ES2210291T3

ES2210291T3 - Metodos para la identificacion de composiciones capaces de anular las interacciones de union de vpr-rip-1 del vih.

Info

Publication number: ES2210291T3
Application number: ES95920426T
Authority: ES
Inventors: David B. Weiner; Yosef Refaeli; David M. Levy
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1994-05-19
Filing date: 1995-05-17
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2015-05-17
Also published as: WO1995031901A1; EP0759693B1; EP0759693A4; ATE254847T1; DE69532197T2; EP0759693A1; DE69532197D1; US5780220A; AU690694B2; AU2588095A; PT759693E; CA2190613A1

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA TRATAR A UN INDIVIDUO EXPUESTO O INFECTADO CON HIV QUE COMPRENDE LA ADMINISTRACION A DICHO INDIVIDUO DE UNA CANTIDAD EFECTIVA TERAPEUTICAMENTE DE UNO O MAS COMPUESTOS QUE INHIBEN O PREVIENEN LA REPRODUCCION DE DICHO HIV MEDIANTE INTERFERIR CON LA REPLICA Y OTRAS FUNCIONES ESENCIALES DEL VPR EXPRESADAS POR DICHO HIV, EL BLOQUEO INTERACTIVO DEL VPR SELECCIONADO EN LAS CELULAS HUMANAS, Y POR LO TANTO, MEDIANTE PREVENIR LA TRASLOCACION DEL COMPLEJO SELECCIONADO O VPR A PARTIR DE EL CITOSOL DE DICHAS CELULAS HUMANAS HASTA EL NUCLEO DE DICHAS CELULAS, DONDE EL VPR CONTINUA LAS ACTIVIDADES ESENCIALES PARA LA REPLICA DE HIV. EN LOS MODELOS PREFERIDOS, EL COMPUESTO O LOS COMPUESTOS, LOS CUALES BLOQUEAN INTERACTIVAMENTE EL OBJETIVO SELECCIONADO, SON ANTAGONISTAS RECEPTORES DE HORMONAS ESTEROIDES, ANTAGONISTAS RECEPTORES GLUCORTICOIDES O ANTAGONISTAS DE TIPO II RECEPTORES GLUCORTICOIDES, ESPECIALMENTE MIFEPRISTONA (RU-486). ADEMAS, SE PRESENTAN LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN ESTOS COMPUESTOS, ASI COMO UN METODO PARA IDENTIFICARLOS Y UNOS UTENSILIOS PARA SU UTILIZACION.

Description

Métodos para la identificación de composiciones capaces de anular las interacciones de unión de Vpr-rip-1 del VIH.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de las composiciones que inhiben o evitan la replicación del VIH para el tratamiento de individuos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

En particular, la presente invención se refiere a las composiciones que inhiben o evitan la función replicativa y otras funciones esenciales de la proteína viral R (vpr) del VIH mediante el bloqueo interactivo de la diana vpr en células humanas. Como se describirá posteriormente, la diana vpr puede incluir, pero sin limitarse necesariamente a ella, la proteína que interacciona con la proteína R, denominada en lo sucesivo en este documento rip-1.

La presente solicitud se refiere a la solicitud U.S. nº de serie 08/167.519, presentada el 15 de diciembre, 1993), y es una solicitud en parte continuación del nº de serie 08/246.177, presentada el 19 de mayo, 1994, y del nº de serie 08/382.873, presentada el 3 de febrero, 1995.

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que la diana vpr en la célula huésped humana involucra rip-1 sola o combinada, es decir, como parte o combinada funcionalmente, con uno o más receptores esteroides en dicha célula huésped, especialmente el receptor de glucocorticoide (GR), por la que se forma un complejo, el cual comprende vpr, rip-1, dicho receptor o receptores esteroides, y potencialmente otros componentes, que media en las actividades de vpr que son esenciales en la replicación del VIH en dicha célula huésped humana. La presente invención también contempla que la diana vpr sea uno o más de dichos receptores esteroides por sí solos. De esta manera, la presente invención también se encuentra en el campo putativo de las composiciones inhibidoras o antagonistas que, mediante su unión, o de otra manera, mediante la evitación completa o parcial del funcionamiento de rip-1, solo o en combinación con un receptor esteroide, especialmente un receptor de tipo GR, o potencialmente con otros componentes, o con uno o más receptores esteroides por sí solos, evitan que vpr interaccione con su diana, la cual comprende especialmente un complejo de múltiples componentes que incluye rip-1, evitando o interfiriendo de esta manera las actividades esenciales de vpr necesarias para la replicación del VIH.

En particular, de acuerdo con la presente invención se contempla que las composiciones inhibidoras o antagonistas que se dan a conocer en este documento evitan la translocación del vpr/rip-1 y/o receptor esteroide u otro componente complejo desde el citosol hasta el núcleo, o la señalización de dicho complejo translocado, por la que vrp continuaría de otro modo sus diversas actividades esenciales para la replicación del VIH. De esta manera, la presente invención también se encuentra dentro del campo putativo de las composiciones inhibidoras o antagonistas que se unen, o de otro modo, evitan completa o parcialmente el funcionamiento de rip-1, por sí solo o en combinación con un receptor esteroide u otro componente, especialmente con un receptor de tipo GR, o con uno o más receptores esteroides solos, evita o interfiere con la translocación de vrp, o del complejo con el que está asociado, desde el citosol hasta el núcleo de dicha célula huésped humana, o la señalización de dicho vpr o complejo translocado, por el que se frustran las actividades esenciales de dicho vpr o complejo que son necesarias para la replicación del VIH.

La presente invención también se encuentra en el campo putativo de los métodos para la identificación de composiciones que inhiben o evitan la replicación del VIH en células huésped humanas; en particular, de aquellas composiciones que evitan que vpr interaccione con su diana, especialmente las que comprenden un complejo de varios componentes que incluya rip-1; y más particularmente, aquellas composiciones que evitan o interfieren con la translocación de vpr, o del complejo con el que está asociado, desde el citosol hasta el núcleo de dicha célula huésped humana, o la señalización de dicho vpr o complejo translocado, por el que las actividades esenciales de dicho vpr o complejo necesarias para la replicación del VIH quedan frustradas.

Breve descripción de la técnica anterior

Un enfoque en el tratamiento de los individuos infectados por VIH es administrar a tales individuos, compuestos que intervengan directamente e interfieran con la maquinaria por medio de la cual el VIH se replica dentro de las células humanas. Teniendo en cuenta este enfoque, se destaca en primer lugar que el VIH es un lentivirus cuyo genoma contiene solo, aproximadamente, 9-11 kb de material genético, y menos de 10 marcos de lectura abierta. De esta manera, cada gen del VIH es probable que desempeñe un papel vital en la historia natural del virus in vivo. Además, el VIH posee un conjunto de pequeños marcos de lectura abierta y de polaridad positiva, que codifican 1-2 exones cuyos productos proteicos regulan diversos aspectos del ciclo vital del virus. Algunos de estos genes son factores genéticos transactivantes que son necesarios para la replicación del virus en todos los tipos celulares permisivos.

De esta manera, la complejidad del VIH puede atribuirse a los intrincados patrones de regulación de la expresión génica que se observan durante el ciclo vital vírico. Debido a que todos estos mecanismos reguladores operan mediante la interacción de proteínas codificadas en el virus con factores diferenciados de la célula huésped, será posible identificar compuestos que interfieran directamente con la unión y translocación de estas proteínas esenciales para la replicación del VIH.

La progresión desde infección por VIH hasta el SIDA en gran parte se ve determinada por los efectos del VIH sobre las células que infecta, incluyendo los linfocitos T CD4^{*} y macrófagos. Por otra parte, la activación, diferenciación y proliferación celular, a su vez, regula la infección y replicación por VIH en células T y macrófagos. Gallo, R.C. et al. (1984) Science 224:500; Levy, J.A. et al. (1984) Science 225:840; Zack, J.A. et al. (1988) Science 240:1026; Griffin, G. E. et al. (1988) Nature 339:70; Valentin, A. et al. (1991) J. AIDS 4:751; Rich, E.A. et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:176; y Schuitemaker, H. et al. (1992) J. Virol. 66:1354. La división celular per se puede no ser necesaria, ya que el VIH y otros lentivirus pueden proliferar en macrófagos no proliferantes en estado de diferenciación terminal y en linfocitos T de crecimiento retardado. Rose, R. M. et al. (1986) Am. Rev. Respir. Dis. 143:850; Salahuddin, S. Z. et al. (1986) Blood 68:281; y Li, G. et al. (1993) J. Virol. 67:3969. La capacidad de los lentivirus, incluyendo el VIH, de replicarse en células no proliferantes, en particular en macrófagos, se cree que es única entre los retrovirus, y es significativo que varios lentivirus contengan un gen similar a vpr. Myers, G. et al. (1992) AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:373. La infección por VIH de líneas celulares mieloides puede resultar en un fenotipo más diferenciado e incrementar la expresión de factores tales como NF-KB, los cuales son necesarios para la replicación del VIH. Roulston, A. et al. (1992) J. Exp. Med. 175:751; y Chantal Petit, A. J. et al. (1987) J. Clin. Invest. 79:1883.

Desde la demostración en 1987 de que el marco pequeño de lectura abierta en VIH-1 denominado R codifica una proteína de 15 KD (Wong-Staal, F. et al. (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:33-39), ha existido un cuerpo creciente de literatura acerca de la función de la proteína viral R (vpr). Se conserva el marco de lectura abierta de vpr dentro de todos los genomas del VIH-1 y VIH-2 y dentro de todos los aislados patogénicos de genomas de virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS). El requisito evolutivo de economía en el diseño se considera que requiere que la presencia de vpr en el genoma del VIH esté relacionado con una función específica y no indispensable en el ciclo vital vírico. Además, la proteína vpr es el único producto de gen regulatorio de VIH-1 que se ha demostrado que está incorporado en viriones. Esto habitualmente sugeriría un papel estructural para vpr, pero debido a que los virus en los que vpr ha sido eliminado son capaces de producir viriones normales, esto se considera evidencia adicional de un papel regulatorio para esta molécula.

Además, la presencia de vpr en viriones se ha asociado con un incremento cinético en la replicación de linfocitos T, y con la capacidad del VIH de establecer infección productiva en monócitos y macrófagos. De esta manera, se ha dado a conocer que las mutaciones en el gen vpr resultan en una reducción en la replicación y citopatogenicidad del VIH-1, VIH-2, y VIS en linfocitos primarios T CD4^{*} y líneas celulares T transformadas. Ver, por ejemplo, Ogawa, K. et al. (1989) J. Virol. 63:4110-4114; Shibata, R. et al. (1990a) J. Med. Primatol. 19:217-225; Shibata, R. et al. (1990b) J. Virol. 64:742-747, y Westervelt, P. et al. (1992), J. Virol. 66:3925, aunque otros han dado a conocer la ausencia de efecto de una mutación en el gen vpr sobre la replicación (Dedera, D. et al. (1989) Virol. 63:3205-3208).

Aún más importante, se ha dado a conocer que VIH-2 mutado en vpr era incapaz de infectar monócitos/macrófagos primarios (Hattori, N. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8080-8084). Además, la replicación viral en macrófagos puede ser casi completamente inhibida por ribonucleótidos con orientación opuesta con diana en el marco de lectura abierto de vpr. Esto, junto con la inducción de la diferenciación celular del rabdomiosarcoma, se considera que dicta una función crucial para vpr en la patogénesis del VIH.

La presencia de proteína vpr en partículas virales implica una función temprana para el vpr durante el proceso infectivo, después de la penetración y decapsidación del virus. Este papel se considera que implica la interacción del vpr con mecanismos celulares regulatorios, resultando en un incremento en la permisividad celular para sostener los procesos de replicación viral. Ver, por ejemplo, Cohen, E.A. et al. 1990a J. Virol. 64:3097-3099; Yu, X.F. et al. (1990) J. Virol. 64:5688-5693; y, Yuan, X. et al. (1990) AIDS Res. Hum. Retroviruses 6:1265-1271.

La acción del vpr puede involucrar la sobrerregulación de elementos celulares que potencian la expresión génica viral, o la modulación negativa de rutas celulares inhibitorias que afectan a tales procesos virales. Tal desregulación celular es consistente con la observación de que vpr es suficiente para la diferenciación y cesación de la proliferación celular del rabdomiosarcoma y de las líneas celulares de osteosarcoma. De esta manera, el gen vpr del VIH-1 se ha demostrado que induce la inhibición y diferenciación del crecimiento celular en líneas tumorales de diferenciación intermedia in vitro (Levy, D.N. et al. (1993) Cell 72:541). De esta manera, la capacidad de una proteína asociada a un virus, tal como vpr, de reiniciar un programa de desarrollo retardado, se basa claramente en su interacción con otras proteínas celulares, y debido a que la proteína vpr se origina dentro de las partículas virales, se considera que vpr debe, de acuerdo con esto, desempeñar un papel en el establecimiento de la infección productiva.

