CN115109123B - 一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用 - Google Patents

一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用，本发明提供一种用于抗冠状病毒的多肽，并在此基础上提供了上述多肽的含胆固醇的衍生物，这些多肽衍生物对冠状病毒，尤其是SARS‑CoV‑2原始毒株及以及变异毒株产生意料不到的抑制效果，可作为制备预防或治疗新冠病毒的药物或疫苗，具有极大的预防或治疗潜力。

Description

一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于预防或治疗冠状病毒的多肽、其衍生物、编码其多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防和/或治疗新冠病毒的药物或疫苗中的应用。
背景技术
冠状病毒(英文名：Coronavirus)是一种具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。其中一些冠状病毒会感染人类并引起疾病，目前为止能够感染人的冠状病毒有七种，包括SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1。
SARS-CoV-2病毒为新冠肺炎疫情的病原体，是21世纪以来引起人类疫情的第三种冠状病毒。目前，虽然已有多种针对SARS-CoV-2的疫苗和单克隆抗体药物获得紧急使用许可，但是多数研究表明它们对当下广泛传播的新冠病毒变异毒株，例如Beta、Delta和Omicron等，表现出下降的保护效果，因而亟待开发针对目前流行以及未来出现的新的变异毒株的广谱药物或疫苗。
目前已报道有多种新冠相关冠状病毒(属于sarbecovirus)，如蝙蝠源RaTG13、RmYN02、ZC45、ZXC21等，穿山甲源GX/P2V/2017和GD/1/2019，研究表明RaTG13、GX/P2V/2017、GD/1/2019等也存在感染人的潜力，因而也亟需研发针对这些相关冠状病毒的药物或疫苗，以应对将来可能出现的新的疫情。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供用于预防或治疗冠状病毒的多肽、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或治疗冠状病毒的药物或疫苗中的应用。
第一方面，本发明提供一种用于抗冠状病毒的多肽，其为以下(1)-(8)任一所述序列的多肽，其中：
(1)多肽，其包含以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)多肽，其包含以SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(3)多肽，其包含以SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(4)多肽，其包含以SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；
(5)多肽，其包含以SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；
(6)多肽，其包含以SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；
(7)多肽，其包含在所述多肽(1)-(6)任一的氨基酸序列中取代、缺失、添加或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，且该多肽具有针对冠状病毒的抑制活性；或
(8)多肽，其包含与所述多肽(1)-(6)任一的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、94％或95％同一性的氨基酸序列，且该多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
优选地，所述多肽的序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14。
第二方面，本发明提供一种用于抗冠状病毒的多肽衍生物，所述多肽衍生物为上述抗冠状病毒的多肽上修饰有胆固醇的衍生物。
进一步地，所述胆固醇的衍生物的修饰位点在多肽的C端、N端或多肽氨基酸碱基侧链上。优选地，所述胆固醇修饰的修饰位点在所述多肽的C端。
进一步地，所述胆固醇的衍生物通过连接子连接或者直接连接在所述多肽的C端。
进一步地，所述胆固醇的衍生物为胆固醇经过半胱氨酸和或PEG修饰的衍生物。
进一步地，所述胆固醇衍生物选自
Figure BDA0003576069970000021
Figure BDA0003576069970000022
所述R2为OH或者NH2；
所述n为1-20的任意整数，优选为2-6的任意整数，例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；
所述x为1-6的任意整数，例如为1、2、3、4、5、6。
进一步地，所述连接子为-NH-PEGn-(CH2)x-CO-、(GSG)m、(GSGSG)m、(GSG)m-CONH-PEGn-(CH2)x-CO-或(GSGSG)m-CONH-PEGn-(CH2)x-CO-；
其中m为0-6的任意整数，例如为0、1、2、3、4、5或6；
所述n为1-20的任意整数，优选为2-6的任意整数，例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；
所述x为1-6的任意整数，例如为1、2、3、4、5、6。
进一步地，所述多肽衍生物具有如下结构I、结构II及结构III所示的结构式：
Figure BDA0003576069970000031
其中，所述多肽序列是指上述(1)-(8)任一所述多肽序列；
优选地，所述多肽序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14；
所述R1为(GSG)m或(GSGSG)m，m选自0-6的任意整数；优选地m为1或2；
所述R2为OH或者NH2；优选地R2为NH2。
进一步地，所述多肽衍生物选自：
Figure BDA0003576069970000041
Figure BDA0003576069970000051
Figure BDA0003576069970000061
Figure BDA0003576069970000071
Figure BDA0003576069970000081
第三方面，本发明提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列用于编码第一方面的多肽。
第四方面，本发明提供了一种载体，所述载体中包含第三方面所述的多核苷酸序列。
第五方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞中包含本发明第四方面所述的载体。
第六方面，本发明提供了一种药用组合物，其包含第一方面提供的多肽和或第二方面提供的衍生物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
在一个实施例中，所述药物组合物为吸入剂、鼻腔用制剂或口服制剂或胃肠外制剂的形式；
优选的，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂和溶液剂；
优选地，所述胃肠外制剂为可注射或可推注制剂；
更优选地，所述药物组合物为疫苗组合物。
优选地，其中所述药物的剂型是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂；
优选地，其中所述药物优选通过以下方式给药：注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等，腔道给药，如经直肠、阴道和舌下，呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药，或者表面给药；
第七方面，本发明提供一种上述多肽、多肽衍生物、融合蛋白或缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制冠状病毒或治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病。
优选地，其中所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1的原始毒株或其变异毒株。
