1B). Todos los mutantes de sustitución de Vpr se generaron por el método de PCR solapada y se subclonaron en vectores de expresión de mamíferos pCDNA3 como se describe en materiales y métodos. Las construcciones resultantes se verificaron por análisis de la secuencia de ADN.

Efectos de las mutaciones en la expresión y empaquetamiento de Vpr en el virión

Se empleó el sistema de expresión de la ARN polimerasa T7 del virus vaccinia (vTF7-3) para estudiar el efecto de las mutaciones en la expresión de Vpr en células y en la incorporación en partículas tipo virus, dirigidas por el gen gag de VIH-1. Las células HeLa infectadas con vTF7-3 se transfectaron con los plásmidos de expresión de Vpr tipo silvestre o mutante por el método de lipofectina. Las células se marcaron durante dos horas con metionina ^{35}S, se lisaron, se inmunoprecipitaron con antisuero anti-Vpr, y se analizaron por PAGE al 12% en SDS. Como se esperaba, las células transfectadas con los plásmidos de expresión de Vpr produjeron una proteína de 14kDa (Figura 1C). La transfección con cada mutante dio como resultado niveles detectables de Vpr en el lisado celular. Es interesante saber que se observó una migración más lenta de Vpr en células transfectadas con el plásmido de expresión \alphaL-A de Vpr. Los mutantes de Vpr E21, 24P y H71Y también dieron como resultado una migración ligeramente más lenta que el tipo silvestre (Figura 1C). Esta diferencia en la migración electroforética puede ser el resultado de una conformación alterada de las proteínas Vpr mutantes en relación con el polipéptido tipo silvestre o cambios en la cara hidrófoba (\alphaL-A) del primer dominio helicoide (Figura 1D).

Para definir los restos de aminoácidos de Vpr que se requieren para la incorporación en el virión, se ensayaron varias moléculas mutantes de Vpr para la capacidad de empaquetarse en partículas de virus. Se utilizó un sistema de empaquetamiento transitorio que se genera por el gen gag de VIH-1 como se describió previamente (Mahalingham, S. et al., Virology, 1995, 207: 297-302; y Mahalingham, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 3794-3798). En este ensayo, los plásmidos de expresión de Vpr se cotransfectaron con vectores de expresión de Gag de VIH-1 en células HeLa infectadas con vTF7-3. Después de una transfección durante una noche, las células se marcaron con metionina ^{35}S y se recogieron las partículas tipo virus que se habían secretado en el medio de cultivo y se concentraron usando un concentrador Centricon 30. Después se detectó por inmunoprecipitación la cantidad de Vpr presente en el virión y de Vpr asociada a la célula.

La expresión de Gag dio como resultado un producto de proteína de 55 kDa en el sobrenadante del cultivo celular y la cotransfección de vectores de expresión de Gag y Vpr de tipo silvestre dio como resultado un empaquetamiento eficaz de Vpr en las partículas tipo virus como se esperaba (Figura 2). En contraste, no se pudo detectar Vpr en las partículas tipo virus a partir de células cotransfectadas con Gag y los mutantes E21, 24P, \alphaL-A, y A59P de Vpr, a pesar de los niveles detectables de expresión en las células (Figura 1C y Tabla 1). Las moléculas de Vpr con mutaciones en la alanina30 (A30S y A30L) e His71 mostraron niveles reducidos de la incorporación de Vpr en partículas tipo virus. Estos resultados indican que las mutaciones en las posiciones de los aminoácidos 64, 67, y 68 (L64S, L67S y L68S), Gly75 y Cys76 permiten el empaquetamiento eficaz de Vpr en partículas tipo virus. Tomados conjuntamente con otros estudios, estos resultados sostienen la importancia de un dominio helicoide putativo con estas mutaciones adicionales en el empaquetamiento de Vpr en partículas de virus VIH-1.

El análisis de mutaciones de sustitución revela que los dominios putativos helicoide y LR son necesarios para el transporte nuclear de Vpr.

