KR20230127657A - 엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 엑소좀에 의하여 효과적인 암세포 특이적 세포사멸 유도가 가능하므로, 간암의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법{Pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer containing exosomes and method for preparing the same}

본 발명은 엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

간암은 간세포에 기원하는 악성 종양으로, 주로 간암 중 가장 흔하게 나타나는 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)을 의미한다. 간암은 폐암, 대장암 등과 더불어 주로 발생하는 암종이며, 국내 암 사망자수에서도 1위인 폐암 다음으로 높은 비중을 차지하고 있고, 5년 생존률이 40% 이하로 낮게 나타난다. 간암은 만성 B형간염이나 C형간염, 간경변증, 과도한 음주 등에 의해 발병하며, 바이러스 감염이나 알코올에 의해 간의 파괴와 재생이 반복되는 경우 간암의 발생 위험이 크게 증가한다. 간암의 치료는 수술을 통한 절제가 가장 효과적이나, 진단 시에 수술적인 절제가 불가능한 경우가 많고 5년 내 재발률이 60%에 이르러 완치를 위한 효과적인 치료제의 개발이 절실하다.

한편, 엑소좀(exosome)은 세포 내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포 밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병의 진행 등에 관여하고 있다. 생체 나노소포체(nanovesicle)인 엑소좀의 경우 면역반응을 피할 수 있고, 인체 적합성이 뛰어나며, 약물탑재 기능, 특정세포로의 표적전달 효과, 혈액 내 안정성 등의 장점을 통해 최근 약물 전달체로 큰 관심을 받고 있다.

다만, 엑소좀을 약물 전달체로 이용하기 위해서는 엑소좀의 생산세포에 대한 안정성 및 생산효율이 확보되어야 하는데, 종양발생능(tumori-genecity) 없이 안전하고 안정한 세포일 수록 엑소좀 분비효율은 낮게 나타나는 한계가 있다. 따라서, 인체에 안전하고 안정적인 세포에서 엑소좀의 생산효율을 개선하는 방법에 대한 필요성이 증가하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 엑소좀 기반의 간암 예방 및 치료제를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-2249652호

본 발명의 하나의 목적은 암세포 특이적 세포사멸 유도 단백질을 포함하는 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 암세포 특이적 세포사멸 유도 단백질을 포함하는 엑소좀을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀은 일반 엑소좀 및 세포고사(apoptosis) 엑소좀일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포고사는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 절단(cleavage)에 의하여 유도될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 절단은 아니소마이신(Anisomycin), 아우린트리카르복실산(Aurintricarboxylic acid), 디프테리아독소(Diphtheria toxin), 에데인(Edeine), 푸시딘산(Fusidic acid), 팍타마이신(Pactamycin), 퓨로마이신(Puromycin), 리신(Ricin), 플루오린화나트륨(Sodium fluoride), 스파르소마이신(Sparsomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 트리코더마(Trichoderma), MG132(Z-Leu-Leu-Leu-al), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 시클로헥사미드(Cycloheximide) 및 스타우로스포린(staurosporine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀을 수득하기 위한 기질배지는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 시클로헥사미드(Cycloheximide), 아니소마이신(Anisomycin), 아우린트리카르복실산(Aurintricarboxylic acid), 디프테리아독소(Diphtheria toxin), 에데인(Edeine), 푸시딘산(Fusidic acid), 팍타마이신(Pactamycin), 퓨로마이신(Puromycin), 리신(Ricin), 플루오르화나트륨(Sodium fluoride), 스파르소마이신(Sparsomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 트리코더마(Trichoderma) 및 스타우로스포린(staurosporine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 가스더민 군 단백질은 GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5(GSDME) 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질일 수 있다.

GSDMD(GasderminD)는 염증조절복합체(inflammasome)에 의해 활성화되는 카스파아제(caspase)의 절단(cleavage)에 의해 C-말단 억제 도메인으로부터 N-말단 도메인이 분리외며, 분리된 N-말단 도메인이 세포막에서 올리고머화(oligomerization)되어 지름 10 내지 16nm의 구멍이 뚫리게 되는데, 이 구멍을 통해 염증성 사이토카인인 IL-1 및 IL-18의 분비가 일어나고 결국에는 세포막의 파열과 함께 파이롭토시스(pyroptosis)가 일어나 세포내 구성분의 세포외 분비가 유도될 수 있다.

또한, DFNA5 유전자에 의하여 발현되는 GSDME(GasderminE)는 세포고사 과정 중에 활성화되는 caspase 3에 의해 절단되어 네크롭토시스(secondary necrosis) 또는 파이롭토시스(pyroptosis)가 일어나, 세포막에 구멍이 뚫려 세포내 구성분의 세포외 분비가 유도될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 퓨로마이신(puromycin), 블라스티딘(blastidin) 및 제오신(zeocin) 등과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 체세포, 태아세포 세포주 및 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포 유래일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 암세포 특이적 세포사멸 유도 단백질은 TRAIL(TNF-related apoptosis-induction ligand) 단백질일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: the science and practice of pharmacy 22nd edition (2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 골관절염 예방 또는 치료 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 골관절염의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000㎎/㎏일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등의 형태로 투여될 수 있으며, 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 경구투여 제형으로 제형화할 경우, 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 광물유가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 제제화에 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하여 조제될 수 있으며, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여될 수 있으며, 예를 들어, 피하주사, 정맥주사, 관절주사 또는 근육 내 주사 등의 방법을 통하여 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

비경구 투여용 제형으로의 제제화는, 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 멸균되고, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건하에 저장할 수 있다. 즉석의 사용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다.

엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 엑소좀에 의하여 효과적인 암세포 특이적 세포사멸 유도가 가능하므로, 간암의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. TRAIL 단백질을 과발현하는 세포주 제조

293T 세포주에 대하여, TRAIL(TNF-related apoptosis-induction ligand) 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector)로 형질도입(transduction)하였다. 그 후, 1㎍/㎖ 퓨로마이신(puromycin)으로 2주간 선별하여, TRAIL 단백질을 과발현하는 세포주를 제조하였다.

실시예 2. 형질도입 세포주의 TRAIL 단백질 발현 확인

실시예 1에서 제조한 세포주에서 TRAIL 단백질이 발현되는지 확인하였다.

웨스턴 블롯 방법을 통하여 세포주의 단백질 발현 여부를 분석한 결과, 실시예 1에서 제조한 모든 세포주에서 TRAIL 단백질이 발현되는 것으로 확인되었다.

실시예 3. 형질도입 세포주로부터 세포고사 유도에 따른 세포고사 엑소좀 분비 유도

실시예 1에서 제조한 세포주를 배양한 후, 세포고사(apoptosis)를 유도하여 세포고사 엑조좀이 분비를 유도하였다.

구체적으로, 세포고사(apoptosis)가 유도되어 엑조좀이 분비되도록 변형된 세포주를 제조하기 위하여, 293T(human embryonic kidney, System Biosciences) 세포를 10% 열 불활성화 FBS, 2mM L글루타민, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에서 배양하였다. 가스더민 군(Gasdermin family) 유전자인 GSDMA(Sino biological, Beijing, China), GSDMB(Sino biological, Beijing, China), GSDMC(Sino biological, Beijing, China), GSDMD(Sinobiotic, Beijing, China), DFNA5(GSDME, Sinobiotic, Beijing, China) 또는 DFNB59 cDNA(Sino biological, Beijing, China)를 pCDH-EF1-MCS-T2A-puro Lentivrial vector(System Biosciences)에 서브클로닝(subcloning)하였다. 모든 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector)를 293T 세포에 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 형질도입 시약(transfection reagents, Invitrogen)을 사용하여 감염시켰다. 2일 후, 슈도바이러스 입자(pseudo-virus particle)를 수거한 다음, 실시예 1에서 제조한 세포주에 감염시켰다. 감염 2일째부터 2㎍/㎖ 퓨로마이신을 처리하고 2주간 더 배양하여, 가스더민 군 유전자를 발현하는 세포를 선별하였다. 선별된 각 세포주에 스타우로스포린(staurosporine) 1μM 처리에 의해 가스더민 군 단백질의 절단(cleavage)을 유도하여 세포고사 및 세포고사 엑소좀 분비를 유도하였다.

실시예 4. 세포고사 엑소좀 분리 및 단백질 발현 확인

실시예 3에서 분비 유도된 세포고사 엑소좀을 분리하여 세포고사 엑소좀에 TRAIL 단백질의 발현 여부를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 3에서 세포고사 유도에 의하여 분비된 세포고사 엑소좀의 배양액을 300g에서 5 내지 20 분간 1차 원심분리 및 2,000g에서 5 내지 40 분간 2차 원심분리하여 배양액의 상층액(supernatants)을 수득하고, 100,000g에서 20 내지 120분간 초원심분리하여 최종적으로 세포고사 엑소좀을 분리하였다. 분리한 엑소좀 펠렛(pellet)은 PBS(phosphate-buffered cell line) 또는 RIPA buffer(pH 7.5 50mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 1mM EDTA)에 부유하였다. 그 후, PBS에 부유한 엑소좀을 100mM Na2CO3(pH 11)으로 1시간 처리하고, PBS로 세척하여 엑소좀 막(membrane) 성분을 분리한 다음, TRAIL 단백질의 발현을 웨스턴 블롯, 유세포분석(Flow cytometry) 및 투과형 전자현미경(transmission EM)으로 분석하였다.

그 결과, 세포고사 엑소좀에 TRAIL 단백질이 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

1. 암세포 특이적 세포사멸 유도 단백질을 포함하는 엑소좀.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 엑소좀은 일반 엑소좀 및 세포고사(apoptosis) 엑소좀인 것인 엑소좀.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 세포고사는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 절단(cleavage)에 의하여 유도되는 것인 엑소좀.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 절단은 아니소마이신(Anisomycin), 아우린트리카르복실산(Aurintricarboxylic acid), 디프테리아독소(Diphtheria toxin), 에데인(Edeine), 푸시딘산(Fusidic acid), 팍타마이신(Pactamycin), 퓨로마이신(Puromycin), 리신(Ricin), 플루오린화나트륨(Sodium fluoride), 스파르소마이신(Sparsomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 트리코더마(Trichoderma), MG132(Z-Leu-Leu-Leu-al), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 시클로헥사미드(Cycloheximide) 및 스타우로스포린(staurosporine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 의해 유도되는 것인 엑소좀.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 엑소좀을 수득하기 위한 기질배지는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 시클로헥사미드(Cycloheximide), 아니소마이신(Anisomycin), 아우린트리카르복실산(Aurintricarboxylic acid), 디프테리아독소(Diphtheria toxin), 에데인(Edeine), 푸시딘산(Fusidic acid), 팍타마이신(Pactamycin), 퓨로마이신(Puromycin), 리신(Ricin), 플루오르화나트륨(Sodium fluoride), 스파르소마이신(Sparsomycin), 테트라사이클린(Tetracycline) 및 트리코더마(Trichoderma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 엑소좀.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 가스더민 군 단백질은 GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5(GSDME) 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 것인 엑소좀.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 체세포, 세포주 및 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포 유래인 것인 엑소좀.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 암세포 특이적 세포사멸 유도 단백질은 TRAIL(TNF-related apoptosis-induction ligand) 단백질인 것인 엑소좀.
   
9. 제1항의 엑소좀을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.