CN104774249B - 猪流行性腹泻病毒m蛋白亲和肽及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法，所述M蛋白亲和肽的氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。本发明利用噬菌体展示技术获得能特异性结合PEDV及其重组蛋白M的短肽，并对该短肽人工合成，分析其抗病毒的生物学功能，结果表明本发明首次筛选合成的2种PEDV M蛋白的亲和多肽均能够有效的抑制PEDV的复制，这为今后对PEDV小分子诊断和治疗制剂的开发提供了一定的理论基础和试验依据。

Description

猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒M蛋白的亲和多肽及其筛选方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪的接触性肠道传染病。常以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪的高致死率为主要特征。PEDV的结构蛋白与其他冠状病毒相似，该病毒有糖基化纤突蛋白(Spike，S)、糖基化囊膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)三种结构蛋白。其中M蛋白是一种糖蛋白，是由226个氨基酸组成的，分子质量为20-32ku，是PEDV刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白之一。其氨基酸序列非常保守，在病毒装配期间将核衣壳连接到囊膜上，决定病毒粒子的装配位点、病毒成熟及出芽位点。另外，抗M蛋白抗体在补体存在的情况下可中和病毒的感染性。

噬菌体展示技术(Phage display technique)是近年发展起来的一项新的分子生物学技术，是将外源蛋白或多肽与噬菌体的外壳蛋白在噬菌体的表面融合表达，再利用特异性的抗体对改造的噬菌体进行淘选，通过几轮淘选将得到含有目的蛋白的重组噬菌体，然后提取噬菌体的基因组并测序，从而获得编码目的基因序列，进而可以知道目的蛋白或多肽的氨基酸序列组成。噬菌体展示技术作为一种新兴的研究蛋白质相互作用的方法，被广泛应用到了生物学的各个领域中。

近年来PED频繁爆发，目前该病尚无特效药物的应用，主要依靠疫苗接种进行防治。但由于PEDV常发生突变的原因而使疫苗接种保护失败，给世界养猪业造成严重的损失。噬菌体展示技术是一种探索蛋白质分子间相互作用的有效工具，利用随机肽库，通过数轮生物淘选，快速获得相应靶分子的多肽配体。PEDV M蛋白具有很高的保守性，是病毒刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白之一，是冠状病毒外膜最主要的成分，它的一级结构对病毒的装配是非常重要的。故通过对PEDV M蛋白的噬菌体亲和多肽的筛选及其抗病毒生物学功能的鉴定，为PED开发研制新型多肽疫苗与小分子抗病毒药物的开发提供参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法，利用噬菌体展示技术获得能特异性结合PEDV及其重组蛋白M的短肽，并对该短肽人工合成，分析其抗病毒的生物学功能，结果表明本发明首次筛选合成的2种PEDV M蛋白的亲和多肽均能够有效的抑制PEDV的复制，这为今后对PEDV小分子诊断和治疗制剂的开发提供了一定的理论基础和试验依据。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽，其序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。

上述猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛选方法，包括如下步骤：

1、猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达，得到纯化的重组M蛋白。

2、M蛋白亲和肽的筛选

M蛋白的包被：将浓度为15μg/100μL的M蛋白包被在酶标板中，4℃过夜，封闭，用0.1％TBST洗6次，每次10s。洗过后加入稀释好的噬菌体文库100μL，震摇10min停歇10min，共40min，用0.1％TBST洗10次，加洗脱液100μL，震摇30min，将上清加到EP管中，加入15μL中和液，分别进行噬菌体滴度测定和扩增，并进行后续筛选。按上述步骤进行以后三轮筛选，并逐步增加选择压力，即以后每轮M蛋白的包被浓度依次减半，TBST洗涤次数每轮增加5次。

噬菌体的扩增：挑取每次筛选后的阳性噬菌体，加入ER2738培养液，37℃震摇5h。转移至离心管，4℃，9 000r/min，15min，取上清，加1/6体积的PEG-NaCl，4℃沉降过夜，离心弃上清，用1mL TBS悬浮沉淀，离心取上清。加1/6体积的PEG-NaCl，沉降1h，离心后用100μLTBS悬沉淀，离心1min，取上清，进行滴度测定。

