ES2286818T3 - Funcion y actividad de vpr. - Google Patents
Funcion y actividad de vpr. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2286818T3 ES2286818T3 ES94909839T ES94909839T ES2286818T3 ES 2286818 T3 ES2286818 T3 ES 2286818T3 ES 94909839 T ES94909839 T ES 94909839T ES 94909839 T ES94909839 T ES 94909839T ES 2286818 T3 ES2286818 T3 ES 2286818T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- vpr
- protein
- hiv
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
SE PRESENTAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN LA PROTEINA VPR DEL HIV O UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA VPR. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA TRATAR PACIENTES QUE SUFRAN ENFERMEDADES CARACTERIZADAS POR LA HIPERPROLIFERACION DE CELULAS NO DIFERENCIADAS TALES COMO EL CANCER MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE TALES COMPOSICIONES. SE PRESENTAN METODOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE TENGAN ACTIVIDAD ANTI HIV, EN PARTICULAR METODOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE MODULEN LA ACTIVIDAD DE LA VPR Y DE LOS COMPUESTOS DE IDENTIFICACION QUE INHIBEN LA UNION DE LA VPR AL GAG DE LA PROTEINA DEL HIV.
Description
Función y actividad de vpr.
La presente invención se refiere a métodos para
diferenciar células, compuestos farmacéuticos relacionados con las
mismas, y métodos para identificar compuestos posiblemente útiles en
el tratamiento del SIDA.
Desde la demostración en 1987 que una pequeña
fase de lectura abierta en VIH-1 denominada R
codifica una proteína de 15 kD (Wong-Staal, F.,
et al., (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:
33-39), se ha informado de muy poco acerca de la
función de la proteína viral R (vpr). El documento WO
90/15875 describió una secuencia de ADN que codifica un gen que
puede expresar el producto génico de vpr, la propia proteína y un
anticuerpo que reacciona con la proteína. La fase de lectura
abierta vpr está conservada en todos los genomas de
VIH-1 y VIH-2 y en la mayoría, sino
en todos, los genomas del virus de inmunodeficiencia de simios
(SIV). VPR es inmunogénica in vivo porque un gran conjunto
de individuos VIH^{+} fabrica anticuerpos que pueden reaccionar
con un péptido vpr producido de forma bacteriana
(Wong-Staal, F. et al., (1987) AIDS Res.
Hum. Retroviruses 3: 33-39).
El progreso de la infección por VIH a SIDA está
en gran parte determinado por los efectos de VIH sobre las células
que infecta, incluyendo linfocitos T CD4^{+} y macrófagos. Por
otro lado, la activación, diferenciación y proliferación celular se
cree a su vez que están regulados por la infección de VIH y la
replicación en células T y macrófagos. Gallo, R. C. et al.
(1984) Science 24: 500; Levy, J. A. et al.,
(1984) Science 225: 840; Zack, J. A. et al.,
(1988) Science 240:1026; Griffin, G. E. et al.,
(1988) Nature 339: 70; Valentin, A. et al.,
(1991) J. AIDS 4: 751; Rich, E.A. et al.,
(1992) J. Clin. Invest. 89:176 y Schuitemaker, H.
et al., (1992) J. Virol. 66:1354. La división
celular per se puede no ser necesaria ya que VIH y otros
lentivirus pueden proliferar en macrófagos no proliferantes,
diferenciados de forma terminal y linfocitos T detenidos en el
crecimiento. Rose, R. M. et al. (1986) Am. Rev. Respir.
Dis. 143: 850; Salahuddin, S.Z. et al. (1986)
Blood 68: 281; y Li, G. et al. (1993) J.
Virol. 67: 3969. La capacidad de los lentivirus,
incluyendo VIH, de replicarse en células no proliferantes,
particularmente en macrófagos, se cree que es única entre los
retrovirus y puede ser significativo que varios lentivirus contengan
un gen tipo vpr. Myers, G. et al. (1992) AIDS Res. Hum.
Retrovir. 8: 373. Una infección por VIH de las líneas
celulares mieloides puede provocar un fenotipo más diferenciado y un
aumento de la expresión de factores tales como
NF-KB que son necesarios para la replicación de VIH.
Roulston, A. et al., (1992) J. Exp. Med. 175:
751; y Chantal Petit, A. J. et al. (1987) J. Clin.
Invest. 79:1883.
La mayor evidencia para la función de la
proteína vpr proviene de varios estudios que informan de las
actividades de las cepas de VIH que tienen mutaciones en el gen
vpr. Se ha informado de que mutaciones en el gen vpr provoca una
disminución en la replicación y citopatogenicidad de
VIH-1, VIH-2 y SIV en linfocitos T
CD4^{+} primarios y líneas de células T transformadas (Ogawa, K.,
et al., (1989) J. Virol. 63:4110-4114;
Shibata, R., et al. (1990a), J. Med. Primatol.
19:217-225; Shibata, R., et al.
(1990b) J. Virol. 64:742-747 y
Westervelt, P. et al. (1992) J. Virol.
66:3925), aunque otros han informado de que el gen vpr mutado
no tiene efectos sobre la replicación (Dedera, D., et al.
(1989) Virol. 63:3205-3208). Es
interesante observar que VIH-2 mutado para vpr se
ha presentado como incapaz para infectar monocitos
primarios/macrófagos (Hattori, N., et al. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:8080-8084). La
transactivación de la repetición terminal larga de VIH y promotores
heterólogos por VIH está aumentada en aproximadamente 3 veces en
VIH-1 de tipo silvestre frente a
vpr-negativo, aunque el mecanismo a través del cual
vpr puede transactivar la transcripción es desconocido y
puede ser indirecto (Cohen, E. A., et al., (1990b) J.
Acquir. Immune Defic. Syndr. 3:11-18). La
relación entre los efectos de vpr sobre la actividad del promotor y
la infectividad viral no está clara. La proteínas vpr se
incorpora en la partícula viral, y este descubrimiento ha conducido
a la propuesta de que vpr funciona pronto en la infección, después
de la penetración del virus y la pérdida de la envuelta, y que vpr
puede interaccionar con mecanismos reguladores celulares importantes
para establecer la infección (Cohen, E. A. et al. 1990a
J. Virol. 64:3097-3099; Yu, X.F.,
et al. (1990) J. Virol.
64:5688-6593; y Yuan, X., et al.,
(1990) AIDS Res. Hum. Retroviruses
6:1265-1271).
El gen vpr de VIH-1 ha
demostrado inducir la inhibición del crecimiento celular y la
diferenciación en líneas tumorales de diferenciación intermedia
in vitro. Levy, D. N. et al. (1993) Cell
72:541. Como la proteína vpr se origina en partículas
virales, vpr puede jugar un papel en el establecimiento de una
infección productiva.
La presente invención se refiere a métodos in
vitro para inducir células indiferenciadas a diferenciarse. La
presente invención se refiere a un método para estimular las células
indiferenciadas a que se diferencien, lo que comprende la etapa de
poner en contacto células in vitro con una cantidad de
proteína vpr suficiente para estimular la diferenciación. De
acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, las
células indiferenciadas se ponen en contacto con la proteína
vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr para
inducir que las células se diferencien. De acuerdo con algunas
realizaciones de la presente invención, una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia que codifica la proteína
vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr se introduce
en células indiferenciadas. La expresión de la secuencia que
codifica la proteína vpr o el fragmento funcional de la
proteína vpr provoca la producción de la proteína vpr o el
fragmento el funcional de la proteína vpr en la célula, provocando
que la célula se diferencie. De acuerdo con algunas realizaciones
de la presente invención, la secuencia que codifica la proteína
vpr a un fragmento funcional de la misma está unida de forma
operativa a elementos reguladores que son necesarios para la
expresión de la secuencia en la célula. De acuerdo con algunas
realizaciones de la presente invención, la molécula de ácido
nucleico es ADN.
La presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que comprenden la proteína vpr y vehículo
farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con alguna realización de la
presente invención, la composición farmacéutica comprende un
fragmento funcional de la proteína vpr y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia que codifica la proteína vpr y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con algunas realizaciones
de la presente invención, la composición farmacéutica comprende una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica
un fragmento funcional de la proteína vpr y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con algunas realizaciones de
la presente invención, la composición farmacéutica comprende una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica
la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma que está unida
de forma operativa a elementos reguladores que son necesarios para
la expresión de la secuencia en la célula. De acuerdo con algunas
realizaciones de la presente invención, una composición
farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico que es
ADN.
La presente invención se refiere al uso de una
cantidad de proteína vpr suficiente para estimular la
hiperproliferación de células indiferenciadas en la fabricación de
un medicamento para tratar a individuos diagnosticados con o que se
sospecha que padecen enfermedades caracterizadas por células
indiferenciadas hiperproliferantes. De acuerdo con algunas
realizaciones, el uso de la presente invención comprende las etapas
de administrar a dichos individuos, una cantidad eficaz de proteína
vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr. De acuerdo
con algunas realizaciones de la presente invención, el uso de la
presente invención comprende las etapas de administrar a dichos
individuos una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia que codifica la proteína vpr o un fragmento
funcional de la proteína vpr. De acuerdo con algunas realizaciones
de la presente invención, la secuencia que codifica la proteína vpr
o un fragmento funcional de la proteína vpr está unida de forma
operativa a elementos reguladores que son necesarios para la
expresión de la secuencia en células. De acuerdo con algunas
realizaciones de la presente invención, la molécula de ácido
nucleico es ADN. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente
invención, la enfermedad caracterizada por células indiferenciadas
hiperproliferantes es cáncer o psoriasis.
La presente invención se refiere a un método
para identificar compuestos que inhiban que vpr estimule la
diferenciación de células indiferenciadas que comprende las etapas
de poner primero en contacto, en presencia de un compuesto de
ensayo, dichas células con una cantidad de proteína vpr suficiente
para estimular la diferenciación y después observar dichas células
para determinar si sucede la diferenciación celular.
La presente invención se refiere a una proteína
vpr producida en células eucariotas. La vpr se produce
preferiblemente en células humanas, células CHO, células de insecto
o células de levadura.
La presente invención surge del descubrimiento
de actividades de la proteína vpr reguladora de VIH (mencionada en
este documento como "proteína vpr"). Se ha descubierto que la
proteína de VIH vpr induce que las células indiferenciadas
se diferencien en individuos infectados con VIH ya que pueden
producir anticuerpos que se unen específicamente a vpr
eucariota. Estas actividades y funciones de vpr permiten que
vpr sea útil en métodos in vitro para alterar células
incluyendo células cancerosas y células asociadas con enfermedades
autoinmunes, métodos para identificar compuestos que inhiban la
infección por VIH y/o replicación, y composiciones
farmacéuticas.
La invención se refiere a la capacidad de
vpr de inducir que células indiferenciadas se diferencien. En
algunas realizaciones, se usa vpr en una composición
farmacéutica para tratar a individuos que padecen enfermedades
asociadas con células indiferenciadas hiperproliferantes tales como
cáncer o psoriasis. En algunas realizaciones, se usan vpr
como un reactivo para inducir in vitro que células
indiferenciadas se diferencien. En algunas realizaciones, las
células tumorales indiferenciadas de origen de tipo celular
específico se inducen para que se diferencien de nuevo a su tipo
celular anterior. Se cree que la capacidad de vpr para
estimular la diferenciación ayuda al virus en la replicación
produciendo un entorno o condiciones deseables, particularmente
para la producción de partículas virales. Por consiguiente, en un
aspecto de la invención, pueden identificarse compuestos
anti-VIH identificando compuestos que inhiban la
actividad de vpr para inducir la diferenciación en células
indiferenciadas.
La presente invención también se refiere al uso
de fragmentos funcionales de vpr para inducir in vitro
la diferenciación de células indiferenciadas y a reactivos y
composiciones farmacéuticas que comprenden fragmentos funcionales
de vpr y a usos de fragmentos funcionales de vpr. Como
se usa en este documento, se entiende que la expresión "fragmento
funcional de vpr" se refiere a un fragmento de vpr
que retiene su capacidad de inducir la diferenciación de células
indiferenciadas. El fragmento funcional de vpr es al menos
aproximadamente 5 aminoácidos de longitud derivado de vpr y
puede comprender secuencias aminoacídicas no vpr. Un
especialista en la técnica puede determinar fácilmente si una
proteína o péptido es un fragmento funcional de vpr
examinando su secuencia y ensayando su capacidad de diferenciar
células indiferenciadas sin experimentación excesiva. Las versiones
truncadas de vpr pueden prepararse y ensayarse usando métodos
rutinarios y material de partida fácilmente disponible. Como se usa
en este documento, también se entiende que la expresión "fragmento
funcional" hace referencia a péptidos, polipéptidos, secuencia
de aminoácidos unida por enlaces no peptídicos, o proteínas que
comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica o
sustancialmente homóloga a al menos una parte de la secuencia de
aminoácidos de la proteína vpr y que son capaces de inducir que una
célula indiferenciada hiperproliferante se diferencie. La expresión
"sustancialmente homóloga" se refiere a una secuencia de
aminoácidos que tiene sustituciones conservativas. Un especialista
en la técnica puede producir fragmentos funcionales de la proteína
vpr siguiendo la descripción proporciona en este documento y
técnicas bien conocidas. Los fragmentos funcionales identificados
de este modo pueden usarse y formularse en lugar de vpr de longitud
completa sin experimentación excesiva.
