CN109865138B - 一种坦布苏病毒e蛋白受体结合域的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种坦布苏病毒E蛋白受体结合域的应用。该受体结合域氨基酸序列选自SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明受体结合域通过与坦布苏病毒受体HSPA9特异性结合，阻断病毒粒子与细胞吸附，从而抑制坦布苏病毒感染DF‑1细胞。该结合域对宿主本身不产生影响和副作用，使得该受体结合域具有很高的特异性和更好的应用前景。

Description

一种坦布苏病毒E蛋白受体结合域的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种坦布苏病毒E蛋白受体结合域的应用。

背景技术

坦布苏病毒属于黄病毒科、黄病毒属，可引起以食欲急剧减退、产蛋量骤降为主要特征的 坦布苏病毒病。坦布苏病毒暴发以来已连年在我国多省大面积流行，并且感染的宿主谱还在不 断扩大，蛋鸭、种鸭、雏鸭、蛋鹅、种鹅及蛋鸡等均出现了坦布苏病毒感染的病例报道(Liu M, Chen S,Chen Y,et al.Adapted Tembusu-like virus in chickens andgeese in China.J Clin Microbiol. 2012,50(8):2807-2809.)，已成为危害我国鸭鹅养殖业的重要疫病之一。(Huang X,Han K,Zhao D,et al.Identification and molecularcharacterization of a novel flavivirus isolated from geese in China.Res VetSci.2013,94,774-780；Su J,Li S,Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYDvirus,a new Tembusu-related flavivirus.PLoS One.2011,6,e18106.)。该病的发病率可高 达100％，死亡率在5％～10％之间(Tang Y,Diao Y,Gao X,et al.Analysis of theComplete Genome of Tembusu Virus,a Flavivirus Isolated from Ducks inChina.Transbound Emerg Dis,2012, 59(4):336-343.)。

坦布苏病毒病发病急，传播迅速，流行范围广。虽然已有坦布苏灭活疫苗和弱毒疫苗，但 在有些情况下，抗体在病毒感染过程中却发挥相反的作用。它们协助黄病毒属病毒进入靶细胞， 提高感染率，这一现象就是抗体依赖性增强作用(ADE)。这使得采用疫苗防治坦布苏病毒时 常常难以奏效。

坦布苏病毒属于黄病毒家族成员，该属病毒主要包括几种重要的人类病原体，包括登革病 毒、西尼罗病毒和乙型脑炎病毒等。目前为止，该属病毒没有感染的特异性疗法，物治疗效果 并不理想，临床上较难控制。

黄病毒属病毒以E蛋白作为吸附蛋白，通过E蛋白二聚体与细胞表面的HS、DC-SIGN、 Hsp70/Hsp90、CD14、GRP78/BiP等受体分子结合，使病毒粒子吸附靶细胞。病毒E蛋白与宿 主细胞受体结合后，启动E蛋白构象变化，折叠形成三聚体结构，拉近病毒囊膜与细胞膜距 离，引发两膜融合，随后病毒基因组释放到宿主细胞内感染宿主(Smit JM,MoeskerB, Rodenhuis-Zybert I,et al.Flavivirus cell entry and membranefusion.Viruses,2011,3(2): 160-171.)。以上述机制为基础，筛选E蛋白中参与受体结合的核心结构域，可在病毒E蛋白 吸附受体过程中特异性竞争性结合受体，阻断病毒粒子与受体的结合，达到抑制病毒感染的目 的。

坦布苏病毒病属于新发传染病，相关研究尚属空白，目前坦布苏病毒感染细胞机制尚未明 确，也没有有关受体结合域的报道。因此，鉴定坦布苏病毒E蛋白受体结合域将有助于了解坦 布苏病毒的入胞机制，并应用于坦布苏病毒病的防控。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的坦布苏病毒受体结合域的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

SEQ ID No.1所示的多肽作为坦布苏病毒DF-1细胞的受体结合域在制备抑制坦布苏病毒 的药物中的应用。

SEQ ID NO.2所示的编码SEQ ID No.1所示的多肽的基因序列在制备抑制坦布苏病毒的 药物中的应用。

含有SEQ ID NO.2所示的基因序列的重组载体在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用。

一种抗坦布苏病毒的药物组合物，包含SEQ ID No.1所示的坦布苏病毒DF-1细胞的受体 结合域。

制备本发明所述受体结合域的方法，通过人工直接合成或通过体外表达获得。例如通过含 有在适当的转录启动子控制下的编码所需肽的重组核酸分子的微生物表达肽，以及从所属微生 物收集所需肽。

有益效果：

本发明首次鉴定了一个新的坦布苏病毒DF-1细胞的受体结合域，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。基于该发现，本发明以坦布苏病毒E蛋白为设计基础，用合成坦布苏病毒DF-1细 胞的受体结合域竞争结合坦布苏病毒特异性受体，干扰坦布苏病毒与靶细胞特异性受体的结 合，从而抑制坦布苏病毒感染靶细胞。结果表明，SEQ ID No.1所示的多肽具有干扰坦布苏病 毒与靶细胞特异性受体结合的作用，并呈现抑制坦布苏病毒感染细胞的作用。本领域技术人员 可以根据上述方法设计出基于SEQ ID No.1的类似物，用以干扰坦布苏病毒与靶细胞特异性受 体的结合。

