CN116042614A - RhoD抑制剂在防治寨卡病毒感染中的应用 - Google Patents

RhoD抑制剂在防治寨卡病毒感染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，提供了RhoD抑制剂在防治寨卡病毒感染中的应用。以人肝癌细胞系(Huh7)为靶细胞，结合前期的高通量蛋白组测序数据筛选，采用RNA干扰技术下调靶细胞中宿主蛋白的表达，以鉴定确认能有效抑制ZIKV感染靶细胞的宿主因子。本发明筛选获得了靶向Rho蛋白D(RhoD)特异的具有如SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列。通过实验发现，RhoD在ZIKV感染靶细胞中发挥着重要作用，下调RhoD的表达，能有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制，从而证实了RhoD可作为抗寨卡病毒感染的新靶点。此外，通过细胞毒性实验，本发明对细胞正常的生理功能不会产生任何影响，安全性高。因此，本发明提供了RhoD在制备预防或治疗寨卡病毒感染药物中的应用。

Description

RhoD抑制剂在防治寨卡病毒感染中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及抗寨卡病毒感染的新靶点及其潜在的医学应用。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于黄病毒科的黄病毒属，是一种蚊媒传播的病原体，它还可以通过直接接触、性接触、母婴传播等方式进行传播。ZIKV感染可以引起多种临床症状，比如发烧、皮疹、头痛、关节和肌肉疼痛、结膜炎甚至更严重的眼部病变等，并与严重的神经系统并发症有关，比如新生儿小头畸形和吉雷-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)。此外，ZIKV感染还与多种器官的改变有关，包括肝脏、肺和肾脏。在小鼠和非人灵长类动物中，除脑以外，在肝脏中也检测到高水平的ZIKV基因组复制。目前尚无预防疫苗和治疗药物。由于传播ZIKV的伊蚊(也是登革病毒DENV的传播载体)全球分布较广，加上国际贸易活动频繁、全球旅游业的兴起，包括我国在内的多个未出现疫情的国家和地区也将时刻存在输入性感染及后续本土化感染的风险。因此，抗ZIKV感染的防控策略及治疗药物研究备受关注。
病毒感染的起始步骤是对宿主细胞的入侵，该过程需要借助于宿主细胞的膜状结构以及囊泡运输系统。病毒进入宿主细胞以后，再在细胞内进行基因组的复制、病毒蛋白的翻译，继而在内质网-高尔基体处进行病毒组装，最终释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，细胞入侵作为病毒感染宿主细胞的首要环节，已成为抗病毒药物研制的首要靶标。然而，病毒常常进化出不同的入侵策略，即利用不同的机制入侵不同甚至是相同的靶细胞。已有研究表明，ZIKV可利用不同的膜表面分子和感染途径来入侵多种不同种类的靶细胞，比如ZIKV感染人神经胶质细胞是利用细胞膜表面分子Axl作为主要受体，经由网格蛋白依赖的内吞途径(clathrin-dependent endocytosis)完成入侵(Persaud M,Martinez-LopezA,Buffone C,et al.Infection by Zikaviruses requires the transmembrane proteinAXL,endocytosis and low pH.Virology,2018,518:301-312.)；而ZIKV感染胶质母细胞瘤T98G细胞则为网格蛋白依赖性和非依赖性两种独立的内吞途径(Li M,Zhang D,Li C,etal.Characterization ofZika Virus Endocytic Pathways in Human GlioblastomaCells.Front Microbiol.2020,11:242.)。由于ZIKV是与登革热和黄热病病毒密切相关的黄病毒，后两种病毒都会导致肝炎。体外研究显示，ZIKV能有效地感染人肝细胞。但目前关于ZIKV感染人肝细胞的途径及机制仍不清楚。
内吞作用本身其实是细胞正常生理代谢的一个极为重要的过程，比如从外环境中获取营养物质、回收膜组分和传导细胞信号等。有意思的是，包括ZIKV在内的病毒却也能利用这套机制进入细胞。参与内吞途径的关键宿主因子有多种，这些分子在细胞的跨膜运输、囊泡的形成、内化以及分泌中起着重要作用，比如前面提到的网格蛋白。它所介导的内吞作用涉及一种囊泡运输过程：首先，将病毒或病毒-受体复合物输送到网格蛋白包被的凹陷处，然后此凹陷进一步扩大，通过动力蛋白切除将质膜内陷处的膜闭合，形成网格蛋白包被的囊泡。携带病毒的内吞囊泡从质膜处被递送到早期内体，后者进一步成熟为晚期内体，然后病毒包膜与内体膜发生融合，从而将病毒RNA释放到细胞质中。