Los aspectos terapéuticos incluyen el uso de
vpr, un fragmento funcional de vpr, moléculas de ácido
nucleico que codifican vpr o moléculas de ácido nucleico que
codifican un fragmento funcional de vpr en la fabricación de
composiciones farmacéuticas útiles para tratar a un individuo que
padece enfermedades asociadas con células indiferenciadas
hiperproliferantes tales como cáncer o psoriasis.
Un aspecto de la presente invención es usar vpr,
fragmento funcional de vpr, moléculas de ácido nucleico que
codifican vpr o moléculas de ácido nucleico que codifican
vpr o moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento
funcional de vpr en la fabricación de una composición
farmacéutica para combatir enfermedades que se caracterizan por la
hiperproliferación de células indiferenciadas tales como cáncer o
psoriasis. De acuerdo con la invención, se proporcionan
composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr o
un fragmento funcional de la misma o una molécula de ácido nucleico
que comprende una secuencia de ADN o ARN que codifica la proteína
vpr o un fragmento funcional de la misma.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr de VIH o
un fragmento funcional de la misma y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que
comprenden la proteína vpr o un fragmento funcional de la
misma son útiles para tratar a un individuo que tiene una patología
o afección caracterizada por células indiferenciadas
hiperproliferantes. Como se describe en este documento, las
composiciones farmacéuticas útiles para tratar enfermedades
caracterizadas por células indiferenciadas hiperproliferantes puede
incluir la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma
ya que la proteína vpro un fragmento funcional de la misma son por
definición agentes que inducen que las células indiferenciadas se
diferencien. Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención son particularmente útiles para tratar un cáncer
caracterizado por tumores sólidos. La capacidad de estimular
células indiferenciadas hiperproliferantes a diferenciarse
proporciona un medio para alterar la hiperproliferación de las
células. En enfermedades tales como cáncer y psoriasis que están
caracterizadas por la hiperproliferación de células
indiferenciadas, la composición farmacéutica es útil para estimular
que las células indiferenciadas se diferencien. Cuando se induce a
células indiferenciadas hiperproliferantes a diferenciarse, cesan de
proliferar y finalmente mueren.
Por consiguiente, otro aspecto la presente
invención es el uso de una cantidad de proteína vpr suficiente para
estimular la diferenciación de células indiferenciadas
hiperproliferantes en la fabricación de un medicamento para tratar
a un individuo que padece una enfermedad asociada con células
indiferenciadas hiperproliferantes.
Vpr puede producirse por un medio
rutinario usando materiales de partida fácilmente disponibles como
se ha descrito anteriormente. La secuencia de ácido nucleico que
codifica vpr así como la secuencia de aminoácidos de la proteína
son bien conocidas. El genoma completo de VIH está publicado. Las
secuencias de las repeticiones terminales largas están presentadas
en Stacich, B. et al., (1985) Science 227:
538-540. Las secuencias de nucleótidos completas
están presentadas en Ratner, L. et al., (1985) Science
313:277-284 y Ratner, L. et al.,
(1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses
3:57-69. La secuencia de ADN de
HIV-1/3B está publicada en Fisher, A., 1985
Nature 316:262. La secuencia de nucleótidos de la cepa
HXB2 de VIH-1 está disponible en línea con el
número de acceso a Genbank K03455. La secuencia de ADN de VIH está
publicada en Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro.
8:1549. La secuencia está accesible en Genbank Nº: M17449.
Cada una de estas referencias que incluye la información de
secuencia disponible al público se incorpora en este documento como
referencia.
Las moléculas de ADN que codifican vpr están
fácilmente disponibles al público. El plásmido
pNL-43 que contiene una secuencia de ADN que
codifica la cepa MN de VIH-1 que incluye la proteína
vpr y el plásmido pHXB2 que contiene una secuencia de ADN que
codifica la cepa HIV-1/3B de VIH están ambas
disponibles en el AIDS Research Referente and Reagen Program
(ARRRP), Division of AIDS, NIAID, NIH, Bethesda, MD.
Proporcionar una secuencia de ADN adecuada que
codifique la proteína deseada permite la producción de la proteína
usando técnicas recombinantes ahora conocidas en la técnica. La
secuencia codificante puede obtenerse recuperando la secuencia de
ADN de los plásmidos disponibles al público que comprende ADN que
codifica la proteína vpr. La secuencia de ADN también puede
obtenerse de otras fuentes de ADN de VIH o puede prepararse
químicamente usando una secuencia de nucleótidos sintetizada.
Cuando el ADN codificante se prepara de forma sintética, puede
obtenerse la ventaja de preferencias de codones conocidas del
hospedador pretendido donde tiene que expresarse el ADN.
Un especialista en la técnica puede, usando
técnicas bien conocidas, obtener una molécula de ADN que codifique
la proteína vpr e insertar esa molécula de ADN en un vector
de expresión disponible en el mercado para su uso en sistemas de
expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido disponible en el
mercado pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la
producción en E. coli. El plásmido disponible en el mercado
pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para producción en
cepas de levadura de S. cerevisiae. El sistema de expresión
de baculovirus completo MaxBac^{TM} (Invitrogen, San Diego, CA)
disponible en el mercado puede usarse para la producción en células
de insecto. El plásmido pcDNA I disponible en el mercado
(Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción en
células de mamífero tales como células de Ovario de Hámster
Chino.
Un especialista en la técnica puede usar estos
sistemas de vectores de expresión comerciales y otros para producir
la proteína vpr usando técnicas rutinarias y materiales de partida
fácilmente disponibles.
Un especialista en la técnica puede usar otros
vectores de expresión y sistemas disponibles en el mercado o
producir vectores usando métodos bien conocidos y materiales de
partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que
contienen las secuencias de control necesarias, tales como
promotores y señales de poliadenilación, y preferiblemente
potenciadores, están fácilmente disponibles y son conocidos en la
técnica para una diversidad de hospedadores. Véase, por ejemplo
Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory
Manual, Segunda Ed. Col. Spring Harbor Press (1989). Por tanto,
las proteínas deseadas pueden prepararse tanto en sistemas
procariotas como eucariotas, produciendo un espectro de formas
procesadas de la proteína.
El sistema procariota más comúnmente usado sigue
siendo E. coli, aunque también son útiles otros sistemas
tales como B. subtilis y Pseudomonas. Las secuencias
de control adecuadas para sistemas procariotas incluyen promotores
tanto constitutivos como inducibles que incluyen el promotor
lac, el promotor trp, promotores híbridos tales como el
promotor tac, el promotor P1 del fago lambda. En general, las
proteínas extrañas pueden producirse en estos hospedadores como
proteínas de fusión o maduras. Cuando las secuencias deseadas se
producen como proteínas maduras, la secuencia producida puede estar
precedida por una metionina que no se retira de forma eficaz
necesariamente. Por consiguiente, los péptidos y proteínas
reivindicados en este documento pueden estar precedidos por una Met
N-terminal cuando se produce en bacterias. Además,
las construcciones pueden hacerse donde la secuencia codificante
para el péptido está precedida por un péptido señal operativo que
provoca la secreción de la proteína. Cuando se producen en
hospedadores procariotas a este respecto, la secuencia señal se
retira después de la secreción.
También está ahora disponible una amplia
diversidad de hospedadores eucariotas para la producción de
proteínas extrañas recombinantes. Como bacterias, los hospedadores
eucariotas pueden transformarse con sistemas de expresión que
producen la proteína deseada directamente, pero más habitualmente se
proporcionan secuencias de señal para realizar la secreción de la
proteína. Los sistemas eucariotas tienen la ventaja adicional de que
son capaces de procesar intrones que pueden existir en las
secuencias genómicas que codifican proteínas de organismo
superiores. Los sistemas eucariotas también proporcionan una
diversidad de mecanismos de procesamiento que provocan, por
ejemplo, la glicosilación, amidación
carboxi-terminal, oxidación o derivatización de
ciertos restos aminoacídicos, control conformacional y etc.
Los sistemas eucariotas habitualmente usados
incluyen, aunque sin limitación, levaduras, células fúngicas,
células de insecto, células de mamífero, células de ave, y células
de plantas superiores. Están disponibles promotores adecuados que
son compatibles y funcionales para su uso en cada uno de estos tipos
de hospedador así como secuencias de terminación y potenciadores,
como por ejemplo el promotor del poliedro de baculovirus. Como
anteriormente, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles.
Por ejemplo, en sistemas de mamífero, puede inducirse el promotor
de la metalotioneína de ratón por la adición de iones de metales
pesados.
Las particularidades para la construcción de
sistemas de expresión adecuados para hospedadores deseados son
conocidas para los especialistas en la técnica. Para la producción
recombinante de la proteína, el ADN codificante se liga
adecuadamente en el vector de expresión de elección y después se usa
para transformar el hospedador compatible que después se cultiva y
se mantiene en condiciones en las que tiene lugar la expresión del
gen extraño. La proteína de la presente invención producida de este
modo se recupera del cultivo, lisando las células o del medio de
cultivo según sea apropiado y conocido por los especialistas en la
técnica.
Un especialista en la técnica, puede, usando
técnicas bien conocidas, aislar la proteína vpr producida usando
dichos sistemas de expresión.
Además de producir estas proteínas por técnicas
recombinantes, también pueden emplearse sintetizadores de
aminoácidos automáticos para producir la proteína vpr. Debe
observarse adicionalmente que si las proteínas de este documento se
preparan sintéticamente, también puede hacerse sustitución de
aminoácidos que no están codificados por el gen. Los restos
alternativos incluyen, por ejemplo, los aminoácidos \omega de
fórmula H_{2}H(CH_{2})_{n}COOH en la que n es
2-6. Estos son aminoácidos neutros, no polares, como
la sarcosina (Sar), t-butilalanina
(t-BuAla), t-butilglicina
(t-BuGly), N-metil isoleucina
(N-Melle) y norleucina (Nleu). La fenilglicina, por
ejemplo, puede sustituirse por Trp, Tyr o Phe, un aminoácido neutro
aromático; la citrulina (Cit) y sulfóxido de metionina (MSO) son
polares pero neutros, la citohexil alanina (Cha) es neutra y no
polar, el ácido cisteico (Cya) es ácido, y la ornitina (Om) es
básica. Las propiedades que confieren conformación de los restos de
prolina pueden obtenerse si se sustituye uno o más de estos por
hidroxiprolina (Hyp).
La composición farmacéutica que comprende la
proteína vpr y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable
puede formularse por un especialista en la técnica con composiciones
seleccionadas dependiendo del modo elegido de administración. Los
vehículos farmacéuticos adecuados se describen en la edición más
reciente de Remignton's Pharmaceutical Science, A. Osol, un
texto de referencia convencional en este campo.
Para administración parenteral, la proteína vpr
puede, por ejemplo, formularse como una solución, suspensión,
emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo
parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de dichos
vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de
dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. También pueden usarse
liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijados. El
vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen
la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y la
estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La
formulación se esteriliza por técnicas habitualmente usadas. Por
ejemplo, una composición parenteral adecuada para administración por
inyección se prepara disolviendo un 1,5% en peso de ingrediente
activo en un 0,9% de solución de cloruro sódico.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
la presente invención pueden administrarse como dosis sencillas o
en múltiples dosis. Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden administrarse como agentes terapéuticos
individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los
tratamientos de la presente invención pueden combinarse con
terapias convencionales, que pueden administrarse secuencial o
simultáneamente.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
la proteína vpr, o fragmentos o derivados pueden administrarse por
cualquier medio que posibilite que el agente activo alcance el sitio
de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Como las
proteínas se someten a digestión cuando se administran por vía oral,
se usaría de forma ordinaria administración parenteral, es decir,
intravenosa, subcutánea, intramuscular, para optimizar la
absorción. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden inyectarse en un sitio en o cerca del crecimiento
hiperproliferativo. Por ejemplo, la administración puede ser por
inyección directa en una masa de tumor sólido o en el tejido
directamente adyacente a la misma. Si el individuo a tratar padece
psoriasis, la proteína de vpr puede formularse con un vehículo
tópico farmacéuticamente aceptable y la formulación puede
administrarse de forma tópica en forma de una crema, loción o
pomada, por ejemplo.