噬菌体滴度测定：取底层琼脂板，取4-5个EP管，每管100μL ER2738菌液，向第一管中加入10μL噬菌体洗脱物，倍比稀释，4-5个稀释度，将熔化后的顶层琼脂倒入离心管中，加入稀释的混合物，弹匀后倒在底层琼脂上，温箱避光倒置培养过夜。

3、M蛋白亲和噬菌体测序和亲和肽的合成：

随机挑取第4轮筛选后的10个噬斑，扩增后提取单链DNA，参照《噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册》提供的特异性噬菌体引物序列，由北京六合华大基因科技有限公司合成一对引物：

+130M13：5’-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3’；

-28M13：5’-CCCTCATAGTTAGCG TAACG-3’。

经基因测序公司测序，扩增片段大小为250bp。

在随机十二肽的gIII融合蛋白N末端有一段信号肽前导序列，在表达融合蛋白后前导序列可以被切除，所以随机肽就位于成熟蛋白的N末端。设计一对特异性引物直接扩增出包含淘选肽配体在内的核苷酸序列，从而推导出所淘选肽配体的36个核苷酸序列。分析10个单克隆噬菌斑的序列并翻译成氨基酸，送到上海强耀生物公司合成纯度为95％的短肽，命名为M-2、M-9。

4、M蛋白亲和肽的功能鉴定

间接免疫荧光检测多肽的抗病毒作用：将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃5％CO₂培养1h，再将混合物加入到96孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞中1h，弃去上清，补液，至出现明显的CPE后停止培养。进行间接免疫荧光检测，抗体为制备的抗PEDV全病毒阳性血清，二抗为FITC标记山羊抗兔IgG。

实时荧光定量PCR检测多肽的抗病毒作用：通过实时定量PCR扩增PEDV的N基因来检测多肽在体外对病毒的浓度依赖性抑制作用。将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃5％CO₂培养1h，再将混合物加入到6孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞，36h后收集细胞板中的病毒液。根据RNA提取试剂盒的操作说明，提取病毒总RNA，反转录。同样用TGEV-M作为无关多肽对照。随后用ABI PRISM 7500实时定量PCR仪器进行实时定量PCR。

本发明相对于现有研究，具有如下的优点及有益效果：

(1)由于表达M全基因存在困难，即使表达，表达量也会受到一定限制，导致实验当中M蛋白的表达十分困难。本发明通过pET-32a原核表达载体，建立高效表达M全长基因的原核表达体系，获取大量M蛋白，为PEDV相关研究提供重要的实验材料。

(2)噬菌体展示技术是一种探索蛋白质分子间相互作用的有效工具，利用随机肽库，通过数轮淘选，快速获得相应靶分子的多肽配体。本发明以表达纯化复性后的M蛋白作为靶蛋白，利用噬菌体展示随机十二肽库进行筛选，4轮淘选后，挑选10个与PEDV M蛋白特异性结合力高的噬菌体单克隆，序列测定并推导其氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ、AYCTRHVCYLDN，命名为M-2、M-9多肽。合成多肽的体外抗病毒试验中，间接免疫荧光实验和实时荧光定量PCR实验证明M-2、M-9多肽单独与PEDV作用或者M-2与M-9多肽联合与PEDV作用都能够有效的抑制病毒的复制，M-2与M-9多肽联合抗病毒作用更好，且都呈剂量依赖性。为进一步研究PEDV M蛋白功能性配体以及为进一步研究PEDV新型多肽疫苗与小分子诊断和抗病毒药物的开发提供了参考。

附图说明

图1为重组质粒pET32a-M的PCR鉴定图，其中，M：DNA marker；1：pET-32a-M重组质粒的PCR产物；2：ET-32a-M重组质粒的EcoR I/Xho I酶切产物；

图2为PEDV M蛋白的表达及纯化，其中，A：M：低分子质量蛋白质标准；1：pET32a-M经IPTG诱导超声后的上清；2：pET32a-M经IPTG诱导超声后的沉淀；3-9：分别代表质粒诱导0-6h；B：M：低分子质量蛋白质标准；1：纯化的M重组蛋白；