优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2原始毒株、SARS-CoV-2变异毒株。
进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株选自Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
优选地，冠状病毒引起的疾病选自新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease2019，COVID-19)、严重急性呼吸道综合症、中东呼吸综合症。
第八方面，本发明提供一种在体外抑制冠状病毒的方法，其包括应用上述多肽、多肽衍生物、融合蛋白或缀合物或药物组合物，
优选地，其中所述冠状病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
进一步优选地，所述变异毒株包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron。
进一步地，应用的方法为将第一方面的多肽、第二方面提供的衍生物和/或第三方面的药用组合物与病毒进行接触。
第九方面，本发明提供一种预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病的方法，其包括向受试者施用上述多肽、多肽衍生物、融合蛋白或缀合物或药物组合物，
优选地，其中所述冠状病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
第十方面，本发明提供使用一种上述多肽以及多肽衍生物、融合蛋白或缀合物用于预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病，
优选地，其中所述冠状病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
进一步优选地，所述变异毒株包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
本发明的有益效果为：
本发明基于SARS-CoV-2病毒的S蛋白的HR2区域，设计出多肽P3，并对其进行一系列改造(包括一个或多个氨基酸的增加或替换)，得到多肽，并对多进行连接子和胆固醇修饰得到多肽衍生物，多肽及其衍生物对SARS-CoV-2原始毒株及以及变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron产生很好的抑制效果，可作为制备预防或治疗新冠病毒的药物或疫苗，具有极大的预防或治疗潜力。
附图说明
图1为实施例2中不同多肽对SARS-CoV-2原始毒株假病毒的抑制效果；
图2为实施例2中不同多肽对SARS-CoV-2变异毒株Omicron假病毒的抑制效果；
图3为实施例3中多肽P3-2对新冠原始毒株和变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron假病毒的抑制效果；
图4为实施例3中多肽P3-2-GS-Chol对新冠原始毒株和变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron假病毒的抑制效果；
图5为实施例3中多肽P3-2-PEG-Chol对新冠原始毒株和变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron假病毒的抑制效果；
图6为实施例3中多肽P3-2-GS-PEG-Chol对新冠原始毒株和变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron假病毒的抑制效果；
图7为实施例3中多肽P3-1-GS-PEG-Chol对新冠原始毒株和变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron假病毒的抑制效果。
图8为实施例4中多肽P3-2-GS-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol从N端逐个敲除氨基酸后的截短多肽对原始毒株(SARS-CoV-2Prototype)的假病毒的抑制效果；
图9为实施例4中多肽P3-2-GS-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol从N端逐个敲除氨基酸后的截短多肽对变异毒株Delta的假病毒的抑制效果；
图10为实施例4中多肽P3-2-GS-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol从N端逐个敲除氨基酸后的截短多肽对变异毒株Omicron的假病毒的抑制效果；
图11为实施例5中多肽P3-2-GS-chol在Vero细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果；
图12为实施例5中多肽P3-2-PEG-chol在Vero细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果；
图13为实施例5中多肽P3-2-GS-PEG-chol在Vero细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果；
图14为实施例6中多肽P3-2-GS-chol在Vero E6细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果；
图15为实施例6中多肽P3-2-PEG-chol在Vero E6细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果；
图16为实施例6中多肽P3-2-GS-PEG-chol在Vero E6细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果。
具体实施方式
冠状病毒刺突(S)蛋白在介导病毒入侵过程中发挥着重要作用，分为S1和S2两个亚基；其中S1亚基负责识别受体，S2亚基介导病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合。S2中的七肽重复序列HR1和HR2通过形成六螺旋束结构发挥膜融合功能，研究表明加入外源的HR1或HR2多肽能够抑制病毒本身的HR1和HR2六螺旋束结构的形成，进而抑制膜融合过程。
本发明的目的是提供一组可对SARS-CoV-2及类SARS病毒感染具有抑制功能的多肽类进入抑制剂，所述的多肽类进入抑制剂就是与SARS-CoV-2及类SARS病毒S2蛋白中的HR1区域结合，干扰病毒自身六螺旋的形成过程，从而抑制病毒的融合感染过程。
本发明基于SARS-CoV-2病毒的S蛋白的HR2区域，设计出多肽P3，并对其进行一系列改造(包括一个或多个氨基酸的增加或替换)，得到多肽P3-1、P3-2、P3-3，并对多肽P3-1、P3-2、P3-3进行连接子和胆固醇修饰，使得其胆固醇修饰多肽衍生物对SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株Omicron具有较强的抑制效果，可作为制备预防或治疗新冠病毒的药物或疫苗。
该组多肽的具体序列如表1所示，或详见于多肽序列表中。该发明的多肽对SARS-CoV-2具有抑制活性，有些多肽的抑制活性达到了预料不到的高水平，尤其是对新冠变异毒株Omicron的抑制达到了很好的抑制的效果。
在本文中，多肽可以是包含SEQ ID NO:1-6的多肽或其变体。
例如，多肽可以包括以SEQ ID NO:1、2或3所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入1个或多个氨基酸。
氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1、2或3的C端或N端添加氨基酸，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1、2或3的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
氨基酸插入指在氨基酸序列例如SEQ ID NO:1、2或3的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1、2或3的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
本发明的多肽或多肽衍生物可以是合成生成的或者本发明的多肽可以是细胞表达的。例如，可以通过化学手段合成本发明的多肽。或者，可以在重组细胞中表达本发明的多肽。细胞的类型不受限制，例如细胞可以是真核细胞或者原核细胞。真核细胞可以是真菌细胞，例如酵母细胞，或者昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如小鼠细胞。原核细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。