La dosificación administrada varía dependiendo
de factores tales como: características farmacodinámicas; su modo y
vía de administración; edad, salud y peso del destinatario;
naturaleza y grado de los síntomas; tipo de tratamiento
concurrente; y frecuencia de tratamiento. Habitualmente, una
dosificación diaria de proteína vpr puede ser de
aproximadamente 1 \mug a 100 miligramos por kilogramos de peso
corporal. Habitualmente de 0,5 a 50, y preferiblemente de 1 a 10
miligramos por kilogramo por día dado en dosis divididas de 1 a 6
veces al día o en forma de liberación sostenida que es eficaz para
obtener resultados deseados.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido
nucleico que codifica vpr y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con la presente invención,
el material genético que codifica la proteína vpr se suministra a un
individuo en una forma expresable. El material genético, ADN o ARN,
se capta por las células del individuo y se expresa. La proteína
vpr que se produce de este modo puede estimular que las
células indiferenciadas hiperproliferantes se diferencien. Por
tanto, las composiciones farmacéuticas que comprenden material
genético que codifica la proteína vpr son útiles del mismo modo que
composiciones farmacéuticas que comprendan la proteína vpr: para
tratar a un individuo que tenga una patología o afección
caracterizada por células indiferenciadas hiperproliferantes. Las
composiciones farmacéuticas de la presente invención son
particularmente útiles para tratar cáncer caracterizado por tumores
sólidos.
Por tanto, un aspecto adicional de la presente
invención se refiere a una cantidad de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vpr
unida de forma operativa a elementos reguladores necesarios para la
expresión en la fabricación de un medicamento para tratar a un
individuo que padece una enfermedad asociada con células
indiferenciadas hiperproliferantes.
Las secuencias de nucleótidos que codifican la
proteína vpr unida de forma operativa a elementos reguladores
necesarios para la expresión en la célula del individuo puede
suministrarse como composiciones farmacéuticas usando estrategias
de terapia génica que incluyen, aunque sin limitación, vectores
virales tales como vectores adenovirales o retrovirales o
transferencia directa de ácido nucleico. Los métodos de suministro
de ácidos nucleicos que codifican proteínas de interés usando
vectores virales están ampliamente presentados. Se prepara un
vector viral recombinante tal como un vector retroviral o adenoviral
usando métodos y materiales de partida rutinarios. El vector viral
recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
vpr. Dicho vector se combina con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. La preparación farmacéutica resultante
puede administrarse a un individuo. Una vez que un individuo se ha
infectado con el vector viral, la proteína vpr se producen en las
células infec-
tadas.
tadas.
Como alternativa, puede administrarse una
molécula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
vpr como una composición farmacéutica sin el uso de vectores
infecciosos. La molécula de ácido nucleico puede ser ADN o ARN,
preferiblemente ADN. La molécula de ADN puede ser lineal o circular,
es preferiblemente un plásmido. La molécula de ácido nucleico se
combina con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con la invención, la composición
farmacéutica que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica la proteína vpr puede administrarse directamente al
individuo o suministrarse ex vivo en células retiradas del
individuo que se reimplantan después de la administración. Por
cualquier vía, el material génico se introduce en las células que
están presentes en el cuerpo del individuo. Las vías preferidas de
administración incluyen inyección intramuscular, intraperitoneal,
intradérmica y subcutánea. Como alternativa, la composición
farmacéutica puede introducirse por diversos medios en las células
que se retiran del individuo. Dichos medios incluyen, por ejemplo
transfección, electroporación y bombardeo de microproyectiles.
Después de que la molécula de ácido nucleico se haya captado por
las células, se reimplantan en el individuo.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
este aspecto de la presente invención comprenden de aproximadamente
0,1 a aproximadamente 1000 microgramos de ADN. En algunas
realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen
de aproximadamente de 1 aproximadamente 500 microgramos de ADN. En
algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas
contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de
ADN. Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen
aproximadamente 100 microgramos de ADN:
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
este aspecto de la presente invención se formulan de acuerdo con el
modo de administración a usar. Un especialista en la técnica puede
formular fácilmente una molécula de ácido nucleico que codifique
vpr. En casos en los que la inyección intramuscular es el modo
elegido de administración, se usa una formulación isotónica.
Generalmente, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro
sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. Pueden usarse
soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con
fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para estimular que células indiferenciadas se
diferencien, lo que comprende la etapa de poner en contacto dichas
células in vitro con una cantidad de proteína vpr o
una molécula de ácido nucleico que codifique vpr suficiente
para estimular la diferenciación.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para identificar compuestos que inhiban que vpr
estimule la diferenciación de células indiferenciadas, lo que
comprende las etapas de poner primero en contacto, en presencia de
un compuesto de ensayo, dichas células con una cantidad de proteína
vpr suficiente para estimular la diferenciación y después observar
dichas células para determinar si sucede la diferenciación celular.
Se cree que la capacidad de vpr de estimular que células
indiferenciadas se diferencien, es importante para la producción
eficaz de partículas virales durante la infección de VIH.
Identificar compuestos que impidan la estimulación por vpr
de la diferenciación celular proporciona una diana de fármaco para
combatir el virus.
De acuerdo con este aspecto de la invención, se
identifican compuestos que modulan la estimulación por vpr
de la diferenciación de células indiferenciadas. Se proporciona un
ensayo que compara la estimulación de la diferenciación por vpr en
presencia o ausencia de compuestos de ensayo. Usando este ensayo,
pueden identificarse compuestos que modulan la actividad
estimuladora de vpr. En particular, pueden identificarse compuestos
que inhiben la acción estimuladora de vpr. Dichos compuestos pueden
ser útiles como agentes terapéuticos anti-VIH.
El método de la presente invención comprende la
etapa de poner en contacto células indiferenciadas con vpr
en presencia de un compuesto de ensayo. Las células después pueden
observarse para determinar si la vpr induce la
diferenciación. Puede proporcionarse un control en el que se ponga
en contacto vpr con células en ausencia de compuesto de
ensayo. Puede proporcionarse un control adicional en el que el
compuesto de ensayo se pone en contacto con células en ausencia de
vpr. Si las células en contacto con vpr en presencia
de compuesto de ensayo no se diferencian, entonces se indica
actividad anti-vpr para el compuesto de ensayo. Esto puede
confirmarse si las células en contacto con vpr en ausencia de
compuesto de ensayo se diferencian y las células en contacto con el
compuesto de ensayo en ausencia de vpr no se diferencian.
El ensayo puede realizarse usando muchos tipos
diferentes de células indiferenciadas y el suministro de vpr a
través de una diversidad de medios. Además, pueden usarse fragmentos
funcionales de vpr en lugar de vpr. Un especialista en la
técnica, siguiendo los contenidos de la memoria descriptiva, puede
apreciar fácilmente los varios modos para practicar este aspecto de
la presente invención.
Las células indiferenciadas incluyen células
madre excepto células madre embrionarias humanas en el contexto de
la presente invención, y células transformadas tales como células
tumorales en cultivo. Se prefiere que el tipo celular elegido sea
uno en el que las células diferenciadas se puedan distinguir
fácilmente de las células indiferenciadas. En algunas realizaciones
de la invención, los tipos celulares preferidos son los de
rabdomiosarcoma alveolar de tumor muscular sólido tal como las
líneas celulares RD, TE671 y D17. MG63 y HOS-TE86,
que son ejemplos de líneas celulares de osteosarcoma, también pueden
usarse. Las líneas celulares KG-1,
THP-1, U937 HL60 y PLB973 son ejemplos de células de
linaje mieloide que pueden usarse en el ensayo. Otras líneas
celulares que pueden usarse en el ensayo incluyen la línea celular
de glioblastoma humano U-138MG, la línea celular de
glioblastoma/astrocitoma humano U373MG y la línea celular de
glioblastoma/astrocitoma humano U87-MG.
El compuesto de ensayo se proporciona,
preferiblemente en solución. Pueden usarse diluciones en serie de
los compuestos de ensayo en una serie de ensayos. El compuesto de
ensayo puede añadirse a concentraciones de 0,01 \muM a 1 M. Un
intervalo preferido de concentraciones finales de un compuesto de
ensayo es de 10 \muM a 100 \muM. Un compuesto de ensayo que sea
eficaz para inhibir la actividad de vpr es un anticuerpo que
se une específicamente a vpr y evite que induzca la diferenciación
de células indiferenciadas.
Vpr puede suministrarse por una
diversidad de medios. En algunas realizaciones de la invención, se
combina con células como una proteína. La proteína vpr puede
añadirse directamente al medio de cultivo celular. La proteína
vpr puede producirse a partir de materiales de partida
ampliamente disponibles usando técnicas bien conocidas, tales como
las descritas anteriormente. Un intervalo de concentración preferido
de la vpr usada es de aproximadamente 1 \mug/ml a un 1
mg/ml.
Como alternativa, puede ponerse en contacto
vpr con células diferenciadas introduciendo en la célula una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido
nucleico que codifica vpr. En dichas realizaciones, la
secuencia de ácido nucleico puede introducirse como parte de una
partícula de VIH, parte de un sistema de expresión infeccioso
recombinante o parte de un vector de expresión tal como un plásmido.
Además, también puede introducirse ADN lineal o ARN en la célula en
una forma expresable. Un especialista en la técnica puede construir
cualquiera de varios vectores de expresión u otra molécula de ácido
nucleico diseñada para producir vpr en células cultivadas. Dicho
sistema de expresión puede incluir un sistema de vector para
introducir el material genético o la molécula de ácido nucleico
puede introducirse por otras técnicas convencionales tales como
transfección, electroporación o bombardeo de microproyectiles.
Los especialistas en la técnica pueden
distinguir las células indiferenciadas de células diferenciadas de
forma rutinaria. Los métodos para distinguir células diferenciadas
de células indiferenciadas incluyen observar diferencias
morfológicas, metabólicas y bioquímicas entre fases celulares. Por
ejemplo, diferencias en tamaño, forma y sobre todo el aspecto son a
menudo profundas cuando se compara una célula indiferenciada de una
célula diferenciada correspondiente. Asimismo, la diferenciación de
las células provoca cambios en las proteínas de que se están
produciendo por la célula.
Por ejemplo, las células de rabdomiosarcoma
alveolar diferenciadas producen elevados niveles de miosina, una
proteína muscular, con relación al nivel de miosina producida por
células de rabdomiosarcoma alveolar indiferenciadas. Cuando las
células alveolares indiferenciadas se inducen a diferenciarse, el
aumento en la presencia de miosina puede detectarse usando técnicas
rutinarias. El medio para detectar la presencia de un producto
proteico es rutinario e incluye ensayos enzimáticos y ensayos
ELISA. Un especialista en la técnica puede detectar la presencia o
ausencia de una proteína usando métodos bien conocidos.
Específicamente, el conjunto inicial de líneas
celulares que se estudió incluía RD, TE671 y D17 como representantes
de líneas celulares de rabdomiosarcoma (músculo). Los marcadores de
diferenciación para estas células incluyen
alfa-actina esquelética, miosina, creatina quinasa
específica de músculo, y troponina 1.
Los efectos de vpr en la expresión del
fenotipo de los osteoblastos diferenciados en la líneas celulares
de osteosarcoma MG63 y HOS-TE86 pueden observarse
usando marcadores no específicos de alteración en la función
celular tales como morfología y proliferación celular así como la
expresión de marcadores osteoblásticos. Los marcadores de
osteoblastos incluyen la expresión de ARNm de ostocalcina, fosfatasa
alcalina y colágeno de tipo (I) (aI) (por análisis de Northern) y
la síntesis de osteocalcina (por radioinmunoensayo) y fosfatasa
alcalina (ensayo colorimétrico). La especificidad de los efectos de
los compuestos de ensayo en vpr también se compara con los efectos
de los compuestos sobre otros agentes de diferenciación de
osteoblastos establecidos tales como ácido retinoide y 1,25
dihidroxivitamina D_{3}.
Los análisis de diferenciación en líneas
celulares KG-1, THP-1, U937, HL60 y
PLB973, que son de linaje mieloide, incluyen aumentos en la
adherencia plástica, fagocitosis aumentada de perlas de látex,
tinción positiva para alfa-naftil acetato esterasa
y pérdida de expresión de elastasa y catepsina G, por ejemplo.
Adicionalmente, puede correlacionarse la diferenciación de líneas
celulares mieloides con cambios en la expresión de oncogenes
específicos tales como disminuciones en la transcripción de
c-myc.
Durante la diferenciación de líneas celulares de
glioblastoma, tales como la línea celular de glioblastoma humano
U-138MG, la línea celular de
glioblastoma/astrocitoma humano U373MG y la línea celular de
glioblastoma/astrocitoma humano U87-MG, hay un
disminución en la proliferación celular, aumentos en la ornitina
descarboxilasa, aumentos en GFAP, aumentos transitorios en fos,
aumentos en colágeno específico, aumentos en las proporciones
citoplasmática a nuclear, extensión de pseudópodos, crecimiento
neuritas, bipolaridad y actividad citoesquelética activada. Además,
se ha informado de que durante la diferenciación de astrocitos
aumenta la expresión de fibro-
nectina.
nectina.
Aunque las partes de la descripción de este
documento que se refieren a composiciones terapéuticas se refieren
principalmente a agentes terapéuticos útiles para tratar seres
humanos, las composiciones de la presente invención pueden
aplicarse también a usos médicos veterinarios.
Ejemplo
1
El gen vpr de VIH-1 es
suficiente para la diferenciación de la línea celular de
rabdomiosarcoma humano TE617, una línea celular de
rabdomiosarcomas, que son tumores de origen muscular y que pueden
inducirse a diferenciación in vitro. Las células diferencias
se caracterizan por un gran aumento, morfología alterada, ausencia
de replicación, y elevado nivel de expresión de la miosina proteica
específica de músculo. También se ha observado la diferenciación
morfológica e inhibición de la proliferación de otras dos líneas
celulares transformadas. Las células transfectadas con vpr
siguen siendo completamente viables en cultivo durante periodos
prolongados.