Previamente se ha mostrado que Vpr se localiza en el núcleo de células infectadas y transfectadas en ausencia de otras proteínas virales a pesar de la ausencia de una señal de localización nuclear canónica (DiMarzio, P. et al., J. Virol., 1995, 69: 7909-7916; Lu, Y. et al., J. Virol., 1993, 67: 6542-6550; Mahalingham, S. et al., Virology, 1995, 210: 495-500; y Yao, X et al., J. Virol., 1995, 69: 7032-7044). Se analizó la serie de plásmidos de expresión de Vpr para definir los restos de aminoácidos requeridos para la localización nuclear como se muestra esquemáticamente en la Figura 1B. Se transfectaron los plásmidos mutantes en células HeLa infectadas con vTF7-3 para determinar la localización subcelular de las moléculas de Vpr mutantes. Después de una transfección durante una noche, las células se fijaron con metanol, se marcaron con antisuero anti-Vpr, y se analizaron por un ensayo de inmunofluorescencia indirecto para evaluar la capacidad de diversos mutantes de Vpr de dirigirse al núcleo. Como se esperaba, la Vpr tipo silvestre se localizó principalmente en el núcleo de células transfectadas y no se observó señal en las células transfectadas con el vector o en células transfectadas con Vpr de tipo silvestre teñidas con suero preinmune (Figuras 3A-3O). En contraste, los mutantes E21, 24P, \alpha-L-A, A59P, L67S, y L68S de Vpr dañaban gravemente la localización nuclear de Vpr como se muestra en la Figuras 3A-3O. La mayoría de las células que expresaban esta proteína Vpr mutante mostraron localización en el citoplasma. Es interesante observar que las moléculas mutantes A30L y G75A de Vpr conservaron la capacidad de localizarse en el núcleo (Figuras 3A-3O). Los mutantes A30S, L64S, H71C, H71Y, y C76S tenían cantidades notables de proteína tanto en el núcleo como en el citoplasma (Figuras 3A-3O). Los mutantes de los dominios putativos helicoide y LR mostraron patrones de inmunofluorescencia notablemente diferentes del de Vpr de tipo silvestre. Estos resultados sugieren que tanto los dos dominios N-terminales hélice-\alpha y LR son esenciales para el transporte de Vpr al interior del núcleo.

Se requieren restos de aminoácidos de Vpr para la detención del ciclo celular en la fase G2/M del ciclo celular.

Los estudios previos han mostrado que Vpr induce la diferenciación celular (Levy, D.N. et al., Cell, 1993, 72: 541-550), la detención del crecimiento, y bloquea el ciclo celular en la fase G2/M (Rogel, M. et al., J. Virol., 1995, 69: 882-888). Se analizaron varios plásmidos de expresión de Vpr para identificar los restos de aminoácidos esenciales para la detención del ciclo celular y para definir la interrelación entre las funciones de Vpr de incorporación al virión, localización subcelular, y detención del ciclo celular. Se transfectaron transitoriamente células de rabdomiosarcoma humano con plásmidos de expresión de Vpr y se seleccionaron con puromicina. En paralelo, se transfectaron células con el vector solo como controles. Las células transfectadas se fijaron y tiñeron con yoduro de piridinio como células enteras para determinar el contenido de ADN por citometría de flujo. Había un aumento drástico en la proporción de células en fase G2/M de división celular en células transfectadas con el plásmido de expresión de Vpr tipo silvestre (Figuras 4A-1-4A-4), mientras que las células transfectadas con vector mostraron un contenido de ADN similar el de células que en ciclo no sincronizadas que están creciendo sin puromicina (Figuras 4A-1-4A-4). Las células que expresaban Vpr mostraron cambios morfológicos tales como adherencia aumentada y detención del crecimiento consecuente con un fenotipo diferenciado terminal (4B-1-4B-2). Estos resultados confirman los informes previos de que la expresión de Vpr en células es capaz de alterar la distribución del ciclo celular y el estado morfológico.