由于ZIKV可以感染多种不同的靶细胞，且涉及多种不同的内吞途径，因此，其入侵是一个非常复杂且多步骤相互协同的过程，涉及到除网格蛋白之外的多种不同的分子和膜转运系统。研究发现，发动蛋白(Dynamin II)、小窝蛋白(caveolin-1)及其依赖性膜胆固醇和动态肌动蛋白细胞骨架也是ZIKV感染T98G细胞所需要的。发动蛋白家族是一类鸟苷酸三磷酸酶(GTPase)，是细胞内吞途径中的一种特异蛋白，主要参与囊泡从细胞膜上出芽和剪切。Rho蛋白属于低分子量GTPase(又称小G蛋白)Ras超家族的亚家族成员。作为细胞信号的分子开关，Rho蛋白不仅可以打开或关闭细胞中各类信号通路，还能以多种方式调节肌动蛋白细胞骨架动力学，其外源表达可以引起广泛的细胞骨架和细胞形态表型。此外，还参与细胞的诸多生理活动，包括细胞迁移、粘附、增殖、分化、凋亡和转化等。其中Rho蛋白D(RhoD)在大多数组织和常用的细胞系中表达，且在小鼠肝脏、肾脏、膀胱、子宫、胃和肠中以高水平表达。虽然中枢神经系统中尚未见RhoD表达，但它可以参与神经元细胞中的轴突调节，且这种在轴突引导中的作用可能仅限于周围神经系统中新轴突的向外生长。
对其结合分子的鉴定研究表明，RhoD可以调节肌动蛋白组装、细胞粘附、内体运输动力学或高尔基体稳态等。例如，RhoD与WHAMM分子结合，在高尔基体内平衡和ER到高尔基体的运输中发挥作用。通过共聚焦荧光显微镜观察，发现RhoD与早期内体和循环内体标记物即Rab5和Rab11共定位。此外，RhoD也能与Rab5效应蛋白Rabankyrin-5相互作用，刺激酪氨酸激酶Src的活性，可能在跨膜受体的内化和内体运输过程中起重要作用(P.Atypical Rho GTPases RhoD and Rifintegrate cytoskeletal dynamics andmembrane trafficking.Biol Chem.2014,395(5):477-484.)。巧合的是，ZIKV也能与Rab5阳性早期内体和Rab7阳性晚期内体共定位，提示RhoD可能也参与了ZIKV感染的早期入侵阶段。
研究表明，外源表达的RhoD可以定位于囊泡和细胞质膜，其中质膜定位需要活性三磷酸鸟苷(GTP)结合构象，而囊泡定位则不需要此结合构象。更为关键的是，RhoD可以水解GTP提供能量，因而完整的GTPase活性可以促进RhoD阳性囊泡进行高效融合。RhoD的N末端有14个氨基酸残基的独特延伸基序，该基序在囊泡动力学中具有重要的调节作用(BlomM,Reis K,P.RhoD localization and function is dependent on its GTP/GDP-bound state and unique N-terminal motif.Eur J Cell Biol.2018,97(6):393-401.)。综上所述，RhoD与ZIKV入侵尤其是内吞过程紧密相关，揭示二者之间的相互作用有助于对病毒入侵机制的阐明，更能为抗病毒治疗提供新靶点、新思路。
目前还没有任何关于RhoD分子在ZIKV感染人肝癌细胞系(Huh7)中作用的研究报道，进一步对RhoD分子进行深入研究不仅有助于提升对ZIKV感染与致病机制的理解，也可以为预防和治疗ZIKV感染提供新的思路与靶点，以便开发出新型有效的抗病毒药物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗寨卡病毒感染的新靶点。
本发明的第二目的在于提供Rho蛋白D(RhoD)分子的新用途，尤其是在抗寨卡病毒感染中的应用。
本发明的第三目的在于具体提供了干扰RhoD分子表达的siRNA。
本发明的研究思路如下：基于课题组前期已获得的高通量蛋白组测序结果，利用现有的网络资源和常用生物学软件，结合包膜病毒入侵与感染特点，尤其是病毒颗粒与宿主细胞的起始黏附与结合以及随后的内吞、融合等步骤需借助于宿主细胞的内吞作用及囊泡运输系统这一重要理论，从蛋白组测序的差异蛋白中挑选出候选的RhoD分子，它在宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架动力学、内体运输以及囊泡功能调节中发挥着重要作用，符合病毒在感染过程中所需要的劫持并利用的宿主因子特质。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用常规软件对其进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计特异的siRNA。以人肝癌细胞系(Huh7)作为ZIKV感染的靶细胞，通过RNA干扰技术下调该候选宿主因子的表达，然后观察其对ZIKV感染的影响。我们发现，RhoD在ZIKV感染Huh7细胞中发挥着重要作用，下调RhoD的表达，能明显抑制ZIKV的感染活性，同时不影响细胞正常的生理功能。
本发明的第一方面，提供了Rho蛋白D(RhoD)作为一种抗寨卡病毒感染的新靶点。该Rho蛋白D(RhoD)的GENEBANK ID：NM_29984。
