CN116440285A - 冠状病毒多肽类融合抑制剂的长效化的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了冠状病毒多肽类融合抑制剂的长效化的方法。方法包括将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1‑3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。本发明的方法可以将冠状病毒多肽类治疗剂长效化或者增加冠状病毒多肽类治疗剂的功效。

Description

冠状病毒多肽类融合抑制剂的长效化的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种冠状病毒多肽类融合抑制剂的长效化方法，具体涉及一种长效的广谱冠状病毒多肽类融合抑制剂。该方法可用于制备长效化的广谱抗冠状病毒药物。
背景技术
冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)对人类健康和公共卫生造成了巨大威胁。目前共确认有七种可感染人类的冠状病毒(HCoVs)，包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，又称新型冠状病毒)。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2是高致病性的HCoVs。SARS-CoV-2的基因组突变率很高，迄今已出现Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron等需关注的突变株(variants of concern,VOCs)。相比于之前的VOCs，目前全球主要流行的Omicron突变株致病性较低，但传染性明显增强。并且，Omicron对感染或疫苗接种引发的免疫反应，以及已开发的单克隆中和抗体，存在很强的免疫逃逸能力。另外，SARS-CoV-2的小分子抑制剂被报道容易出现耐药毒株，而且存在病毒反弹的现象。小分子抑制剂对肝脏和肾脏也会存在一定的毒性。
冠状病毒多肽类融合抑制剂，例如EK1，通过靶向冠状病毒刺突蛋白S2亚基上高度保守的区域，抑制病毒膜融合过程中六螺旋束(6-HB)的形成，从而阻止冠状病毒进入细胞。因此，相比单抗药物来说其广谱性更好，相比小分子抑制剂其特异性更高，毒性较低。然而，未经修饰的多肽药物的分子量普遍很小，在体内的半衰期很短。
因此，本领域需要冠状病毒多肽类融合抑制剂的长效化方法。
发明内容
目前已经有药物上市的多肽长效化策略，包括偶联聚合物(如聚乙二醇)、与长效化片段融合(IgG Fc结构域、人血清白蛋白)、与白蛋白结合配体偶联(如脂肪酸链)等。但是，本发明人发现这些长效策略应用于多肽药物存在各自的局限性。例如，多肽PEG化存在免疫原性和安全性等问题，导致治疗效果下降和不良事件。多肽与IgG的Fc结构域或白蛋白融合后，分子量增大十余倍，会导致空间位阻增加，药物的活性容易损失。
因此，本发明人开发出新的长效化方法，以延长抗冠状病毒的多肽药物在体内的半衰期。本申请的发明人提出，将可与人类IgG Fc结构域进行结合的IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，达到延长多肽药物在体内半衰期的目的。由此，为延长冠状病毒多肽类治疗剂在体内的半衰期提供一种新的长效化方法，并提供一种长效、广谱的冠状病毒多肽类治疗剂，可用于对抗当下及未来可能暴发的冠状病毒疫情。
在一方面，本发明提供了冠状病毒多肽类治疗剂的长效化的方法或者延长冠状病毒多肽类治疗剂的体内半衰期的方法。在一方面，本发明提供了用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效的方法或用于增加IgG Fc结合肽对IgG蛋白的结合能力的方法。
各方法可以包括将IgG Fc结合肽与多肽(例如冠状病毒多肽类治疗剂，诸如冠状病毒多肽类融合抑制剂)偶联。冠状病毒多肽类融合抑制剂可以包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。IgG Fc结合肽可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
在一个实施方案中，IgG Fc结合肽偶联至多肽类治疗剂的N端或C端。
在一个实施方案中，IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类融合抑制剂直接或者接头偶联。
在一个实施方案中，接头是柔性接头或刚性接头。
在一个实施方案中，接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数。例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。
在一方面，本发明提供了融合多肽，其包含冠状病毒多肽类治疗剂(例如冠状病毒多肽类融合抑制剂)和IgG Fc结合肽。冠状病毒多肽类治疗剂可以包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。IgG Fc结合肽可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
在一个实施方案中，IgG Fc结合肽偶联至冠状病毒多肽类融合抑制剂的N端或C端。
在一个实施方案中，IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类融合抑制剂直接或者通过接头偶联。