Se midió la actividad relativa de bloquear el ciclo celular para cada molécula mutante de Vpr en el ensayo de transfección transitoria para identificar el aminoácido o aminoácidos importantes para la detención del ciclo celular. Se observó alguna variabilidad experimental en la proporción G2/M de células transfectadas tanto con Vpr tipo silvestre como con Vpr mutante sobre experimentación repetida. Los resultados del análisis mostraron que los mutantes \alphaL-A y L68S de Vpr mantenían la actividad de bloquear el ciclo celular (Figura 4C). Se redujo drásticamente la actividad de detención del ciclo celular en mutantes E21, 24P, A30S, A30L, A59P, L64S, L67S, H71C, H71Y, G75A, y C76S de Vpr (Figura 4C). Se cree que probablemente este descubrimiento no se debe a la inestabilidad de la proteína, ya que estas moléculas mutantes se expresaban de manera estable. Los mutantes A30L y G75A de Vpr eran inactivos en la detención del ciclo celular aunque conservaban la localización nuclear de tipo silvestre. De todos los mutantes Vpr, \alphaL-A y L68S conservaron la actividad de bloquear el ciclo celular, aunque estas moléculas mutantes se localizaban en el citoplasma. En contraste, los mutantes E21, 24P, L64S, y L67S de Vpr eran inactivos en la detención del ciclo celular y se localizaron en el citoplasma (Figuras 3A-3O). Estos resultados indican claramente que el dominio helicoide y los aminoácidos del dominio carboxi-terminal controlan la función de Vpr de detención del ciclo celular. En apoyo de esto, Vpr de HXB2 (deleción de 18 aminoácidos en C-terminal) no induce ni la detención del ciclo celular ni la diferenciación morfológica, y muestra el fenotipo de localización nuclear difuso. Estos resultados sostienen la importancia de dominios helicoides para las funciones de Vpr de incorporación al virión, localización nuclear y detención del ciclo celular. En gran medida, estos mutantes de Vpr segregan claramente las funciones de localización nuclear y detención del ciclo celular, así como de diferenciación morfológica (Tabla 1).

Análisis

Vpr es única entre las proteínas accesorias de VIH-1 a causa de su asociación con partículas de virus. Recientemente, se ha mostrado que la proteína codificada por el gen gag es suficiente para la incorporación de Vpr en el interior de partículas de virus (Figura 6A). La presencia de Vpr en el virión es un fuerte indicio de que esta proteína puede tener un papel funcional al principio de la replicación viral. Cuando se expresa en ausencia de otras proteínas virales, se mostró que Vpr se localizaba en el núcleo y detenía las células en la fase G2/M de la división celular (He, J. et al., J. Virol., 1995, 69: 6705-6711). Para definir la interrelación entre las diferentes funciones (incorporación al virión, localización nuclear, detención del ciclo celular, y diferenciación) de Vpr, se generaron varias moléculas con mutaciones en diferentes dominios estructurales de Vpr. Los resultados muestran claramente que la incorporación al virión y la localización nuclear de Vpr están controladas por dominios putativos helicoides y el dominio rico en leucina/isoleucina, mientras que la detención del ciclo celular está controlada en gran medida por el dominio C-terminal (aminoácido 71 a 82) (Figura 5). Lo más notable fue, sin embargo, que los experimentos de incorporación mostraron que los mutantes de sustitución de prolina no se incorporaron a las partículas tipo virus. Las propiedades de las prolinas de desestabilizar las hélices están bien documentadas (Chou, P.Y. y G.D. Fasman., Annu. Rev. Biochem., 1978, 47: 251-276; Tacke, E. et al., Virology, 1993, 197: 274-282). La sustitución de prolina para el ácido glutámico 21, 24 (E21, 24P) y alanina 59 (A59P) en los dominios helicoides impide la incorporación de Vpr en las partículas tipo virus, sugiriendo que los dominios putativos helicoides se requieren para la incorporación de Vpr al virión.

Las mutaciones en alanina 30 (A30S y A30L) dieron como resultado unos niveles marcadamente reducidos de incorporación de Vpr en las partículas tipo virus. Además, la sustitución de alanina para cuatro leucinas (\alphaL-A) en el dominio helicoide dio como resultado un mutante de Vpr que no se incorporaba en las partículas tipo virus, sugiriendo la importancia de las leucinas hidrófobas en los dominios helicoides para el empaquetamiento del virión. Todos los mutantes del dominio helicoide excepto A30L mostraron una incorporación al virión y localización nuclear dañadas. Estos daños pueden deberse a la conformación estructural y/o estabilidad alteradas de las proteínas Vpr mutantes. Un análisis del motivo helicoide de proteína, relacionado con funciones biológicas específicas, sugiere que hay restos de aminoácidos en las hélices que son esenciales para un procesamiento y estabilidad normales asegurando una conformación correcta. De acuerdo con estas observaciones, los dominios putativos helicoides presentes en Vpr juegan un papel importante en el empaquetamiento del virión en las partículas de virus.