本发明的多肽的胆固醇修饰可以在多肽的C端进行，使得多肽在C端与胆固醇部分连接。该连接可以是直接连接或者可以通过连接子连接。本发明中多肽进行胆固醇修饰的方法是现有技术中公知的方法。
连接子的种类和长度可以有所变化。例如，连接子可以是(GSG)m或(GSGSG)m，其中m可以是任何整数，例如1、2、3、4、5、6等等。
连接子可以是PEG化的。PEG化修饰的手段对于本领域技术人员是已知的。如本文中使用，术语PEG化连接子是指连接子附加有一个或者更多个PEG。在本文中，PEG化连接子可以是PEG化的(GSG)n或(GSGSG)n。n可以是任何整数，例如1、2、3、4、5、6等等。
如本文中使用，“PEGm”表示聚乙二醇重复单元的数目为m。m可以是任何整数，例如1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20。
如本文中使用，冠状病毒可以是任何种类的冠状病毒。优选地，所述冠状病毒是原始毒株Prototype或变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
本发明的多肽或多肽衍生物可以制备成药物或药物组合物，此类药物组合物为吸入剂、鼻腔用制剂或口服制剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，优选地，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂和溶液剂；
优选地，所述胃肠外制剂为可注射或可推注制剂；
优选地，药物组合物为疫苗组合物；
此类药物可以是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂。可以通过各种施用方式应用这些药物或药物组合物，例如注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等，腔道给药，如经直肠、阴道和舌下，呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药，或者表面给药。
发明提供了预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病的方法，其包括施用本发明的多肽或多肽衍生物。本发明还提供了在预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病中使用的多肽或多肽衍生物。
本发明还涉及预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病的方法，其包括给受试者/患者施用本发明所述的多肽或多肽衍生物的组合物，
优选地，其中冠状病毒是原始毒株Prototype或变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
本发明还涉及多肽或多肽衍生物或的组合物，用于预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病，优选地，其中所述冠状病毒原始毒株Prototype或变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
本发明还涉及用于预防或治疗受试者/患者中的多肽或多肽衍生物或的组合物，药物组合物，和试剂盒，优选地，其中所述冠状病毒是原始毒株Prototype或变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
实施例
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
以下，对本发明进行详述。
本发明基于SARS-CoV-2S蛋白的HR2区域，设计出多肽P3，并对P3多肽进行了一系列的改造(包括一个或多个氨基酸的增加或替换)，改造后的多肽分别命名为P3-1、P3-2、P3-3，并对多肽P3-1、P3-2、P3-3进行连接子和胆固醇修饰得到相应的多肽衍生物，通过本领域常规使用的方法直接合成得到。
实验仪器和材料：
假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)。
真核系统蛋白pCAGGS表达载体(由苏州金唯智公司提供)。
HEK293T ACE2细胞(购自苏州金唯智公司提供)。
多肽：
发明人通过将人感染冠状病毒蛋白中HR1和HR2序列的同源性对比，设计了多肽P3，并对P3多肽进行了一系列的改造(包括一个或多个氨基酸的增加或替换)，改造后的多肽分别命名为P3-1、P3-2、P3-3，并对多肽P3-1、P3-2、P3-3进行一系列连接子和胆固醇修饰得到相应的多肽衍生物，得到表1中显示的这些多肽及多肽衍生物的具体序列和结构。由深圳翰宇药业股份有限公司进行合成及纯化，其纯度>95％。
表1.实施例中所用的氨基酸序列
Figure BDA0003576069970000141
Figure BDA0003576069970000151
本发明的SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒为发明者实验室包装得到(参见实施例2)。
实施例1
SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装
截短的S蛋白的表达质粒的制备
1)将编码SARS-CoV-2原始毒株(Prototype)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(BA.1))的S蛋白的后18位氨基酸的核苷酸去掉，分别得到核苷酸序列SARS-CoV-2-Prototype-S-del18、B.1.1.7-S-del18、B.1.351-S-del18、P.1-S-del18、B.1.617.2-S-del18、BA.1-S-del18，并由苏州金唯智公司进行合成。
2)分别将1)中获得的各核苷酸序列克隆到pCAGGS表达载体上，得到表达质粒pCAGGS-SARS-CoV-2-Prototype-S-del18、pCAGGS-B.1.1.7-S-del18、pCAGGS-B.1.351-S-del18、pCAGGS-P.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.2-S-del18和pCAGGS-BA.1-S-del18。
SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装
a.细胞准备：在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞汇合密度至80％左右。
b.转染：取上述步骤2)中获得的各S蛋白的表达质粒，用PEI转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，37℃培养24h。
c.加毒：将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。
d.收毒：收上清3000rpm离心10min,在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。
经过上述步骤，分别得到SARS-CoV-2原始毒株(SARS-CoV-2prototype)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)及Omicron(BA.1))的假病毒。
实施例2
多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果评价
本实施例旨在测定表1中多肽对原始毒株(SARS-CoV-2Prototype)及变异毒株Omicron(BA.1))的假病毒的抑制效果。
