CN104193805A - 鸭坦布苏病毒囊膜e蛋白抑制肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽及其应用，属于动物病毒分子生物学技术领域。本发明通过基因工程方法获得DTMUV囊膜E蛋白，并以DTMUV HN1株E蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列为：HWSTRQGSTRWN。该抑制肽可抑制鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞的增殖，在不同浓度下均能显著下调DTMUV在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DTMUV在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度，而其本身对鸭胚成纤维细胞的增殖无明显影响。鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽在制备抗鸭坦布苏病毒病的药物或饲料添加剂方面具有良好的应用前景，可用于鸭坦布苏病毒病的防治。

Description

鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，同时还涉及该抑制肽的应用，属于动物病毒分子生物学技术领域。 

背景技术

近年来，中国南方爆发了一种新的鸭病毒性传染病，主要引起鸭产蛋严重下降，该病传播迅速、涉及范围广，发病前期为持续高热，发病后期出现一定比例的神经症状，表现为瘫痪、翻滚、站立不稳及共济失调等，有些病鸭甚至在数日内死亡。剖检死亡鸭，多数呈现脾脏和肾脏明显肿大，蛋鸭表现为出血性卵巢炎。该病首先在江浙一带爆发，随后蔓延到福建和安徽等地，之后在江西、山东、湖南、河南、河北相继爆发。对于此病，国外尚未见报道。国内研究人员对其病原进行了分离、形态学观察、理化特性测定、RT-PCR检测及序列分析，现已确定该病病原为鸭坦布苏病毒，故称该病为鸭坦布苏病毒病。该病发病率高、传播迅速，发病范围极广，已给养鸭业造成重大经济损失。 

鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)是一种新型黄病毒，属于黄病毒科不分节段的单股正链RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直径约45～50 nm，有囊膜和纤突，病毒约由10990个核苷酸组成。该病毒对热、脂溶剂和去氧胆酸钠敏感，pH<5或pH>10时便失去感染活性，50℃以上加热60 min即被灭活。DTMUV能在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero、BHK、C6/36等部分传代细胞系上增殖。其病毒基因组由5’端、3’端的非编码区和中间的一个开放阅读框组成，5’端的非编码区长度为142 nt，含I型m7GpppNp帽子结构，3’端非编码区长618 nt，没有poly(A)尾巴，开放阅读框编码由3410个氨基酸残基构成的多聚蛋白前体。前体蛋白在宿主信号肽酶和病毒丝氨酸蛋白酶的作用下被切割成3种结构蛋白(C、prM和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。 

E蛋白是一种囊膜蛋白，编码501个氨基酸，其氨基酸序列中存在高度保守区和变异区。E蛋白位于成熟病毒颗粒表面，在病毒吸附受体、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过程中具有重要的作用，且含有多种抗原表位，这些表位与病毒识别宿主细胞膜受体、吸附和进入细胞，病毒的致病性和诱导免疫应答等密切相关，在病毒感染中起重要作用。另外，E蛋白还具有较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检 测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。 

噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，具有快捷、高效、表型和基因型一致等特点，近年来被广泛应用于肽类药物、抑制肽、抗原模拟表位的筛选等研究领域。利用噬菌体展示技术筛选鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，并研究该抑制肽对DTMUV在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响，可为鸭坦布苏病毒病防治提供一个新的途径，具有较好的应用前景。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽。 

同时，本发明还提供一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽的应用。 

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是： 

鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 

所述的鸭坦布苏病毒为鸭坦布苏病毒HN1株。 

鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽的应用，具体为鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽在制备抗鸭坦布苏病毒病(抑制鸭坦布苏病毒增殖，如抑制鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞增殖)的药物或饲料添加剂中的应用。 

本发明的有益效果： 

本发明通过基因工程方法获得DTMUV HN1株E蛋白，并以DTMUV HN1株E蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列为：HWSTRQGSTRWN。该抑制肽可抑制鸭坦布苏病毒HN1株在鸭胚成纤维细胞的增殖。标准MTT法检测E蛋白抑制肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影响，结果显示，E蛋白抑制肽本身对鸭胚成纤维细胞的增殖无明显影响。荧光定量PCR和TCID50检测E蛋白抑制肽对DTMUV在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响，结果显示，不同浓度的的抑制肽(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)均能显著下调DTMUV在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DTMUV在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度。结果表明，囊膜E蛋白抑制肽能抑制DTMUV在鸭胚成纤维细胞的增殖，在DTMUV的防治中具有良好的应用前景。 