Con el fin de que vpr ejerza sus efectos celulares, casi con seguridad requiere un ligando o diana celular que medie en estas funciones. Hasta el momento no se ha descrito tal ligando o diana, al cual también se puede hacer referencia como receptor o proteína de unión o de interacción para vpr. De acuerdo con lo anterior, en el presente documento se describe como parte de la presente invención el aislamiento de una proteína vpr citosólica de 41 KD, de unión o de interacción, denominada a continuación en este documento rip-1.

Vpr y rip-1 eluyen juntos en un sistema de inmunoafinidad, y pueden entrecruzarse específicamente con un complejo de 58 KD. Mediante la utilización de la competición entre péptido y anticuerpo, se ha resuelto el sitio de su interacción a los aminoácidos 38 a 60 en la secuencia de aminoácidos de vpr. Rip-1 ha sido detectado en diversas líneas celulares.Rip-1 se transloca selectivamente entre el citosol y el núcleo, con la exposición de la célula a vpr, en forma soluble o a través de la infección con el virus de tipo original, pero no en respuesta a PMA, sugiriendo que existe un acoplamiento en sus funciones reguladoras. En consecuencia, la presente invención involucra el descubrimiento de que rip-1 puede ser parcialmente responsable de la mediación en la actividad de vpr en la célula huésped humana.

Como parte de la presente invención se contempla adicionalmente, como se describe en detalle posteriormente, que rip-1 funcione en asociación con uno o más miembros de la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, y en particular, en asociación con uno o más miembros de la familia de receptores de glucocorticoides (GR), y más en particular, en asociación con uno o más miembros de la familia de receptores GR-tipo II. Por "en asociación con" se significa que rip-1 es parte de, forma un complejo discreto con, o es funcionalmente interactivo o se combina con uno o más de dichos receptores esteroides. De esta manera, el vpr, rip-1, y receptor esteroide u otro componente pueden estar químicamente y/o físicamente unidos entre sí formando un complejo de varios componentes. Esto puede hacerse en etapas, por ejemplo, el vpr puede formar un complejo con rip-1, al que puede unirse posteriormente uno o más receptores esteroides, o puede darse la secuencia inversa de etapas, o vpr puede formar primero un complejo con uno o más receptores esteroides, al que se une después rip-1. Por otra parte, la asociación puede darse a nivel funcional, es decir, rip-1 y el receptor esteroide pueden estar relacionados entre sí en términos de una secuencia de translocación y/o sucesos de señalización. También es posible que exista una combinación o mezcla de formación de uno o más complejos, además de una secuencia de translocación y/o sucesos de señalización. La presente invención no se limita a ningún mecanismo particular de acción.

También se encuentra dentro de lo que contempla la presente invención que sean de utilidad en el tratamiento de individuos expuestos o infectados por VIH, las composiciones que inhiben o evitan las funciones replicativas u otras funciones esenciales, de vpr mediante la unión, o de otro modo asociación, con el vpr mismo, en lugar de su ligando o diana celular, de manera que se evita que vpr interactúe con dicha diana, o que ésta actúe sobre vpr, o se evita que vpr sea translocado al núcleo, o que, una vez translocado, se evita su señalización. Por ejemplo, una composición que ocupe uno o más sitios de unión activos de vpr, o que cause un cambio conformacional crítico en vpr, o que cause de algún otro modo la formación de un complejo entre vpr, rip-1, y/o uno o más receptores esteroides u otros componentes, y la translocación y señalización subsiguientes, será útil en el tratamiento de individuos expuestos o infectados por VIH.

De esta manera, es un aspecto clave de la presente invención proporcionar una composición para el tratamiento de individuos expuestos o infectados por VIH, comprendiendo la composición, compuestos que sean antagonistas de receptores de hormonas esteroides, en particular antagonistas de receptores de glucocorticoides, y más en particular, antagonistas de receptores GR de tipo II. Tales antagonistas de receptores de la presente invención inhibirán o evitarán la función replicativa u otras funciones esenciales de vpr mediante el bloqueo interactivo de la diana de vpr en células humanas.

Tal vez el antagonista de receptor de glucocorticoide mejor conocido es RU-486, o mifepristona. Aunque actúa como un antagonista de receptor progesterona, es un abortivo terapéutico de uso autorizado, en combinación con prostaglandinas, en Europa y en otros sitios. Se han descrito en la literatura muchos otros antagonistas de receptor de glucocorticoide como éste. Mientras que es posible que RU-486, u otros antagonistas de receptores de glucocorticoides o de otros receptores esteroides, sean tomados por un individuo que también esté infectado por VIH en ese momento, tal uso hubiera sido puramente coincidental, ya que no se ha sugerido hasta la presente invención que un antagonista de receptor de glucocorticoide, o de cualquier otro receptor esteroide, inhiba o evite de cualquier manera la replicación del VIH. Además, tal uso coincidental, con toda probabilidad habría involucrado un régimen de dosificación y curso del tratamiento totalmente diferentes al tratar la infección por VIH, y también habría incluido el uso concomitante de prostaglandinas, una combinación totalmente fuera del ámbito de la presente invención.

Persiste una necesidad urgente de identificar métodos de tratamiento de individuos infectados por VIH. Persiste una necesidad de identificar compuestos que eviten o inhiban la replicación del VIH en células infectadas y que, de est amanera, sean útiles en el tratamiento de individuos infectados por VIH.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se da a conocer el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos que comprenden uno o más antagonistas de receptores esteroides y un portador farmacéuticamente aceptable del mismo, bajo la condición de que dicho antagonista no sea un péptido o un ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del VIH.

De manera conveniente, durante su utilización, el antagonista de receptor esteroide, inhibe o evita la replicación de dicho VIH interfiriendo en las funciones de replicación u otras funciones esenciales del vpr expresado por dicho VIH, o mediante el bloqueo interactivo de la diana de vpr en las células de un individuo tratado con el medicamento, por el que vpr llevaría a cabo, de otro modo, actividades esenciales en la replicación del VIH.

En particular, la diana vpr comprende rip-1, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos, en dicha célula huésped, por la que se forma un complejo, especialmente un complejo de múltiples componentes, que media en las actividades de vpr que son esenciales para la replicación del VIH. La composición de acuerdo con la presente invención es, de esta manera, una composición inhibitoria o antagonista que, mediante su unión a rip-1, o mediante la prevención total o parcial del funcionamiento de rip-1, solo o en asociación con un receptor esteroide, especialmente un receptor de tipo GR, u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos, evita que vpr interaccione con su diana, especialmente con el complejo de múltiples componentes que incluye rip-1, evitando o interfiriendo de esta manera las actividades esenciales de vpr que son necesarias para la replicación del VIH. Por ejemplo, uno o más de estos receptores o componentes, actuando solos o juntos en diversas combinaciones para formar un complejo, pueden ocupar uno o más de los sitios de unión activos de vpr, o pueden causar un cambio conformacional crítico en vpr, o pueden, de algún otro modo, evitar la formación del complejo entre vpr, rip-1 y/o estos otros receptores y componentes, evitando de esta manera la translocación y señalización posterior.

De esta manera, se verá que las composiciones de la presente invención que bloquean interactivamente la diana vpr en células humanas bloquearán interactivamente cualquiera o todos de los siguientes: 1) vpr solo; 2) rip-1 solo; 3) receptores GR de tipo II solos; 4) complejos de cualquier combinación de 1), 2) o 3), en el receptor esteroide o en algún otro sitio que evite la formación del complejo; y 5) otros receptores esteroides, u otros componentes, o complejos de los mismos con cualquier combinación de 1), 2) o 3).

Convenientemente, la composición inhibe o evita las funciones replicativas, u otras funciones esenciales de vpr, mediante la unión, o bien por asociación con el vpr mismo, en lugar de asociarse con su ligando o diana celular, de manera que se evita que vpr interaccione con dicha diana, o que ésta actúe sobre vpr, o se evita que se transloque al núcleo, o que una vez translocado, sea señalizado. Se entenderá que tales composiciones no incluyen anticuerpos contra vpr mismo, ya que dichos complejos vpr-anticuerpo ya son conocidos en la técnica.

Preferiblemente, el antagonista de receptor esteroide bloquea interactivamente la diana vpr mediante la unión, o evitando total o parcialmente el funcionamiento de vpr, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides, o con otros componentes, o con uno o más receptores esteroides solos, de manera que se evita la translocación de vpr/rip-1 y/o del receptor esteroide o de otro complejo componente, desde el citosol de dichas células hasta los núcleos de las mismas, o la señalización de dicho complejo translocado, por la que vpr, de otra manera continuaría llevando a cabo las actividades esenciales para la replicación del VIH.

A este respecto, la composición puede ser un inhibidor o un antagonista que evite la translocación de vpr/rip-1 y/o de un receptor esteroide, o de otro complejo receptor, desde el citosol de dicha célula huésped humana hasta el núcleo de dicha célula, o la señalización de dicho complejo translocado, por la que vpr, de otra manera, continuaría llevando a cabo actividades esenciales para la replicación del VIH.

En una realización preferida, dicha diana de vpr comprende rip-1, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos, en dicha célula huésped, de manera que se forma un complejo que media en las actividades de vpr que son esenciales a la replicación del VIH.

A este respecto, la diana de vpr es rip-1 y/o un miembro de la superfamilia de los receptores de hormonas esteroides, en particular, de la familia de receptores de glucocorticoides (GR), y más en particular, un receptor GR de tipo II u otro componente, o uno o más receptores esteroides solos.

Convenientemente, dicho complejo es un complejo de múltiples componentes que comprende vpr, rip-1 y un receptor esteroide.

Se contempla que tal composición bloquee interactivamente el complejo diana que comprende rip-1/vpr y/o uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos, evitando de esta manera que vpr se una o interaccione con rip-1 y/o con dicho receptor esteroide o con otro componente. También se contempla que dicha composición evite la translocación de vpr/rip-1 y/o de receptor esteroide, o de otro complejo componente, desde el citosol hasta el núcleo de la célula infectada, por la que vpr lleva a cabo las diversas actividades que son esenciales para la replicación del VIH.

Preferiblemente, dicho receptor esteroide es un receptor GR de tipo II.

Preferiblemente, uno o más antagonistas de receptor esteroide son uno o más miembros seleccionados entre antagonistas de receptores de hormonas esteroides, antagonistas de receptores de glucocorticoides, y antagonistas de receptores de glucocorticoides (GR) de tipo II.

Preferiblemente, el antagonista de receptor esteroide es mifepristona, 11\beta-(4-dimetilaminofenil)-17\beta-hidroxi-17\alpha-(propil-1-inil)estra-4,9-dien-3-ona.

Preferiblemente, el medicamento comprende, adicionalmente, uno o más agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de individuos infectados por VIH.

Preferiblemente, los agentes terapéuticos son zidovudina (AZT), aciclovir, ganciclovir, foscarnet, dideoxinosina, dideoxicitidina, MK68, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, compuestos integrasa anti-VIH, compuestos TAT anti-VIH, compuestos REV anti-VIH, compuestos proteasa anti-VIH, compuestos transcriptasa inversa anti-VIH, señuelos REV VIH, señuelos TAT VIH, ribozimas y compuestos inmunológicos tales como vacunas y agentes de terapia génica.

En un aspecto adicional de la presente invención, se da a conocer un método de identificación de un compuesto que es capaz de inhibir o evitar la replicación de VIH mediante la interferencia con las funciones replicativas, u otras funciones esenciales, de vpr mediante el bloqueo interactivo de la diana vpr en células humanas, comprendiendo dicho método, en un cultivo de células humanas infectadas por VIH, la etapa de puesta en contacto de vpr y rip-1 y/o uno o más receptores esteroides, o de otros compuestos o de un fragmento de cualquiera de los mismos, uno o más, en presencia de dicho compuesto de ensayo, determinando el nivel de unión, y comparando dicho nivel con el nivel de unión cuando vpr y rip-1 y/o receptor esteroide, u otro componente, son puestos en contacto en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

En todavía un aspecto más de la invención, se da a conocer un método de identificación de un compuesto que sea un antagonista de receptor de glucocorticoide, y que sea capaz de inhibir o evitar la replicación del VIH al interferir con las funciones replicativas, u otras funciones esenciales, de vpr mediante el bloqueo interactivo de la diana vpr en células humanas, un complejo de rip-1, expresado por dicho VIH, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos; comprendiendo dicho método las etapas de (1) determinación de la actividad antagonista glucocorticoide de un compuesto de ensayo, y si dicho compuesto de ensayo exhibe actividad antagonista de glucocorticoide, (2) puesta en contacto de vpr y rip-1 y/o de un receptor esteroide, o de otro componente, o de un fragmento de cualquiera de los mismos, uno o más, en presencia de dicho compuesto de ensayo, determinando el nivel de unión, y comparando dicho nivel con el nivel de unión cuando vpr y rip-1 y/o un receptor esteroide, u otro componente, son puestos en contacto en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

Preferiblemente, la actividad antagonista de glucocorticoide se mide mediante la determinación del efecto de dicho compuesto de ensayo sobre las tirosina aminotransferasas. Esta etapa puede llevarse a cabo utilizando el método de Granner y Tompkins (1970) Meth. Enzymol. 15, 633.

