CN101798337B

CN101798337B - 内毒素中和肽突变体及其应用

Info

Publication number: CN101798337B
Application number: CN 201010102944
Authority: CN
Inventors: 段光杰; 刘友生; 邓军; 朱江
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: CN101798337A

Abstract

本发明公开了一种内毒素中和肽突变体，是将由SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的内毒素中和肽第5位、第8位、第11位和第15位氨基酸残基中的至少两个替换为以下对应氨基酸残基而得到：第5位氨基酸残基由赖氨酸替换为丙氨酸，第8位氨基酸残基由苯丙氨酸替换为色氨酸，第11位氨基酸残基由谷氨酰胺替换为赖氨酸，第15位氨基酸残基由天门冬氨酸替换为赖氨酸；本发明的内毒素中和肽突变体可通过直接中和LPS活性以及竞争性抑制LBP与LPS的结合，在体外和体内抑制LPS诱导的过度炎症反应，作用强于来源于LBP的亲代内毒素中和肽，且无可见的细胞毒性，可用于制备防治革兰氏阴性菌感染引起的内毒素相关性炎症的药物。

Description

内毒素中和肽突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种多肽，特别涉及内毒素中和肽突变体，还涉及该多肽在医药方面的应用。

背景技术

内毒素/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，由核心多糖、O-多糖侧链及类脂A组成，是革兰氏阴性菌感染导致脓毒血症的主要致病因子。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)是介导LPS与靶细胞表面受体CD14结合的关键载体蛋白，起着催化放大LPS启动巨噬细胞分泌炎性介质和细胞因子的作用，可将LPS诱导的炎症级联反应放大100～1000倍，严重时可导致全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭甚至死亡。因此，抑制LBP的催化放大效应是防治LPS诱导的脓毒血症的有效策略之一。

LBP的结构与功能关系研究显示，LBP的氨基端是LBP与LPS的结合位点，尤其是富含疏水性氨基酸和碱性氨基酸的LBP 109-133片段(部分文献报道的是LBP 84～108片段，二者序列一致)，容易与带有负电荷磷酸基团及疏水性长链脂肪酸的LPS结合；LBP的羧基端则是其与靶细胞表面受体CD14的结合位点。进入血液中的LPS先与LBP的氨基端结合，再通过LBP的羧基端与靶细胞表面受体CD14结合，形成LPS-LBP-CD14复合体，从而发挥致炎效应。仅含有LPS结合位点的截断型LBP可以结合LPS，但不能将其递呈给受体CD14，不能形成LPS-LBP-CD14复合体，从而可阻断LPS诱导的炎症级联反应。因此，通过分子克隆或化学合成的方法获取LBP的LPS结合位点片段或其改造多肽，通过竞争性抑制LBP与LPS的结合来中和LPS活性，是抗内毒素的有效手段。

目前已有一些针对LBP的LPS结合位点截选LBP片段并对其进行改造的研究报道。如Taylor等合成了覆盖LBP全长序列的全套部分重叠15肽以筛选具有中和LPS活性的LBP片段，结果发现LBP 91-105片段和LBP 94-108片段可以抑制LPS与LBP-Ig的结合。Reyes等利用对应于人LBP 86-99片段的丙氨酸扫描肽库鉴定了单个氨基酸残基对LBP 86-99片段与LPS结合的必要性，结果发现第91位色氨酸和第92位赖氨酸对LBP 86-99片段与LPS的结合必不可少，而将第94位精氨酸、第95位赖氨酸及第98位苯丙氨酸分别替换为丙氨酸可以增强中和LPS活性，其中，将第95位赖氨酸替换为丙氨酸时中和LPS活性最强。Arana等比较了LBP 86-99、LBP 88-101、LBP 91-108片段的中和LPS活性，结果LBP 91-108片段的中和LPS活性最好；对LBP 86-99片段个别位点进行选择性丙氨酸替换发现，将第95位赖氨酸替换为丙氨酸后中和LPS活性有明显提高，提示LBP衍生肽的两亲性对其中和LPS活性具有重要作用。但上述LBP的LPS结合位点片段或其改造多肽的中和LPS活性离理想中和活性尚有一定差距，还需进一步改进和提高。