本发明的第二方面，提供了Rho蛋白D(RhoD)在制备预防或治疗寨卡病毒感染药物中的用途。特别地，该用途指的是阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制的用途，即、提供了抑制或下调RhoD表达的制剂在制备预防或治疗寨卡病毒感染药物中的应用。
进一步地，本发明还提供了Rho蛋白D(RhoD)在制备预防或治疗寨卡病毒病药物中的应用，即、抑制或下调RhoD表达的制剂在制备治疗寨卡病毒病药物中的应用。
优选的，上述抑制或下调RhoD表达的制剂为任何能够降低Rho蛋白D的活性或稳定性、抑制RhoD基因表达或加工、或减少Rho蛋白D有效作用时间的物质。
进一步优选，该抑制或下调RhoD表达的制剂为干扰RhoD的siRNA、shRNA或反义核苷酸，或者包含该siRNA、shRNA或反义核苷酸的重组载体。
最优选，所述抑制或下调RhoD表达的制剂为RhoD的干扰RNA，所述干扰RNA的序列如下述SEQ ID NO.1～3任一项所示：
AUGAUGGGUACCUUCUUGC(SEQ ID NO.1)、
UCUUCGGAGCUUGUUCACC(SEQ ID NO.2)、
AUCGAAGCAAAGCAGCAGG(SEQ ID NO.3)。
其中，以如SEQ ID NO.3所示的siRNA下调RhoD的表达量效果最佳，且抑制ZIKV对Huh7细胞的感染最为明显。
本发明的第三方面，提供了一种抗寨卡病毒的药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的载体，所述活性组分包括抑制或下调RhoD表达的制剂，或者以该抑制或下调RhoD表达的制剂作为唯一活性组分。
抑制或下调RhoD表达的制剂如第二方面所述。
本发明的第四方面，提供了一种抗寨卡病毒的重组表达载体，包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的RhoD的siRNA、shRNA或反义核苷酸。
优选的，所述表达载体为质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体或病毒载体，所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒与水疱性口炎病毒。shRNA的序列如SEQID NO.1～3任一项所示。
本发明筛选到能够抑制ZIKV感染Huh7细胞的一个新的宿主细胞因子RhoD。RhoD基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显阻断了ZIKV对Huh7细胞的感染。
本发明的有益保障及效果：
本发明提供了一种自行设计的siRNA，通过实验证实，该siRNA能够抑制ZIKV对靶细胞的感染，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制，从而证实了本发明的siRNA具备有效阻断ZIKV对宿主细胞的感染能力。通过细胞毒性实验，本发明所使用的siRNA浓度对细胞正常的生理功能不会产生任何影响，安全性高。因此，本发明为寨卡病毒病的预防和治疗提供了新的思路，为临床预防和治疗因ZIKV感染所导致的各类疾病提供了新的靶点和治疗方案，具备潜在的良好的临床应用价值。
附图说明
图1为real-time PCR法检测转染RhoD基因的不同干扰序列后，RhoD基因的mRNA水平，即干扰效率图。以不转染任何siRNA的细胞组作为对照组(Ctrl)；以转染non-targetingsiRNA即siNC的细胞组作为阴性对照组(siNC)；转染针对RhoD基因的siRNA(SEQ ID NO:1)的细胞组(siRhoD-1)；转染针对RhoD基因的siRNA(SEQ ID NO:2)的细胞组(siRhoD-2)；转染针对RhoD基因的siRNA(SEQ ID NO:3)的细胞组(siRhoD-3)。与对照组相比，**，P<0.01；***，P<0.001。
图2为转染RhoD基因的不同干扰序列后对细胞毒性的影响，其中A为CCK-8法检测各siRNA转染组中的细胞活性；B为光学显微镜观察各实验组的细胞病变效应图。以不转染任何siRNA的细胞组作为阳性对照组(Ctrl)；以转染siNC的细胞组作为阴性对照组(siNC)；转染针对RhoD基因的siRNA(SEQ ID NO:1)的细胞组(siRhoD-1)；转染针对RhoD基因的siRNA(SEQ ID NO:2)的细胞组(siRhoD-2)；转染针对RhoD基因的siRNA(SEQ ID NO:3)的细胞组(siRhoD-3)。与对照组相比，P>0.05。
图3为免疫荧光法检测宿主细胞因子RhoD下调后对ZIKV感染的影响，其中A为下调RhoD后对病毒感染性抑制的荧光检测图(所用一抗为ZIKV Capsid抗体)；B为下调RhoD后对病毒感染的抑制率图。未加病毒感染的细胞作为实验空白对照组(Mock)；以不转染任何siRNA的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(Ctrl)；以转染siNC的等量病毒感染的细胞组作为阴性对照组(siNC)；以转染针对RhoD基因的siRNAs(SEQ ID NO:3)的等量病毒感染的细胞组作为实验组(siRhoD)。与对照组相比，**，P<0.01。