实验分组：HEK293T ACE2细胞(空白对照组，细胞未感染病毒)；HEK293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+DMEM培养基(阴性对照组，细胞感染了病毒，但未用多肽处理)；HEK293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+多肽P3(P3处理组)；HEK293TACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-1(P3-1处理组)、HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2(P3-2处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-3(P3-3处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-1-GS-Chol(P3-1-GS-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-Chol(P3-2-GS-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-3-GS-Chol(P3-3-GS-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-3-GS2-Chol(P3-3-GS2-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-1-PEG-Chol(P3-1-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-PEG-Chol(P3-2-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-3-PEG-Chol(P3-3-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-1-GS-PEG-Chol(P3-1-GS-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-PEG-Chol(P3-2-GS-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-3-GS-PEG-Chol(P3-3-GS-PEG-Chol处理组)。
多肽原液配制：表1中的各多肽先分别用DMSO配制成10mM母液，再用含10％FBS的DMEM培养基将母液稀释成20μM，作为进一步梯度稀释的原液。
多肽梯度稀释液的配制：用含10％FBS的DMEM培养基将上述20μM的各多肽原液以2倍的倍比稀释，共稀释9个梯度(分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM、0.078μM、0.039μM)，每个梯度3个复孔，每孔50μL。
假病毒用量的确定：将SARS-CoV-2原始毒株或变异毒株假病毒原液及一系列稀释液在HEK 293T ACE2细胞上进行定量，将出现1000个FFU时的稀释度作为评价多肽抑制效果时的病毒用量(稀释倍数介于6～20倍之间)。
病毒抑制效果的测定方法为：
a.在96孔细胞培养板中铺HEK 293T ACE2细胞，培养使第二天细胞汇合密度达到80-90％。
b.根据上述实验分组，取上述各多肽梯度稀释液，加入等体积(50μL)的定量的假病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1h。
c.将步骤a中的96孔细胞培养板上清小心弃去，加入步骤b中的多肽-假病毒混合液(100μL/孔)，在培养箱中继续培养15h-24h。
d.利用高内涵显微镜统计被感染的细胞数，计算各多肽在不同浓度下的抑制率，再利用GraphPad计算出各多肽的EC50(如图1、图2所示)，共进行两次平行实验，结果标记为1st和2nd，结果见表2。
表2.多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果(EC50)
EC50(μM) Prototype 1st Omicron 1st Prototype 2nd Omicron 2nd
P3 0.3665 8.896 N.D. N.D.
P3-1 N.D. 7.899 N.D. N.D.
P3-2 0.1904 6.59 N.D. 7.289
P3-3 0.5011 22.66 N.D. N.D.
P3-1-GS-Chol 0.03368 8.614 3.067 0.6463
P3-2-GS-Chol 0.0929 0.02208 0.05333 0.01469
P3-3-GS2-Chol 0.1991 0.6057 8.955 1.694
P3-3-GS-Chol 0.1615 N.D. 15.67 1.729
P3-1-PEG-Chol 0.1903 N.D. 24.02 0.959
P3-2-PEG-Chol 0.2113 0.004168 0.1955 0.01631
P3-3-PEG-Chol 0.1946 N.D. 1.916 0.5712
P3-1-GS-PEG-Chol 0.668 0.2818 0.6805 0.25
P3-2-GS-PEG-Chol 0.1535 0.007021 0.0454 0.007624
P3-3-GS-PEG-Chol 0.2596 0.1397 0.1758 0.0198
注：N.D.表示本次实验中该多肽在设计的浓度范围内未能测得抑制该毒株的半数起效浓度(EC50)。
结果与讨论：
从表2中可看出，发明所有的多肽及其衍生物都显示出具有冠状病毒SARS-CoV-2抑制效果。其中，P3-2对于原始毒株Prototype和变异毒株Omicron的抑制效果优于原始P3，但针对原始毒株的抑制结果重复性较差；
P3-1-GS-Chol、P3-2-GS-Chol、P3-3-GS2-Chol对于原始毒株Prototype和变异毒株Omicron的抑制效果显著优于与各自对应的未进行修饰的P3-1、P3-2、P3-3，其中P3-2-GS-Chol的抑制效果提升幅度较大，其针对原始毒株Prototype的两次实验EC50分别为0.0929μM和0.05333μM，其针对变异毒株Omicron的两次实验EC50分别为0.02208μM和0.01469μM；
P3-1-PEG-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-3-PEG-Chol对于原始毒株Prototype和变异毒株Omicron的抑制效果显著优于与各自对应的未进行修饰的P3-1、P3-2、P3-3，其中P3-2-PEG-Chol的抑制效果提升幅度较大，其针对原始毒株Prototype的两次实验EC50分别为0.2113μM和0.1955μM，其针对变异毒株Omicron的两次实验EC50分别为0.004168μM和0.01631μM；
P3-1-GS-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol、P3-3-GS-PEG-Chol对于原始毒株Prototype和变异毒株Omicron优于与各自对应的未进行修饰的P3-1、P3-2、P3-3，其中P3-2-GS-PEG-Chol的抑制效果提升幅度较大，其针对原始毒株Prototype的两次实验EC50分别为0.1535μM和0.0454μM，其针对变异毒株Omicron的两次实验EC50分别为0.007021μM和0.007624μM；
且，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol对原始毒株Prototype和变异毒株Omicron的抑制效果最好，特别是针对变异毒株Omicron的抑制效果显著，且P3-2衍生物两次实验结果重复性好，表明其对病毒的抑制能力最稳定。
实施例3
多肽P3-2及其衍生物对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果评价
本实施例旨在测定多肽P3-2，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol、P3-1-GS-PEG-Chol对原始毒株(SARS-CoV-2Prototype)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)及Omicron(BA.1))的假病毒的抑制效果。
实验分组：HEK293T ACE2细胞(空白对照组，细胞未感染病毒)；HEK293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+DMEM培养基(阴性对照组，细胞感染了病毒，但未用多肽处理)；HEK293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+多肽P3-2(P3-2处理组)；HEK293TACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-Chol(P3-2-GS-Chol处理组)；HEK293TACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-PEG-Chol(P3-2-PEG-Chol处理组)；HEK293TACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-PEG-Chol(P3-2-GS-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-1-GS-PEG-Chol(P3-1-GS-PEG-Chol处理组)。