在本项目组先前的研究中，麻莉等采用基因克隆和原核表达的方法获得了内毒素结合肽EBP(包含LBP 108～133片段)，经体外和体内实验初步证明具有中和LPS活性。在此基础上，孙亚丽等采用基因定点突变和原核表达的方法将EBP的第5位和第18位谷氨酰胺替换为赖氨酸，获得了EBP的突变体mEBP，比较研究发现mEBP比EBP具有更好的中和LPS活性，提示对LBP的LPS结合位点片段进行选择性定点突变是提高中和LPS活性的有效方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种内毒素中和肽突变体，可通过直接中和LPS活性以及竞争性抑制LBP与LPS的结合，在体外和体内抑制LPS诱导的过度炎症反应，作用强于来源于LBP的亲代内毒素中和肽，且无可见的细胞毒性；目的之二在于提供所述内毒素中和肽突变体在医药方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、内毒素中和肽突变体，是将由SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的内毒素中和肽第5位、第8位、第11位和第15位氨基酸残基中的至少两个替换为以下对应氨基酸残基而得到：第5位氨基酸残基由赖氨酸替换为丙氨酸，第8位氨基酸残基由苯丙氨酸替换为色氨酸，第11位氨基酸残基由谷氨酰胺替换为赖氨酸，第15位氨基酸残基由天门冬氨酸替换为赖氨酸。

进一步，所述内毒素中和肽突变体由SEQ ID No.2至SEQ ID No.12所示任一氨基酸序列组成；

进一步，所述内毒素中和肽突变体由SEQ ID No.4、SEQ ID No.10或SEQ IDNo.11所示氨基酸序列组成；

进一步，所述内毒素中和肽突变体由SEQ ID No.10所示氨基酸序列组成。

2、所述内毒素中和肽突变体在制备防治革兰氏阴性菌感染引起的内毒素相关性炎症的药物中的应用。

进一步，所述革兰氏阴性菌感染引起的内毒素相关性炎症为脓毒血症。

本发明的有益效果在于：由SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的内毒素中和肽为人LBP的LPS结合位点片段LBP 116-133或LBP 91-108(二者序列一致)。本发明通过氨基酸替换对该内毒素中和肽进行选择性改建(定点突变)，以增加其阳性电荷数和/或疏水性，并保持其两亲性。在选择突变位点方面，本发明在分析了该内毒素中和肽中哪些位点是与LPS结合的关键位点的基础上，选择除这些关键位点之外的位点进行选择性定点突变，以提高其拮抗LPS活性。本发明采用固相合成法制得11条内毒素中和肽突变体(SEQ ID No.2～SEQ ID No.12)并进行了体外和体内拮抗LPS活性检测，结果显示，所得11条内毒素中和肽突变体可通过直接中和LPS活性和竞争性抑制LBP与LPS的结合，在体外和体内抑制LPS诱导的过度炎症反应，作用强于来源于LBP的亲代内毒素中和肽，且无可见的细胞毒性，其中3条内毒素中和肽突变体(SEQ ID No.4、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)的拮抗LPS活性更强。因此，本发明的内毒素中和肽突变体可用于制备防治革兰氏阴性菌感染引起的内毒素相关性炎症的药物，在脓毒血症等内毒素相关性炎症的防治方面具有重要的应用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示了11条内毒素中和肽突变体体外中和LPS活性比较筛选；

图2显示了3条优选内毒素中和肽突变体体外中和LPS活性；

图3显示了3条优选内毒素中和肽突变体竞争性抑制rLBP与LPS的结合；

图4显示了内毒素中和肽突变体对小鼠RAW264.7细胞生长无可见的细胞毒性；

图5显示了内毒素中和肽突变体对人THP-1细胞生长无可见的细胞毒性；

图6显示了内毒素中和肽突变体抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α；

图7显示了内毒素中和肽突变体抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞分泌IL-6；

图8显示了内毒素中和肽突变体抑制LPS诱导人THP-1细胞分泌TNF-α；

图9显示了内毒素中和肽突变体抑制LPS诱导人THP-1细胞分泌IL-6；

图10显示了内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应1(降低BALF内中性粒细胞数量)；

图11显示了内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应2(降低BALF内巨噬细胞数量)；

图12显示了内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应3(降低BALF内总蛋白含量)；

图13显示了内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应4(降低BALF内TNF-α水平)；

图14显示了内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应5(减少肺部支气管周围和肺泡间隔内的炎性细胞浸润)；

图15显示了内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型的保护作用1(降低血清TNF-α水平)；