图4为培养细胞中RhoD下调后对ZIKV感染的影响，其中A为Westernblot法检测RhoD下调后ZIKV核衣壳蛋白Capsid表达图，B为荧光定量PCR(real-time PCR)法检测RhoD下调后对ZIKV复制能力的影响，结果显示为相对于实验对照组，各实验组中寨卡病毒基因组RNA水平的相对变化检测图。未加病毒感染的细胞作为实验空白对照组(Mock)；以不转染任何siRNA的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(Ctrl)；以转染siNC的等量病毒感染的细胞组作为阴性对照组(siNC)；以转染针对RhoD基因的siRNAs(SEQ ID NO:3)的等量病毒感染的细胞组作为实验组(siRhoD)。与对照组相比，**，P<0.01。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如PCR方法，那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术操作人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明，具体实施方式文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：设计、合成宿主因子的特异性siRNA序列
1.1针对RhoD这一目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用分子生物学软件对目的基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行比对，确保所设计的序列无同源性；排除反义链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。然后，利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，共合成3条干扰序列，详见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
1.2单链siRNA的合成与纯化由RiboBio公司完成。
实施例2：siRNA序列干扰效果鉴定
2.1siRNA转染
转染步骤参照Lipofectamine 3000说明书。
1)转染前一天，将Huh7细胞按2×105个/孔接种于24孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜，以确保次日转染时细胞密度达到80-90％。
2)取1μL Lipofectamine 3000加入25μL opti-MEM中，轻柔混匀，室温孵育5min；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和25μL opti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的Lipofectamine3000转染试剂加入稀释的RNA中，轻柔混匀，室温孵育15min，加入Huh7细胞，补加450μLopti-MEM，使RNA终浓度为50nM。
3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。
2.2荧光定量PCR(real-time PCR)法检测宿主因子的mRNA水平
2.2.1抽提总RNA准备
购置无核酶的实验材料(如试管、tip头和Ep管)，或用已消毒的0.1％DEPC水浸泡实验材料两小时以上，然后用无菌去离子水冲洗干净，尽量不残留DEPC，再对待用材料进行高压灭菌，室温保存备用。
2.2.2抽提细胞中总RNA
利用Invitrogen公司的总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得细胞中的总RNA。方法如下：
对于上述经不同处理的Huh7细胞，先吸弃旧的培养液，每孔加入1mL的TRIzol溶解细胞，反复吹打几次，待细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物转移至无核酶的Ep管。将细胞裂解样品在15～30℃条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。按每1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，盖紧管盖，用力摇晃15sec充分混匀，室温静置5min进行分层。于2～8℃12000rpm离心15min。将上层无色的水样层转移至一个新的无核酶的Ep管中。按每1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇沉淀RNA。颠倒混匀，室温静置10min，然后2～8℃12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤RNA沉淀，2～8℃7500rpm离心5min，弃上清，空气干燥5-10min RNA沉淀，加入50μL不含RNA酶的无菌超纯水溶解RNA样品。整个过程须勤换手套，谨防RNA酶污染。