El análisis de inmunofluorescencia indica claramente que los dominios putativos helicoide y LR de Vpr juegan un papel importante en el transporte de Vpr al interior del núcleo. La importancia de los dominios helicoides para dirigirse al núcleo se sostiene por el daño en la localización nuclear para mutantes E21, 24P y A59P que se mostró que interrumpían la conformación de la estructura helicoide. En contraste, la mutación en la cara hidrófoba de la hélice en Vpr (A30L) dio como resultado una proteína mutante que conservaba la capacidad de localizarse en el núcleo pero que disminuía la función de Vpr de incorporación al virión. El remplazo de leucinas por serina en el dominio LR impedía la localización nuclear pero conservaba la capacidad de Vpr de empaquetar el virión. Se desconoce el mecanismo por el que Vpr se transporta al núcleo y el medio por el que los restos median estas funciones. Las secuencias identificadas para la localización nuclear de Vpr no contienen motivos canónicos para dirigirse al núcleo que podría esperarse que fueran directamente responsables de que se dirijan al núcleo. Se sabe que las estructuras helicoides mantienen las interacciones proteína-proteína, y de este modo puede ser que Vpr se desplace al núcleo a través de la asociación con una proteína o proteínas celulares (Figura 6B). Las observaciones recientes de este laboratorio y otros sugieren que Vpr puede asociarse con un factor o factores celulares que son consistentes con esta hipótesis (Refaeli, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 3621-3625. Zhao, L-J. et al., J. Biol. Chem., 1994, 269: 15577-15582). Estos factores incluyen un complejo receptor de glucocorticoides putativo que puede desplazarse al núcleo con Vpr (Figura 6B). Zhao et al., (J. Biol. Chem Supra) demostró recientemente que una mutación en el dominio LR, implicado en la interacción con una proteína celular (RIP), impide las interacciones proteína-proteína. Se mostró que RIP está presente en el citoplasma y el núcleo. Es posible que el desplazamiento de Vpr al interior del núcleo pueda estar relacionado con su asociación con la proteína o complejo de proteína RIP. En contraste a los dominios helicoide y LR, la Gly75 y Cys76 conservadas en el C-terminal son prescindibles para las propiedades de Vpr de desplazamiento al núcleo e incorporación al virión. Estos resultados sugieren que el desplazamiento de Vpr al núcleo no requiere un NSL típico. Todas las proteínas se sintetizan en el citoplasma y algunas se transportan al núcleo a través del reconocimiento de un NSL específico rico en restos de aminoácidos básicos. Sin embargo, otras se transportan a través de una unión de remolque con otra proteína que tiene un NLS (Dingwall, C. y R.A. Laskey, Tends Biochem. Sci., 1991, 16: 478-481). También es posible que el transporte nuclear de Vpr no sea dependiente de NLS.

Es interesante observar que de todas las moléculas de Vpr mutantes, A30L y G75A conservaban el patrón de localización nuclear de tipo silvestre pero estaban dañados en la función de detención del ciclo celular. En contraste, los mutantes E21, 24P, \alphaL-A, L64S, L67S, y L68S conservaban la capacidad de detener el ciclo celular en la fase G2/M pero fallaban en localizarse en el núcleo. Además, el mutante A59P de Vpr está dañado para todas las funciones de Vpr a pesar de la expresión detectable. Es de suponer que Vpr bloquea la división celular modificando un complejo de proteína p34cdc2-Ciclina B que está implicado en la regulación del ciclo celular. Los mutantes de Vpr que fallan en detener el ciclo celular probablemente no interaccionan con un factor celular implicado en la regulación del ciclo celular o puede que interaccionen sin señales de desencadenamiento necesarias para detener el ciclo celular.