附图说明

图1为本发明实施例1中重组表达质粒pET32a-E构建示意图； 

图2为实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性； 

图3为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果； 

图4为试验例中DRMUV HN1株E蛋白抑制肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影响； 

图5为试验例中抑制肽对DRMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞增殖的影响(Real time PCR)； 

图6为试验例中抑制肽对DRMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞增殖的影响(TCID50)。 

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。 

实施例1 

本实施例中鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽的筛选，包括以下步骤： 

1)常规方法制备DTMUV HN1株囊膜E蛋白 

根据GenBank发表的DTMUV HN1株E蛋白的基因序列(序列号：JQ669731)，利用DNAStar软件分析，设计一对特异性引物P1和P2，引物两端分别加限制性酶切位点EcoR I和Xba I及保护性碱基(Takara公司合成)，下划线部分为酶切位点。 

上游引物P1：5’-CCG GAATTC TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3’(如SEQ ID NO:2，下划线部分为EcoR I酶切位点)； 

下游引物P2：5’-CGATCTAGA ATTGACATTTACTGCCAGG-3’(如SEQ ID NO:3，下划线部分为Xba I酶切位点)。 

常规方法提取DTMUV HN1株RNA(病毒RNA提取试剂盒，南京Tiangen有限公司)，通过常规反转录PCR获取E蛋白的基因全长序列(Invitrogen一步法RT-PCR试剂盒)，将获取的E蛋白基因克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。将pMD18-T载体上的E蛋白基因目的片段经EcoR I与Xba I酶切后，克隆入pET32a载体，构建重组表达质粒pET32a-E，并用EcoR I与Xba I双酶切和PCR进行鉴定，鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a-E，送上海Invitrogen公司测序(见图1)。 

重组表达质粒pET32a-E的诱导表达与纯化 

采用CaCl₂转化法，将重组质粒pET32a-E转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆，即为含DTMUV HN1株E蛋白的基因的阳性基因工程菌株。将阳性基因工程菌株于37℃培养，待A₆₀₀值达到0.5时(0.4～0.6均可)，加IPTG至终浓度为0.8mM，进行诱导表达。收集不同诱导时间表达的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，并以鸭抗DTMUV-1血清为一抗，HRP标记的兔抗鸭IgG为二抗对表达产物进行Western blot分析，最后用DAB显色试剂盒显色。将诱导表达的菌液离心并收获沉淀，以洗涤液(5 mM咪唑，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.9)重悬菌 体后，经超声波裂解后离心，将可溶性表达上清用蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程参照Novagen公司His·bind purification kit说明书，E蛋白经镍柱纯化后，即获得DTMUV HN1株E蛋白。 

2)噬菌体随机12肽库的亲和筛选 

(1)包被纯化的DTMUV HN1株E蛋白 

将上述基因工程表达的E蛋白以TBS稀释为10μg/mL，取稀释后的E蛋白包被酶标板，100μL/孔，放置湿盒中4℃过夜；次日倾弃包被液，加入含0.05％Tween 20的TBST洗涤3次(每次静置3 min)，叩干，然后以含5％脱脂奶粉的TBS按100μL/孔加入各孔，置湿盒中37℃封闭2 h；倾弃封闭液，以含0.05％Tween 20的TBST溶液洗涤3次，叩干，将包被好的酶标板封口，于4℃保存待用。 

(2)亲和筛选 

以TBST稀释原始文库(购于美国New England Biolabs，NEB公司)至1×10¹¹pfu/mL，取稀释后的文库液100μL加入到预先包被E蛋白的酶标板孔内，放置湿盒中4℃过夜。次日弃孔内液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100μL 0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，于室温温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入15μL 1M Tris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。测定少量(～1μL)洗脱物的滴度，剩余洗脱物加入到20mL ER2738培养物中(菌体处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5h。将培养物转入离心管中，4℃12,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。取80％上清转入新管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀过夜。次日，4℃12,000rpm离心PEG沉淀15min。弃上清，再短暂离心，弃去残留上清。沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育30min(15～60min均可)。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200μL TBS、0.02％NaN₃中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌体液以TBS稀释为1×10¹¹pfu/mL，取100μL加入到预先包被E蛋白的酶标板孔中进行第二轮筛选，37℃温育2h，弃孔内液，并用含0.05％Tween 20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第三轮筛选。 