2.2.3逆转录制备cDNA
利用TaKaRa逆转录试剂盒获取对照组与实验组细胞的cDNA，具体步骤如下：
在PCR管中加入如下反应体系，
轻柔混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒灭活逆转录酶。
2.2.4荧光定量PCR法检测
设计引物，检测宿主因子的mRNA水平。GAPDH作为检测用内参。引物序列如下：
RhoD-F：
CACCTCCACATCTGGGACAC(SEQ ID NO:4)
RhoD-R：
GTTGTCAAAGCTGTTCGGGC(SEQ ID NO:5)
GAPDH-F：
TGGGCTACACTGAGCACCAG(SEQ ID NO:6)
GAPDH-R：
AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT(SEQ ID NO:7)
然后，利用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行检测，反应体系如下：
利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，设置程序为95℃预变性2min，进行40个PCR循环，95℃5sec，60℃30sec。
实验数据分析：PCR产物量的变化采用比较Ct值法来进行相对定量。该法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。
定义：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内标
ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内标)已处理-(Ct目的基因-Ct内标)未处理
RQ＝2-ΔΔCt
利用Excel或Prism里的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。将siRhoD转染组与siNC对照组进行T检验分析比较。
2.2.5实验结果
将50nM的siRNA转染入Huh7细胞中，同时以不转染siRNA的细胞组作为阳性对照组(Ctrl)；以siNC转染的细胞组作为阴性对照组(siNC)。转染后48h通过荧光定量PCR法检测目的基因的mRNA水平以确认干扰效果。
结果如图1所示，与对照(Ctrl和siNC)组相比，转染体系中加入50nM的针对RhoD基因的siRNA后，细胞中RhoD基因的mRNA水平显著降低(**，P<0.01；***，P<0.001)。
实施例3：细胞毒性实验
采用CCK-8方法检测加入siRNA对Huh7细胞增殖的影响，具体步骤如下：
收集处于对数生长期的Huh7细胞，以每孔约3×104个的密度接种于96孔板。待细胞生长过夜后，加入实施例1中各浓度的siRNA，继续培养48小时，然后CCK-8法检测细胞增殖情况。具体检测方法为：弃去细胞中原有的培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，置于37℃培养箱继续培养3h，然后用多功能酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值和标准误。
实验结果如图2所示，各组不同序列的siRNA加入细胞后，对细胞没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，光镜下也未见siRNA对细胞形态有任何影响，说明各序列的siRNA对细胞正常的生理功能并未产生影响，可用于后续实验。
实施例4：特异siRNA对ZIKV感染的抑制实验
4.1Huh7细胞的ZIKV病毒感染实验
正常的Huh7细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，且细胞培养液中添加2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100μg/mL的链霉素和100U/mL的青霉素。
转染前一天，将Huh7细胞按3×104个/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。次日，转染siRNA，方法同2.1。72h后，再进行ZIKV病毒感染实验。先将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种ZIKV，37℃感染2h，弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，换成新鲜培养基，37℃继续培养24h，免疫荧光法检测ZIKV感染阳性细胞。