El desarrollo de células musculares esqueléticas
maduras implica un proceso ordenado de diferenciación celular a
partir de miocitos destinados al músculo (supuestos mioblastos), en
mioblastos post-mitóticos, para madurar los
miotubos multinucleados que tienen un aparato contráctil muscular
funcional. El rabdomiosarcoma embrionario es un cáncer de un
células que se parecen a supuestos mioblastos y pueden originarse de
células satélite musculares (Bruni, 1979). Las líneas celulares de
rabdomiosarcoma se han usado en estudios de diferenciación muscular
y tumorigénesis, y pueden inducirse a diferenciación a partir de una
población de células de rápida división (tipo mioblastos) que
expresan bajas cantidades de unas pocas proteínas musculares maduras
en células post-mitóticas, enormemente agrandadas y
alargadas, multinucleadas (tipo miotubo) que expresan elevadas
cantidades de proteínas específicas de músculo maduro y un aparato
contráctil muscular funcional (Aguanno, S., et al., (1990)
Cancer Res. 50: 3377-3382; Hiti, A. L.
et al., (1989) Ho. Cell. Biol.
9:4722-4730; Siegel, H. N., y Lukas, R. J.
(1988) Dev. Brain Res. 44:269-280; y
Stratton, M.R., et al., (1989) Carcinogenesis
10:899-905.)
La expresión de VIH en una línea de tumor
celular muscular humano conduce a la inhibición de la proliferación
y activación del programa de diferenciación celular endógeno
suprimido. El gen vpr de VIH-1 es suficiente para
los efectos observados y necesario para la diferenciación de
esencialmente todas las células. Estos resultados establecen a vpr
de VIH-1 como una proteína reguladora capaz de una
profunda regulación de las funciones celulares, incluyendo la
proliferación y diferenciación celular.
La línea TE671 de rabdomiosarcoma embrionario
humano TE671 (ATCC HTB 139) y la línea D17 de osteosarcoma canino
(ATCC CLL 183) se obtuvieron de la American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland. TE671 se clasificó originalmente como una
línea de meduloblastoma. Las células RD se proporcionaron por el Dr.
A. Srinivasan. Todas las células se cultivaron en medio de Eagle
modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al
10%, penicilina-estreptomicina, y piruvato sódico y
se mantuvo en una atmósfera del 5%-6% de CO_{2} a 37ºC.
Se infectaron las células TE671 con retrovirus
murino deficiente en la replicación que contenía el vector de
expresión retroviral de CD4 humano T4-pMV7 como se
describe en Weiner, D.B., et al., (1991), Pathobiology
59:361-371. Las poblaciones clonales se
analizaron para la expresión de CD4 por citometría de flujo como se
describe en Weiner, D.B., et al., (1989) Oncogene
4:1175-1183. En resumen, las células se
incubaron con Leu-3a, un anticuerpo monoclonal
murino específico para la molécula de superficie celular CD4 humano,
o Upc-21, un anticuerpo monoclonal murino de
isotipo coincidente irrelevante. El anticuerpo secundario fue un
anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con
fluoresceína. Se seleccionó un clon CD4^{+} estable para el
análisis adicional y se denomino TE671\Psi.
El clon genómico pNL43 de VIH se obtuvo a través
del National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Referente
Reagen Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and
Infections Diseases, NHI, (Adachi, A., et al., (1986) J.
Virol. 59:284-291), y se usó como
material de partida para la mayoría de las construcciones genéticas
usadas en este estudio. El plásmido pNL43 consta de ADN proviral de
VIH-1 más 3 kb de la secuencia del hospedador del
sitio de integración clonado en pUC18.
Para simplificar etapas de clonación
adicionales, el sitio StuI en el ADN humano flanqueante 5' no
VIH de pNL43 se destruyó por digestión parcial con StuI
seguido por digestión de los extremos libres con polimerasa de
Escherichia coli. El plásmido lineal se rellenó, después se
autoligó dejando un único sitio StuI en el genoma de VIH.
Este plásmido, pNL\Deltastu, después se digirió con las enzimas
StuI y BsaBl de extremos romos, que eliminaron una
gran sección de la secuencia codificante de gp120. El promotor de
SV40 y la región codificante de resistencia a puromicina
(puromicina acetiltransferasa) se aisló de
pBABE-puro (Morganstern, J. P., y Land, H. (1990)
Nucl. Acids Res. 18:3587-3596;
proporcionada amablemente por el Dr. Hartmut Land del Imperial
Cancer Research Fund) usando EcoRI y ClaI. Este
fragmento se cortó con extremos romos, después se clonó en el
pNL\Deltastu digerido con StuI-BsaBI. Se seleccionó
un clon con el fragmento SV40-puro en la
orientación correcta de modo que la repetición terminal larga 3' de
VIH pudiera proporcionar funciones poli(A) para el mensaje
de puromicina acetiltransferasa. Este plásmido se denomino
pNLpuro.
Se amplificó el ADN que codifica la proteína vpr
de VIH por PCR a partir del plásmido pLN43 genómico de
VIH-1. Se realizó la PCR en condiciones que
producen la amplificación de ADN con elevada fidelidad (Ling, L. L.,
et al., (1991) PCR Meth. Appl. 1:
63-69). Se usaron tres cebadores de PCR para
amplificar el gen. Un cebador, llamado cebador de inicio/clonación
universal (USP), codifica sitios de restricción apropiados para
clonar el producto de PCR en un vector, una secuencia consenso
determinada por Kozak, M. (1996) Cell, 44;
283-292, para promover el inicio fuerte de la
traducción, y un sitio de inicio ATG. Este cebador se usó en la
amplificación del gen. El USP se colocó en una PCR con un segundo
cebador corto que consta de un complemento inverso del extremo 3'
del USP más aproximadamente 15 pb del extremo 5' del gen vpr. El
producto bicatenario de esta PCR se usó como cebador 5' en una
segunda reacción con un cebador 3' apropiado específico para el gen
de interés. El cebador 3' introdujo sitios de restricción para la
clonación del producto de PCR. Las secuencias de los cebadores son
las siguientes:
| USP: | ggcggctcgaggatccgccgccaccatg | (SEC ID Nº 1) |
Cebador vpr: cebador enlazador 5',
complementario al USP y el extremo 5' de la fase de lectura abierta
de vpr: ggggcttgttccatggtggc (SEC ID Nº 2)
Cebador vpr: cebador de clonación 3',
complementario al extremo 3' de la fase de lectura abierta de
vpr más en sitio de clonación BamHI:
ccgcggatcctaggatctactggc (SEC ID Nº 3).
El producto de PCR resultante se clonó el vector
retroviral pBABE-puro. El vector
pbabe-puro, que se usa como material de partida
para producir muchas de las construcciones enumeradas a
continuación, se construyó originalmente y se presentó por
Morgenstern, J. P. y H. Land, 1990 Nucl. Acids. Res.
18 (12): 3587-3596, que se incorpora en este
documento como referencia. El plásmido pBabe-puro es
particularmente útil para la expresión de genes exógenos en células
de mamífero. Las secuencias de ADN a expresar se insertan en sitios
de clonación bajo el control del promotor de la repetición terminal
larga (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo MuLV).
El plásmido contiene el marcador de selección para la resistencia a
puromicina. El plásmido resultante se denomina
pBabe-puro-vpr.
Los genes reguladores de VIH nef, vpu y
vif se amplificaron por PCR a partir del plásmido pNL43
genómico de VIH-1. Los cebadores diseñados para
amplificar los genes reguladores restantes (vif, vpu, nef) se
construyeron por el mismo principio de diseño que el empleado en la
amplificación de vpr. Cada gen después se clonó en
pBabe-puro.
Se amplificó una región justo cadena arriba del
único sitio PfMI hasta justo después del codón de terminación
de vif por PCR usando cebadores que introducían un cambio de
aminoácido no conservativo (Glu\rightarrowVal) en el aminoácido
22 de vpr, un codón de parada en la fase de lectura de vpr
inmediatamente después del aminoácido 22, y un sitio EcoRI
inmediatamente después del nuevo codón de parada. Este fragmento de
PCR se sustituyó por el fragmento PfMI-EcoRI de
pNLpuro o pNL43. Esta sustitución provoco la deleción del
nucleótido 122 de la fase de lectura abierta de vpr,
eliminando de este modo la posibilidad de reversión. Los plásmidos
resultantes, pNLpuro\Deltavpr y pNL\Deltavpr, codifican los
primeros 21 aminoácidos naturales de vpr más una valina más todos
los otros genes restantes de VIH-1 y uniones de
corte y empalme en su forma nativa.
La región codificante de los dos exones de rev y
las fases de lectura abierta de vpu y env de
VIH-1 HXB2 se amplificó por PCR y se clonó en el
vector de expresión pCDNAI/neo (Invitrogen). La expresión de las
proteínas rev y env se demostró por análisis de transferencia de
Western y por la capacidad de las células transfectadas con esta
construcción de fusionarse con líneas celulares CD4^{+}.
tat
Se obtuvo el plásmido pCV1 de expresión de tat
de VIH-1 a través del Aids Research and Referente
Reagen Program. Se subclonó una región del vector
pBABE-hygro (Morganstern, J.P. y Land, H (1990),
Nucl. Acids. Res. 18:3587-3596) que
expresa resistencia a higromicina en este plásmido para preparar
pCV1-hygro. Como alternativa, se cotransfectó pCV1
con pBABE-puro a una proporción de 100:1. Se
obtuvieron resultados idénticos con ambos métodos.
Se transfectaron células TE671 (0,5 x 10^{6} a
1,0 x 10^{6}) usando DOTAP (Boehringer Mannheim) con vectores de
expresión que codifican genes reguladores individuales. Se lisaron
las células cuarenta y ocho horas después in situ usando
RNA_{20L} B (Biotecs Laboratorios, Inc.) y se preparó ARN celular
total de acuerdo con metodología convencional. Se preparó ADNc por
transcripción inversa usando cebadores de 6 unidades aleatorios y
la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney.
Se usó una alícuota de ADNc como molde en la amplificación por PCR.
Como control para la posible contaminación de ADN genómico, se
usaron alícuotas de ARN no sometido a transcripción inversa como
moldes en PCR.
Para el análisis de la infectividad de TE671 y
TE671\Psi, se cultivaron las células hasta una confluencia del
80% en matraces de cultivo tisular, después se incubaron con
sobrenadantes filtrados (tamaño de poro de 0,2 \mum) a partir de
células HUT-78 crónicamente infectadas con
VIH-1 (cepa RF). Un día después se lavaron las
células una vez con solución salina tamponada con fosfato que
contenía tripsina (2,5 mg/ml), después dos veces con medio de
cultivo para retirar el virus residual usado para infectar las
células. Los sobrenadantes se recogieron a intervalos de 24 horas
sucediendo la primera recogida inmediatamente después de la etapa de
lavado. La detección del antígeno p24^{gag} se realizó usando un
kit de ensayo de antígeno p24 de VIH1 (Coulter Immunology, Coulter
Corporation) según las instrucciones del fabricante. Este método
emplea un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de
antígeno. Los pocillos se analizaron para la absorbancia a 450 nm en
un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Dynatech
MR5000.
Para experimentos de diferenciación se
transfectaron células TE671 por electroporación o con el método
mediado por lípidos usando DOTAP. Aunque DOTAP producía
transfecciones más eficaces que la electroporación, se obtuvieron
resultados idénticos con los dos métodos con respecto a la
diferenciación. Se transfectaron células RD y D17 usando DOTAP. En
resumen, se realizó la electroporación con un
Bio-Rad GenePulser y Pulse Controller en 2 x
10^{4} a 5 x 10^{4} células recogidas en crecimiento en fase
logarítmica. La transfección con DOTAP se realizó según las
instrucciones del fabricante en matraces de cultivo tisular en 0,5 x
10^{4} a 1 x 10^{4} en crecimiento en fase logarítmica. En
cualquier caso se añadió medio de selección 48-60
horas después de la transfección, y se mantuvieron las células en
selección mientras duraron los experimentos. Las células
transfectadas con plásmidos que contenían el gen de resistencia a
puromicina (puromicina acetiltransferasa) se seleccionaron en 1
\mug/ml de puromicina. La selección con neomicina fue en mg/ml de
G418.