多肽原液配制：分别表1中的各多肽先用DMSO配制成10mM母液，再用含10％FBS的DMEM培养基将母液稀释成20μM，作为进一步梯度稀释的原液。
多肽梯度稀释液的配制：用含10％FBS的DMEM培养基将上述20μM的各多肽原液以2倍的倍比稀释，共稀释9个梯度(分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM、0.078μM、0.039μM)，每个梯度3个复孔，每孔50μL。
假病毒用量的确定：将SARS-CoV-2原始毒株或变异毒株假病毒原液及一系列稀释液在HEK 293T ACE2细胞上进行定量，将出现1000个FFU时的稀释度作为评价多肽抑制效果时的病毒用量(稀释倍数介于6～20倍之间)。
病毒抑制效果的测定方法为：
a.在96孔细胞培养板中铺HEK 293T ACE2细胞，培养使第二天细胞汇合密度达到80-90％。
b.根据上述实验分组，取上述各多肽梯度稀释液，加入等体积(50μL)的定量的假病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1h。
c.将步骤a中的96孔细胞培养板上清小心弃去，加入步骤b中的多肽-假病毒混合液(100μL/孔)，在培养箱中继续培养15h-24h。
d.利用高内涵显微镜统计被感染的细胞数，计算各多肽在不同浓度下的抑制率，再利用GraphPad计算出各多肽的EC50(如图3-7所示)结果见表3。
表3.多肽P3-2及其衍生物对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果(EC50)
EC50(μM) Prototype Alpha Beta Gamma Delta Omicron
P3-2 N.D. 327.9 N.D. 1304 280.7 7.289
P3-2-GS-Chol 0.05333 0.1618 0.3385 0.09824 0.0586 0.01469
P3-2-PEG-Chol 0.1955 0.1443 0.5096 1.257 0.2623 0.01631
P3-2-GS-PEG-Chol 0.0454 0.1605 0.1359 0.05655 0.05991 0.007624
P3-1-GS-PEG-Chol 0.6805 4.093 1.373 1.285 0.9383 0.25
注：N.D.表示本次实验中该多肽在设计的浓度范围内未能测得抑制该毒株的半数起效浓度(EC50)。
结果与讨论
从表3看出，多肽P3-2的修饰衍生物P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol不仅对新冠病毒的原始毒株Prototype、变异毒株Omicron有良好的抑制效果，同时对其他变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta亦拥有良好的数据效果，而且对原始毒株和变异毒株Omicron的抑制实验结果重复性好；
相比于多肽P3-1的衍生物P3-1-GS-PEG-Chol，多肽P3-2的衍生物P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol对原始毒株Prototype、变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron的抑制效果更好；
相比于多肽P3-2，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol对原始毒株Prototype、变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron的抑制效果更好，其中P3-2-GS-PEG-Chol的抑制效果要优于P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol；
针对各种变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol对毒株Omicron的抑制效果最好。
实施例4
多肽P3-2-GS-PEG-Chol截短多肽及P3-2-GS-Chol截短多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果评价
本实施例旨在评价多肽P3-2-GS-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol从N端逐个敲除氨基酸后的截短多肽对原始毒株(SARS-CoV-2Prototype)及变异毒株(Delta(B.1.617.2)和Omicron(BA.1))的假病毒的抑制效果。
其中，P3-2-GS-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol从N端逐个敲除氨基酸后的截短多肽的氨基酸序列如表4、表5所示。
表4.P3-2-GS-Chol从N端逐个敲除氨基酸的截短多肽的氨基酸序列
Figure BDA0003576069970000201
Figure BDA0003576069970000211
表5.P3-2-GS-PEG-Chol从N端逐个敲除氨基酸的截短多肽的氨基酸序列
Figure BDA0003576069970000212
其中，P3-2-GS-Chol-1和P3-2-GS-PEG-Chol-1在合成制备的纯化过程中性质极为不稳定，因此不继续参与对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果的评价实验。
实验分组：HEK 293T ACE2细胞(空白对照组，细胞未感染病毒)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+DMEM培养基(阴性对照组，细胞感染了病毒，但未用多肽处理)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-PEG-Chol(P3-2-GS-PEG-Chol处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+多肽P3-2-GS-PEG-Chol-2(P3-2-GS-PEG-Chol-2处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-PEG-Chol-3(P3-2-GS-PEG-Chol-3处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-Chol-2(P3-2-GS-Chol-2处理组)；HEK 293T ACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2-GS-Chol-3(P3-2-GS-Chol-3处理组)。
多肽原液配制：分别表4、表5中的各多肽先用DMSO配置成10mM母液，再用含10％FBS的DMEM培养基将母液稀释成20μM，作为进一步梯度稀释的原液。
多肽梯度稀释液的配制：用含10％FBS的DMEM培养基将上述20μM的各多肽原液以3倍的倍比稀释，共稀释9个梯度(分别为6.67、2.22、0.74、0.25、0.082、0.027、0.009、0.003、0.001μM)，每个梯度3个复孔，每孔50μL。
假病毒用量的确定：将SARS-CoV-2原始毒株或变异毒株假病毒原液及一系列稀释液在HEK 293T ACE2细胞上进行定量，将出现1000个FFU时的稀释度作为评价多肽抑制效果时的病毒用量(稀释倍数介于6～20倍之间)。
病毒抑制效果的测定方法为：
a.在96孔细胞培养板中铺HEK 293T ACE2细胞，培养使第二天细胞汇合密度达到80-90％。
b.根据上述实验分组，取上述各多肽梯度稀释液，加入等体积(50μL)的定量的假病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1h。
c.将步骤a中的96孔细胞培养板上清小心弃去，加入步骤b中的多肽-假病毒混合液(100μL/孔)，在培养箱中继续培养15h-24h。
d.利用高内涵显微镜统计被感染的细胞数，计算各多肽在不同浓度下的抑制率，再利用GraphPad计算出各多肽的EC50结果见表6。
表6.多肽P3-2-GS-PEG-Chol截短多肽及P3-2-GS-Chol截短多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果(EC50)