4.2免疫荧光染色检测ZIKV感染
上述处理的各组Huh7细胞用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：
1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μL预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。
2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预冷PBS洗涤细胞3次。
3)封闭：每孔加入100μL 3％BSA，于室温下孵育1h。
4)一抗孵育：每孔加入稀释的ZIKV Capsid抗体(1:100，3％BSA稀释)100μL，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤细胞3次。
5)二抗孵育：每孔加入AF488荧光标记抗兔IgG(1:1000，3％BSA稀释)100μL，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤细胞2次。
6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤细胞3次。
7)荧光显微镜下检测、拍照并计算绿色AF488阳性细胞克隆数。
4.2.1实验结果
将50nM的siRNA转染入Huh7细胞中，72h后感染ZIKV，以不转染siRNA、不感染病毒的细胞组作为空白对照组(Mock)；以不转染siRNA的等量病毒感染的细胞组作为阳性对照组(Ctrl)；以转染siNC的等量病毒感染的细胞组作为阴性对照组(siNC)；以转染siRhoD的等量病毒感染的细胞组作为实验组(siRhoD)。感染后24h，通过细胞免疫荧光染色法检测干扰RNA对病毒感染的抑制情况。
结果如图3所示，与对照(Ctrl和siNC)组相比，体系中加入50nM的针对RhoD基因的siRNA后能明显抑制ZIKV病毒的感染能力，抑制效率可达到约43％(**，P<0.01)。
4.3蛋白免疫印迹法检测ZIKV Capsid蛋白的表达
4.3.1特异siRNA对ZIKV感染的抑制实验
转染前一天，将Huh7细胞按2×105个/孔接种于24孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。次日，转染siRNA 72h，进行ZIKV病毒感染实验。先吸弃培养上清，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种ZIKV，37℃感染2h，弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，换成新鲜培养基，37℃继续培养24h。
4.3.2细胞样品的制备
各对照组与siRNA转染组细胞弃去培养液后，用预温的PBS洗2～3次，每孔加100μL蛋白裂解液，反复吹打细胞促其裂解，转移至Ep管中，加入25μL 5×Loading buffer，于100℃煮10min左右，以12000rpm离心2min，弃沉淀，取上清(含细胞的总蛋白)进行SDS－PAGE电泳。
4.3.3蛋白免疫印迹法(Western blot)检测
(1)溶液配制
30％Acr/Bis：29.2％Acr，0.8％Bis，过滤后于4℃保存；
4×分离胶缓冲液：36.3g Tris，10％SDS 4mL，加H2O约180mL，用浓HCl调整pH至8.8，定容至200mL；
4×浓缩胶缓冲液：6.55g Tris，10％SDS 4mL，加H2O约80mL，用浓HCl调整pH至6.8，定容至100mL；
电泳缓冲液：3.03g Tris，14.41g Gly，1g SDS，加H2O溶解，定容至1000mL；
Loading buffer：1M Tris-HCl(pH6.8)1.2mL，10％SDS 4mL，巯基乙醇1mL，甘油2mL，溴酚蓝0.2mg，加H2O至20mL；
SDS－PAGE浓缩胶(上层胶)：2.4mL水，1.0mL 4浓缩胶缓冲液，0.6ml 30％Acr/Bis，50μL 10％过硫酸铵溶液，10μL TEMED；
SDS－PAGE分离胶(12.5％下层胶)：4.2mL水，3.0mL 4分离胶缓冲液，4.8ml 30％Acr/Bis，100μL10％过硫酸铵溶液，10μL TEMED。
(2)SDS－PAGE蛋白电泳
1)聚丙烯酰胺凝胶的制备——按照产品说明书安装聚丙烯酰胺凝胶板，先加入2mL分离胶溶液，在胶面上加水覆盖，待胶凝固后倾去覆盖液，擦干后加入浓缩胶，插上合适尺寸梳子，待其凝固后进行电泳。
2)12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳——将上述制备好的细胞样品和预染色的蛋白分子量Marker加入上样孔，80－100V/cm电压下电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底端，停止电泳，取出凝胶，切去浓缩胶。