图3为PEDV M重组蛋白的Western blot分析，其中，M：低分子质量蛋白质标准；1：空载体；2：未纯化PEDV M蛋白；3：纯化PEDV M蛋白；

图4为亲和噬菌体与PEDV亲和性ELISA检测；

图5为亲和噬菌体与PEDV M蛋白亲和性ELISA检测；

图6为亲和多肽M-2、M-9单独与联合抑制PEDV感染的间接免疫荧光检测，其中，A：阳性对照组；B：M-2多肽处理组；C：M-9多肽处理组；D：M-2与M-9联合多肽处理组；E：VeroE6细胞对照；

图7为亲和多肽M-2、M-9单独与联合抑制PEDV感染的实时荧光定量PCR检测。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1

重组质粒pET32a-M的原核表达：

根据GenBank已发表的PEDV M基因序列，设计引物P1和P2：

P1：5’-CGCGAATTCGCCATGTCTAACGGTTCTAT-3’(下划线表示引入的酶切位点为EcoRI)

P2：5’-CGCCTCGAGTTAGACTAAATGAAGCAC-3’(下划线表示引入的酶切位点为Xho I)

选取标准病毒株CV777，提取基因组DNA，利用PCR扩增PEDVM基因片段，扩增条件：94℃预变性10min、94℃变性30s、50.2℃退火30s、72℃延伸1min和94℃预变性10min、94℃变性30s、49.6℃退火30s、72℃延伸1min，共进行30个循环，72℃终延伸10min。PCR产物用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，在681bp附近存在单一的目标条带，结果如图1所示，表明实验获得了与预期相符的特异DNA片段即M基因片段。与载体pET32a分别用EcoR I和Xho I双酶切处理，连接后转入表达感受态细胞BL21中，将菌液涂布于固体LB培养基(NaCl 1g，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，琼脂粉1.5g，用100mL去离子水溶解后高压灭菌)，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素(Amp⁺)的液体LB培养基中，37℃培养3h至OD为0.4-0.6时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，终浓度1mmol/L)诱导表达6h，菌体超声破碎后，经切胶纯化制备的M重组蛋白；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western-blot)验证纯化后的M重组蛋白的纯度和免疫原性(见图1)，用于后续噬菌体筛选实验。

实施例2

PEDV M多克隆抗体的制备：

选取2-3kg新西兰大白兔，首免为纯化的重组M蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射，剂量为2mg/只，以后为弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组M蛋白完全乳化，间隔1周免疫一次，3免后1周用不加佐剂的纯化的重组M蛋白加强免疫，7d后兔心脏采血获得血清，得到抗PEDV M蛋白多克隆抗体，通过间接ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹法用于多抗特性鉴定。SDS-PAGE分析结果表明，重组质粒菌液诱导后在41ku处出现特异性条带，重组M蛋白以包涵体形式表达，切胶纯化后可获得较好结果(见图2A和2B)。以抗PEDV全病毒阳性血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，进行Western-blot分析，结果在24ku处可见特异性条带(见图3)

实施例3

PEDV M亲和肽的筛选及功能测定：

(1)M蛋白的包被

将浓度为15μg/100μL的M蛋白包被在酶标板中，4℃封闭过夜，用0.1％TBST洗6次。洗过后加入稀释好的噬菌体文库100μL，震摇10min，间停10min，共40min，用0.1％TBST洗10次，加洗脱液100μL，震摇30min，将上清加到EP管中，加入15μL中和液，分别进行噬菌体滴度测定和扩增，并进行后续筛选。按上述步骤进行以后三轮筛选，并逐步增加选择压力，即以后每轮M蛋白的包被浓度依次减半，TBST洗涤次数每轮增加5次。

(2)亲和噬菌体的扩增：挑取每次筛选后的阳性噬菌体，加入ER2738培养液，37℃震摇5h。转移至离心管，4℃，9 000r/min，15min，取上清，加1/6体积的PEG-NaCl，4℃沉降过夜，离心弃上清，用1mL TBS悬浮沉淀，离心取上清。加1/6体积的PEG-NaCl，沉降1h，离心后用100μL TBS悬沉淀，离心1min，取上清，进行滴度测定。