图16显示了内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型的保护作用2(降低血清ALT活性)；

图17显示了内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型的保护作用3(降低血清AST活性)；

图18显示了内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型的保护作用4(降低模型小鼠死亡率)；

图2～3、6～10、11～13和15～17中的“*”表示该内毒素中和肽突变体组与内毒素中和肽组比较具有显著性差异(P＜0.05)。

具体实施方式

下面参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

1、实验材料

LPS(大肠杆菌，Escherichia coli，0111：B4)、豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)和多黏菌素B(PMB)购自Sigma公司(USA)，CE TAL显色基质鲎试剂盒(终点显色法)购自厦门鲎试剂实验厂有限公司；重组脂多糖结合蛋白(rLBP)和抗rLBP抗体购自Cell Sciences公司(USA)，细胞毒性检测试剂盒(Cell countingkit-8，CCK-8)购自Dojindo laboratories公司(JAPAN)；BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce Biotechnology公司(USA)，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；人肿瘤坏死因子α(TNF-α)和细胞介素6(IL-6)酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒、小鼠TNF-α和IL-6ELISA检测试剂盒购自Bender MedSystems公司(Austria)；6～8周龄、体重18～22g的昆明小鼠购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心；小鼠巨噬细胞系RAW264.7和人急性单核系白血病细胞株THP-1购自ACTT公司(USA)，使用含体积分数为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养。

2、内毒素中和肽突变体的设计

将内毒素中和肽(LBP 116-133/91-108)第5位、第8位、第11位和第15位氨基酸残基中的至少两个替换为以下对应氨基酸残基：K5A、F8W、Q11K、D15K，得到内毒素中和肽突变体1～11，其氨基酸序列如下表所示。

3、内毒素中和肽突变体的制备

委托南京金斯瑞生物科技有限公司采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成内毒素中和肽突变体1～11、内毒素中和肽以及无关对照肽，合成的多肽用高效液相色谱(HPLC)测定纯度，并用质谱(MS)测定分子量。

4、内毒素中和肽突变体的体外中和LPS活性检测

采用CE TAL显色基质鲎试剂盒检测内毒素中和肽突变体的体外中和LPS活性，方法如下：取专用无热源试管，加入不同终浓度(1～40μg/ml)的多肽 (mENP、ENP或ESP)溶液50μl和终浓度为1EU/ml的LPS标准溶液50μl，同时设置空白对照(加入内毒素检查用水100μl)和LPS对照[加入不同终浓度(0.125、0.25、0.5、1、2EU/ml)的LPS标准溶液100μl，建立吸光度与LPS浓度的标准曲线]，37℃水浴30分钟，再加入鲎试剂溶液100μl，37℃水浴8分钟，再加入显色基质溶液100μl，37℃水浴6分钟，再依次加入偶氮化试剂1、2、3溶液各500μl，静置5分钟，于波长545nm处测定吸光度，计算鲎试剂(LAL)活化抑制率。

取内毒素中和肽突变体1～11的粗品(纯度大于70％)作多剂量梯度试验(10、20、40μg/ml)，结果如图1所示，内毒素中和肽突变体1～11均呈剂量依赖性抑制LPS诱导的LAL活化，其中内毒素中和肽突变体3、9和10的抑制效应最好。

进一步，取内毒素中和肽突变体3、9和10的纯品(纯度大于95％)作多剂量梯度试验(1、5、10、20、40μg/ml)，结果如图2所示，内毒素中和肽突变体3、9和10均呈剂量依赖性抑制LPS诱导的LAL活化，且抑制效应显著强于内毒素中和肽(P＜0.05)，其中内毒素中和肽突变体9抑制效应最强。

5、内毒素中和肽突变体竞争性抑制rLBP与LPS的结合能力检测

采用ELISA竞争结合试验检测内毒素中和肽突变体竞争性抑制rLBP与LPS结合的能力，方法如下：用LPS包被96孔板，100ng/孔，37℃包被120分钟，再用PBST于室温下封闭20分钟，再每孔加入多肽(mENP3、mENP9、mENP10、ENP或ESP)和rLBP的混合液(多肽终浓度为0、1、2、4、8、16μg/ml，rLBP终浓度为2μg/ml)100μl，37℃孵育60分钟，PBST洗涤3次，再加入兔抗rLBP一抗，37℃孵育60分钟，PBST洗涤3次，再加入抗兔二抗，37℃孵育60分钟，于波长405nm处测定吸光度，计算rLBP/LPS结合率。