Se transfectaron células TE671 con el vector de
expresión de vpr, y 48 horas después se trataron con tripsina
las células, se transfirieron a portaobjetos de vidrio, y se
seleccionaron con puromicina durante 5 días antes de la tinción. Se
cultivaron las células TE671 no transfectadas de rápida
proliferación en portaobjetos de vidrio durante 2-4
días antes de la tinción. Se realizó la permeabilización y fijación
con metanol al 100% a -20ºC durante 10 minutos. Las etapas
restantes se realizaron en tampón PHEM, que consta de HEPES 25 mM,
PIPES 60 mM, EGTA 10 mM, MgCl_{2} 2 mM (pH 6,9). Las células
fijadas se lavaron tres veces con PHEM entre cada etapa. Las
células se bloquearon primero con suero de cabra normal al 5% para
reducir la tinción no específica. El anticuerpo monoclonal murino
MY-32 que es específico para la cadena pesada de la
miosina de músculo esquelético de contracción rápida (tipo II)
(Sigma número M4276), después se incubó con las muestras. Como
control negativo, se usó un anticuerpo de isotipo coincidente
(SIM.4 anti-CD4, obtenido a través del AIDS Research
and Referente Program del Dr. James Hildreth) como anticuerpo
primario en algunas células. Se usó inmunoglobulina G de cabra
anti-ratón conjugada con rodamina (TAGO), como
anticuerpo secundario, o como alternativa se usó un anticuerpo
secundario conjugado con peroxidasa (Boehringer Mannheim). Las
células se lavaron con PHEM, después se examinaron en un
microscopio de fluorescencia y se fotografiaron.
Se sembraron células CD4^{+} TE671\Psi o
CD4^{-} TE671 en cultivo tisular a muy baja confluencia (<5%).
Un día después, se añadió el sobrenadante y las células infectadas a
partir de células de linfoma T HUT-78 CD4+
infectadas con VIH-1 (cepas RF o MN). El siguiente
día se lavaron las células infectadas del cultivo, y se añadió
medio reciente a las células. Las células se examinaron para la
diferenciación comenzando en el segundo día después de la
infección.
Se construyó un plásmido genómico de
VIH-1 mutante con deleción de env seleccionable por
fármacos, pNLpuro, basado en clon pNL43 molecular infeccioso de
VIH-1. pNL puro se introdujo por transfección en la
línea celular de rabdomiosarcoma humano TE671 y se seleccionaron
los transfectantes estables. Las células TE671 normalmente crecen
como pequeñas células adherentes tipo fibroblasto redondeadas o
policlonales mononucleadas de aproximadamente 3-7
\mum de longitud y desarrollan largas protuberancias, algunas
veces ramificadas. Algunas células llegaron a ser grandes, planas y
de forma irregular. Las células que se diferencian llegan a menudo a
ser bi o multinucleadas, aunque las células con protuberancias
largas que se parecen a miotubos carecen de la disposición lineal de
muchos núcleos que se encuentran en los verdaderos miotubos. Las
células grandes permanecieron completamente viables durante varias
semanas.
La diferenciación de células TE671 por agentes
químicos es un fenómeno bien descrito, ya que esta línea celular se
ha usado como un modelo para la diferenciación de músculo
esquelético. Algunos agentes, incluyendo ésteres de forbol que
activan la proteína quinasa C, así como un medio sin suero, inducirá
que las células TE671 experimenten alteraciones tanto en morfología
como en las características de crecimiento que son paralelas en
muchos aspectos a la diferenciación de los mioblastos en miotubos.
Las células TE671 estimuladas con miristato acetato de forbol
aumentarán el tamaño global y longitud, a menudo están
multinucleadas, y presentan proliferación ralentizada. Por otro
lado, no se observaron células transfectadas con pNLpuro
diferenciadas morfológicamente que se dividieran después de hasta
10 días.
Para definir el gen o genes virales responsables
de la inducción de la diferenciación celular en la línea celular de
rabdomiosarcoma, se examinaron genes reguladores de
VIH-1 individuales, ya que se ha informado de que
algunos de sus productos proteicos influyen en los acontecimientos
celulares. Se obtuvo un vector de expresión tat (Arya, S.K., et
al., (1985) Science 229:69-73) y
se modificó para permitir la selección de células transfectadas
estables. La región env-rev de
VIH-1 se amplificó por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) a partir de un clon molecular de
VIH-1 y se subclonó directamente en el vector de
expresión pCDNAI/neo. Para clonar los genes reguladores restantes
en vectores de expresión, se amplificó la fase de lectura abierta
única de cada gen usando PCR. Durante la amplificación por PCR se
introdujo una secuencia de inicio del ribosoma consenso
inmediatamente cadena arriba de cada codón de inicio. Los genes que
codifican las proteínas reguladoras nef, vpr, vif y
vpu se amplificaron por este método y se subclonaron el
vector de expresión pBABE-puro.
Cada plásmido se transfectó en células TE671 y
se seleccionó en el antibiótico apropiado. La expresión de
rev se demostró indirectamente mostrando la expresión de la
proteína de envuelta (env) en ensayos de transferencia de
Western y fusión celular. Como la expresión de env depende del nivel
umbral crítico de la expresión de rev, puede deducirse que se
producían niveles fisiológicamente relevantes de rev. La
proteína vpr expresada a partir del vector vpr mostró
una única especie de 15 kD por análisis de transferencia de
Western. La expresión celular de tat, vif, vpr, vpu y
nef se demostró por análisis de PCR de transcripción
inversa. Los productos de PCR se procesaron en genes de agarosa al
2% y se tiñeron con bromuro de etidio para fotografía. Como control
contra posible cruce de ADN en las preparaciones de ARN, se usó el
ARN que no se sometió a transcripción inversa como molde en
PCR.
La expresión de vpu, vif, tat, nef, rev y
env no logró inducir cambios morfológicos significativos en
células TE671. La expresión de vpr, por otro lado indujo una
diferenciación profunda en la mayoría de las células
transfectadas.
Para verificar que la diferenciación de TE671
implica el desarrollo del fenotipo muscular bien definido y no un
programa nuevo, las células TE671 transfectadas con vpr se
tiñeron con un anticuerpo específico para la cadena pesada de
miosina de músculo esquelético de contracción rápida, que se expresa
a elevados niveles solamente en células de músculo esquelético
maduro. El anticuerpo MY-32 reaccionó fuertemente
con células TE671 transfectadas con vpr. La mayoría de las
células TE671 no transfectadas expresaron bajos niveles de miosina,
aunque, como se ha informado previamente para TE671, unas pocas
células no transfectadas se tiñeron ligeramente para miosina. La
tinción con un anticuerpo de control de isotipo coincidente fue
negativa para células TE671 tanto transfectadas como no
transfectadas.
La eficacia de transfección conseguida por el
vector vpr fue igual a la eficacia de transfección de los otros
vectores. La eficacia de transfección se determinó por la cantidad
de células que permanecen después de la selección en puromicina
durante 2 días, que es tiempo suficiente para eliminar todas las
células no transfectadas. Después de varios días más, pareció haber
muchas menos células en el cultivo vpr que en cultivo no
vpr, debido a la replicación continuada de las células en
los cultivos no vpr. Sin embargo, no todas las células
transfectadas con el plásmido pNLpuro genómico o con vpr solo
experimentaron diferenciación morfológica. Este resultado es
coherente con la respuesta heterogénea observada en líneas de
rabdomiosarcoma sometidas a condiciones inductoras de
diferenciación. Muchas células permanecieron sin diferenciar en los
cultivos transfectados con vpr (10%-20%) que en los cultivos
de pNLpuro (<1%). La eficacia de transfección igual en el cultivo
vpr indica que vpr no eliminaba células en
replicación y dejaba vivas solamente las células diferenciadas
espontáneamente de origen natural, que en teoría podría producir una
falsa interpretación de que vpr puede inducir la
diferenciación. La cantidad absoluta de células diferenciadas en los
cultivos transfectados con vpr de VIH también fue mayor que
la encontrada las otras transfecciones de genes reguladores o en
células TE671 no transfectadas, indicando adicionalmente que vpr
inducía diferenciación en lugar de "revelar" célula
diferenciadas de otro modo. Además, las células del fenotipo radical
observadas en cultivos transfectados con vpr de VIH nunca se
observaron en los controles no transfectados o en las células
transfectadas por otros genes reguladores.
El gen vpr se introdujo por transfección
en la línea RD de rabdomiosarcoma relacionada con TE671 y la línea
D17 de sarcoma osteogénico (osteosarcoma) para examinar la
generalidad de los efectos observados en TE671. Después de la
selección con fármaco de las células transfectadas, se observó una
alteración radical en el tamaño y morfología en ambas líneas
celulares. La inhibición de la proliferación se observó en ambas
líneas. La video microscopia de intervalo de tiempo de células D17
mostró que eran muy activas. Las regiones centrales o perinucleares
de muchas células rotaron con un periodo de aproximadamente 2 horas,
provocando frecuentemente una forma creciente distinta. La mayoría
de las células grandes en ambos cultivos permanecían viables
durante al menos 2 semanas y no proliferaban, aunque algunas células
proliferantes pequeñas permanecían tanto en transfectantes D17 como
RD, como se observó en los cultivos TE671. Las células de
osteosarcoma D17 no expresaron niveles aumentados de fosfatasa
alcalina, sin embargo, que es un marcador de la maduración ósea.
A continuación se examinó si vpr es
necesaria para la diferenciación inducida por VIH-1.
Para este fin, se construyó un mutante con deleción de vpr
del plásmido VIH^{-} env pNLpuro llamado pNLpuro\Deltavpr. Se
introdujo un codón de parada después del aminoácido 22 de
vpr, y se retiraron 122 nucleótidos de la región codificante
de vpr desde el aminoácido 22 hasta el aminoácidos 62. En
primer lugar, se ensayo si la deleción del gen vpr afectaba a la
expresión de genes de VIH-1 ya que dicho efecto
podría complicar la interpretación de los experimentos. La
expresión de la proteína viral después de la transfección con
pNLpuro\Deltavpr fue igual a la expresión de pNLpuro, medida por
la proteína p24^{gag} liberada en el medio de cultivo. Como la
expresión de genes estructurales por VIH depende de la expresión
exitosa de las proteínas tanto tat como rev, es evidente que la
mutación introducida en el genoma no provocaba una alteración
general de la transcripción de VIH o corte y empalme del ARN. Como
control adicional para examinar el efecto de la deleción de
vpr en la expresión VIH-1, se construyó un
mutante de deleción de vpr a partir de pNL43 de tipo
silvestre, por el mismo método que el usado para el mutante de
deleción de vpr de pNLpuro, para producir la construcción
env^{+}, pNL\Deltavpr. Cuando se introducía por transfección en
el transfectante TE671\Psi CD4^{+} de TE671, se produjeron de
forma eficaz sincitios por las construcciones tanto vpr^{-}
como vpr^{+}. A pesar de la producción de proteínas de
VIH-1 casi equivalente entre pNLpuro y
pNLpuro\Deltavpr, el resultado de la transfección con el mutante
de deleción de vpr con respecto a la diferenciación, fue
claramente diferente del de la transfección con el genoma de
VIH-1 vpr^{+}. Aunque las células
transfectadas con pNLpuro se diferenciaron, la mayoría de las
células TE671 transfectadas con el mutante de deleción de vpr
pNLpuro\Deltavpr no mostraron ningún cambio o un aumento pequeño
y transitorio en el tamaño y la longitud. Aunque se produjeron unas
pocas células diferenciadas morfológicamente con tinción de miosina
en cada transfección, la eficacia de este efecto varío de un
experimento a otro y nunca se observó que excediera en 10% de las
células restantes después de la selección con fármaco. Tomados en
conjunto estos resultados (resumidos en la Tabla 1) se demuestra
que la diferenciación inducida por VIH-1 de células
TE671 es una función principalmente del gen vpr.
La producción de p24^{gag} en
pNLpuro\Deltavpr continuó durante 2-3 semanas
después de la transfección y subcultivo, mientras que p24 liberada
de células transfectadas con pNLpuro se eliminó después del
subcultivo. El subcultivo elimino de forma eficaz las células
diferenciadas grandes, dejando solamente las células indiferenciadas
en replicación intactas. Por lo tanto, solamente las células
diferenciadas liberaron virus en los experimentos de transfección
con pNLpuro. La exposición de los transfectantes al miristato
acetato de forbol de éster de forbol que activa la proteína quinasa
C, que ha demostrado que simula la expresión de
VIH-1 en células infectadas de forma crónica
(Harada, S. et al., (1986) Virology 154
249-258), provoco un aumento de 3 veces en la
liberación de 24 de las células transfectadas con pNLpuro\Deltavpr
pero no una liberación p24 que se pueda medir a partir de las
células transfectadas con pNLpuro indiferenciadas. Este resultado
indica que, en presencia de vpr, la producción de
VIH-1 en células TE671 es incompatible con su
replicación, mientras que en ausencia de vpr, la expresión
de VIH-1 puede continuar en células en replicación.
Estas células retienen la capacidad de diferenciarse en respuesta a
diversos agentes y por tanto permanecen relativamente sin afectar
por la expresión de VIH-1.
Se examinó la capacidad de la infección por VIH
de inducir la diferenciación de la línea celular de rabdomiosarcoma.
Para estos experimentos, se usó la línea celular TE671\Psi.