本发明提供的多肽，通过抑制病毒与靶细胞特异性受体的结合来抑制坦布苏病毒的感染， 而对宿主本身不产生影响和副作用，使得该多肽具有很高的特异性和更好的应用前景。

附图说明

图1是合成的多肽对坦布苏病毒的感染具有显著抑制效应。终浓度为100μg/ml的多肽可有效 抑制坦布苏病毒的感染，抑制效率为50％。但是对照小鼠阴性血清组没有此抑制效果。

图2显示本发明多肽可与坦布苏病毒受体HSPA9特异性结合，干扰坦布苏病毒与靶细胞特异 性受体结合，从而抑制病毒感染靶细胞，但是阴性对照组未检测到蛋白与受体的结合。

具体实施方式

实施例1结合域的获得

根据坦布苏病毒E蛋白氨基酸序列，设计多肽，采用人工合成的方法获得，氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

实施例2结合域抑制坦布苏病毒感染细胞

1、按正常细胞培养方法培养DF1细胞(鸡胚成纤维细胞)至80％饱和水平。

2、将实施例1合成的多肽(终浓度为100μg/ml)与DF1细胞4℃孵育1小时，将孵育物吸 出，PBS洗涤2次，接种坦布苏病毒(浓度为200TCID₅₀)；对照组采用小鼠阴性血清(终浓度为100μg/ml)，其余操作步骤与试验组相同。

3、坦布苏病毒接种后4℃孵育0.5小时，37℃孵育1小时，将孵育物吸出，PBS洗涤2次，加 入正常细胞培养液，细胞培养24小时，荧光定量RT-PCR检测病毒核酸含量。

实验结果见图1：对照组(小鼠阴性血清终浓度为100μg/ml)病毒核酸相对含量分别为99.8％、 98.4％、99.3％，试验组(实施例1合成的多肽终浓度为100μg/ml)病毒核酸相对含量分别 为52.5％、55.9％、43.5％，通过与对照组对比分析，加入实施例1合成的多肽的DF-1细胞中 坦布苏病毒含量下降50％，说明本发明多肽能与特异性受体结合，阻断坦布苏病毒粒子吸附， 抑制病毒感染。

实施例3结合域的体外表达

人工合成SEQ ID NO.1所示多肽编码基因，在5’端加上Bam HI酶切位点(AAGCTT)，3’ 端加上Not I酶切位点(GCGGCCGC)。将合成的基因克隆到蛋白表达载体pGEX-4T-1多克隆位点Bam HI和Not I位点之间。该多肽的基因序列如SEQ ID No.3所示，重组的多肽带有GST标签。转化BL21(DE3)，常规方法培养并诱导表达，通过GST标签蛋白纯化系统(GST-tagPurification Resin)按说明书方法纯化得到重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测与预期相一致。采 用实施例2的方法进行坦布苏病毒在DF-1细胞上的抑制试验，重组蛋白的终浓度为100μg/ml， 相应的病毒核酸相对含量分别为57.9％、63.1％、60.2％，阴性对照组病毒核酸相对含量分别为 99.2％、100％、99.5％，结果表明通过原核表达获得的重组蛋白抑制病毒感染的效果与直接合 成的多肽片段一致。

实施例4结合域与坦布苏病毒细胞受体的结合

为了鉴定多肽与坦布苏病毒受体HSPA9的结合，将多肽点样于硝酸纤维素膜(NC膜)上， 待多肽溶液完全被吸收后，用含有3％BSA的PBST溶液于37℃封闭2h，PBS洗涤3次，每 次3分钟，后与HSPA9蛋白37℃孵育1h，PBS洗涤3次，每次3分钟，然后以HSPA9特异 性抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Dot-Blot检测。阴性对照在封闭后与 PBST孵育1h，其余操作与试验组相同。阳性对照为直接将HSPA9蛋白点于NC膜上，其余 操作与试验组相同。

实验结果：本发明多肽可与坦布苏病毒受体蛋白HSPA9结合，阻断病毒吸附DF-1细胞， 从而竞争性抑制病毒对细胞的感染(图2)。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种坦布苏病毒E蛋白受体结合域的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Gly Val Asn Gly Val Glu Trp Ile Asp Val Val Leu Glu Gly Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggagtga atggtgttga gtggatcgat gtcgttctgg aaggaggc 48

Claims (4)

1.SEQ ID No.1所示的多肽作为坦布苏病毒DF-1细胞的受体结合域在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用。

2.SEQ ID NO.2所示的编码SEQ ID No.1所示的多肽的基因序列在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用。

3.含有SEQ ID NO.2所示的基因序列的重组载体在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用。

4.一种抗坦布苏病毒的药物组合物，其特征在于包含SEQ ID No.1所示的坦布苏病毒DF-1细胞的受体结合域。

Images