结果如图3所示，内毒素中和肽突变体3、9、10和内毒素中和肽均呈剂量依赖性竞争性抑制rLBP与LPS的结合，但内毒素中和肽突变体的抑制效应显著强于内毒素中和肽(P＜0.05)。

6、内毒素中和肽突变体的细胞毒性检测

(1)内毒素中和肽突变体对小鼠RAW264.7细胞生长无可见的细胞毒性

采用细胞毒性检测试剂盒检测内毒素中和肽突变体对小鼠RAW264.7细胞生长的影响，方法如下：将体外培养的小鼠RAW264.7细胞用PBS洗涤后，用含体积分数为5％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，调整细胞密度为5×10³个/ml，接种于96孔板，100μl/孔，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养24小时，再每孔加入不同终浓度(0、1、5、10、20、40μg/ml)的mENP9溶液10μl，每个浓度设6个复孔，共培养6小时，再每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养2小时，于波长450nm处测定各孔OD值，结果以6个复孔去掉最高值和最低值后的4个复孔的平均值表示。

结果如图4所示，内毒素中和肽突变体9在1～40μg/ml范围内对小鼠RAW264.7细胞生长均无明显影响，即无可见的细胞毒性。

(2)内毒素中和肽突变体对人THP-1细胞生长无可见的细胞毒性

采用细胞毒性检测试剂盒检测内毒素中和肽突变体对人THP-1细胞生长的影响，方法如下：将体外培养的人THP-1细胞用PBS洗涤后，用含体积分数为5％的胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，其余步骤同前述“采用细胞毒性检测试剂盒检测内毒素中和肽突变体对小鼠RAW264.7细胞生长的影响”。

结果如图5所示，内毒素中和肽突变体9在1～40μg/ml范围内对人THP-1细胞生长均无明显影响，即无可见的细胞毒性。

7、内毒素中和肽突变体抑制单核巨噬细胞对LPS刺激的反应能力检测

(1)内毒素中和肽突变体抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6

将体外培养的小鼠RAW264.7细胞用PBS洗涤后，用含体积分数为1％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，以每孔2×10⁶个细胞接种于6孔板，每孔1.95ml(空白对照孔为2ml)，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养4 小时，再加入终浓度为100ng/ml的LPS和不同终浓度(0、1、5、10、20μg/ml)的多肽(mENP9或ENP)至总体积为2ml，继续培养4小时，吸取培养上清液1ml置离心管中，于温度4℃、1000rpm离心10分钟，再吸取上清液400μl，采用小鼠TNF-α和IL-6ELISA检测试剂盒检测上清液中TNF-α和IL-6的浓度，按照试剂盒说明书操作。

结果如图6～7所示，内毒素中和肽突变体9和内毒素中和肽均呈剂量依赖性抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6，在剂量为5、10、20μg/ml时，内毒素中和肽突变体9的抑制效应明显强于内毒素中和肽，二者差异有显著性(P＜0.05)。

(2)内毒素中和肽突变体抑制LPS诱导人THP-1细胞分泌TNF-α和IL-6

将人THP-1细胞用PBS洗涤后，用含体积分数为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，以每孔2×10⁶个细胞接种于6孔板，每孔2ml，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养4小时，再加入终浓度为10ng/ml的PMA诱导分化48小时，倒置显微镜下可见细胞由独立的悬浮的小圆形细胞变为成团(葡萄状)的贴壁的形状不规则细胞并伴有伪足样突起，PBS洗涤2次，用含体积分数为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基培养24小时，得成熟巨噬细胞，PBS洗涤2次，换用含体积分数为1％的胎牛血清的RPMI1640培养基，每孔1.95ml(空白对照孔为2ml)，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养4小时，再加入终浓度为100ng/ml的LPS和不同终浓度(0、1、5、10、20μg/ml)的多肽(mENP9或ENP)至总体积为2ml，继续培养4小时，吸取培养上清液1ml置离心管中，于温度4℃、1000rpm离心10分钟，再吸取上清液400μl，采用人TNF-α和IL-6ELISA检测试剂盒检测上清液中TNF-α和IL-6的浓度，按照试剂盒说明书操作。