Convenientemente, el método comprende también la etapa adicional en la que se determina que dicho compuesto de ensayo ha inhibido o detenido sustancialmente la formación de dicho complejo, el cual comprende vpr/rip-1 y/o un receptor esteroide u otro componente, por el bloqueo interactivo de dicho complejo, se determina el nivel de p24 producido en dichas células infectadas por VIH, las cuales reciben dicho compuesto de ensayo, y se compara dicho nivel con el nivel de p24 producido por células infectadas por VIH con eliminación de vpr en dicho VIH, así como con el nivel de p24 producido en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

En una realización preferida, el método comprende la etapa adicional de realizar un ensayo que sea capaz de determinar la colocalización en el núcleo de vpr y rip-1 y/o de un receptor esteroide, o de otro componente, y de determinar el nivel de dicha colocalización en presencia de dicho compuesto de ensayo, y de compararlo con el nivel de colocalización en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se da a conocer un kit para identificar compuestos que bloqueen interactivamente la formación o funcionamiento de un complejo que comprende vpr y rip-1 y/o uno o más receptores esteroides u otro componente, que comprende un primer recipiente que comprende tirosina aminotransferasa, un segundo recipiente que comprende proteína vpr y un tercer recipiente que comprende rip-1 o un fragmento del mismo. En una realización preferida, la lista comprende adicionalmente un cuarto recipiente que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína vpr o a rip-1.

La presente invención involucra la utilización de rip-1, la cual es una proteína humana esencialmente pura con un peso molecular aparente en el intervalo de 40-43 KD, presente en el citoplasma de células humanas, que se une a vpr solo o en asociación con uno o más receptores esteroides, o con otros componentes, o a uno o más receptores esteroides solos, y que es transportado desde el citoplasma hasta el núcleo cuando se encuentra unido a vpr, solo o en asociación con un receptor esteroide, o con otro componente, formando un complejo; o con un fragmento del mismo. La utilización puede ser como sonda para identificar o aislar vpr y rip-1, o análogos o mutaciones del mismo; para el diagnóstico del VIH; o para la investigación, especialmente para el descubrimiento de compuestos que bloqueen interactivamente vpr. Rip-1 puede ser producido por el método que comprende una etapa de cultivo de células huésped que comprenden un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica rip-1, o un fragmento del mismo, y el aislamiento de la proteína o fragmento producido en las células del cultivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención nace del descubrimiento de que la proteína reguladora R del VIH, denominada en este documento "vpr", se une a una proteína humana que se encuentra en el citoplasma de las células humanas, y que tiene un peso molecular aparente comprendido en el intervalo 40-43 KD. Esta unión o interacción ocurre por sí sola, o más en particular, en presencia de uno o más receptores esteroides, especialmente glucocorticoides, más especialmente receptores GR de tipo II, u otros componentes. Pueden estar involucrados uno o más receptores esteroides solos. Se ha descubierto que cuando vpr se une o interacciona con esta proteína humana, sola o en asociación con un receptor esteroide o con otro componente, la proteína forma un complejo de múltiples componentes, habitualmente un complejo de tres partes, que es transportado desde el citoplasma hasta el núcleo. De esta manera, la proteína humana actúa como un receptor, interaccionando o uniéndose a proteína para vpr, y se denomina en este documento "rip-1".

Acción de los antagonistas de receptores de glucocorticoides

En su uso en este documento, el término "rip-1" se refiere a la proteína humana que tiene un peso molecular aparente comprendido en el intervalo de 40-43 KD, que se encuentra en el citoplasma de las células humanas, que se une a vpr y que es transportada desde el citoplasma hasta el núcleo cuando está unida a vpr, solo o en asociación con un receptor esteroide. El rip-1 puede estar colocalizado con el factor transcripcional de las células T y células B NF x B. Se contempla que rip-1 actúe conjuntamente con un miembro de la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, y en particular, conjuntamente con un miembro de la familia de receptores de glucocorticoides (GR), y más en particular, con una molécula receptora GR de tipo II.

Debido a que rip-1 en células humanas aparentemente actúa conjuntamente con un miembro de la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, especialmente con la familia de receptores de glucocorticoides, esto puede aclarar el modo en el que interviene la unión de vpr a rip-1 en la replicación del VIH y, de esta manera, en la patogénesis. De acuerdo con lo anterior, el bloqueo interactivo de rip-1, o de un complejo que incluya rip-1, inactiva efectivamente vpr y evita que convierta las células en mejores huéspedes para la replicación del VIH. La identificación de los compuestos que pueden inhibir los efectos de vpr y, de esta manera, inhibir la replicación del VIH en células infectadas por VIH se basa en el descubrimiento de que muchas de las acciones del vpr son análogas a aquéllas de un glucocorticoide. El mecanismo de acción de vpr permite la orientación de dicho mecanismo para una intervención activa, y de esta manera permite el diseño racional y la selección de compuestos anti-VIH.

Las características del tráfico celular que se han observado en rip-1 son consistentes con que rip-1 funcione en asociación con la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, o incluso formando parte de esta superfamilia. Los receptores de glucocorticoides y mineralocorticoides son ejemplos de miembros de esta familia de proteínas de los que se conoce que se translocan desde el citoplasma hasta el núcleo al exponerse a su ligando. Se han descrito dos tipos de receptores de glucocorticoides. Los receptores de tipo I se concentran en el núcleo, incluso cuando no hay ligando presente. Los receptores de tipo II se concentran específicamente en el citoplasma en ausencia de ligando, y sólo se translocan al núcleo en presencia de la hormona estimulante apropiada. Los dos tipos de receptor de glucocorticoide tienen una elevada afinidad por sus ligandos específicos, y se considera que funcionan a través de las mismas rutas de transducción. La diferencia funcional principal entre estas dos clases de receptores es que los receptores de tipo II son activados por sus ligandos de tal manera que sólo transactivan sus protooncogenes celulares diana en algunas células, pero no en todas. Tal especificidad celular no se observa en receptores de tipo I. Estas observaciones son consistentes con que rip-1 esté íntimamente asociado funcionalmente, o que de hecho sea una molécula GR de tipo II.

Los receptores de glucocorticoides tienen una serie de roles. Se ha demostrado que los receptores de glucocorticoides actúan como potentes transactivadores. También se ha demostrado que los receptores de glucocorticoides operan a través de la represión de la expresión génica de determinados marcos de lectura abierta. La represión mediada por receptores de glucocorticoides se consigue por competición por los sitios en los que la molécula de ADN estaría, de otro modo, unida por transactivadores. Un ejemplo de lo último es la relación específica bilateral descrita para los receptores de glucocorticoides y c-Jun. En este caso, el receptor de glucocorticoide reprime la actividad c-Jun, y lo contrario también se observa. El éster de forbol PMA también se ha dado a conocer que activa la transcripción del promotor AP-1/c-Jun. Además, se ha demostrado que los glucocorticoides contrarrestan la actividad de linfoquinas, al observar la inhibición de la proliferación de una diversidad de líneas celulares. Este mecanismo se considera que afecta los mecanismos inmunorreguladores en áreas tal como la activación de las células T, la cual está en parte mediada por la actividad Jun/AP-1, y las linfoquinas resultantes. La observación del cese en la proliferación en diferentes líneas celulares transfectadas con vpr se considera explicada por una ruta mediada por receptores de glucocorticoides, en la que rip-1, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides, actúa conectando actividades virales y celulares.

También es importante remarcar que los receptores glucocorticoides funcionan como parte de un complejo multimérico mayor. Estos grupos de proteína de 330 KD comprenden un dímero de proteína de shock térmico 90, una unidad de proteína de shock térmico 56, y algunas veces por una unidad de proteína de shock térmico 70 (HSP 70), además de la molécula receptora glucocorticoide específica; y se ha observado rip-1 asociado con este HSP 70. El polipéptido receptor de glucocorticoide mismo está habitualmente compuesto de tres dominios funcionales dispuestos en una configuración lineal; un dominio de unión a hormona, un dominio de unión a ADN, y un tercer dominio, el cual se ha demostrado que interacciona con proteínas celulares adicionales, definiendo las características del tráfico de este producto génico. Se contempla que el complejo que comprende rip-1, vpr, y un receptor esteroide u otros componentes, puede incluir como ejemplo de los otros componentes, las unidades de proteína de shock térmico que se han descrito anteriormente.

Rip-1 es la primera proteína que se asocia con vpr que se ha identificado de acuerdo con la presente invención, pero es posible que otros productos génicos puedan interaccionar con vpr directamente, o indirectamente a través de asociaciones mediadas por rip-1. También se ha descubierto de acuerdo con la presente invención, que uno o más receptores esteroides, especialmente los receptores de glucocorticoides, y GR de tipo II, pueden formar un complejo de múltiples componentes con rip-1 y vpr, o son funcionalmente interactivos o están combinados con los mismos, de manera que vpr se transloca desde el citoplasma hasta el núcleo de la célula huésped humana, y ahí desempeña un papel esencial en la replicación del VIH.

La relación entre vpr y las proteínas de shock térmico relacionadas con receptores de glucocorticoides que se considera que existe de acuerdo con la presente invención, dicta que rip-1 se considere íntimamente asociado funcionalmente con la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, o que de hecho sea un miembro de dicha superfamilia. Además, esto dictará qué funciones celulares responden a efectos de desregulación celular causados por vpr, los cuales se ha observado que son inducidos por el mismo.

En su utilización en este documento, los términos "antagonista de receptor esteroide" y "antagonista de receptor de glucocorticoide" significan, simplemente, cualquier compuesto que pueda unirse al receptor esteroide, especialmente glucocorticoide, y más especialmente receptor GR de tipo II, y que, por lo tanto, pueda bloquear interactivamente cualquier receptor esteroide, especialmente receptor de glucocorticoide, que haya formado un complejo, o haya interactuado funcionalmente, con vpr, solo o en asociación con rip-1. También se contempla que tal esteroide, especialmente un compuesto antagonista de receptor de glucocorticoide, también bloquee interactivamente rip-1, solo o en asociación con un receptor esteroide o con otro componente. Tales compuestos antagonistas bloquearán interactivamente un complejo de múltiples componentes de vpr, rip-1 y/o receptor esteroide u otro componente. En este contexto, el término "antagonista" se refiere al bloqueo de rip-1 y/o receptor esteroide, u otro componente o complejo, por el compuesto, evitando de esta manera que el ligando natural, vpr, se una al mismo, o de otro modo evitando el funcionamiento natural de vpr, creando de esta manera un antagonismo mediante la prevención de la acción del agonista. Sin embargo, no es necesario que el compuesto sea, en rigor, un antagonista esteroide o glucocorticoide, es decir, que tenga una actividad antiesteroidal o antiglucocorticoide significativas. De esta manera, tal compuesto puede ser un agonista o antagonista, o ambos; sin embargo, se prefiere seleccionar compuestos que tengan actividad antiglucocorticoide, es decir, que se unan al receptor de glucocorticoide y/o rip-1, pero que no tengan actividad agonista glucocorticoide significativa. Tales compuestos bloquearán interactivamente rip-1 y/o el receptor o receptores esteroides, formando un complejo con los mismos, pero no producirán, en los casos en los que tales compuestos también se unan a receptores de glucocorticoides en las células del individuo bajo tratamiento por la infección por VIH, los efectos y actividades de glucocorticoides comparativamente activos en pacientes, lo cual puede ser no deseable durante períodos extendidos de tiempo. Para tales agonistas, el resultado final dependerá de la dosis inicial, así como de la cantidad de compuesto que esté unido a rip-1 y/o al receptor o receptores esteroides que forman un complejo con el mismo, además del grado de unión a los receptores de glucocorticoides y la actividad agonista resultante en el individuo involucrado. De esta manera, está todavía dentro del ámbito de la presente invención la utilización de agonistas glucocorticoides, aunque esto no es preferente, y la elección del tipo, es decir, agonista o antagonista de receptor de glucocorticoide, así como del compuesto específico, puede realizarse de un modo sencillo mediante la utilización de procedimientos de evaluación bien conocidos en la técnica y que se describen en este documento.

Es posible identificar compuestos con actividad antiglucocorticoide determinando el efecto de un compuesto candidato sobre el enzima tirosina aminotransferasa. El sistema de ensayo se basa en la medición de la actividad del enzima hepático tirosina aminotransferasa (TAT) en cultivos de células de hepatoma de rata (RHC). El enzima cataliza la primera etapa en el metabolismo de la tirosina y puede inducirse mediante glucocorticoides en hígado y en células de hepatoma. La actividad se mide fácilmente en extractos crudos. TAT convierte el grupo amino de la tirosina a ácido 2-oxoglutárico, y también se forma p-hidroxifenilpiruvato, el cual se convierte al más estable p-hidroxibenzaldehído en solución alcalina. Su línea de medición de adsorción está en los 331 nm. Puede encontrarse más información sobre este procedimiento en Granner y Tomkins (1970) Meth. Enzymol. 15, 633.