(3)Western blot检测
将上述经12.5％SDS-PAGE进行总蛋白分离的下层凝胶，根据预染蛋白分子量Marker条带大小的指示，截取相应大小的目的条带，通过电转仪将蛋白转移到PVDF膜上。
用含5％脱脂牛奶的封闭液对膜上的非特异性结合位点进行封闭，然后与合适的一抗(抗-ZIKV Capsid的鼠源单抗和抗-GAPDH的兔源多抗，均为1:1000稀释)4℃轻摇孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜三遍后，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(羊抗鼠或抗兔IgG，均为1:1000稀释)室温作用孵育2小时后，用TBST缓冲液洗膜三遍，再利用HRP-ECL发光法进行底物显色，并拍照分析。
4.4real-time PCR法检测ZIKV mRNA的复制
方法基本同4.3.1。转染siRNA的Huh7细胞感染ZIKV后继续培养24h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，并逆转录成cDNA，设计引物，通过荧光定量PCR法检测寨卡病毒基因组RNA复制情况。具体步骤同2.2所示。
引物序列如下：
ZIKV-F：
CGGCAATCAAGCCATCACT(SEQ ID NO:8)
ZIKV-R：
GCCTCGTCTCTTCTTCTCCTT(SEQ ID NO:9)
4.6实验结果
将50nM的siRNA转染入Huh7细胞中，72h后感染ZIKV，以不转染siRNA、不感染病毒的细胞组作为空白对照组(Mock)；以不转染siRNA的等量病毒感染的细胞组作为阳性对照组(Ctrl)；以转染siNC的等量病毒感染的细胞组作为阴性对照组(siNC)；以转染siRhoD的等量病毒感染的细胞组作为实验组(siRhoD)。感染后24h，通过Westernblot法检测干扰RNA对病毒蛋白表达的影响。
结果如图4所示，与对照(Ctrl和siNC)组相比，体系中加入50nM的针对RhoD基因的siRNA后，寨卡病毒核衣壳蛋白Capsid的表达显著降低(见图4A)；寨卡病毒基因组RNA复制水平显著降低(见图4B)(**，P<0.01)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.抑制或下调RhoD表达的制剂在制备预防或治疗寨卡病毒感染药物中的应用。
2.抑制或下调RhoD表达的制剂在制备治疗寨卡病毒病药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抑制或下调RhoD表达的制剂为任何能够降低Rho蛋白D的活性或稳定性、抑制RhoD基因表达或加工、或减少Rho蛋白D有效作用时间的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制或下调RhoD表达的制剂为干扰RhoD的siRNA、shRNA或反义核苷酸，或者包含该siRNA、shRNA或反义核苷酸的重组载体。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制或下调RhoD表达的制剂为RhoD的干扰RNA，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.1～3任一项所示。
6.一种抗寨卡病毒的药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的载体，所述活性组分包括抑制或下调RhoD表达的制剂，或者以该抑制或下调RhoD表达的制剂作为唯一活性组分。
7.根据权利要求6所述的抗寨卡病毒的药物组合物，其特征在于，抑制或下调RhoD表达的制剂为干扰RhoD的siRNA、shRNA或反义核苷酸，或者包含该siRNA、shRNA或反义核苷酸的重组载体。
8.根据权利要求6所述的抗寨卡病毒的药物组合物，抑制或下调RhoD表达的制剂为RhoD的干扰RNA，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.1～3任一项所示。
9.一种抗寨卡病毒的重组表达载体，其特征在于，重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的RhoD的siRNA、shRNA或反义核苷酸。
10.根据权利要求9所述的抗寨卡病毒的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体或病毒载体，所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒与水疱性口炎病毒，
shRNA的序列如SEQ ID NO.1～3任一项所示。
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