结果如图8～9所示，内毒素中和肽突变体9和内毒素中和肽均呈剂量依赖性抑制LPS诱导人THP-1细胞分泌TNF-α和IL-6，在剂量为5、10、20μg/ml时，内毒素中和肽突变体9的抑制效应明显强于内毒素中和肽，二者差异有显著性(P＜0.05)。

8、内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应检测

将昆明小鼠随机分成4组：空白对照组、模型组、内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组(每组5只)，其中，模型组、内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组按照文献方法(Moon C，et al.Synthetic RGDS peptide attenuateslipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation by inhibiting integrin signaledMAP kinase pathways.Respir Res，2009，10，18.)建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型：将氯胺酮(45mg/kg体重)和赛拉嗪(8mg/kg体重)的混合液腹腔注射麻醉昆明小鼠，将LPS(1mg/kg体重，用50μl无内毒素PBS溶解)置小鼠咽后壁，使其被小鼠吸入肺内，建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型；空白对照组吸入50μl无内毒素PBS；内毒素中和肽突变体组于LPS处理前30分钟腹腔注射内毒素中和肽突变体9(5mg/kg体重)；内毒素中和肽组于LPS处理前30分钟腹腔注射内毒素中和肽(5mg/kg体重)；各组于LPS处理后24小时评估肺损伤程度：用不含Ca²⁺和Mg²⁺的生理盐水3ml洗涤气道3次获得支气管肺泡灌洗液(BALF)，于温度4℃、1500g离心10分钟，分别收集上清液和细胞沉淀，采用BCA蛋白检测试剂盒检测上清液中总蛋白含量，并用小鼠TNF-αELISA检测试剂盒检测上清液中TNF-α水平；细胞沉淀制作细胞涂片经改良的吉姆萨染色进行细胞分类和计数；小鼠肺组织用体积分数为10％的福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm切片，HE染色，光镜观察。

结果如图10～14所示，机体募集中性粒细胞和巨噬细胞进入支气管肺泡内是肺部炎症反应的最直接证据，LPS处理后24小时，可见模型组BALF内中性粒细胞和巨噬细胞数量显著增多，而内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组可明显抑制中性粒细胞和巨噬细胞数量增加，其中内毒素中和肽突变体组对中性粒细胞的抑制效应显著强于内毒素中和肽组(P＜0.05)，对巨噬细胞的抑制效应强于内毒素中和肽组但差异无显著性。此外，LPS处理后24小时，可见模型组BALF内总蛋白含量和TNF-α分泌水平显著增加，而内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组可明显降低BALF内总蛋白含量和TNF-α分泌水平，且内毒素中和肽突变体组的抑制效应显著强于内毒素中和肽组(P＜0.05)。LPS处理后小鼠肺组织病理学的改变进一步证实了BALF的检测结果：内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组小鼠肺部支气管周围和肺泡间隔内的炎性细胞浸润明显减少。

9、内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型的保护效应检测

将昆明小鼠随机分成4组：空白对照组、模型组、内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组(每组5只)，其中，模型组、内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组建立烧伤合并内毒素血症小鼠模型：将昆明小鼠背部以质量分数为8％的硫化钠溶液脱毛后，将凝固汽油(1ml/100g体重)均匀涂抹于脱毛皮肤上，燃烧30秒造成20％III度烧伤(经病理证实)，立即腹腔注射LPS(1mg/kg体重，用0.5ml无内毒素PBS溶解)，建立烧伤合并内毒素血症小鼠模型；空白对照组腹腔内注入0.5ml无内毒素PBS；内毒素中和肽突变体组于LPS注射后1分钟内腹腔注射内毒素中和肽突变体9(5mg/kg体重)；内毒素中和肽组于LPS注射后1分钟内腹腔注射内毒素中和肽(5mg/kg体重)；各组于处理后6小时活杀小鼠取血，采用小鼠TNF-αELISA检测试剂盒检测血清中TNF-α水平，采用ALT和AST检测试剂盒检测血清中ALT和AST活性。另取20只昆明小鼠，按前述方法分组和处理，观察并统计各组小鼠死亡率(每12小时统计1次，共观察48小时)。