Está en investigación intensiva la importancia de la capacidad de Vpr para detener el ciclo celular y su relevancia directa en la replicación de VIH-1 en monocitos/macrófagos o patogénesis del SIDA. Vpr puede impedir no específicamente los complicados acontecimientos de la división celular. Sin embargo, los resultados de este y otros laboratorios sugieren que este no es el caso, ya que dos mutantes de Vpr (A30L y G75A) se localizaron en el núcleo pero no estaban implicados en la función de Vpr de detención del ciclo celular. En contraste, el mutante L68S de Vpr se localizó en el citoplasma y mantuvo la actividad de detención del ciclo celular. Vpr es capaz de importar un complejo de preintegración grande al interior de los núcleos de células que no se están dividiendo (Heinziger, N.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 7311-7315). Los resultados obtenidos de los mutantes de los dominios putativos helicoide y LR indican claramente que la localización nuclear no es esencial para la actividad de Vpr de detención del ciclo celular. En este contexto, Fletcher et al., (9EMBO, 1996, 15: 6155-6165) informó de que las actividades de importación nuclear de un complejo de preintegración y detención del ciclo celular están mediadas por dos genes separados (Vpx y Vpr) en VIH-2/VIS. Puede tener importancia práctica la identificación de los restos de aminoácidos de Vpr requeridos para la incorporación al virión, localización nuclear, detención del ciclo celular, así como diferenciación de la célula hospedadora. Recientemente, se ha sugerido que los lentivirus tienen utilidad como vectores de terapia génica debido a su propiedad inherente única de importación nuclear e integración del genoma en células que no están en división (Naldini, L. et al., Science, 1996, 272: 263-267). La segregación de la función de Vpr de importación nuclear de la función de detención del ciclo celular/diferenciación permite la construcción de vectores de suministro de genes que toman la ventaja de la propiedad de importación nuclear de Vpr sin otras actividades de Vpr menos deseables.

TABLA 1 Efecto de la mutagénesis en las funciones de Vpr de incorporación al virión, localización subcelular y detención del ciclo celular/diferenciación

1

Claims

1. Una composición conjugada que comprende:

un fragmento de Vpr de VIH-1 que comprende la secuencia de los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o una proteína no Vpr de VIH-1 que comprende los aminoácidos 17-36 y 59-84 conjugados con un compuesto terapéutico.

2. La composición conjugada de la reivindicación 1, donde dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o dicha proteína no Vpr de VIH-1 también comprende una secuencia de aminoácidos policatiónica.

3. La composición conjugada de la reivindicación 1, donde dicho compuesto terapéutico es un plásmido de vacuna de ADN conjugado con dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o proteína no Vpr de VIH-1 por enlaces iónicos.

4. La composición conjugada de la reivindicación 1, donde dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o proteína no Vpr de VIH-1 también comprende una secuencia de aminoácidos policatiónica y dicho compuesto terapéutico es una molécula de ácido nucleico que se conjuga con dicha secuencia de aminoácidos policatiónica por enlaces iónicos.

5. La composición conjugada de la reivindicación 1, donde dicho compuesto es una molécula antisentido.

6. La composición conjugada de la reivindicación 1, donde dicho compuesto es un oligonucleótido antisentido.

7. Un método para administrar un compuesto al núcleo de una célula in vitro que comprende la etapa de:

poner en contacto dicha célula con un compuesto conjugado que es dicho compuesto conjugado con un fragmento de la proteína Vpr de VIH-1 que comprende los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 o dicho compuesto conjugado con una proteína no Vpr de VIH-1 que comprende los aminoácidos 17-36 y/o 59-84 de la proteína Vpr de VIH-1; donde dicho compuesto conjugado se capta por dicha célula y se localiza en el núcleo de dicha célula.

8. El método de la reivindicación 7, donde dicho compuesto es una molécula de ADN.

9. El método de la reivindicación 7, donde dicho compuesto es una molécula de ADN plasmídico.

10. El método de la reivindicación 7, donde dicho compuesto es una molécula antisentido.

11. El método de la reivindicación 7, donde dicho compuesto es un oligonucleótido antisentido.

12. Un fragmento de Vpr de VIH-1 que consta de los aminoácidos 17-36 o que consta de los aminoácidos 59-84, o una proteína no Vpr de VIH-1 que comprende secuencias no de Vpr y secuencias de Vpr en la que las secuencias de Vpr consta de los aminoácidos 17-36 o comprende los aminoácidos 59-84 de la proteína Vpr de VIH-1.