EC50(μM) Prototype Delta Omicron
P3-2-GS-PEG-Chol 0.03110 0.01589 0.01085
P3-2-GS-PEG-Chol-2 0.2100 0.02260 0.01156
P3-2-GS-PEG-Chol-3 1.585 0.04737 0.1563
P3-2-GS-Chol-2 0.8645 1.248 0.1928
P3-2-GS-Chol-3 0.7789 0.6295 0.06472
结果与讨论
本实施例中，通过固相合成了P3-2-GS-Chol以及P3-2-GS-PEG-Chol的截短多肽P3-2-GS-Chol-1和P3-2-GS-PEG-Chol-1，但这两条多肽的稳定性差，通过纯化无法得到高纯度样品，无法用于假病毒中和试验评估对病毒抑制效果。
从表6和图8-10看出，多肽P3-2-GS-PEG-Chol的截短多肽P3-2-GS-PEG-Chol-2、P3-2-GS-PEG-Chol-3对新冠病毒的原始毒株Prototype、变异毒株Delta、Omicron也显示了较好的抑制效果，但抑制效果均弱于P3-2-GS-PEG-Chol，且这种抑制效果并不是随着肽序的逐渐截短而逐渐减弱的；多肽P3-2-GS-Chol的截短多肽P3-2-GS-Chol-2、P3-2-GS-Chol-3、P3-2-GS-Chol-4、P3-2-GS-Chol-5对原始毒株Prototype和变异毒株Delta、Omicron同样具有一定的抑制效果，但抑制效果均弱于P-2-GS-Chol。
对比截短多肽和原始长度多肽的假病毒中和试验数据，可以发现P3-2-GS-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol截短后抗病毒效果均会有不同程度的下降。
实施例5
多肽P3-2的衍生物在Vero细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果评价
本实施例旨在测定表1中多肽P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol在Vero细胞上对原始毒株(SARS-CoV-2WH01)及变异毒株Delta(B.1.617.2)及Omicron(BA.1)的活病毒的抑制效果。
实验分组：Vero细胞(空白对照组，细胞未感染病毒)；Vero细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+DMEM培养基(阴性对照组，细胞感染了病毒，但未用多肽处理)；Vero细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+P3-2-GS-Chol(P3-2-GS-Chol处理组)；Vero细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+P3-2-PEG-Chol(P3-2-PEG-Chol处理组)；Vero细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+P3-2-GS-PEG-Chol(P3-2-GS-PEG-Chol处理组)。
多肽原液配制：表1中的测定表1中多肽P3-2、P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol先用DMSO配置成5mM母液，再用含2％FBS的DMEM培养基将母液稀释成5μM，作为进一步梯度稀释的原液。多肽P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol对三种毒株均从5μM开始3倍倍比稀释，共11个梯度；多肽P3-2-GS-PEG-Chol对SARS-CoV-2Prototype和Delta毒株从5μM开始3倍倍比稀释，对Omicron从5μM开始5倍倍比稀释，共11个梯度；每个梯度4个重复孔，每孔50μl。
活病毒用量的确定：按TCID50计算，分别稀释SARS-CoV-2WH01、Delta和Omicron的病毒液至2000TCID50/mL，每种病毒液共需要9.6mL(按12mL准备)。稀释时使用DMEM(含2％FBS)。
病毒抑制效果的测定方法为：
a.根据上述实验分组，取上述各多肽梯度稀释液，加入等体积(50μL)的定量的活病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1h。
b.将悬浮的Vero细胞加入混合液中，在培养箱中继续培养48h-120h。
c.观察细胞病变情况，分别记录48h、72h和120h时细胞病变孔数，计算各多肽在不同浓度下的抑制率，再利用GraphPad计算出各多肽的EC50(如图11-13所示)结果见表7。
表7.多肽P3-2及其衍生物对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效(EC50)
Figure BDA0003576069970000231
Figure BDA0003576069970000241
结果与讨论
从表7可以看出，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol在Vero细胞上具有优异的新冠病毒活病毒抑制效果。
P3-2-GS-Chol的活病毒中和试验中，对于新冠病毒原型毒株(WH01)，在48小时观察CPE(细胞病变效应)，计算得到EC50为0.5280μM。对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中未观察到CPE，此时多肽对病毒抑制率为100％，延长观察时间至72小时，可观察到CPE，计算得到EC50为0.0206μM。对于新冠病毒Omicron变异株，在48和72小时的实验组中均未观察到CPE，此时多肽对病毒抑制率为100％，延长观察时间至120小时，可观察到CPE，计算得到EC50为0.0362μM。
P3-2-PEG-Chol的活病毒中和试验中，对于新冠病毒原型毒株(WH01)，在48小时观察CPE，计算得到EC50为0.5292μM。对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中未观察到CPE，此时多肽对病毒抑制率为100％，延长观察时间至72小时，可观察到CPE，计算得到EC50为0.0206μM。对于新冠病毒Omicron变异株，在48和72小时的实验组中均未观察到CPE，此时多肽对病毒抑制率为100％，延长观察时间至120小时，可观察到CPE，计算得到EC50为0.1852μM。
P3-2-GS-PEG-Chol的活病毒中和试验中，对于新冠病毒原型毒株(WH01)，在48小时观察CPE，计算得到EC50为0.0587μM。对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中未观察到CPE，此时多肽对病毒抑制率为100％，延长观察时间至72小时，可观察到CPE，计算得到EC50为0.0406μM。对于新冠病毒Omicron变异株，在48和72小时的实验组中均未观察到CPE，此时多肽对病毒抑制率为100％，延长观察时间至120小时，可观察到CPE，计算得到EC50为0.0216μM。
综合观察时间和EC50分析，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol在Vero细胞上对新冠病毒活病毒有效，尤其针对Omicron的抑制效果最好。
实施例6
多肽P3-2的衍生物在Vero E6细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效果评价
本实施例旨在测定表1中多肽P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol在Vero E6细胞上对原始毒株(SARS-CoV-2WH01)及变异毒株Delta(B.1.617.2)及Omicron(BA.1)的活病毒的抑制效果。
实验分组：Vero E6细胞(空白对照组，细胞未感染病毒)；Vero E6细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+DMEM培养基(阴性对照组，细胞感染了病毒，但未用多肽处理)；Vero E6细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+P3-2-GS-Chol(P3-2-GS-Chol处理组)；Vero E6细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+P3-2-PEG-Chol(P3-2-PEG-Chol处理组)；Vero E6细胞+原始毒株或变异毒株活病毒+P3-2-GS-PEG-Chol(P3-2-GS-PEG-Chol处理组)。