结果如图15～18所示，处理后6小时，可见模型组血清TNF-α显著增加，而内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组可明显降低血清TNF-α水平，且内毒素中和肽突变体组的效果显著强于内毒素中和肽组(P＜0.05)。处理后6小时，可见模型组血清ALT和AST活性显著增加，而内毒素中和肽突变体组和内毒素中和肽组可明显降低血清ALT和AST活性，且内毒素中和肽突变体组的效果显著强于内毒素中和肽组(P＜0.05)。此外，模型组24小时存活率为20％，48小时内全部死亡；内毒素中和肽突变体组24小时存活率为60％，48小时存活率为60％；内毒素中和肽组24小时存活率为60％，48小时存活率为40％。

基于上述实验结果，可得出如下结论：①内毒素中和肽突变体可通过直接中和LPS活性以及竞争性抑制LBP与LPS的结合，抑制LPS诱导的过度炎症反应；②内毒素中和肽突变体对小鼠RAW264.7细胞和人THP-1细胞生长均无毒副作用；③内毒素中和肽突变体可抑制小鼠RAW264.7细胞和人THP-1细胞对LPS刺激的反应，减少TNF-α和IL-6的分泌；④内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型具有保护效应，可明显降低BALF内中性粒细胞和巨噬细胞数量、总蛋白及TNF-α水平，明显减少小鼠肺部支气管周围和肺泡间隔内的炎性细胞浸润；⑤内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型具有保护效应，可明显降低模型小鼠死亡率，降低血清TNF-α水平及ALT和AST活性。

需要补充说明的是，尽管本发明只是以内毒素中和肽突变体3、9和10为代表，对内毒素中和肽突变体竞争性抑制rLBP与LPS的结合能力进行了考察；并且，在后续内毒素中和肽突变体的细胞毒性检测、内毒素中和肽突变体抑制单核巨噬细胞对LPS刺激的反应能力检测、内毒素中和肽突变体对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护效应检测以及内毒素中和肽突变体对烧伤合并内毒素血症小鼠模型的保护效应检测中，只是以内毒素中和肽突变体9为代表进行了考察，但由于内毒素中和肽突变体1～11均来源于相同的内毒素中和肽，具有相似的氨基酸序列，通过相同的作用机制(即直接中和LPS活性和竞争性抑制LBP与LPS的结合)发挥拮抗内毒素作用(见图1～3)，因此，根据上述实验结果结合本领域技术知识，本领域技术人员足以推断得出如下结论：内毒素中和肽突变体1～11均具有与内毒素中和肽突变体9类似的体外和体内拮抗LPS活性，且拮抗活性强于亲代内毒素中和肽，尤其是内毒素中和肽突变体3、9和10。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>内毒素中和肽突变体及其应用

<160>13

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<223>内毒素中和肽

<400>1

Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Phe Lys Leu Gln Gly Ser Phe Asp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体1

<400>2

Trp Lys Va l Arg Ala Ser Phe Trp Lys Leu Gln Gly Ser Phe Asp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体2

<400>3

Trp Lys Val Arg Ala Ser Phe Phe Lys Leu Lys Gly Ser Phe Asp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>4

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体3

<400>4

Trp Lys Val Arg Ala Ser Phe Trp Lys Leu Gln Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体4

<400>5

Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Trp Lys Leu Trp Gly Ser Phe Asp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体5

<400>6

Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Trp Lys Leu Gln Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体6

<400>7

Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Phe Lys Leu Lys Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>8

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体7

<400>8

Trp Lys Val Arg Ala Ser Phe Trp Lys Leu Trp Gly Ser Phe Asp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体8

<400>9

Trp Lys Val Arg Ala Ser Phe Trp Lys Leu Gln Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>10

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体9

<400>10

Trp Lys Val Arg Ala Ser Phe Phe Lys Leu Lys Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>11

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体10

<400>11

Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Phe Lys Leu Lys Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>12

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内毒素中和肽突变体11

<400>12

Trp Lys Val Arg Ala Ser Phe Phe Lys Leu Lys Gly Ser Phe Trp Vla

1 5 10 15

Ser Vla

<210>13

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>无关对照肽

<400>13

Ser Trp Gly Lys Asp Phe Val Ser Lys Phe Val Arg Val Gln Leu Phe

1 5 10 15

Lys Ser

Claims

1.内毒素中和肽突变体，其特征在于：该突变体是将由SEQ ID No.10所示氨基酸序列组成。

2.权利要求1所述内毒素中和肽突变体在制备防治LPS诱导的小鼠急性肺损伤和烧伤合并内毒素血症的药物中的应用。