De acuerdo con la presente invención, un grupo preferente de antagonistas de receptores de glucocorticoides son aquéllos a los que pertenece la mifepristona, mejor conocida como RU-486. Este compuesto, 11\beta-(4-dimetilaminofenil)-17\beta-hidroxi-17\alpha-(propil-1-inil)estra-4,9-dien-3-ona, es un buen antagonista glucocorticoide, el cual tiene también actividad antiprogestina. Pueden encontrarse información adicional sobre este compuesto y compuestos relacionados en Agarwal, M.K. et al. "Glucocorticoid antagonists" FEBS LETTERS 217, 221-226 (1987). Se ha realizado trabajo extensivo a lo largo de los años en la síntesis y ensayo de antagonistas glucocorticoides que pertenecen a este grupo, y la literatura publicada es una guía abundante para la selección de compuestos candidatos dentro del ámbito de la presente invención. La literatura de patentes por sí sola es sustancial. De esta manera, se hace referencia a las siguientes patentes U.S.: 4.296.206; 4.386.085; 4.447.424; 4.477.445; 4.519.946; 4.540.686; 4.547.493; 4.634.695; 4.634.696; 4.753.932; 4.774.236; 4.814.327; 4.829.060; 4.861.763; 4.912.097; 4.943.566; 4.954.490; 4.978.657; 5.006.518; 5.043.332;
5.064.822; 5.073.548; 5.089.488; 5.089.635; 5.093.507; 5.095.010; 5.095.129; 5.132.299; 5.166.146; y 5.276.023. El análisis de las patentes citadas anteriormente y la literatura técnica relacionada revela que el sustituyente en posición 11, y en particular el tamaño de tal sustituyente, desempeña un papel clave en la determinación de la actividad antiglucocorticoide, aunque el carácter del anillo A también es importante. También se remarca que una cadena lateral de 17-hidroxipropenil reduce generalmente la actividad antiglucocorticoidal en comparación con los compuestos que contiene cadena lateral de 17-propinil, y que generalmente los grupos 9\alpha,10\alpha- CH_{2} reducen la actividad antiglucocorticoidal.

Acción de vpr

El virus de la inmunodeficiencia humana se considera un retrovirus complejo debido a que el genoma del VIH codifica seis genes reguladores (tat, rev, vif, vpr, vpu, nef), además de los marcos de lectura abierta comunes gag, pol y env, los cuales se encuentran en todos los retrovirus. La complejidad del VIH y los lentivirus relacionados, puede atribuirse, además, a los patrones intrincados de regulación de la expresión génica observados durante el ciclo vital del virus. Todos estos mecanismos regulatorios se consiguen mediante la interacción de las proteínas codificadas en el virus con factores diferenciados de la célula huésped.

Se requieren muchas proteínas celulares para la expresión génica del VIH durante el proceso infectivo, por ejemplo, el gen tat del VIH se ha demostrado que es un gen regulador indispensable, responsable de la transactivación del LTR viral. El gen vpr del VIH-1 codifica un poliéptido de 15 KD. Vpr tiene una secuencia nucleotídica altamente conservada entre los diferentes lentivirus de primate. Todos los VIH-1 y VIH-2, así como todos los aislados de VIS patogénico tiene un gen vpr. Vpr tiene varias actividades involucradas en la infección por VIH. Ver las solicitudes PCT nº de serie PCT/US 94/02191 (Referencia nº 63); solicitud U.S. nº serie 08/019.601 (Referencia nº 3); y solicitud U.S. nº serie 08/167.608 (Referencia nº 8).

En particular, vpr se considera que potencia la infección retroviral causando cambios en las células que hacen que sean mejores huéspedes para la replicación del VIH, todos los cuales se han explicado en detalle anteriormente en la sección que describe la técnica anterior.

Acción de rip-1

El método de tratamiento de individuos expuestos o infectados por VIH con la composición producida mediante la presente invención se basa en la administración de compuestos que bloquean interactivamente, es decir, evitan o inhiben la formación o funcionamiento de vpr/rip-1 y/o complejo de receptor o receptores esteroides y, más en particular, su translocación desde el citoplasma, es decir, desde el citosol, hasta el núcleo. De esta manera, un aspecto importante de la presente invención es un procedimiento para la obtención de rip-1 humano esencialmente puro. Como se ha mencionado anteriormente, rip-1 tiene un peso molecular aparente comprendido en el intervalo 40-43 KD y se encuentra en el citoplasma de las células humanas, y no ligado, en forma de proteína citosólica. Cuando está unido a vpr, la proteína rip-1 forma un complejo con vpr y el complejo se transloca desde el citoplasma hasta el núcleo. Rip-1 puede aislarse de células humanas pasando una preparación de células humanas a través de una columna de vpr inmovilizado bajo condiciones que permitan la unión vpr/rip-1, y a continuación, cambiando las condiciones a unas que no favorezcan tal unión. El rip-1 liberado puede recogerse en forma esencialmente pura. Puede conseguirse una purificación adicional utilizando medios cromatográficos de rutina.

Puede utilizarse el siguiente procedimiento para purificar rip-1. Se obtienen extractos celulares de células T primarias y monocitos, así como células sanguíneas y macrófagos periféricos, mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Los extractos celulares se separan por cromatografía de afinidad. Brevemente, el vpr producido eucarióticamente es inmovilizado sobre una matriz sólida de soporte a través de uno o más enlaces covalentes. Entre las matrices sólidas de soporte se incluyen agarosa, poliacrilamida-agarosa, vidrio de tamaño de poro controlado, y otros materiales similares conocidos por los expertos en la materia. Un experto en la materia apreciará fácilmente las técnicas estándar involucradas en la unión de vpr a la matriz, así como las técnicas involucradas en la activación de la misma. Puede utilizarse una molécula espaciadora para alejar vpr del esqueleto de la matriz, con el fin de permitir que vpr se una más libremente a las proteínas del extracto celular. Un experto en la materia apreciará fácilmente la diversidad de moléculas espaciadoras de posible utilización.

Se extiende una capa del extracto celular sobre la columna de afinidad de vpr mediante métodos estándar conocidos por los expertos en la materia. Se seleccionan tampones, condiciones de lavado y de elución apropiados, los cuales son conocidos por los expertos en la materia. El eluido resultante puede purificarse adicionalmente hasta la homogeneidad mediante técnicas tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HLPC) u otros métodos similares conocidos por los expertos en la materia.

El rip-1 ha sido purificado hasta una pureza de aproximadamente 95% mediante una columna de afinidad de vpr utilizando esta técnica de purificación. Dicha proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 40-43 KD cuando se separa mediante SDS-PAGE reductor. La proteína ha sido detectada en líneas celulares TE 671 y RD de radbdomiosarcoma; en líneas celulares D17 y HOS de osteosarcoma; en líneas celulares HTB14, U373 y HBT10 de glioblastoma; así como en líneas Supt-1 y H9 de células T, y líneas U937, THP-1, KG-1 y HL-60 de monocitos/macrófagos, así como en células primarias. Pueden encontrarse información adicional en el Ejemplo 6, posteriormente.

Las técnicas para el clonado de una proteína son ampliamente conocidas por los expertos en la materia. Brevemente, se secuencia una preparación pura de la proteína celular de 41 KD que se une a vpr (rip-1), mediante técnicas de secuenciación N-terminal convencionales, conocidas por los expertos en la materia. Se diseña un juego de sondas oligonucleotídicas que codifican el rip-1, mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Este juego de sondas se utiliza para explorar una biblioteca de ADN_{c}humano mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se seleccionan las placas positivas y se secuencian mediante métodos tal como la secuenciación dideoxi para toda la secuencia nucleotídica del rip-1.

Alternativamente, puede inyectarse una preparación pura de rip-1 en un mamífero, tal como un conejo o ratón, resultando en la producción de un antisuero policlonal. Tales procedimientos de inmunización son bien conocidos por los expertos en la materia. Además, pueden aislarse células del plasma (células B productoras de anticuerpo) del mamífero inyectado, y fusionarse con células de mieloma para producir hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, pueden producirse anticuerpos recombinantes mediante una diversidad de métodos; y tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. El antisuero policlonal puede ser utilizado para explorar la biblioteca de expresión de ADN_{c} humano, de manera que las células que expresen rip-1 sean identificadas con el antisuero. Se seleccionan los clones positivos y el ADN se aísla y secuencia mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

Una vez se conoce la secuencia nucleotídica completa de rip-1, puede incorporarse la secuencia, o cualquier porción de la misma, en un vector plásmido o cualquier otro vector capaz de expresar rip-1. Además, pueden transformarse células de mamífero, así como células bacterianas, con el constructo plásmido que contiene la secuencia, o con derivados del mismo, que codifican el rip-1. Dichas células transformadas pueden producir rip-1 intracelular o extracelularmente. Además, también pueden producirse los oligonucleótidos que corresponden con las partes codificante o antisentido de rip-1. Estos oligonucleótidos pueden comprender entre 10 y 5.000 nucleótidos, preferiblemente entre 10 y 500 nucleótidos, con la mayor preferencia entre 10 y 100 nucleótidos.

La presente invención involucra, de esta manera, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica rip-1 o un fragmento del mismo; un vector de expresión que comprende tal secuencia nucleotídica; una célula huésped que comprende tal vector de expresión; un método de producción de rip-1 o un fragmento del mismo que comprende la etapa de cultivo de tal célula huésped.

Rip-1 puede ser producido mediante métodos rutinarios utilizando productos de partida fácilmente disponibles, como se ha descrito anteriormente. La producción de una secuencia de ADN adecuada que codifica la proteína deseada permita la producción de la proteína utilizando técnicas recombinantes conocidas actualmente en la técnica. La secuencia de ADN puede obtenerse también a partir de otras fuentes de ADN del VIH, o puede prepararse químicamente utilizando una secuencia nucleotídica de síntesis. Cuando se prepare el ADN codificante de manera sintética, pueden aprovecharse las preferencias de codón conocidas en el huésped donde se va a expresar el ADN.

Un experto normalmente versado en la técnica, utilizando técnicas bien conocidas, puede obtener una molécula de ADN que codifica rip-1 e insertar esa molécula de ADN en un vector de expresión comercialmente disponible para su utilización en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido comercialmente disponible pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para la producción en E. coli. El plásmido comercialmente disponible pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para la producción en cepas S. cerevisiae de levadura. El sistema de expresión completo de baculovirus comercialmente disponible MaxBac^{TM} (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para la producción en células de insecto. El plásmido comercialmente disponible pcADN I (Inntrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para la producción en células de mamífero, tal como células ováricas de hámster chino. Un experto normalmente versado en la técnica puede utilizar estos sistemas de vectores de expresión comerciales, u otros, con el fin de producir rip-1 utilizando técnicas de rutina y productos de partida fácilmente disponibles.

Un experto normalmente versado en la técnica puede utilizar otros vectores y sistemas de expresión comercialmente disponibles, o producir vectores utilizando métodos bien conocidos y productos de partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control necesarias, tal como promotores y señales de poliadenilación, y preferiblemente potenciadores, están fácilmente disponibles y se conocen en la técnica para una diversidad de huéspedes. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press (1989). De esta manera, las proteínas deseadas pueden prepararse en sistemas procarióticos y eucarióticos, resultando en un espectro de formas procesadas de la proteína.

El sistema procariótico más habitualmente utilizado sigue siendo E. coli, aunque otros sistemas, tal como B. subtilis y Pseudomonas también resultan útiles. Entre las secuencias de control adecuadas para los sistemas procarióticos se incluyen promotores constitutivos e inducibles, incluyendo el promotor lac, el promotor trp, promotores híbridos, tal como el promotor tac, y el promotor del fago lambda P1. En general, pueden producirse proteínas foráneas en estos huéspedes, como proteínas de fusión o como proteínas maduras. Cuando se producen las secuencias deseadas como proteínas maduras, la secuencia producida puede estar precedida por una metionina, la cual no es eliminada necesariamente con eficiencia. De acuerdo con esto, los péptidos y proteínas que se reivindican en este documento pueden estar antecedidos por una metionina N-terminal cuando son producidas en bacterias. Además, pueden prepararse constructos en los que la secuencia codificante para el péptido viene precedida por un péptido señal operable que resulta en la secreción de la proteína. Cuando se produce en huéspedes procarióticos de esta manera, se elimina la secuencia de señal con la secreción.

En la actualidad también están disponibles una amplia variedad de huéspedes eucarióticos para la producción de proteínas recombinantes foráneas. Como en las bacterias, los huéspedes eucarióticos pueden transformarse con sistemas de expresión que producen la proteína deseada de manera directa, pero más habitualmente se proporcionan secuencias señal para llevar a cabo la secreción de la proteína. Los sistemas eucarióticos tienen la ventaja adicional de que son capaces de procesar intrones, los cuales pueden existir en las secuencias genómicas que codifican proteínas en organismos superiores. Los sistemas eucarióticos también proporcionan una variedad de mecanismos de procesamiento que resultan, por ejemplo, en la glicosilación, amidación carboxi-terminal, oxidación o derivación de ciertos residuos aminoacídicos, el control conformacional, y otros.