多肽原液配制：表1中的测定表1中多肽P3-2、P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol、P3-2-GS-PEG-Chol先用DMSO配置成5mM母液，再用含2％FBS的DMEM培养基将母液稀释成5μM，作为进一步梯度稀释的原液。多肽P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol对三种毒株均从5μM开始3倍倍比稀释，共11个梯度；多肽P3-2-GS-PEG-Chol对SARS-CoV-2Prototype和Delta毒株从5μM开始3倍倍比稀释，对Omicron从5μM开始5倍倍比稀释，共11个梯度；每个梯度4个重复孔，每孔50μl。
活病毒用量的确定：按TCID50计算，分别稀释SARS-CoV-2WH01、Delta和Omicron的病毒液至2000TCID50/mL，每种病毒液共需要9.6mL(按12mL准备)。稀释时使用DMEM(含2％FBS)。
病毒抑制效果的测定方法为：
a.根据上述实验分组，取上述各多肽梯度稀释液，加入等体积(50μL)的定量的活病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1h。
b.将悬浮的Vero E6细胞加入混合液中，在培养箱中继续培养48-72h。
c.观察细胞病变情况，记录48h和72h时细胞病变孔数，计算各多肽在不同浓度下的抑制率，再利用GraphPad计算出各多肽的EC50(如图14-16所示)结果见表8。
表8.48h和72h多肽P3-2及其衍生物在Vero E6细胞上对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株活病毒抑制效(EC50)
Figure BDA0003576069970000251
注：N.D.表示本次实验中该多肽在设计的浓度范围内未能测得抑制该毒株的半数起效浓度(EC50)。
结果与讨论
从表8可以看出，P3-2-GS-Chol、P3-2-PEG-Chol和P3-2-GS-PEG-Chol在Vero E6细胞上具有优异的新冠病毒活病毒抑制效果。由于48h后即能够观察到各多肽的EC50，主要对比48h的数据。
P3-2-GS-Chol的活病毒中和试验中，在Vero E6细胞上对于新冠病毒原型毒株(WH01)，48h和72h均未能观察到对活病毒的抑制效果。对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.3485μM。对于新冠病毒Omicron变异株，在48的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.0022μM。
P3-2-PEG-Chol的活病毒中和试验中，在Vero E6细胞上对于新冠病毒原型毒株(WH01)，48h和72h均未能观察到对活病毒的抑制效果。对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.5292μM。对于新冠病毒Omicron变异株，在48的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.0015μM。
P3-2-GS-PEG-Chol的活病毒中和试验中，在Vero E6细胞上对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.1208μM。对于新冠病毒Delta变异株，在48小时的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.0403μM。对于新冠病毒Omicron变异株，在48的实验组中可观察到CPE，计算得到EC50为0.000028μM。
综合观察时间和EC50分析，P3-2-GS-Chol和P3-2-PEG-Chol在Vero E6上对新冠病毒活病毒变异株有效，尤其针对Omicron的抑制效果最好；P3-2-GS-PEG-Chol对新冠病毒活病毒原始毒株和变异株均有效，尤其针对Omicron的抑制效果最好。
综上，在SARS-CoV-2入侵宿主细胞的过程中，本发明的多肽及其衍生物通过抑制S蛋白介导的膜融合过程抑制病毒入侵，适用于冠状病毒，尤其是SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株引起的疾病的预防或治疗。本发明的多肽及其衍生物对SARS-CoV-2原始毒株和变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron，尤其是对变异毒株Omicron的抑制效果显著，具有潜在的广泛应用价值。
上述实施例1-6中涉及的缩写及英文的含义如下表9所示。
表9缩写及英文的含义
Figure BDA0003576069970000261
Figure BDA0003576069970000271
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
深圳翰宇药业股份有限公司
<120> 一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用
<130> CP122010222C
<150> CN202111675955.3
<151> 2021-12-31
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
20 25 30
Lys Glu Leu
35
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile
1 5 10 15
Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
35 40
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Val Lys Phe Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile
1 5 10 15
Lys Glu Glu Ile Asp Arg Leu Tyr Glu Val Val Lys Asn Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
35 40
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
20 25 30
Gln Glu Leu
35
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
20 25 30
Lys Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Cys
35 40
<210> 6
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile
1 5 10 15
Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Cys
35 40 45
<210> 7
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Val Lys Phe Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile
1 5 10 15
Lys Glu Glu Ile Asp Arg Leu Tyr Glu Val Val Lys Asn Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Cys
35 40 45
<210> 8
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ser Val Val Asn Ile Lys Glu Glu Ile Asp Arg Leu Tyr Glu Val Val
1 5 10 15
Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Cys
35
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
20 25 30
Lys Glu Leu Cys
35
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile
1 5 10 15
Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Cys
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Val Lys Phe Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile
1 5 10 15
Lys Glu Glu Ile Asp Arg Leu Tyr Glu Val Val Lys Asn Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Cys
35 40
<210> 12
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln
1 5 10 15
Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser
20 25 30
Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
35
<210> 13
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
1 5 10 15
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
20 25 30
Ile Asp Leu Gln Glu Leu
35
<210> 14
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu
1 5 10 15
Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile
20 25 30
Asp Leu Gln Glu Leu
35
<210> 15
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln
1 5 10 15
Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser
20 25 30
Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Cys
35 40 45
<210> 16
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
1 5 10 15
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
20 25 30
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Cys
35 40
<210> 17
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu
1 5 10 15
Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile
20 25 30
Asp Leu Gln Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Cys
35 40

Claims (21)

1.一种用于抗冠状病毒的多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物为用于抗冠状病毒的多肽修饰有胆固醇的衍生物；
所述用于抗冠状病毒的多肽的序列为SEQ ID NO.2；
所述胆固醇修饰的修饰位点在所述多肽的C端；所述胆固醇的衍生物通过连接子连接或者直接连接在所述多肽的C端；
所述胆固醇的衍生物为胆固醇经过半胱氨酸修饰的衍生物；
或
所述胆固醇的衍生物为胆固醇经过半胱氨酸和PEG修饰的衍生物；
所述胆固醇的衍生物选自
Figure FDA0004118311570000011
Figure FDA0004118311570000012
所述R2为OH或者NH2；
所述n为1-20的任意整数；
所述x为1-6的任意整数。
2.根据权利要求1所述的多肽衍生物，其特征在于，所述胆固醇的衍生物中n为2-6的任意整数。
3.根据权利要求1-2任一项所述的多肽衍生物，其特征在于，所述连接子为-NH-PEGn-(CH2)x-CO-、(GSG)m、(GSGSG)m、(GSG)m-CONH-PEGn-(CH2)x-CO-或(GSGSG)m-CONH-PEGn-(CH2)x-CO-；
其中m为0-6的任意整数；
所述n为1-20的任意整数；
所述x为1-6的任意整数。
4.根据权利要求3所述的多肽衍生物，其特征在于，所述连接子中n为2-6的任意整数。
5.根据权利要求1-2任一项所述的多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物具有如下结构I、结构II及结构III所示的结构式：
结构I：
Figure FDA0004118311570000021
Figure FDA0004118311570000022
结构II：
Figure FDA0004118311570000023
结构III：
Figure FDA0004118311570000024
Figure FDA0004118311570000025
其中，所述R1为(GSG)m或(GSGSG)m，m选自0-6的任意整数；
所述R2为OH或者NH2；
所述多肽序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求5所述的多肽衍生物，其特征在于，m为0、1或2；R2为NH2。
7.根据权利要求1-2任一项所述的多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物选自：
Figure FDA0004118311570000031
8.一种药用组合物，其特征在于，其包含权利要求1-2任一项所述的多肽衍生物或其混合物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药用组合物，其特征在于，所述药用组合物为吸入剂、鼻腔用制剂或口服制剂或胃肠外制剂的形式。
10.根据权利要求9所述的药用组合物，其特征在于，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂和溶液剂。
11.根据权利要求9所述的药用组合物，其特征在于，所述胃肠外制剂为可注射或可推注制剂。
12.根据权利要求9所述的药用组合物，其特征在于，所述药用组合物为疫苗组合物。
13.权利要求1-2中任意一项所述的多肽衍生物或其混合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制冠状病毒或治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病，
其中所述冠状病毒选自SARS-CoV-2的原始毒株或其变异毒株。
14.根据权利要求13所述的用途，所述SARS-CoV-2变异毒株选自Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron、Kappa、Lambda、Deltacron。
15.根据权利要求13所述的用途，冠状病毒引起的疾病选自新型冠状病毒肺炎(CoronaVirus Disease 2019，COVID-19)。
16.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物的剂型是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂。
17.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物通过以下方式给药：注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输。
18.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物通过以下方式给药：腔道给药，包括经直肠、阴道和舌下。
19.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物通过以下方式给药：呼吸道给药，包括经鼻腔。
20.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物通过以下方式给药：粘膜给药。
21.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物通过以下方式给药：表面给药。
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