TE671\Psi expresa elevados niveles de CD4 en su superficie
celular y puede infectarse con VIH a una eficacia muy elevada,
produciendo un elevado nivel de producción viral. La infección de
células TE671\Psi en o cerca de la confluencia provoca la fusión
celular en sincitios multinucleados gigantes, debido a la fusión de
las membranas celulares después de la coexpresión de las proteínas
de envuelta de VIH y su receptor, CD4. Para permitir la infección y
mantenimiento en cultivo de células no fusionadas durante varios
días después de la infección, se sembró TE671\Psi a una baja
densidad celular, típicamente confluencia del 5% o menos. Las
células sembradas a baja densidad celular y dejadas no expuestas a
VIH-1 no se diferenciaron y continuaron
replicándose. Las células infectadas con VIH-1
(cepas RF o MN) se diferenciaron de un modo muy similar a lo
observado después de la transfección con el genoma viral de
pNLpuro. Estos resultados demuestran que la infección con VIH puede
inducir directamente la diferenciación celular.
En este documento se presenta la observación
inesperada de que la introducción por transfección de ADN genómico
de VIH-1 en la línea de rabdomiosarcoma embrionario
TE671 inducía la inhibición del crecimiento celular y la
diferenciación. La infección de TE671 por una molécula CD4
transfectada produjo el mismo resultado, indicando que los efectos
no estaban producidos por artefactos de transfección y tenían
relevancia para la infección natural por VIH. La transfección y
expresión de cada gen regulador de VIH-1 en la línea
celular reveló que el gen vpr puede producir la inhibición del
crecimiento y diferenciación morfológica que el virus complejo
induce. La activación del programa muscular endógeno se demostró
mostrando que las células transfectadas con vpr expresaban
elevados niveles de miosina de contracción rápida, mientras que la
mayoría de las células no transfectadas no lo hacía. La
introducción por transfección de un mutante con deleción de
vpr en células TE671 provocó la producción de grandes
cantidades de células indiferenciadas en replicación que continuaban
produciendo elevados niveles de proteína viral. Estos resultados
indican que vpr es el determinante principal para la
inhibición de la diferenciación y el crecimiento en células TE671.
La introducción por transfección de vpr en la línea RD de
rabdomiosarcoma y la línea D17 de osteosarcoma provocó que cesara la
proliferación, cambios morfológicos bastos, y agrandamiento
profundo. Por tanto vpr puede ser un regulador de la función
celular en células de origen diverso.
La diferenciación muscular se ha estudiado bien
en rabdomiosarcomas y en células normales. La expresión de factores
de transcripción hélice-bucle-hélice
tales como MyoD en mioblastos normales conduce a la diferenciación
en miotubos post-mitóticos maduros. En la mayoría de
los rabdomiosarcomas embrionarios, a pesar de la expresión de MyoD,
la detención del ciclo celular y la diferenciación están inhibidas.
La transformación de los rabdomiosarcomas embrionarios está unida a
la expresión de un oncogén ras activado, la pérdida de un supresor
tumoral putativo en el cromosoma 11, y la expresión constitutiva
del factor del crecimiento de fibroblastos autocrino y el factor de
crecimiento transformante \beta. Además, se ha demostrado que RD
(por lo tanto TE671) carece de un gen supresor tumoral p53 de tipo
silvestre. La expresión de p53 recientemente se ha asociada con el
control del ciclo celular y la regulación de los mecanismos de
reparación del ADN, acontecimientos celulares unidos a la
integración retroviral. Los osteosarcomas muestran características
de osteoblastos de secreción de matriz ósea pero se cree que surgen
de tejido mesequimático multipotencial y por lo tanto representan de
forma similar una desregulación de las células primitivas. Estos
tumores también presentan típicamente mutaciones de p53 de pérdida
de función. Vpr puede al menos parcialmente superar el
bloqueo en la diferenciación y restaurar completamente la
inhibición de la proliferación celular; por lo tanto, vpr
puede reemplazar una pérdida de función durante la transformación o
activar una vía que esquive los defectos
genéticos.
genéticos.
Estos estudios demuestran directamente que el
gen vpr de VIH codifica una proteína que puede funcionar en
la regulación de los acontecimientos celulares básicos. El resultado
de esta regulación se observa en este documento como una inhibición
de la proliferación celular y la inducción de diferenciación.
Ejemplo
2
Se formula una composición farmacéutica
proporcionando 100 \mug/\mul de pBabe-puro+vpr
combinado con solución salina tamponada con fosfato estéril que es
isotónica con las células. La composición se administra por
inyección directa en una masa tumoral sólida de un individuo.
Ejemplo
3
El ADN que codifica la proteína vpr de
VIH-1 se amplifica por PCR a partir del plásmido
pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR
y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR
resultante se inserta en el plásmido pSE420 del vector de expresión
(Invitrogen, San Diego, CA) y se introdujo en E. coli.
Se prepara una composición farmacéutica aislando
la proteína vpr de las células y/o el medio y combinándola con una
solución farmacéuticamente aceptable estéril.
Ejemplo
4
El ADN que codifica la proteína vpr de
VIH-1 se amplifica por PCR a partir del plásmido
pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR
y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR
resultante se inserta en el plásmido pYES2 de vector de expresión
(Invitrogen, San Diego, CA) y se introduce en S.
cerevisiae.
Se prepara una composición farmacéutica aislando
la proteína vpr de las células y/o medio y combinándola con
una solución farmacéuticamente aceptable estéril.
Ejemplo
5
El ADN que codifica la proteína vpr de
VIH-1 se amplifica por PCR a partir del plásmido
pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR
y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR
resultante se inserta en el plásmido pcDNA I del vector de
expresión (Invitrogen, San Diego, CA) y se introduce en células de
Ovario de Hámster Chino (CHO).
Se prepara una composición farmacéutica aislando
la proteína vpr de las células y/o medio y combinándola con una
solución farmacéuticamente aceptable.
Ejemplo
6
Se produjo la proteína vpr recombinante
en baculovirus. La producción de proteína vpr recombinante
permitió estudios de la función de la proteína in vitro,
permitió la generación de anticuerpos anti-vpr en conejos y
anticuerpos monoclonales en ratones.
El gen vpr se cortó de la construcción
vpr-pBabe-puro. Este inserto después se
introdujo en el vector de expresión de baculovirus
pVL-1393 (PharMingen) por técnicas convencionales.
Los virus recombinantes se produjeron como se ha descrito
previamente (Matsuura, et al. 1987) usando ADN linealizado
Baculogold (PharMingen) en experimentos de cotransfección en
células de Spodoptera frugiperda (SF-9). Las
células SF-9 y las infecciones virales posteriores
se realizaron como se ha descrito previamente (Matsuura et
al., 1987, O'Reilly et al., 1991). La presencia de virus
recombinante se observó fácilmente al microscopio óptico después de
la transfección. La presencia de proteína vpr se ensayó por ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y análisis de
transferencia de western, usando un suero policlonal de conejo
anti-péptido (aminoácidos 2-21
N-terminales) obtenido a partir del depósito de
SIDA.
Se infectaron células Sf-9 con
virus recombinante a una multiplicidad de infección de
5-10 y se recogieron en diversos momentos después
de la infección. Se analizaron células completas y fracciones
sobrenadantes por ELISA usando el anticuerpo mencionado
anteriormente. Tan pronto como a las 24 horas después de la
infección, podía encontrarse la proteína recombinante en el
sobrenadante. Esta presencia alcanzaría su pico a las 30 horas
después de la infección. Se emprendieron experimentos de
fraccionamiento para optimizar la recogida de la proteína vpr. La
mayoría de la reactividad de vpr se encontró localizada en el
sobrenadante de células Sf-9 recombinantes. Se
recuperó poca proteína vpr adicional de lisados con detergente no
iónico de sonicados celulares.
La actividad de esta proteína se verificó
adicionalmente explorando el sobrenadante de cultivo celular que
contenía proteína con una mezcla de muestras de pacientes
seropositivos VIH+ como muestras de control. Los pacientes con VIH
habían demostrado producir una respuesta inmune humoral contra el
producto génico de vpr. Se recubrieron placas ELISA Immulon
II (Dynatech laboratories, Chantilly, Virginia) con tres diluciones
del sobrenadante vpr. Estos después se sondearon con 2
diluciones en serie de sueros de pacientes inactivados por calor.
Los resultados demuestran que los sueros de pacientes positivos a
VIH reaccionaban con la vpr presente en el sobrenadante
celular. El nivel de su reactividad no se correlacionaba con los
niveles de reactividad de los sueros contenidos frente a la
envuelta de VIH-1 (medida por ELISA en fase
sólida).
Se tituló el anticuerpo
anti-proteína vpr de conejo a dilución 1/1000 y se
usó en ensayo ELISA para determinar la producción de vpr por
diversas preparaciones de células Sf-9. Se observó
la reactividad específica y significativa en la fracción
sobrenadante de solamente células transfectadas con vpr. El
anti-suero de conejo es un
anti-suero anti-péptido de epítopo
restringido y como tal puede no reconocer una fracción de vpr
asociada a células insolubles mal procesada en estas células. Para
confirmar la producción de vpr se hicieron reaccionar las muestras
idénticas con sueros de pacientes de VIH combinados y se usaron
sueros humanos normales combinados como control específico. Los
sueros de pacientes positivos a VIH reaccionaron con el sobrenadante
que contenía la fracción de un modo similar al antisuero de conejo.
Estas mismas muestras de suero reaccionaron muy mal con
sobrenadantes de células Sf-9 no infectadas. Los
mismos sueros de pacientes reaccionaron mal con sobrenadantes de
células Sf-9 que se habían infectado con virus
recombinantes de control (virus que se formaron
co-transfectando ADN linealizado y pVL 1393 solo).
La reactividad observada demuestra la producción de proteína
vpr en los sobrenadantes de células Sf-9
infectadas.
El sobrenadante que contiene la proteína vpr se
sometió a purificación por dos métodos de cromatografía
diferentes.
Los sobrenadantes de células
Sf-9 infectadas se concentraron en una unidad de
filtración a presión amicon, se dializaron, se aclararon y se
trataron con inhibidores de proteasa antes de la cromatografía en
columna. El producto vpr de 24 horas en el sobrenadante se
concentró, centrifugó a 10000 g durante 10 minutos. Después se
añadió inhibidor de proteasa a este sobrenadante (PMSF, aprotinina,
leupeptina y EDA) a sus concentraciones apropiadas. Esta solución
después se pasó sobre una columna de anticuerpo de conejo
anti-vpr-proteína A. Se purificó la inmunoglobulina
anti-vpr de conejo en una columna de
agarosa-proteína A y se eluyó y dializó y después
se acopló a perlas de CNBr-sepharose 4B de acuerdo
con las instrucciones de los fabricantes (Sigma). Esta columna
después se utilizó para cromatografía por inmunoafinidad de vpr de
baculovirus. Se eluyó vpr en un gradiente de pH. La columna
después se lavó con PBS. Se emprendió Na-Fosfato 10
mM, pH 8,0 y elución por un gradiente de pH. La reactividad
específica pareció concentrarse en una cantidad de fracciones
limitada como se determina por la reactividad de antisueros de
conejo anti-vpr en ELISA. El pico de proteína específica y
el pico de actividad solapan claramente.
Además, se recogió la proteína vpr de la
columna de DEAE sepharose usando un gradiente salino. Se trató el
sobrenadante que contiene la proteína vpr de baculovirus como
anteriormente y después se colocó en una columna de
DEAE-sepharose. La columna se eluyó por gradiente
salino, se concentró la actividad de vpr en un intervalo
limitado.
Ambos procedimientos de purificación generan
muestras que reaccionan con muestras de pacientes de VIH así como
los antisueros de conejo anti-péptido vpr en
ELISA y en experimentos de transferencia de western. En
experimentos de transferencia de western, está presente una proteína
de 26 kD dominante a una proteína de 14 kD y se observan dos
pequeñas bandas de proteínas sugieren productos de ruptura. La banda
de 26 kD puede representar un artefacto de purificación (tal como
acetilación) o puede indicar un estado de agregación que requiere
investigación adicional.
Ejemplo
7
Se amplificó el ADN que codifica la proteína vpr
de VIH-1 por PCR a partir del plásmido pNL43
genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR y la
estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR resultante
se inserta en el plásmido de vector de expresión del sistema de
expresión de baculovirus completo MaxBac^{TM} (Invitrogen, San
Diego, CA) y se introduce en células de insecto usadas en este
sistema.
Se prepara una composición farmacéutica aislando
la proteína vpr de las células y/o medio y combinándola con una
solución farmacéuticamente aceptable estéril.
Ejemplo
8
Se transfectan líneas celulares de glioblastoma
con el vector de expresión de vpr y se observaron los
ejemplos específicos de acontecimientos de diferenciación. Para
experimentos de diferenciación se transfectaron las células por un
método mediado por lípidos usando DOTAP (Boehringer Mannheim). La
transfección con DOTAP (Boehringer Mannheim) se realizó según las
instrucciones de fabricante en matraces de cultivo tisular en 0,5 x
10^{6} células en crecimiento en fase logarítmica. Se añadió medio
de selección 48-60 horas después de la transfección
y las células se mantuvieron en selección mientras duraron los
experimentos. Las células transfectadas con plásmidos que contenían
el gen de resistencia a puromicina (PAC) se seleccionaron en 1
\mug/ml de puromicina (Sigma). Para ambas líneas celulares
U87-MG y U138MG se observó la diferenciación
morfológica específica. En comparación con las células
transfectadas de control, las células transfectadas con vpr
mostraron pseudópodos extendidos y crecimiento de neuritas
demostrado concurrente con una inhibición observada de su
proliferación celular. Ambas líneas celulares también demostraron
una proporción citoplasmática a nuclear aumentada así como un claro
aumento en el tamaño celular. También se observó bipolaridad
frecuente en las líneas celulares transfectadas con vpr junto con
actividad citoesquelética activa.