Entre los sistemas eucarióticos habitualmente utilizados se incluyen, pero sin limitación, levaduras, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero, células de ave, y células de plantas superiores. Los promotores adecuados que son compatibles y operables para su utilización en cada uno de estos tipos de huésped están disponibles, así como las secuencias de terminación y los potenciadores, como por ejemplo el promotor poliédrico de baculovirus. Como se ha mencionado anteriormente, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, en sistemas de mamífero, el promotor metalotioneína de ratón puede inducirse mediante la adición de iones de metales pesados.

Los detalles de la construcción de sistemas de expresión adecuados para los huéspedes deseados son conocidos por los expertos en la materia. Para la producción recombinante de la proteína, el ADN que lo codifica está adecuadamente ligado en el vector de expresión de elección y es posteriormente utilizado para transformar el huésped compatible, el cual a continuación se cultiva y mantiene bajo condiciones en las que tenga lugar la expresión del gen foráneo. La proteína de la presente invención, producida de esta manera, se recupera del cultivo mediante lisado de las células, o se recupera del medio de cultivo, como resulte más apropiado y conocido por los expertos en la materia.

Una persona normalmente versada en la materia puede, utilizando técnicas conocidas, aislar el rip-1 o fragmentos del mismo, producidos utilizando tales sistemas de expresión.

Además de aislar rip-1 de fuentes naturales y de producir rip-1, o fragmentos del mismo, mediante técnicas recombinantes, los sintetizadores automatizados de aminoácidos puede ser utilizados también para producir rip-1, o fragmentos del mismo. Debe remarcarse también que si las proteínas de la presente invención se fabrican sintéticamente, también puede realizarse sustitución de aminoácidos que no están codificados en el gen. Entre los residuos alternativos se incluyen, por ejemplo, los aminoácidos \omega de fórmula H_{2}N(CH_{2})_{n}COOH en la que n es 2-6. Estos son aminoácidos neutros, no polares, como son sarcosina (Sar), t-butilalanina (t-BuAla), t-butilglicina (t-BuGly), N-metil isoleucina (N-MeIle), y norleucina (Nleu). La fenilglicina, por ejemplo, puede ser sustituida por Trp, Tyr o Phe, un aminoácido aromático neutro; citrulina (Cit) y metionina sulfóxido (MSO) son polares pero neutros, ciclohexil alanina (Cha) es neutro y no polar, el ácido cisteico (Cya) es ácido, y la ornitina (Orn) es básica. Las propiedades de conformación de los residuos prolina pueden obtenerse si se sustituye uno o más de los mismos por hidroxiprolina (Hyp).

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que bloquea interactivamente la diana vpr en células humanas, comprendiendo preferiblemente uno o más antagonistas de hormonas esteroideas, más preferiblemente antagonistas de receptores de glucocorticoides, especialmente antagonistas de receptores de glucocorticoides de tipo II, los cuales mediante la unión a rip-1, o a un fragmento del mismo, y/o un receptor esteroide u otro componente, o uno o más receptores esteroides solos, evitan que vpr forme un complejo con rip-1, o interaccione funcionalmente con el mismo, y/o con un receptor esteroide u otro componente, y en particular evita la translocación de vpr/rip-1 y/o de complejo receptor de esteroide desde el citosol hasta el núcleo de la célula infectada, donde vpr lleva a cabo sus diversas actividades esenciales para la replicación del VIH.

La composición farmacéutica que comprende la composición inhibitoria o antagonista, especialmente un antagonista de receptor de glucocorticoide que bloquee interactivamente rip-1 o un fragmento del mismo, y/o un receptor esteroide u otro componente, y un portador farmacéuticamente aceptable o diluyente, puede ser formulado por una persona normalmente versada en la técnica, utilizando composiciones seleccionadas según el modo de administración elegido. Se describen portadores farmacéuticos adecuados en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

Para la administración parenteral, la composición inhibitoria o antagonista, especialmente un antagonista de receptor de glucocorticoide que bloquee interactivamente rip-1 o un fragmento del mismo, y/o un receptor esteroide u otro componente, puede ser, por ejemplo, formulada como una solución, suspensión, emulsión o polvos liofilizados, en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Son ejemplos de tales vehículos el agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y albúmina de suero humana al 5%. También pueden utilizarse liposomas y vehículos no acuosos, tal como aceites fijos. El vehículo o polvos liofilizados pueden contener aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas de uso habitual. Por ejemplo, se prepara una solución parenteral adecuada para su administración por inyección disolviendo 1,5% en peso de ingrediente activo en solución de cloruro sódico al 0,9%.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse como dosis únicas o en dosis múltiples. Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente invención pueden administrarse como agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los tratamientos de la presente invención pueden combinarse con terapias convencionales, las cuales pueden administrarse secuencialmente o simultáneamente. En particular, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de una composición inhibitoria o antagonista, especialmente un antagonista de receptor de glucocorticoide que bloquee interactivamente rip-1 o un fragmento del mismo, y/o un receptor esteroide u otro componente, junto con uno o más agentes terapéuticos de utilidad en el tratamiento de individuos infectados por VIH, seleccionados del grupo consistente en zidovudina (AZT), aciclovir, ganciclovir, foscarnet, dideoxinosina, dideoxicitidina, MK68, interferón alfa-2a, e interferón alfa-2b, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de una composición inhibitoria o antagonista, especialmente un antagonista de receptor de glucocorticoide que bloquee interactivamente rip-1 o un fragmento del mismo, y/o un receptor esteroide u otro componente, junto con uno o más agentes terapéuticos de utilidad en el tratamiento de individuos infectados por VIH, seleccionado del grupo consistente en compuestos integrasa anti-VIH, compuestos TAT anti-VIH, compuestos REV anti-VIH, compuestos proteasa anti-VIH, compuestos transcriptasa inversa anti-VIH, señuelos REV VIH, señuelos TAT VIH, ribozimas y compuestos inmunológicos tal como vacunas y agentes de terapia génica.

Las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden administrarse por cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. La dosis administrada varía dependiendo de factores tales como: características farmacodinámicas; su modo y ruta de administración; edad, estado de salud, y peso del recipiente; naturaleza y grado de los síntomas; tipo de tratamiento concurrente; y frecuencia del tratamiento. Habitualmente, una dosis diaria del ingrediente activo puede ser de, aproximadamente, 1 \mug a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Habitualmente, 0,01 a 50, y preferiblemente 0,1 a 20 miligramos por kilogramo por día administrados en dosis divididas 1 a 6 veces al día, o en forma de liberación sostenida, es efectiva para obtener los resultados deseados. Se advertirá que el tratamiento durante períodos extendidos de tiempo es necesario para el tratamiento efectivo del VIH.

Identificación de compuestos que se unen a rip-1

La presente invención también se refiere a un método para identificar los compuestos que inhiben o evitan la replicación del VIH al interferir con la función replicativa u otras funciones esenciales de vpr mediante la unión interactiva con la diana vpr en células humanas, con rip-1 y/o un receptor esteroide u otro componente, dichos compuestos comprenden especialmente antagonistas de receptores de glucocorticoides (GR), los cuales mediante la unión, o evitando total o parcialmente el funcionamiento de rip-1, solo o en asociación con un receptor esteroide, especialmente un receptor de tipo GR, evitan o interfieren con la unión o la combinación de vpr con rip-1, y/o con un receptor esteroide u otro componente para formar un complejo, el cual a continuación es translocado al núcleo. Este método de identificar compuestos que inhiben la unión de vpr a rip-1 y/o a un receptor esteroide u otro componente, comprende la etapa de (1) determinar la actividad antagonista de glucocorticoide de un compuesto de ensayo por determinación del efecto de dicho compuesto de ensayo sobre la tirosina aminotransferasa de acuerdo con el método de Granner y Tompkins (1970) Meth. Enzymol. 15, 633. Si dicho compuesto de ensayo exhibe actividad antagonista glucocorticoide, podría bloquear interactivamente el receptor esteroide y/o el rip-1. Sin embargo, una segunda etapa puede llevarse a cabo entonces, comprendiendo (2) la puesta en contacto de vpr y rip-1, o un fragmento del mismo, en presencia de dicho compuesto de ensayo, determinando el nivel de unión y comparando ese nivel con el nivel de unión que tiene lugar cuando vpr y rip-1 se ponen en contacto en ausencia de dicho compuesto de ensayo. Los compuestos que se identifican de esta manera, interfieren con la unión de vpr con rip-1 y/o con un receptor esteroide u otro componente, y son, de esta manera, útiles para impedir la replicación del VIH; por lo tanto, tales compuestos serán útiles como agentes terapéuticos anti-VIH, solos o como parte de un régimen farmacológico anti-VIH de múltiples facetas que incluya otra terapéutica.

Para poner en práctica estos aspectos de la invención, una vez se ha encontrado que un compuesto de ensayo es un antagonista de receptor de glucocorticoide, se ponen en contacto la proteína vpr y rip-1 en presencia de dicho compuesto de ensayo. Se determina el nivel de unión de las proteínas. El nivel de unión resultante se compara con el nivel conocido de unión cuando ambas proteínas entran en contacto entre sí en ausencia de compuesto de ensayo. En ausencia de un compuesto que interfiera con la unión, las dos proteínas se unirán. Como control, se ponen en contacto la proteína vpr y rip-1 en ausencia de compuesto de ensayo.

Se da a conocer un compuesto de ensayo, preferiblemente en solución. Pueden utilizarse diluciones en serie de compuestos de ensayo en una serie de ensayos. El compuesto de ensayo puede añadirse a concentraciones entre 0,01 \muM y 1 M. Un rango preferido de concentraciones finales de compuesto de ensayo está entre 10 \muM y 100 \muM.

Se describe la producción de proteína vpr en las solicitudes de patente U.S. citadas anteriormente. Un rango preferido de concentración del vpr utilizado está entre aproximadamente 1 \mug/ml y 1 mg/ml. Una concentración preferida del vpr es, aproximadamente, 50 \mug/ml.

El rip-1 puede producirse mediante medios rutinarios utilizando productos de partida fácilmente disponibles, siguiendo las enseñanzas que se describen en el presente documento. Un rango preferido de concentración del rip-1 utilizado está entre, aproximadamente, 1 \mug/ml y 1 mg/ml. Una concentración preferida del rip-1 es de, aproximadamente, 50 \mug/ml.

Los medios de detectar si vpr y rip-1 están unidos, o si la unión ha sido inhibida, son rutinarios e incluyen ensayos enzimáticos y ensayos ELISA. Una persona normalmente versada en la técnica puede detectar la unión de proteínas utilizando métodos bien conocidos. Una persona normalmente versada en la técnica puede apreciar fácilmente la multitud de maneras de poner en práctica un ensayo de unión para detectar compuestos que modularán la unión de vpr a rip-1. Por ejemplo, los anticuerpos son de utilidad en inmunoensayos que detectan o cuantifican la proteína vpr que se une a rip-1. El inmunoensayo comprende, típicamente, la incubación de proteína vpr y rip-1 para permitir la unión proteína-proteína en presencia de un anticuerpo de alta afinidad marcado detectablemente capaz de unirse selectivamente a la proteína vpr o a rip-1, y de detectar el anticuerpo marcado que está unido a la proteína. Se describen diversos procedimientos de inmunoensayo en Immunoassays for the 80's, A. Voller et al., Eds., University Park, 1981.

En este aspecto de la invención, el anticuerpo o la proteína vpr o rip-1 pueden añadirse a nitrocelulosa, u otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar proteínas. El soporte puede ser lavado a continuación con tampones adecuados, seguido de un tratamiento con el anticuerpo específico de vpr marcado detectablemente, o el anticuerpo que se une al rip-1. El soporte de fase sólida puede lavarse a continuación con el tampón una segunda vez para eliminar anticuerpo no unido. La cantidad de marcaje unido sobre dicho soporte sólido puede detectarse entonces por medios convencionales.

Por "soporte de fase sólida" o "portador" se significa cualquier soporte capaz de unirse a antígenos o anticuerpos. Entre los soportes o portadores bien conocidos se incluyen el vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas, y magnetita. Para los fines de la presente invención el portador puede ser de naturaleza soluble en algún grado, o insoluble. La configuración del soporte puede ser esférica, como una partícula, o cilíndrica, como la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una barra. Alternativamente, la superficie puede ser plana, tal como una lámina, tira de ensayo, etc. Los expertos en la materia conocerán muchos otros portadores adecuados para la unión de anticuerpos o antígenos, o serán capaces de determinar los mismos mediante experimentación rutinaria.

La actividad de unión de un lote dado de anticuerpos puede determinarse de acuerdo a métodos bien conocidos. Los expertos en la materia serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación mediante experimentación rutinaria.

Pueden llevarse a cabo ensayos de control positivo en los que no se añada compuesto de ensayo.

Una de las maneras de marcar detectablemente los anticuerpos es mediante la unión de los mismos con un enzima y utilizarlos en un inmunoensayo enzimático (EIA), o mediante ensayo de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA). Este enzima, al ser posteriormente expuesto a su sustrato reaccionará con el mismo, generando un radical químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visualmente. Entre los enzimas que no pueden utilizarse para marcar detectablemente el anticuerpo se incluyen, pero sin limitación, la malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, isomerasa delta-5-esteroide, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.