13. Un método para inhibir la proliferación celular in vitro que comprende la etapa de:

detener el avance de dicha célula en el ciclo celular poniendo en contacto dicha célula con

un fragmento de la proteína Vpr de VIH-1 que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89; o

una proteína no Vpr de VIH-1 que tiene una secuencia de un fragmento de una proteína Vpr que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89 de la proteína Vpr de VIH-1; o

una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr de VIH-1 que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89; o

una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína no Vpr de VIH-1 que tiene una secuencia de un fragmento de una proteína Vpr que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89 de la proteína Vpr de VIH-1;

donde dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o proteína no Vpr de VIH-1 se capta por dicha célula o

dicha molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr de VIH-1 o dicha molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína no Vpr de VIH-1 se capta por dicha célula y se expresa para producir dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o proteína no Vpr de VIH-1 en dicha célula, y dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o proteína no Vpr de VIH-1 inhibe dicha célula de avanzar en dicho ciclo celular.

14. Un fragmento de la proteína Vpr de VIH-1 que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89; o

para usar en terapia.

15. Uso para

en la fabricación de un medicamento para tratar un individuo que tiene una afección hiperproliferativa.

16. Un fragmento de Vpr de VIH-1 que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89 de una proteína no Vpr de VIH-1 que tiene una secuencia de un fragmento de una proteína Vpr que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89 de la proteína Vpr de VIH-1.

17. Una composición farmacéutica que comprende:

un fragmento de Vpr de VIH-1 o una proteína no Vpr de VIH-1 de acuerdo con la reivindicación 16; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de la proteína Vpr de VIH-1 que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89, o una proteína no Vpr de VIH-1 que tiene una secuencia de un fragmento de una proteína Vpr que consta de los aminoácidos 19-35 o 74-89 de la proteína Vpr de VIH-1.

19. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicha molécula de ácido nucleico es un plásmido.

20. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicha molécula de ácido nucleico es un genoma viral.

21. Una composición farmacéutica que comprende:

una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Un método para identificar compuestos que inhiben la unión de la proteína Vpr con el dominio p6 de p55 o la proteína p6 in vitro, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un fragmento de Vpr de VIH-1 que comprende la secuencia de los aminoácidos 17-36 o una proteína no Vpr de VIH-1 que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr de VIH-1 con una proteína que comprende un dominio p6 de la proteína Gag de VIH-1 en presencia de un compuesto de ensayo,

b) determinar el nivel de unión entre dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o dicha proteína no Vpr de VIH-1 y dicha proteína que comprende un dominio p6 de Gag de VIH-1 y

c) comparar ese nivel de unión con el nivel de unión entre dicho fragmento de Vpr de VIH-1 o dicha proteína no Vpr de VIH-1 y dicha proteína que comprende un dominio p6 de Gag de VIH-1 puestos en contacto en ausencia de un compuesto de ensayo.

23. El método de la reivindicación 22, donde dicha proteína que comprende un dominio p6 de Gag de VIH-1 es p55.

24. El método de la reivindicación 22, donde dicha proteína que comprende un dominio p6 de Gag de VIH-1 es p6.

25. Un kit para realizar el método para identificar compuestos que inhiben la unión de la proteína Vpr con dominio p6 de p55 o la proteína p6 de la reivindicación 22, comprendiendo dicho kit:

a) un primer contenedor que comprende un fragmento de Vpr de VIH-1 que comprende la secuencia de los aminoácidos 17-36 o una proteína no Vpr de VIH-1 que comprende los aminoácidos 17-36 de la proteína Vpr de VIH-1; y

b) un segundo contenedor que comprende una proteína que comprende un dominio p6 de la proteína Gag de VIH-1.

26. Una proteína de fusión que comprende secuencias no de Vpr y secuencias de Vpr en la que las secuencias de Vpr constan de la secuencia de los aminoácidos 17-36 de Vpr.

27. La proteína de fusión de la reivindicación 26, donde dichas secuencias de aminoácidos no de Vpr son secuencias de una proteína biológicamente activa.

28. Partículas de libración de fármaco que comprenden las proteínas de fusión de la reivindicación 26.