Los ensayos de prueba comprenden las etapas de
añadir el compuesto de ensayo al medio usado en los cultivos
celulares. El compuesto de ensayo se proporciona en 10 diluciones de
varía de 10 \muM a 100 \muM.
Puede procesarse opcionalmente un ensayo de
control que comprende la etapa de añadir proteína vpr a células sin
añadir compuesto de ensayo.
El análisis de marcadores específicos del linaje
y no específicos en estas líneas celulares se realizó de 2 a 14
días después de la transfección.
Ejemplo
9
Se realiza una exploración para identificar
compuestos que inhiban la capacidad de vpr de inducir la
diferenciación de células indiferenciadas del siguiente modo.
Se usa la línea TE671 de rabdomiosarcoma
embrionario humano (ATCC HTB 139) y la línea D17 de osteosarcoma
canino (ATCC CLL 183). Las células se mantienen en medio de cultivo
celular apropiado en condiciones estándar.
Se produce vpr como se ha descrito en los
Ejemplos 3, 4, 5 ó 6.
Los ensayos de prueba comprenden las etapas de
poner en contacto las células con vpr en presencia de un
compuesto de ensayo. Se añade una mezcla de vpr y el
compuesto de ensayo al medio de cultivo celular juntos o por
separado. El compuesto de ensayo se proporciona en 10 diluciones que
varían de 10 \muM a 100 \muM.
Puede procesarse opcionalmente un ensayo de
control que comprende la etapa de añadir proteína vpr a células sin
añadir compuesto de ensayo.
Después de 2-14 días, se
observan las células para determinar si ha sucedido la
diferenciación. Se describen cambios morfológicos y de tamaño que
indican diferenciación en el Ejemplo 1. La observación visual puede
venir acompañada por o sustituirse con un ensayo de anticuerpos
para observar si se está produciendo miosina por las células. Se
realiza un ensayo anti-miosina como se ha descrito
en el Ejemplo 1.
Ejemplo
10
Un sistema basado en ELISA in vitro
simple para mapear sitios de interacción entre vpr y
gag p55. Se usaron vpr producidas por baculovirus como se ha
resumido anteriormente y gag de baculovirus producida por medios
similares en ensayos de unión. Se recubrieron placas ELISA con gag y
vpr y se hicieron reaccionar con antisueros específicos como
controles, o se recubrieron con diluciones de proteína gag
seguido por vpr y se pusieron en formato sándwich con
anticuerpos anti-vpr. Como alternativa, se recubrieron las
placas con diluciones de vpr seguido por proteína gag
y se pusieron en formato sándwich con antisueros específicos
anti-gag. Los controles para la especificidad incluyen
antisueros gag que no reaccionan con vpr, antisueros
vpr que no reaccionan con gag, antisueros que no
reaccionan ni con gag ni con vpr que reaccionan con
BSA. Las placas se recubrieron con antígeno recombinante en tampón
carbonato, se lavaron extensivamente, se bloquearon con PBS/BSA al
1% y después se lavaron extensivamente, se disolvió la proteína
secundaria en PBS/BSA y se incubó a 4ºC durante 1 hora, después se
lavaron extensivamente y se hicieron reaccionar con antisueros
específicos. Se detectó la actividad de sándwich específica en ambas
direcciones como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo
11
Usando PCR y tecnología de ADN recombinante, se
construyeron mutantes de truncamiento del gen vpr y se clonaron en
plásmidos de expresión pBABE. Estas construcciones delecionan vpr en
grupos de aproximadamente 20AA del extremo carboxi que viaja hacia
el extremo amino de la proteína. Los productos proteicos resultantes
son 72AA, 50AA y 30AA.
Estudios preliminares indican que los 24AA
carboxi terminales de vpr son necesarios para la inducción
de diferenciación de linajes celulares de rabdomiosarcoma y gliales
ya que se ha observado pérdida de la inhibición de la proliferación
y pérdida de cambios morfológicos con los mutantes de deleción. Una
observación interesante de estos estudios es que esta región
carboxi contiene una región significativa de homología con el
oncogén muscular ski. El oncogén ski retroviral aviar muestra
propiedades que se parecen a las descritas para vpr
(Colmenares y Stavnezer, Cell, 1989).
\newpage
Estudios sugieren que los mutantes vpr de
deleción carboxi terminal aún retienen la actividad de unión a gag
en este sistema. Este ensayo, por lo tanto, diferencia la región
funcional de vpr que interacciona con gag y la región
funcional para la función de diferenciación celular.
Ejemplo
12
Se obtuvo suero de conejo
anti-péptido vpr (Garrett, et al.,
J. Virol., 1991; 65, 1653) (a.a.
2-21:
Cys-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-His-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu;
SEC ID Nº 4) del Dr. Brian Cullen a través del NIH AIDS Research
and Referente Reagen Program. Para producir anticuerpos de conejo
adicionales contra vpr, se inmunizó un conejo con
10-20 \mug de proteína vpr parcialmente
purificada (producida como se describe a continuación a partir de
la columna anti-vpr) en adyuvante completo de Freund (CFA)
una vez, después con adyuvante incompleto (IFA) para inmunizaciones
posteriores. La inmunización final fue con 50 \mug de cada uno de
los tres péptidos vpr acoplados a hemocianina de lapa californiana
(KLH) en IFA. Los péptidos se adquirieron de American
Bio-Technologies. Las secuencias de los péptidos:
vpr 9-20
(Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-His-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu;
SEC ID Nº 5), 41-55
(Gly-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala;
SEC ID Nº 6), 81-96
(Ile-Gly-Val-Thr-Gln-Gln-Arg-Arg-Gln-Arg-Asp-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser;
SEC ID Nº 7). Para producir suero de ratón anti-vpr, se
inmunizaron ratones Balb-c con 20 \mug de péptidos
sencillos acoplados a KLH en CFA para la primera inmunización e IFA
para posteriores inmunizaciones.
Ejemplo
13
Se construyeron columnas de afinidad de acuerdo
con Harlow y Lane. Harlow, E. y Lane, E., Antibodies: A
Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory
Press que se incorpora en este documento como referencia. La
fracción IgG de 250 \mul del suero peptídico de conejo se unión a
1 ml de perlas de agarosa proteína A (Gibco BRL), se lavaron en
tampón borato sódico 0,2 M (pH 9,0) y se acoplaron con
dimetilpimelimidato (DMP) 20 mM. La columna de anticuerpo
policlonal de conejo anti-vpr se construyó de acuerdo con el
mismo procedimiento usando 6 ml de suero y 3 ml de perlas de
agarosa proteína G (Gibco BRL).
Ejemplo
14
Para la detección de anticuerpos
anti-vpr, se realizó un ELISA usando vpr producida de
forma eucariota unida a fase sólida, seguido por la adición de la
muestra de ensayo. Se usó anticuerpo anti-humano
acoplado a peroxidasa para la detección (Boehringer Mannheim). El
desarrollo de color fue con diclorhidrato de
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se detectaron
anticuerpos anti-p24 usando p24 recombinante
(American Bio-Technologies) unido a un soporte en
fase sólida. Ambas proteínas recombinantes se usaron a una
concentración aproximada de 1 \mug/ml, 50 \mul/pocillo). La
incubación se hizo durante 1 hora 37º o 12 horas a 4º. Los
anticuerpos de detección se usaron a una dilución 1:15000 según las
directrices del fabricante.
Ejemplo
15
Para la detección de vpr, se realizó una
ELISA de captura. Se inmovilizó suero de conejo
anti-péptido vpr (reactivo a aa
2-21) en pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos
(Immulon II, Dynatech) en tampón
carbonato-bicarbonato (0,2 M, pH 9,2). La detección
del antígeno unido se realizó usando un suero de ratón
anti-péptido vpr (reactivo a aa
81-96) seguido por anticuerpo
anti-ratón acoplado a peroxidasa (Boehringer
Mannheim). El desarrollo de color fue con TMB como se ha descrito
previamente. El anticuerpo de conejo se usó a 1:1000, el anticuerpo
de ratón se usó a 1:800. La incubación se hizo durante 1 hora a 37º
o 12 horas a 4º. Los anticuerpos anti-ratón se
usaron a dilución 1:12000 según las directrices del fabricante.
Ejemplo
16
Para construir un baculovirus recombinante que
contenga el gen vpr, se subclonó la fase de lectura abierta
de vpr y una secuencia de unión a ribosoma eucariota consenso
introducida por PCR, a partir del plásmido de expresión
vpr-pBabe-puro previamente descrito
(Levy et al., Cell, 1993, 72, 541) e
incorporado en este documento como referencia, en el sitio de
clonación múltiple del vector de baculovirus pVL1393 (Invitrogen)
cadena abajo del promotor del poliedro de baculovirus por técnicas
convencionales conocidas para los especialistas en la técnica. Se
prevé que esta construcción codifique una proteína vpr nativa no
fusionada. La transfección de este plásmido junto con el ADN
genómico de AcMNPV linealizado (BaculoGold, PharMingen) por técnicas
convencionales en células de insecto SF9 (Spodoptera
frugiperda) produjo baculovirus recombinantes que contenían el
gen vpr. Veinticuatro horas después de la transfección, se
aplicaron sobrenadantes que contienen virus de células
transfectadas a nuevas células High Five (Trichoplusia ni)
cuyos sobrenadantes y fracciones celulares después se ensayaron
para la expresión de la proteína vpr por técnicas
convencionales. La proteína vpr se detectó en los
sobrenadantes y en las fracciones celulares de células infectadas
por ELISA en 12 horas de infección y no en los sobrenadantes o
fracciones celulares de células infectadas con baculovirus,
preparadas de forma idéntica a los recombinantes vpr pero
que carecen de un gen vpr. Se detectaron niveles de
vpr de pico en el sobrenadante a las 24 horas después de la
infección. Las razones para la exportación preferencial de
vpr en los sobrenadantes de baculovirus no se muestran. Sin
embargo, la exportación de proteínas recombinantes no es poco
habitual para este sistema de expresión.
Ejemplo
17
Se aplicaron sobrenadantes que contienen
vpr a una columna de afinidad anti-péptido
vpr, construida por métodos convencionales. La purificación
parcial y concentración se consiguió por elución con trietanolamina
(pH 11,5) seguido por cromatografía en DEAE sepharose por técnicas
conocidas para los especialistas en la técnica. Este material
presentó formas tanto monoméricas como homodiméricas putativas de
vpr con casi diez veces más monómero que dímero observado. El
material se usó para inmunizar a un conejo 3 veces a intervalos de
6-8 semanas, seguido por una inmunización única con
3 péptidos vpr que representan los restos amino y carboxilo
terminales y una parte hidrófila central de la molécula. La
inmunización final con péptidos vpr sirvió para aumentar el título
anti-vpr específico del suero. El suero resultante se unía a
proteínas vpr de baculovirus virales naturales y recombinantes en
transferencia de Western y ELISA y reconocía específicamente los 3
péptidos vpr en ELISA. La dilución óptima de suero para ELISA fue
1:10.000. No se observó reactividad cruzada con otros componentes
del suero sobrenadante de baculovirus o con cualquier otra proteína
por transferencia de Western o ELISA. Se preparó una columna de
afinidad usando este suero y se aplicaron sobrenadantes vpr. La
proteína que eluye de esta columna presentó tres bandas principales
en geles SDS-PAGE teñidos con plata o teñidos con
coomassie, que representan las formas monoméricas y diméricas de
vpr, más una banda de 50 kDa que probablemente representa la
lactoalbumina presente en el medio de crecimiento celular no
específicamente unida a la columna.
Ejemplo
18
Se puede ensayar la proteína vpr
recombinante para la actividad biológica en cultivo tisular. Los
sobrenadantes vpr y de control se dializaron frente a PBS y
se aplicaron a células TE671 de rabdomiosarcoma. Las células TE671
se diferencian y cesan de proliferar cuando se transfectan con el
gen vpr o se infectan con VIH (Gras-Masse et
al., supra; Levy et al., supra).
Sorprendentemente, las células TE671 expuestas continuamente a
sobrenadante vpr al 20% cesaron la proliferación después de
aproximadamente 3 días y después de 7-9 días
experimentaron diferenciación morfológica similar a la observada
después de transfección con el gen de vpr de VIH-1,
incluyendo gran aumento, la presencia de largas protuberancias
similares a miotubos, multinucleación y cese de la proliferación.
La exposición a más del 20% del sobrenadante demostró se rápidamente
fatal para las células. La incubación de células TE671 con
concentraciones iguales de sobrenadantes de control no logró
inducir ninguno de estos cambios. Las células expuestas a vpr
durante 3 días se examinaron para la presencia de miosina de
músculo adulto, un marcador de diferenciación para estas células
(Aguanno et al., Cancer Res., 1990, 50, 3377).