Mediante el marcaje radioactivo del anticuerpo, resulta posible detectarlo mediante la utilización de un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Work, T.S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y., 1978. El isotopo radioactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo, o por autorradiografía. Son isótopos de particular utilidad para el propósito de la presente invención: ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S, ^{14}C y, preferiblemente, ^{125}I.

También es posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado por fluorescencia se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede ser detectada entonces debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente de uso más habitual están la isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo también puede marcarse detectablemente utilizando metales emisores de fluorescencia, tal como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo TNF-específico utilizando grupos quelantes de metal como el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o el ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).

El anticuerpo también puede ser marcado detectablemente mediante su emparejamiento con un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscentemente se determina entonces mediante la detección de la presencia de luminiscencia generada durante el curso de una reacción química. Entre los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente particularmente útiles están el luminol, isoluminol, éster de acridinio aromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato.

De manera similar, puede utilizarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que tiene lugar en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina mediante la detección de la presencia de luminiscencia. La luciferina, luciferasa y acuorina son compuestos bioluminiscentes importantes como marcadores. La detección del anticuerpo específico de vpr, o del anticuerpo que se une a rip-1, puede conseguirse con un contador de centelleo, por ejemplo, si el marcaje detectable es con un emisor gamma radioactivo, o con un fluorímetro, por ejemplo, si el marcaje es con un material fluorescente.

En el caso de un marcaje enzimático, la detección puede conseguirse por métodos colorimétricos que utilicen un sustrato para el enzima. La detección también puede conseguirse por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar.

Como puede apreciarse fácilmente, una de las proteínas virales puede ser detectable también y servir como molécula señalizadora en lugar del anticuerpo, o además del anticuerpo.

Pueden adaptarse los componentes del ensayo para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo "de dos sitios" o ensayo "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) no marcado se une a un soporte sólido que es insoluble en el líquido a ensayo, y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo de fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Entre los ensayos inmunométricos típicos y preferidos se incluyen los ensayos "forward", en los que el anticuerpo unido a la fase sólida primero se pone en contacto con una de las proteínas virales con el fin de inmovilizarla. Se añade la segunda proteína viral en presencia del compuesto de ensayo. Tras un período de incubación adecuado, se lava el soporte sólido para eliminar la proteína no unida. A continuación, se añade un segundo anticuerpo que es específico de la segunda proteína viral. El segundo anticuerpo es, preferiblemente, detectable. Tras un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme complejo con la segunda proteína viral unida al soporte sólido a través del anticuerpo no marcado y primera proteína viral, se lava el soporte sólido una segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo sándwich forward puede ser un ensayo simple "sí/no" para determinar si ha ocurrido la unión, o puede hacerse cuantitativo mediante la comparación de la medida de anticuerpo marcado con la obtenida en un control. Tales ensayos "de dos sitios" o "sandwich" se describen en Wide, Radioimmune Assay Method, Kirkham, Ed., E. & S. Livingstone, Edimburgo, 1970, páginas 199-206).

Otro tipo de ensayos "sandwich" son los llamados ensayos "simultáneos" e "inversos". Un ensayo simultáneo involucra una sola etapa de incubación en la que el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo marcado, ambos proteína viral y compuesto de ensayo, se añaden al mismo tiempo. Tras completar la incubación, se lava el soporte sólido para eliminar proteínas que no forman complejo. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido se determina entonces de la misma manera que en un ensayo sándwich "forward" convencional.

En el ensayo "inverso", se añade escalonadamente a las proteínas virales primero una solución de anticuerpo marcada, seguido de anticuerpo no marcado unido a un soporte sólido tras un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, se lava la fase sólida de manera convencional para liberarla del residuo de la muestra a ensayo, y de la solución de anticuerpo marcado que no ha reaccionado. La determinación de anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido se determina entonces como en los ensayos "simultáneos" y "forward". En una realización, puede utilizarse una combinación de anticuerpos de la presente invención específicos para epitopos separados con el fin de construir un ensayo inmunoradiométrico sensible de tres sitios.

En algunas realizaciones preferidas, se fija un anticuerpo anti-vpr a una fase sólida. La proteína vpr se pone en contacto con el anticuerpo fijado para formar un complejo. El complejo se pone en contacto con rip-1 en presencia de un compuesto de ensayo. A continuación, se añaden anticuerpos que se unen al rip-1. Se lava la fase sólida para eliminar material no unido. Se lleva a cabo un ensayo de control de manera idéntica, excepto que no se utiliza compuesto de ensayo. La detección de los anticuerpos que se unen al rip-1 indica que los vpr y rip-1 son capaces de unirse entre sí en presencia del compuesto de ensayo. De acuerdo con esto, la no detección de anticuerpos que se unan a la proteína vpr indica que el compuesto de ensayo inhibe la unión de vpr y rip-1. La cuantificación del nivel de unión en presencia y ausencia del compuesto de ensayo permite medir el grado de modulación que puede causar el compuesto de ensayo sobre la unión de vpr a rip-1.

En algunas realizaciones preferidas, los anticuerpos que se unen a rip-1 se fijan a una fase sólida. Rip-1 se pone en contacto con el anticuerpo fijado para formar un complejo. El complejo se pone en contacto con la proteína vpr en presencia de un compuesto de ensayo. A continuación, se añaden los anticuerpos anti-vpr. Se lava la fase sólida para eliminar material no unido. Se lleva a cabo un ensayo de control de manera idéntica, excepto que no se utiliza compuesto de ensayo. La detección de los anticuerpos que se unen a la proteína vpr indica que los vpr y rip-1 son capaces de unirse entre sí en presencia del compuesto de ensayo. De acuerdo con esto, la no detección de anticuerpos que se unan a la proteína vpr indica que el compuesto de ensayo inhibe la unión de vpr y rip-1. La cuantificación del nivel de unión en presencia y ausencia del compuesto de ensayo permite la medición del grado de modulación que puede causar el compuesto de ensayo sobre la unión de vpr a rip-1.

En los métodos de identificación de compuestos que inhiben la unión de la proteína vpr a rip-1, pueden utilizarse fragmentos de vpr bajo la condición de que los fragmentos utilizados conserven su capacidad de unión a rip-1. De manera similar, pueden utilizarse fragmentos de rip-1 bajo la condición de que los fragmentos utilizados conserven la capacidad de unión a la proteína vpr.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a los kits para poner en práctica el método anteriormente descrito de identificación de composiciones inhibitorias o antagonistas, especialmente antagonistas de receptor de glucocorticoide que bloquean interactivamente rip-1, o un fragmento del mismo, y/o un receptor esteroide u otro componente, e interfieren o evitan la translocación del complejo formado de esta manera. Los kits según este aspecto de la invención comprenden un primer recipiente que comprende tirosina aminotransferasa, un segundo recipiente que comprende proteína vpr, y un tercer recipiente que comprende rip-1. Adicionalmente, para poner en práctica el método anteriormente definido, se requieren medios para distinguir proteína vpr unida a rip-1, de proteína vpr no unida, o rip-1 no unido. En una realización preferida del presente aspecto de la invención, se da a conocer un cuarto recipiente que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína vpr o a rip-1. Por lo menos uno de los componentes en los recipientes, preferiblemente el anticuerpo, pueden conjugarse con un agente, tal como aquéllos que se han descrito anteriormente, lo que permite la detección de su presencia. En otra realización preferida del presente aspecto de la invención, se proporciona un cuarto recipiente que contiene un anticuerpo que se une específicamente a la proteína vpr, o a rip-1, pero no a la proteína que está unida al anticuerpo en el tercer recipiente. Por lo menos uno de los componentes en los recipientes, preferiblemente el anticuerpo, puede conjugarse con un agente, tal como aquellos que se han descrito anteriormente, lo que permite la detección de su presencia. En los kits de la invención que son de utilidad para la puesta en práctica de los métodos de identificación de compuestos que inhiben la unión de la proteína vpr a una proteína, pueden incluirse fragmentos de vpr, bajo la condición de que los fragmentos utilizados conserven su capacidad de unión a rip-1. De manera similar, pueden incluirse fragmentos de rip-1, bajo la condición de que los fragmentos utilizados conserven su capacidad de unión a la proteína vpr.

La presente invención implica la utilización de anticuerpos que se unen específicamente a rip-1. La producción de tales anticuerpos puede ser realizada por personas normalmente versadas en la técnica, sin experimentación innecesaria, utilizando productos de partida fácilmente disponibles. Los anticuerpos son de utilidad en el ensayo de identificación de compuestos que inhiben la unión de vpr a rip-1, descrito anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a los métodos de identificación de compuestos que se unen a rip-1 y/o a un receptor esteroide u otro componente, pero que no se translocan al núcleo en forma de complejo con dicho rip-1 y/o con un receptor esteroide u otro componente. Mediante la unión a rip-1 y/o a un receptor esteroide, pero sin translocación, los compuestos inhiben la actividad de vpr, compitiendo con vpr por la unión con rip-1 y/o con un receptor esteroide u otro componente, no siendo activos una vez unidos. En su utilización en este documento, tales compuestos que se unen a rip-1 y/o a un receptor esteroide u a otro componente para formar un complejo que no se transloca, se consideran antagonistas de receptores vpr, es decir, agentes de bloqueo interactivo de la diana vpr. Los compuestos que forman complejos con rip-1 y/o con un receptor esteroide u otro componente y que no se translocan hasta el núcleo son útiles para impedir la replicación del VIH; por lo tanto, tales compuestos serán útiles como agentes terapéuticos anti-VIH, solos o como parte de un régimen farmacológico anti-VIH de múltiples facetas, que incluya otra terapéutica.

Ejemplos de realizaciones preferidas Ejemplo 1 Expresión y purificación de vpr recombinante de VIH-1

Se llevó a cabo la expresión y purificación de vpr de VIH-1 expresado en células de insecto. Se clonó el marco de lectura abierta de vpr del VIH-1 NL 43 en el vector de expresión pVL1393 de baculovirus. Este constructo se contransfectó posteriormente en células de Spodoptera fungupeida (sf-9) con ADN linearizado del virus "Autograph California nuclear polyhydrosis" (Baculogold-AcMNPV). A continuación, los baculovirus recombinantes obtenidos se purificaron en placa y se expandieron siguiendo protocolos publicados.

Se produjo vpr recombinante mediante los procedimientos siguientes. Se infectaron cinco células altas a 5-10 MOI, y a una densidad celular de 2 x 10^{6} células/ml. Se recogieron los sobrenadantes del cultivo tisular 24 horas después. Éstos se centrifugaron a 10.000 g y se suplementaron con un cóctel inhibidor de proteasa (PMSF, EDTA, EGTA, aprotinina, pepstatina A, y leupetina). Se mantuvieron todos los sobrenadantes en hielo hasta su utilización.

Los sobrenadantes anteriormente descritos se pasaron por una columna de afinidad anti-vpr de conejo construida siguiendo procedimientos publicados. El esquema de elución consistió en lo siguiente: elución previa con tampón fosfato 10 mM, pH 8,0, seguido de tampón de elución trietanolamina 100 mM, pH 11,5. Se recogió el eluído en alícuotas de 0,5 ml, y se neutralizó con 1/20 del volumen total de fracción de fosfato sódico 1 M, pH 6,8. Se hizo un seguimiento de la concentración de proteínas en estas fracciones, y se analizaron adicionalmente mediante ELISA, tinción de plata, y western blot.

Ejemplo 2 Anticuerpos vpr

Se obtuvo el péptido 2-21 (808) anti-vpr de conejo a partir de NIH, SIDA RR. Todos los demás anticuerpos utilizados se produjeron como se describe en procedimientos publicados. Estos anticuerpos eran LR1, un anti-vpr de conejo. Se obtuvo este suero mediante la inmunización de un animal con el vpr recombinante purificado descrito anteriormente. Se utilizó también un anti-vpr de ratón, cultivado contra el mismo antígeno. El antisuero de ratón contra el péptido vpr 2-21 se denominan m. anti pl; el antisuero de ratón contra el péptido vpr 90-96 se denominan m. anti p3. Se obtuvo otro antisuero de ratón contra el péptido vpr 41-48; éste se denomina m. anti p2. Todos estos sueros se titraron mediante ELISA, y se ensayaron sus reactividades cruzadas con péptidos y vpr recombinante previamente a su utilización.

Ejemplo 3 Ensayos de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA)

Se utilizaron tres variaciones diferentes de la técnica ELISA. Se utilizó una fase sólida, a menos que se indique lo contrario. También se utilizaron un sistema ELISA de captura, y una ELISA de bloqueo proteína/péptido.