在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input、洗脱得到的噬菌体量记为Output，分析比较每轮产出/投入比(Input/Output)情况，来反映特异性结合噬菌体的富集 程度。经过3轮筛选发现：淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第三轮噬菌体滴度为2.3×10⁶pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高(见下表1)，表明具有特异性结合作用的噬菌体显示较好的富集效果。 

表1 三轮亲和筛选对噬菌体的富集 

3)单克隆噬菌体的扩增 

将ER2738接种于20mL LB培养基中，37℃培养至稍浑浊。用灭菌的吸头从第三轮淘选物中随机分别挑取10个克隆。每个噬菌体克隆加入到每管ER2738培养液中，37℃培养4.5h。将上述培养物于4℃12,000rpm离心10min，上清移入新的离心管，再离心。取80％上清于新离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀过夜(至少1h)。4℃12,000rpm 15min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，弃去残余上清。沉淀重悬于1mL TBS中，将悬液转入微量离心管，4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。上清转入新的微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用30min(15～60min均可)。4℃离心10min，弃上清，再进行短暂离心，弃去残余上清。沉淀重悬于50μL TBS中，按常规M13方法进行噬菌体滴度测定。 

4)ELISA检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性 

为了检测筛选得到的噬菌体克隆是否与E蛋白特异性结合，从第三轮筛选后测滴度的琼脂板中随机挑选20个单个噬菌体克隆，以E蛋白包被酶联板做间接ELISA试验。用100μL 10μg/mL的靶分子E蛋白(溶于0.1M pH8.6 NaHCO₃中)包被ELISA板，并设PBS对照。在密封的湿盒中4℃包被过夜。经封闭液4℃封闭1h后，PBST洗涤，加入100μL待测单个克隆的噬菌体上清(稀释至：10¹¹pfu/mL)为待测短肽，室温反应1h。PBST洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP结合物，室温反应1h。PBST充分洗涤，加入TMB底物显色溶液，室温30min，后加50μL 2M的H₂SO₄终止反应，测A450值。 

结果显示其中10个克隆显示较强的阳性结果(见图2)。分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10。 

5)竞争抑制试验 

将上述10个克隆，做竞争ELISA实验，以进一步鉴定所筛选的噬菌体展示肽是否与 E蛋白特异性结合。在湿盒中，包被靶分子E蛋白并封闭(方法同上)，加入100μL不同浓度(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL)E蛋白与上述单克隆噬菌体(稀释至：10¹¹pfu/mL)等体积混合，室温作用10min，每孔100μL，室温轻摇孵育1h。PBST洗6次，加抗M13-HRP抗体，室温轻摇孵育1h，PBST洗6次，加TMB底物显色，测A450值。 

抑制率的计算公式见下式(1)： 

抑制率(％)＝(未抑制A450值－抑制后A450值)/未抑制A450值×100％    (1) 

结果表明，与E蛋白的预先结合能够阻断噬菌体克隆P3、P8与包被E蛋白的结合(见图3)。说明噬菌体P3、P8中插入的12肽为E蛋白的抑制肽。 

6)单链噬菌体DNA的制备 

按1:100稀释ER2738过夜培养物并接种于LB培养基，分装到培养管中，每管1mL。用灭菌吸头挑一蓝色噬菌斑(从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以保证每个噬菌斑仅含一个DNA序列)加入上述1mL培养管中，每个要鉴定的克隆一管。37℃摇床培养5h(4.5～5h均可)。培养物转入微量离心管中，离心30s。上清转入新管中，再离心，然后将500μL含噬菌体的上清转入新离心管中。加200μL PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。离心10min，弃上清，再短暂离心，小心吸弃残余上清。用70％乙醇洗涤沉淀，充分干燥后，沉淀重悬于30μL TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中。 

7)阳性噬菌体DNA序列测定 

提取上述编号为P3的噬菌体阳性克隆的单链DNA后，用-28gIII(如SEQ ID NO:4所示)和-96gIII测序引物(如SEQ ID NO:5所示)交由上海Invitrongen公司测序，以推测其相应的氨基酸序列，结果显示，得到的DTMUV HN1株E蛋白抑制肽的氨基酸序列为P3-12：HWSTRQGSTRWN(如SEQ ID NO:1所示)。 