Más del 90% de las células tuvieron tinción positiva usando un
anticuerpo anti-miosina, que demuestra que la
diferenciación fue en la vía a la que están destinadas estas células
y es idéntica a la inducida por la expresión de vpr de
ellas.
Ejemplo
19
Se transfectaron células de melanoma con
moléculas de ácido nucleico que comprendía una secuencia de
nucleótidos que codificaba vpr. En experimentos de ensayo, se
seleccionaron células transfectadas e implantadas en ratones. Como
control, se introdujeron células de melanoma no transfectadas en
otros ratones.
Los ratones con células de melanoma
transfectadas implantadas presentaron una vasta reducción en la
cantidad de tumores que se desarrollan a partir de las células
inyectadas en comparación con la cantidad de tumores que se
desarrollan en ratones de control. Los resultados de estos
experimentos demuestran claramente que aunque vpr no
eliminaba completamente la tumorigenicidad de las células de
melanoma, la presencia de gen vpr en las células de melanoma
reducía significativa y sustancialmente la tumorigenicidad de las
células.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: David B WEINER
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 717 Beacom Lane
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Merion
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): PA 19066
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: David Nathan LEVY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 24 Queensbury Street, Apartment 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachussetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): MA 02215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Yosef REFAELI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 88 Washington Street, Apartment 27
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachussetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): MA 02135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Función y actividad de VPR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible 1,44M
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 94909839.6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGGCTCGA GGATCCGCCG CCACCATG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGCTTGTT CCATGGTGGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCGGATCC TAGGATCTAC TGGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Glu Gln Ala Pro Glu Asp Gln Gly Pro Gln
Arg Glu Pro His Asn}
\sac{Glu Trp Thr Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn Glu Trp Thr
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu Thr Gly Asp
Thr Trp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly Val Thr Gln Gln Arg Arg Gln Arg Asp
Gly Ala Ser Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn Glu Trp Thr
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu Thr Tyr Gly
Asp Thr Trp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly Val Thr Gln Gln Arg Arg Ala Arg Asn
Gly Ala Ser Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un método para inducir que células
indiferenciadas se diferencien, que comprende las etapas de:
poner en contacto células indiferenciadas in
vitro con una cantidad de la proteína vpr de VIH o un fragmento
funcional de la misma eficaz para estimular la diferenciación; o
introducir en células indiferenciadas in
vitro una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica la proteína vpr de VIH o un fragmento
funcional de la misma, por lo que dicha secuencia de nucleótidos se
expresa por dichas células,
en el que las células indiferenciadas no son
células madre embrionarias humanas.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que las células indiferenciadas son células tumorales.
3. Una composición farmacéutica que
comprende:
a) proteína vpr de VIH o un fragmento funcional
de la misma, o una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vpr de VIH o un
fragmento funcional de la misma; y
b) vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 3, donde dicha composición farmacéutica está
adaptada para su uso en una inyección intratumoral.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 3, donde dicha composición farmacéutica está
adaptada para administración tópica.
6. El uso de la proteína vpr de VIH o un
fragmento funcional de la misma o una molécula de ácido nucleico
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma en la fabricación
de un medicamento para tratar a un individuo diagnosticado con o que
se sospecha que padece una enfermedad asociada con células
indiferenciadas hiperproliferantes.
7. El uso de la proteína vpr de VIH o un
fragmento funcional de la misma o una molécula de ácido nucleico
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma en la fabricación
de un medicamento para tratar a un individuo diagnosticado con o que
se sospecha que padece cáncer.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que el cáncer se caracteriza por un tumor sólido.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en
el que el medicamento está adaptado para su uso en una inyección
intratumoral.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que la enfermedad es psoriasis.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10,
en el que dicho medicamento está adaptado para administración
tópica.
12. Un método para identificar compuestos que
inhiban que vpr de VIH estimule la diferenciación de células
indiferenciadas, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto, en presencia de un
compuesto de ensayo, dichas células indiferenciadas con una cantidad
de proteína vpr de VIH suficiente para estimular la diferenciación
y
b) comparar la diferenciación que sucede con la
diferenciación que sucede cuando dichas células indiferenciadas se
ponen en contacto con la proteína vpr de VIH en ausencia de dicho
compuesto de ensayo,
en el que las células indiferenciadas no son
células madre embrionarias humanas.
13. Un kit para realizar el método para
identificar compuestos que inhiban que vpr de VIH estimule la
diferenciación de células indiferenciadas de la reivindicación 12,
comprendiendo dicho kit
a) un primer recipiente que comprende células
indiferenciadas, y
b) un segundo recipiente que comprende la
proteína vpr de VIH,
en el que las células
indiferenciadas no son células embrionarias
humanas.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/019,601 US5874225A (en) | 1993-02-19 | 1993-02-19 | Identification of compounds that modulate HIV-1 vpr protein activity |
| US19601 | 1993-02-19 | ||
| US167608 | 1993-12-15 | ||
| US08/167,608 US6838236B1 (en) | 1993-02-19 | 1993-12-15 | VPR function and activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2286818T3 true ES2286818T3 (es) | 2007-12-01 |
Family
ID=26692390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94909839T Expired - Lifetime ES2286818T3 (es) | 1993-02-19 | 1994-02-22 | Funcion y actividad de vpr. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030207252A1 (es) |
| EP (1) | EP0689586B8 (es) |
| AT (1) | ATE361359T1 (es) |
| AU (1) | AU6252494A (es) |
| CA (1) | CA2155017C (es) |
| DE (1) | DE69434961T2 (es) |
| DK (1) | DK0689586T3 (es) |
| ES (1) | ES2286818T3 (es) |
| IL (1) | IL108707A (es) |
| MX (1) | MXPA94001321A (es) |
| WO (1) | WO1994019456A1 (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2042093C (en) * | 1990-05-09 | 2002-12-24 | Gyula Hadlaczky | Cell line carrying an excess of mammalian centromeres |
| EP0753006A4 (en) * | 1994-03-25 | 1999-04-14 | Biomolecular Res Inst Ltd | HIV Vpr and Vpx PROTEINS |
| US5861161A (en) * | 1994-09-07 | 1999-01-19 | Universite De Montreal | Chimeric proteins comprising a Vpr/Vpx virion incorporation domain for targeting into HIV-1 or HIV-2 virions |
| US5763190A (en) | 1994-09-21 | 1998-06-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods for the identification of compounds capable of inducing the nuclear translocation of a receptor complex comprising the glucocoticoid receptor type II and viral protein R interacting protein |
| US5639619A (en) * | 1994-10-13 | 1997-06-17 | Regents Of The University Of California | Screening assay for anti-HIV drugs using the Vpr gene |
| US6087486A (en) * | 1996-01-29 | 2000-07-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleotide sequences encoding vpr receptor protein |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6077697A (en) * | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| AU6435598A (en) * | 1997-02-11 | 1998-08-26 | Regents Of The University Of California, The | Identifying agents for treating lentiviral infection |
| US6818627B1 (en) | 1997-08-14 | 2004-11-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Functional fragments of HIV-1 Vpr protein and methods of using the same |
| DE19908766C2 (de) * | 1999-02-19 | 2001-02-15 | Ulrich Schubert | Verwendung synthetischer Vpr-Peptide des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) zur Entwicklung von therapeutischen und diagnostischen Reagenzien |
| US6984486B1 (en) | 1999-02-19 | 2006-01-10 | J. David Gladstone Institutes | Synthetic peptide of regulatory virus protein R (VPR) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and the utilization thereof |
| US6664040B2 (en) | 2000-05-23 | 2003-12-16 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for delivery of a molecule into a cell |
| US8216585B2 (en) | 2001-05-25 | 2012-07-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeted particles and methods of using the same |
| WO2003040415A1 (en) | 2001-05-25 | 2003-05-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hiv-1 vpr interactions with mitochondrial apoptosis inducing factor and methods of using the same |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4808536A (en) * | 1986-02-27 | 1989-02-28 | Centocor, Inc. | Immunochemical method for detection of antibody against HTLV-III core protein based upon recombinant HTLV-III gag gene encoded protein |
| EP0295803B1 (en) * | 1987-05-29 | 1993-11-03 | Shuzo Matsushita | Monoclonal antibodies |
| US5001230A (en) * | 1988-02-18 | 1991-03-19 | Schering Corporation | T cell activation markers |
| WO1990015875A1 (en) * | 1989-06-02 | 1990-12-27 | Dana Farber Cancer Institute | Protein having a transactivating property, vectors expressing this protein, cell lines, and uses thereof |
-
1994
- 1994-02-18 IL IL10870794A patent/IL108707A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-02-21 MX MXPA94001321A patent/MXPA94001321A/es not_active Application Discontinuation
- 1994-02-22 WO PCT/US1994/002191 patent/WO1994019456A1/en active IP Right Grant
- 1994-02-22 ES ES94909839T patent/ES2286818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-22 DE DE69434961T patent/DE69434961T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-02-22 AU AU62524/94A patent/AU6252494A/en not_active Abandoned
- 1994-02-22 DK DK94909839T patent/DK0689586T3/da active
- 1994-02-22 EP EP94909839A patent/EP0689586B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-22 AT AT94909839T patent/ATE361359T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-02-22 CA CA002155017A patent/CA2155017C/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-08-22 US US09/935,100 patent/US20030207252A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-01-09 US US11/971,792 patent/US20100183622A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0689586T3 (da) | 2007-08-06 |
| EP0689586B8 (en) | 2008-01-02 |
| DE69434961D1 (de) | 2007-06-14 |
| CA2155017C (en) | 2009-06-09 |
| US20100183622A1 (en) | 2010-07-22 |
| WO1994019456A1 (en) | 1994-09-01 |
| MXPA94001321A (es) | 2003-10-29 |
| EP0689586A1 (en) | 1996-01-03 |
| US20030207252A1 (en) | 2003-11-06 |
| EP0689586A4 (en) | 1997-12-29 |
| IL108707A0 (en) | 1994-05-30 |
| IL108707A (en) | 1999-06-20 |
| AU6252494A (en) | 1994-09-14 |
| DE69434961T2 (de) | 2008-01-17 |
| ATE361359T1 (de) | 2007-05-15 |
| CA2155017A1 (en) | 1994-09-01 |
| EP0689586B1 (en) | 2007-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100183622A1 (en) | Vpr function and activity | |
| JP3587538B2 (ja) | Ｈｉｖ−１ のインヒビターとしての合成ポリペプチド | |
| CA2068713A1 (en) | Non-replicating recombinant-made retroviral particles used as antiviral agents and immunogens | |
| EP0939835A1 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| US8030444B2 (en) | Microbicidal compositions comprising human CD38 polypeptides derived from the extracellular membrane-proximal region | |
| US6235881B1 (en) | Polypeptides encoded by novel HIV-2 proviruses | |
| JPH10506008A (ja) | ＨＩＶ−１ Ｖｐｒ 融合分子に基づいたＨＩＶビリオン中へのタンパク質ターゲッティング | |
| CA2087732A1 (en) | Vaccine and treatment method of human immunodeficiency virus infection | |
| US6838236B1 (en) | VPR function and activity | |
| ES2366185T3 (es) | Vacunas de péptidos sintéticas para vih: el epítopo de cbd como un inmunógeno eficaz para provocar anticuerpos ampliamente neutralizantes contra el vih. | |
| AU2017410525B2 (en) | Potent HIV inhibiting lipopeptide, derivative thereof, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| De Rossi et al. | Synthetic peptides from the principal neutralizing domain of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) enhance HIV-1 infection through a CD4-dependent mechanism | |
| CALLEBAUT et al. | Inhibition of HIV infection by pseudopeptides blocking viral envelope glycoprotein-mediated membrane fusion and cell death | |
| Doria | Role of the CD4 down-modulation activity of Nef in HIV-1 infectivity | |
| CA2317107C (en) | Liposomes containing multiple branch peptide constructions for use against human immunodeficiency virus | |
| PT95939A (pt) | Processo de producao de particulas de hiv, tornadas recombinantes e nao replicativas, e de vacinas | |
| WO2018141089A1 (zh) | 广谱抑制hiv的脂肽、其衍生物、其药物组合物及其用途 | |
| EP0717752A1 (en) | Therapeutic compounds | |
| JPH08503704A (ja) | Ｇｐ４１変異体とｈｉｖ治療剤としてのそれらの使用 | |
| US7943139B2 (en) | Methods of generating a humoral immune response against human immunodeficiency virus (HIV) comprising administering Nef apoptotic motif-containing polypeptide-conjugates | |
| Kappes | Viral protein X | |
| JP2005529168A (ja) | Ｇｐ４１ペプチド及びそれに基づいた標的細胞に対するｈｉｖの融合を阻害する方法 | |
| AU681885C (en) | Therapeutic compounds | |
| Davis et al. | change in SHIV MNA Env, which renders sequestered | |
| CA2497890A1 (en) | A mechanism for hiv-1 entry into host cells and peptides inhibiting this mechanism |