La ELISA de fase sólida se realizó inmovilizando proteína sobre las placas (placas Immulon II, Dynatech Corp.) a una concentración de 1 \mug/ml, diluidas en solución carbonato-bicarbonato 0, 2 M, pH 9,2. Se utilizaron péptidos a una concentración de 10 \mug/ml disueltos en el mismo tampón. El tampón de lavado consistió en 1X PBS, con Tween-20 al 0,05%. El tampón de bloqueo consistió en BSA al 2% en el tampón de lavado. Todos los anticuerpos se diluyeron en el tampón de bloqueo. Los anticuerpos de detección utilizados fueron anticuerpo cabra anti-ratón, de conejo, o anticuerpo humano Ig específico, conjugado con peroxidasa de rábano (Boehringer Mannheim). Éstos se utilizaron a una dilución 1:12.000, siguiendo las especificaciones del fabricante. El sustrato utilizado fue 3,3',5,5' tetrametilbenzidina dihidrocloruro (TMB, Sigma), siguiendo las especificaciones del fabricante. Se revelaron las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detuvo la reacción mediante la adición de 20 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 3 M, y se leyeron a D.O. a 450 nm.

En el método ELISA de captura, se inmovilizó anticuerpo diluido en tampón bicarbonato-carbonato a 1 \mug/ml sobre la placa durante dos horas a 25ºC. Se diluyeron las muestras en tampón bloqueante. Todos los pasos restantes fueron como se ha descrito anteriormente.

El ensayo de bloqueo de péptidos se llevó a cabo mediante la inmovilización de una de las proteínas de interés sobre la placa a una dilución de 1 \mug/ml en solución bicarbonato-carbonato. Se disolvieron los péptidos en el tampón bloqueante a una dilución de 50 \mug/ml, y se añadieron a los pocillos bloqueados. La segunda proteína de interés se introdujo en estos pocillos a una dilución de 1 \mug/ml en tampón bloqueante. Los anticuerpos utilizados a partir de este momento se dirigieron a la segunda proteína, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.

Ejemplo 4 SDS-PAGE y transferencia Western

Se prepararon geles de SDS poliacrilamida siguiendo los procedimientos publicados. Se llevó a cabo tinción de plata utilizando el kit de tinción Bio Rad Silver, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se llevó a cabo la transferencia de proteínas desde los geles SDS-PAGE a membranas Immulon-P (Millipore Corp.) utilizando el sistema de transferencia mini gel Bio Rad, siguiendo las especificaciones del fabricante. El tampón bloqueante utilizado fue leche seca no grasa al 5% disuelta en el tampón de lavado (1x TBS, suplementado con Tween-20 al 0,05%). Los anticuerpos se diluyeron en el tampón bloqueante. La sonda de detección utilizada fue proteína G marcada con I^{125} (Dupont-NEN), diluida a 2 \muci/ml en tampón de lavado.

Ejemplo 5 Sistema de transferencia Western en varias etapas para vpr

Se lavaron seis 3x10 celdas dos veces en DPBS, y se lisaron en 200 \mul de tampón de lisado (NaCl 100 mM, Tris, 50 mM, pH 8,0, Triton X-100 al 0,5%, y el cóctel inhibidor de proteasa descrito anteriormente); se incubaron en hielo durante 10 minutos; y se centrifugaron a 12.000 g durante 6 minutos.

Las fracciones solubles en Tritón, así como las insolubles, se corrieron en SDS-PAGE al 12%, y se efectuó un blot sobre una membrana Immulon-P (Millipore Corp.). Estas membranas se bloquearon con NFDM al 5% en 1x TBS (8g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3 g de base Tris, en 1 litro, pH 7,4) con Tween-20 al 0,05%. Se incubaron las membranas con el vpr recombinante purificado (aproximadamente 50 mg/ml) de cualquiera de las columnas, o una preparación idéntica excepto por la presencia de la proteína vpr. La incubación siguiente se realizó utilizando antisuero anti-vpr 808 de conejo, seguido de proteína G yodada (Dupont-NEN). Se secaron estos filtros y se expusieron a película (KODAK X-AR) a -80ºC durante, como mínimo, 12 horas, con una pantalla de intensificación.

Al utilizar sobrenadante de cultivo tisular procedente de células H9 infectadas crónicamente como fuente de vpr, se siguió el procedimiento siguiente. Se cultivaron hasta confluencia células H9 que habían estado infectadas crónicamente con VIH-I MN. Se recogieron estos sobrenadantes mediante la centrifugación de las células a 1.000 g durante 10 minutos. A continuación, los sobrenadantes de cultivo tisular se diluyeron 1:10 en el tampón de lisado descrito anteriormente, y se suplementaron con los inhibidores proteasa mencionados anteriormente. A continuación, se utilizó esta preparación en la etapa en la que el vpr recombiante había sido utilizado anteriormente. El control utilizado en estos experimentos fueron sobrenadantes de cultivo tisular de células H9 no infectadas, cultivadas hasta el mismo nivel de confluencia, y tratadas con las mismas condiciones de lisis.

Ejemplo 6 Cultivo celular y de virus

Se obtuvieron las siguientes líneas celulares de la American Type Culture Collection: la línea TE 671 de rabdomiosarcoma (ATCC HTB 139), así como la línea A673 de rabdomiosarcoma (ATCC CRL 1598); la línea celular D17 de osteosarcoma canino (ATCC CRL 183), y la línea HOS de osteosarcoma humano (ATCC CRL 1543); la línea U373 de blastoma glial (ATCC HTB17) y la línea HBT10 de neuroblastoma (ATCC SK-N-MC). El MRC proporcionó dos líneas adicionales de blastoma glial (HTB17 y HTB16). U87MG es una línea celular glial obtenida de la University of Pennsylvania Cell Center. Se obtuvieron células RD de rabdomiosarcoma de otra fuente. Las células t-linfocíticas (H9, Supt-1) se obtuvieron de la University of Pennsylvania Cell Center. Las células THP-1 monocíticas se obtuvieron a través del MRC. Las células HL60 y U937 se obtuvieron de otra fuente; y KG-1 se obtuvo de incluso otra fuente. Los tres tipos celulares de riñón de mono (BSC1, CV-1, y COS) se obtuvieron de una fuente diferente. El NIH 3T3 murino se obtuvo de la ATCC; y el hibridoma de células B, NIH 1983 se obtuvo del SIDA RR. El PBL primario, así como los monócitos/macrófagos, se aislaron de sangre recién extraída de un individuo normal, siguiendo protocolos publicados. Todas las células adherentes de la lista anterior se cultivaron en DMEM suplementado con suero de feto bovino al 10% inactivado por calor, penicilina/estreptomicina, L-glutamina, hepes y piruvato sódico. Los cultivos en suspensión se cultivaron en RPMI 1640, suplementados con los mismos reactivos. Todas estas células se cultivaron cada cuatro días, diluyéndolas 1:10.

Los sobrenadantes que contenían virus se obtuvieron de células H9 infectadas crónicamente. Estos aislados (HIV-I MN, y HIV-I NL43) se obtuvieron del programa "AIDS Reagent Repository". Se cultivaron hasta confluencia las células infectadas, a continuación se retiraron las células por centrifugación, y los sobrenadantes se diluyeron en el tampón de lisado descrito anteriormente. Se hizo un seguimiento continuo de la infección de células diana H9 mediante la medición de los niveles de p24 en el sobrenadante del cultivo tisular.

Ejemplo 7 Cromatografía de columna

Se prepararon las columnas de inmunoafinidad siguiendo protocolos publicados. Se acoplaron los anticuerpos deseados a partículas de proteína A utilizando DMP. Se cargaron estas columnas con las suspensiones deseadas de proteína, y se eluyeron siguiendo la estrategia que se describe posteriormente.

También se utilizó una columna de sefarosa activada con vpr-CnBr. Esta columna se preparó disolviendo las partículas de sefarosa activada con CnBr (Sigma) en HCl 1 mM, y se dejó que se hinchasen durante 10 minutos. Estas partículas se lavaron con 20 volúmenes de lecho de NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. Se disolvió vpr recombinante en el mismo tampón de lavado hasta una concentración final de 1 mg/ml, y se incubó con las partículas durante 2 horas a temperatura ambiente. Las partículas acopladas se bloquearon con glicina 1 M en el mismo tampón de lavado, pH 8,5, durante dos horas a temperatura ambiente. Esta columna se eluyó con un tampón de elución previa compuesto de fosfato sódico 10 mM, pH 6,8, seguido de tampón de elución; glicina 100 mM, pH 2,5. Estas fracciones se neutralizaron con 1/20 de volumen de fosfato sódico 1 M, pH 8,0.

Ejemplo 8 Entrecruzado de los complejos Vpr/rip-1

Se obtuvieron complejos Vpr/rip-1 utilizando el sistema de columna cromatográfica descrito anteriormente. Brevemente, se corrió vpr recombinante en la columna, seguido por los lisados celulares Triton X-100, fracción soluble. Se agruparon estas fracciones y se dializaron frente a tres cambios de agua. El sobrenadante resultante se liofilizó y resuspendió en PBS hasta un décimo del volumen original. Esta solución se expuso a agentes de entrecruzado. Los entrecruzadores utilizados fueron DSS (Pierce), y DTSSP (Pierce). El último puede cortarse con agentes reductores, DSS es un entrecruzador no reversible. Estos dos agentes necesitan disolverse a 50 mg/ml, en una mezcla al 50% V/V de agua:DMSO.

Las fracciones entrecruzadas resultantes se corrieron en SDS-PAGE al 12%, en un gel reductor, o en un gel no reductor, y se analizaron mediante el método western blot en varias etapas. Los geles no reductores eran idénticos a sus contrapartidas reductoras, excepto por la presencia de 2-beta mercaptoetanol y DTT en el tampón de carga. Estos eran geles desnaturalizantes, por lo que contenían SDS.

Ejemplo 9 Mapado de la interacción Vpr/rip-1

El enfoque utilizado para determinar los sitios de esta interacción fue un sistema ELISA de bloqueo de péptidos. Brevemente, se inmovilizó rbp-1 en placas ELISA (Immulon II, Dynatech Corp.), se disolvió a aproximadamente 1 \mug/ml en un tampón bicarbonato de carbonato 0,2 M, pH 9,2. Los péptidos vpr se disolvieron en tampón bloqueante a 50 \mug/ml, y se incubaron en los pocillos con 50 \mul/pocillo. Éstos eran péptidos solapantes, los cuales abarcan la longitud completa de la molécula vpr (obtenidos del programa francés del SIDA a través del depósito MRC, Reino Unido), las secuencias aminoacídicas de los cuales se describen en detalle en Human Retroviruses and AIDS 1991, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, G. Myers et al., eds., "Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases", publicado por Theoretical Biology y Biophysics grupo T-10, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. Se disolvió vpr en tampón bloqueante a aproximadamente 1 \mug/ml. Se utilizaron diferentes anticuerpos anti-vpr para detectar la cantidad de vpr unido a las placas. Se consiguió la detección mediante la utilización de un antisuero de cabra anti-ratón, o IgG de conejo, respectivamente, conjugado con peroxidasa de rábano.

De acuerdo con los ejemplos anteriores, se descubrió que la proteína vpr recombinante migraba predominantemente como un monómero putativo a 15 KD en el SDS PAGE. La tinción de plata, y el western blot también revelaron la presencia de un posible homodímero a 30 KD, a una concentración menor que el monómero. Esta proteína era idéntica a la proteína nativa en sus características de migración en el SDS- PAGE, así como en sus patrones de reactividad contra anticuerpos.

Se utilizó la cromatografía de afinidad como un medio de obtención de proteína de >80% de pureza. Se observó que la mayor parte de esta proteína purificada migraba como una banda de 15 KD. Aproximadamente 20% del total de proteína presente migró como un compuesto de elevado peso molecular, de aproximadamente 65 KD, el cual no reaccionó con anticuerpos vpr específicos en western blots.

En cuanto a la identificación de rip-1 en lisados celulares, los lisados celulares se obtuvieron utilizando diferentes detergentes en el tampón de lisado. Los detergentes utilizados fueron Triton X-100, SDS, ácido deoxicólico sódico, o una solución que contenía los tres detergentes (SDS, Triton X-100, y ácido deoxicólico sódico). Estos tampones de lisis se utilizaron para lisar 3x10^{6} células RD/muestra.

Los western blots en varias etapas mostraron una banda a aproximadamente 41 KD que hibridaba en la parte soluble de Triton X-100, pero no en la fracción insoluble. La misma banda hibridaba en los otros lisados de detergente, pero no pudo determinarse la localización subcelular, debido a que estos detergentes solubilizaban todas las membranas celulares. Cuando se utilizó vpr nativo en el sistema de western blot en varias etapas, en lugar de la proteína recombinante descrita, hibridó la misma banda de 41 KD. Tampoco se observaron bandas adicionales en este caso.

Se descubrió que rip-1 se expresaba de manera ubicua en líneas celulares derivadas de linfocitos T (H9, SupT-I), ambas líneas celulares, y células primarias, monocitos/macrófagos (HL60, U937, THP-1, KG-1), de líneas celulares así como de células primarias, células gliales (HTB14, HTB10, U373), células de osteosarcoma (D17, HOS), células de rabdomiosarcoma (RD, TE671, A673). Todas estas células tenían rip-1 en sus partes solubles en Triton X-100. Las líneas celulares en las que no se detectó rip-1 eran COS, BSC-1, CV-1, NIH 3T3, y un hibridoma derivado de célula B de ratón (NIH 183). Rip-1 estaba presente en todas las líneas celulares humanas que se exploraron, y en una línea celular de osteosarcoma canino (D17).