8)化学合成多肽 

采用固相合成法合成上述多肽P3-12，由上海科肽生物有限公司合成，纯度95％以上。 

实施例2 

本实施例中鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽在制备抗鸭坦布苏病毒病的药物中的应用，包括以下步骤：取鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽纯化冻干后的粉末(鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽由固相多肽合成方式合成，反向高效液相色谱法纯化，纯化冻干后纯度达95％以上)，与医药领域常用淀粉、蔗糖、滑石粉混合，得到抑制鸭坦布苏病毒增殖的片剂药物，鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽作为抗病毒药物中主要抗病毒活性成分，主药 每片含量为0.1g，主药的百分含量为50％。或者将多肽粉末用PBS缓冲液溶解，配制成不同浓度的多肽溶液，用于抑制鸭坦布苏病毒增殖试验。 

实施例3 

本实施例中鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽在制备抑制鸭坦布苏病毒增殖的饲料添加剂中的应用，包括以下步骤：将鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽纯化后冻干，得到纯度达95％以上的多肽粉末(纯化采用高效液相色谱法，冻干采用冷冻干燥法)，即得。可按饲料重量添加0.2～0.5‰的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，即每吨饲料添加多肽粉末200～500克。 

试验例 

(1)DTMUV HN1株E蛋白抑制肽P3-12对鸭胚成纤维细胞增殖的影响 

将除脑、眼、四肢、内脏的鸭胚胎用PBS漂洗5次(4～5次均可)后剪切成1mm³(0.5～1.5mm³均可)的组织块；将组织移入培养瓶，倒置培养瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养4.5h(4～5h均可)；组织块完全贴壁后加入培养液9ml(8～10mL均可)，培养液成分：DMEM+10％特级胎牛血清(FBS)；弃除培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培养液9mL(8～10mL均可)终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37℃，5％CO₂培养箱中继续培养至2×10⁵cells/mL，均分为5组，第1至第4组分别加不同浓度(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)的P3-12肽。第5组为加PBS空白对照组，继续培养48 h后，采用MTT法检测鸭胚成纤维细胞增殖情况。 

相对细胞增殖率的计算公式见下式(2)： 

相对细胞增殖率＝实验组OD值/对照组OD值×100％    (2) 

细胞抑制率的计算公式见下式(3)： 

细胞抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％(3) 

结果显示，与PBS空白对照组相比，实验浓度下的P3-12肽组细胞相对增殖率均无显著变化(P>0.05)(见图4)，表明DTMUV HN1株E蛋白抑制肽P3-12本身对鸭胚成纤维细胞的增殖无明显影响。 

(2)DTMUV E蛋白抑制肽P3-12对DTMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞增殖的影响 

将鸭胚成纤维细胞培养至2×10⁵cells/mL，用含1％FBS的DMEM培养基冲洗，加入无血清DMEM培养基，然后分装至96孔细胞培养板中，实验分为6组，第1～5组加病毒感染复数为0.01 MOI的DTMUV病毒液。第6组为加PBS空白对照组，各组细胞培养 4 h，弃去感染液，PBS冲洗细胞2次，加含10％FBS的DMEM培养基，然后在第1组至第4组中分别加入不同浓度(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)的P3-12肽。继续培养48 h后，观察记录病变，并按Reed and Munch公式计算各组的TCID50，同时采用荧光定量PCR法检测DTMUV病毒拷贝。 

荧光定量PCR结果显示，与第5组相比，第1组至第4组加入不同浓度的多肽P3-12(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)均能显著下调DTMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数(见图5)，测定不同实验组的DTMUV HN1株TCID50，结果也显示，不同浓度的多肽P3-12均能显著降低DTMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度(见图6)。以上结果表明，DTMUV HN1株E蛋白抑制肽P3-12能够抑制DTMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞的增殖。 

Claims (4)

1.鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽，其特征在于：所述的鸭坦布苏病毒为鸭坦布苏病毒HN1株。

3.一种如权利要求1或2所述的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽的应用，其特征在于：所述鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽在制备抗鸭坦布苏病毒病的药物或饲料添加剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽的应用，其特征在于：所述鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白抑制肽在制备抑制鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞增殖的药物或饲料添加剂中的应用。