(3)亲和噬菌体滴度测定

取底层琼脂板，取4-5个EP管，每管100μL ER2738菌液，向第一管中加入10μL噬菌体洗脱物，倍比稀释，4-5个稀释度，将熔化后的顶层琼脂倒入离心管中，加入稀释的混合物，弹匀后倒在底层琼脂上。温箱中倒置培养。利用噬菌体随机十二肽库，对M蛋白通过4轮“结合-洗脱-扩增”过程，文库滴度先下降后升高并趋于稳定过程，当文库滴度趋于稳定时，说明噬菌体结合能力已经到饱和状态，与M蛋白特异性结合的噬菌体得到了富集，筛选结果见表1。

(4)间接ELISA检测阳性克隆特异性

以重组M蛋白、PEDV病毒作为包被抗原进行间接ELISA，所筛选的噬菌体(1-10)扩增产物37℃孵育1h。M13抗体1∶1000倍稀释，同时37℃作用1h。检测噬菌体单克隆与M蛋白和PEDV的结合效果，包被液、封阻液、噬菌体稀释液分别为对照1、对照2、对照3。第四轮洗脱物的滴度测定时，取噬菌斑总数小于100的平板，无菌随机挑取10个单克隆菌落(编号1-10)，扩增处理后，利用抗噬菌体M13抗体，通过间接ELISA对其与M蛋白及PEDV的亲和力进行检测。结果显示经四轮淘选的10个噬菌体单克隆均能与靶分子M蛋白及PEDV发生特异性结合(见图4和图5)

(5)噬菌体单克隆序列的测定

随机挑取第4轮筛选后的10个噬斑，扩增后提取单链DNA，进行PCR，引物序列为：上游：5’-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3’；下游：M13：5’-CCCTCATAGTTAGCG TAACG-3’。将PCR产物送博士公司测序，扩增片段大小为250bp。根据测序结果，推导氨基酸序列如表2。其中1，3，7，9号噬菌体序列一致，为AGWYCTEVLCVQ；2，4，5，6，8，10号噬菌体一致，AYCTRHVCYLDN。上海强耀公司合成多肽，纯度为95％。

实施例4

多肽的抗病毒作用：

(1)间接免疫荧光检测多肽的抗病毒作用

将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃培养1h，再将混合物加入到96孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞中1h，弃去上清，补液，至出现明显的CPE后停止培养。进行间接免疫荧光检测，一抗为抗PEDV全病毒阳性血清，二抗为FITC标记山羊抗兔IgG。实验证明M-2、M-9多肽及M-2与M-9多肽联合与PEDV作用都能够有效抑制病毒的复制。单独作用时，M-2病毒的抑制作用强于M-9；而M-2、M-9多肽联合作用的抗病毒效果比多肽单独作用的效果更好(见图6)

(2)实时荧光定量PCR检测多肽的抗病毒作用

通过实时定量PCR扩增PEDV的N基因来检测多肽在体外对病毒的浓度依赖性抑制作用。将100μL 100TCID₅₀的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃培养1h，再将混合物加入到6孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞，36h后收集细胞板中的病毒液。根据RNA提取试剂盒的操作说明，提取病毒总RNA，反转录。随后用ABI PRISM 7500实时定量PCR仪器进行实时定量PCR。实验证明M-2、M-9多肽单独与PEDV作用或者M-2与M-9多肽联合与PEDV作用均能有效的抑制病毒复制，M-2与M-9多肽联合作用的抗病毒效果极显著比单独作用的效果好。同时，检测结果显示多肽呈剂量依赖性的方式抑制病毒。浓度同为400μg/mL时，M-2多肽病毒最大抑制率为48％，M-9多肽病毒最大抑制率为37％；当M-2与M-9多肽联合作用时，病毒最大抑制率为53％，随着多肽浓度的下降，抑制率下降(见图7)。

表1噬菌体淘洗产物滴度测定(pfu)

表2噬菌体结合克隆的序列测定

<110>东北农业大学

<120>猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法

<210>1

<211>250 bp

<212> mRNA

<213> 猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽M-2的氨基酸序列

<400>SEQ ID NO. 1

AGWYCTEVLCVQ

<210>2

<211>250 bp

<212> mRNA

<213> 猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽M-9的氨基酸序列

<400>SEQ ID NO. 2

AYCTRHVCYLDN

Claims (1)

1.猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽，其特征在于所述M蛋白亲和肽的氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。