En cuanto a la detección de rip-1 mediante cromatografía de columna; cuando los lisados RD, o posteriormente, los lisados U937, se pasaron por una columna anti-vpr, después de pasar vpr recombinante, se observó que se obtenía un perfil de elución diferente del obtenido cuando se pasaba vpr solo en la misma columna. Vpr eluirá como un pico estrecho, abarcando aproximadamente 5 fracciones. Vpr seguido de un lisado celular dará lugar a una curva de elución bimodal. Todas estas fracciones tendrán actividad vpr, pero esta actividad, cuando se detecte utilizando un sistema ELISA de captura, ocasionalmente puede bloquear determinados anticuerpos. La detección/actividad vpr puede, en última instancia, restaurarse cuando se utilice un anticuerpo de detección localizado en una región diferente a la de vpr.

Se realizó un análisis de los perfiles de elución, y sus actividades ELISA respectivas para diferentes anticuerpos, en ELISA de fase sólida, y para diferentes combinaciones de anticuerpo para un sistema ELISA de captura. Se bloqueó un péptido (91-96) anti-vpr de ratón en un sistema ELISA de captura de las fracciones en las que vpr estaba asociado con rbp-1. Al utilizar un anticuerpo (1-22) anti-vpr de ratón en combinación con un antisuero poliespecífico de conejo en un sistema ELISA de captura, se confirmó la presencia de vpr en ambos juegos de fracciones. Esto sugiere que vpr se acompleja con rip-1 de manera que excluye de la reacción al anticuerpo específico del extremo carboxi-terminal.

La reactividad del western blot en varias etapas de estas fracciones mostró una banda de 41 KD, además de vpr. Esta banda se correlaciona con la que se observó anteriormente con los lisados de células completas, y cuando se corrieron lado a lado parecían idénticas. Por lo tanto, se concluyó que rip-1 había sido aislado, en unión con vpr, en el sistema de cromatografía de columna.

Con respecto al aislamiento de rip-1, se aisló mediante la columna de sefarosa activada con vpr-CnBr. Se incubaron las partes solubles de los lisados celulares de Triton X-100 con esta columna durante dos horas a 4ºC. Esta columna se lavó con 50 volúmenes de lecho del tampón de lavado adecuado, y se eluyó. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE, tinción de plata, y western blot, así como por su capacidad de unirse a vpr en ELISA. La columna inicialmente rindió algo de vpr en las primeras cuatro fracciones, las cuales coeluyeron con rip-1. Después de lavados adicionales, las fracciones resultantes sólo contenían rip-1. Ésta fue la fuente de rip-1 de >95% de pureza, utilizado en los estudios de mapado descritos anteriormente y que se comentan posteriormente.

Con respecto al entrecruzado de los complejos vpr/rip-1, se utilizaron dos reactivos de entrecruzado, uno cortable (DSS), y uno no cortable (DTSSP). El entrecruzador no cortable, DSS, es una agente homo-bifuncional, que se une covalentemente a proteínas que se encuentran próximas. DTSSP es un entrecruzador tiol cortable. Estos dos agentes entrecruzadores químicos son idénticos en todos los aspectos excepto en su reversibilidad. Se detectó una banda de 58 KD en el SDS-PAGE, por tinción de plata. Esta molécula reaccionó con antisueros anti-vpr así como en el sistema western blot en varias etapas, como reaccionarían individualmente vpr y rip-1. Los complejos entrecruzados con DSS se corrieron junto con los complejos entrecruzados con DTSSP, lado a lado con las fracciones de columna no perturbadas. Éstas se corrieron en SDS-PAGE reductor y no reductor. El objetivo de esto fue observar la separación de los complejos entrecruzados en sus componentes específicos, vpr y rip-1. El análisis mostró un gel en el que se observaba la banda de 58 KD en el gel no reductor, con ambos entrecruzadores, mientras que en el gel reductor, podía observarse que la banda de 58 KD estaba sólo en la pista DSS, y la banda de 41 KD más la de 15 KD, correspondientes a vpr y rip-1, estaban en la pista DTSSP, según se podía observar en la pista de la fracción no alterada de la columna.

Con respecto al mapado de la interacción vpr/rip-1, se obtuvieron 14 péptidos solapantes del programa de investigación francés sobre el SIDA. Se utilizó un sistema ELISA de bloqueo de péptidos con el fin de determinar el sitio, sobre la molécula de vpr, en el que rip-1 se une a vpr. El área de esta interacción se resolvió hasta los aminoácidos x a y. Esto es consistente con el partrón de bloqueo de anticuerpos de esta interacción, ya que el anticuerpo m. anti p2 bloqueó esta interacción; pero otros anticuerpos, cultivados contra los extremos terminales amino y carboxi, no dieron este resultado.

Con respecto a la translocación de rip-1 hasta el núcleo en respuesta a estímulos de vpr, se utilizaron células U937 con el fin de explorar los efectos de vpr sobre rip-1 in vivo. Estas células mieloides estaban infectadas con VIH-1 NL43, o infectadas con un VIH-1 NL43 en el que vpr había sido eliminado; en presencia, o ausencia de proteína vpr recombinante. También se expusieron células U937 a PMA, o a vpr soluble recombinante solo. Se evaluaron los efectos de vpr sobre la localización celular de rip-1 mediante el sistema de western blot en varias etapas. Además, se hizo un seguimiento de las infecciones midiendo los niveles en sobrenadante de gag p24. Estos experimentos se llevaron a cabo como un curso temporal, recogiendo muestras a las 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la infección.

En cada caso en el que se expusieron las células a vpr soluble, el western blot en varias etapas mostró vpr en la fracción celular citoplasmática a las 12 horas, y posteriormente en ambas fracciones, la celular y la nuclear. Rip-1 se observó siempre colocalizado con vpr. También se observó la translocación de vpr y de rip-1 desde las fracciones citoplasmáticas a las fracciones nucleares. El éster de forbol PMA no indujo esta translocación, ni tampoco un virus VIH con vpr eliminado. El efecto de translocación sí se detectó en el caso del virus con vpr eliminado tras la adición de vpr recombinante a los cultivos infectados. Pueden utilizarse otros métodos además del western blot en varias etapas para demostrar esta colocalización nuclear de vpr, y rip-1, tal como las técnicas ELISA descritas en este documento.

Se midieron los niveles de p24, los cuales reflejan una infección VIH productiva. Se detectó p24 en los sobrenadantes de los cultivos infectados por VIH-I NL43 a las 96 horas después de la infección. No se detectó ningún p24 en los sobrenadantes de los cultivos infectados por VIH NL43 con vpr eliminado en las 120 horas que se analizaron. Además, no se detectó p24 en los sobrenadantes de las células expuestas a PMA, o vpr recombinante solo. Los cultivos expuestos a ambos, vpr recombinante, y virus con vpr eliminado, mostraron p24 a las 48 horas después de la infección. Además, estos cultivos mostraron el mismo perfil de translocación de rip-1 a los cultivos expuestos a vpr recombinante solo. En todos los casos en los que se detectó p24 en el sobrenadante, se observó la translocación de rip-1 desde el citoplasma al núcleo hasta 24 horas antes.

Claims

1. Uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos que comprenden uno o más antagonistas de receptores esteroides y un portador farmacéuticamente aceptable de los mismos, con la condición de que dicho antagonista no sea un péptido o un ácido nucleico, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de VIH.

2. Uso según la reivindicación 1 en el que, durante su uso, el antagonista de receptor esteroide inhibe o evita la replicación de dicho VIH interferiendo con la función replicativa u otras funciones esenciales de vpr expresadas por dicho VIH, o bloqueando interactivamente la diana vpr en las células de un individuo bajo tratamiento con el medicamento, de tal modo que vpr podría en caso contrario, llevar a cabo las actividades esenciales a la replicación del VIH.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el antagonista de receptor esteroide bloquea interactivamente la diana vpr mediante la unión, o de otro modo, bloqueando total o parcialmente el funcionamiento de vpr, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos, de manera que se evita la translocación de vpr/rip-1 y/o receptor esteroide, u otro complejo componente, desde el citosol de dichas células hasta los núcleos de dichas células, o la señalización de dicho complejo translocado, de tal modo que vpr podría, en caso contrario, llevar a cabo actividades esenciales a la replicación del VIH.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que dicha diana vpr comprende rip-1, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos, en dicha célula huésped, de tal modo que se forma un complejo que media en las actividades de vpr que son esenciales para la replicación del VIH.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho complejo es un complejo de múltiples componentes que comprende vpr, rip-1 y un receptor esteroide.

6. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho receptor esteroide es un receptor GR de tipo II.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno o más de los antagonistas de receptor esteroide son uno o más miembros seleccionados de entre antagonistas de receptores de hormonas esteroides, antagonistas de receptores de glucocorticoides, y antagonistas de receptores de glucocorticoides (GR) de tipo II.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antagonista de receptor esteroide es mifepristona, 11\beta-(4-dimetilaminofenil)-17\beta-hidroxi-17\alpha-(propil-1- inil)estra-4,9-dien-3-ona.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento comprende adicionalmente uno o más agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de individuos infectados por VIH.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que los agentes terapéuticos son zidovudina (AZT), aciclovir, ganciclovir, foscarnet, dideoxinosina, dideoxicitidina, MK68, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, compuestos integrasa anti-VIH, compuestos TAT anti-VIH, compuestos anti-HEV, compuestos proteasa anti-VIH, compuestos transcriptasa inversa anti-VIH, señuelos VIH REV, señuelos VIH TAT), ribozimas y compuestos inmunológicos, tales como vacunas y agentes de terapia génica.

11. Método de identificación de un compuesto que es capaz de inhibir o evitar la replicación del VIH interferiendo con la función replicativa u otras funciones esenciales de vpr mediante el bloqueo interactivo de la diana vpr en células humanas;

comprendiendo dicho método, en un cultivo de células humanas infectadas por VIH, la etapa de puesta en contacto de vpr y rip-1 y/o uno o más receptores esteroides u otros compuestos, o un fragmento de cualesquiera, uno o más, de los mismos, en presencia de dicho compuesto de ensayo, la determinación del nivel de unión y la comparación de dicho nivel con el nivel de unión que ocurre cuando vpr y rip-1 y/o receptor esteroide u otro componente se ponen en contacto en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

12. Método de identificación de un compuesto, el cual es un antagonista de receptor de glucocorticoide y que es capaz de inhibir o evitar la replicación de VIH interferiendo con la función replicativa, u otras funciones esenciales, de vpr mediante el bloqueo interactivo a la diana vpr en células humanas de un complejo de rip-1, expresado por dicho VIH, solo o en asociación con uno o más receptores esteroides u otros componentes, o uno o más receptores esteroides solos;

comprendiendo dicho método las etapas de (1) determinación de la actividad antagonista glucocorticoide de un compuesto de ensayo, y si dicho compuesto de ensayo exhibe actividad antagonista glucocorticoide, (2) puesta en contacto de vpr y rip-1 y/o un receptor esteroide u otro componente, o un fragmento de cualquiera de uno o más de los mismos, en presencia de dicho compuesto de ensayo, determinación del nivel de unión y comparación de dicho nivel con el nivel de unión que ocurre cuando vpr y rip-1 y/o un receptor esteroide u otro componente son puestos en contacto en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

13. Método según la reivindicación 12, en el que se mide la actividad antagonista glucocorticoide determinando el efecto de dicho compuesto de ensayo sobre las tirosina aminotransferasas.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende una etapa adicional en la que se determina si dicho compuesto de ensayo ha inhibido o detenido sustancialmente la formación de dicho compuesto, que comprende vpr/rip-1 y/o receptor esteroide u otro componente, mediante el bloqueo interactivo de dicho complejo, de determinación del nivel de p24 producido en dichas células infectadas por VIH que reciben dicho compuesto de ensayo, y de comparación de dicho nivel al nivel de p24 producido por células infectadas por VIH en las que vpr ha sido eliminado de dicho VIH, así como el nivel de p24 producido en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende la etapa adicional de llevar a cabo un ensayo que sea capaz de determinar la colocalización nuclear de vpr y rip-1 y/o un receptor esteroide u otro componente, y determinar el nivel de dicha colocalización en presencia de dicho compuesto de ensayo, comparándolo al nivel de colocalización en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

16. Kit para la identificación de compuestos que bloquean interactivamente la formación de un complejo, o el funcionamiento de un complejo, que comprende vpr, rip-1 y/o uno o más receptores esteroides u otros componentes, que comprende un primer recipiente que comprende tirosina aminotransferasa, un segundo recipiente que comprende proteína vpr, y un tercer recipiente que comprende rip-1 o un fragmento del mismo.

17. Kit según la reivindicación 16, que comprende adicionalmente un cuarto recipiente que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína vpr o a rip-1.