在一个实施方案中，接头是柔性接头或刚性接头。
在一个实施方案中，接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数。
在一个实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
在一方面，本发明提供了核酸，其编码本文所述的融合多肽。
在一方面，本发明提供了载体，其包含本文所述的核酸。
在一个实施方案中，载体包含编码纯化标签的核苷酸、编码前导物的核苷酸和/或调节元件。
在一个实施方案中，纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。
在一个实施方案中，调节元件选自启动子、终止子和/或增强子。
在一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的载体。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
在一个实施方案中，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一方面，本发明提供了组合物，其包含本文所述的融合多肽、核酸、载体和/或宿主细胞以及药学可接受的载体。
在一个实施方案中，组合物包含另外的抗冠状病毒药物。
在一个实施方案中，组合物为片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉的形式。
在一个实施方案中，抗冠状病毒药物是抗体或小分子药物。
在一个实施方案中，冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在一个实施方案中，抗体是安巴韦单抗、罗米司韦单抗、sotrovimab(即S309单抗)、imdevimab、casirivimab(即10933单抗)、tixagevimab、cilgavimab、bamlanivimab、etesevimab、amubarvimab和/或romlusevimab。
在一个实施方案中，小分子药物是莫诺拉韦、奈玛特韦、利托纳韦和/或阿兹夫定。
在一方面，本发明提供了IgG Fc结合肽用于增加冠状病毒多肽类药物(融合抑制剂)对冠状病毒的功效的用途，其中将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
在一个实施方案中，IgG Fc结合肽偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端。
在一个实施方案中，IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者接头偶联。
在一个实施方案中，接头是柔性接头或刚性接头。
在一个实施方案中，接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，n为1-20的整数。
在一个实施方案中，冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在一方面，本发明提供了在细胞中抑制冠状病毒增殖的体外方法，其包括将细胞与本文的融合多肽或组合物接触。
在一个实施方案中，冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在一方面，本发明提供了本文的融合多肽或组合物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于抑制冠状病毒增殖、治疗和/或预防由冠状病毒引起的疾病或症状。
在一个实施方案中，冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在一个实施方案中，药物为片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉的形式。
在一方面，本发明提供了本文的融合多肽用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效的方法/用途或用于增加IgG Fc结合肽对IgG蛋白的结合能力的用途。
本发明的优点包括：
1.本发明提供了延长与冠状病毒多肽类治疗剂的体内半衰期或者使冠状病毒多肽类治疗剂长效化的方法。与未修饰的多肽的半衰期相比，该方法可以将冠状病毒多肽类治疗剂的体内半衰期延长到约40小时(图2)。
2.IgG Fc结合肽可以进行加强冠状病毒多肽类药物(冠状病毒多肽类融合抑制剂)抑制冠状病毒介导的细胞间融合的能力(图3的A图)。
3.IgG Fc结合肽可以进行加强冠状病毒多肽类药物抑制感染的能力。
4.本发明的融合多肽可以与冠状病毒抗体(例如S309和/或10933单抗)协同发挥治疗效果。
附图说明
图1显示了IBP-EK1与猴IgG的结合情况。
图2显示了IBP-EK1在血浆中的浓度随时间变化的曲线。根据IBP-EK1抑制SARS-CoV假病毒的体外IC50值，以及所测得的血清样本的DF-IC50(左图)，估算在给药后不同时间点，恒河猴血清样本中活性多肽的浓度(右图)。
图3显示了IBP-EK1对SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞融合(A)及SARS-CoV-2假病毒感染(B)的抑制活性。
图4显示了IBP-EK1对Omicron BQ.1突变株假病毒感染的抑制活性。
图5显示了IBP-EK1对靶细胞Caco-2(A),Huh-7(B)的细胞毒性。
图6显示了IBP-EK1的圆二色光谱(A)，IBP-EK1/HR1P复合物的圆二色光谱(B)，以及IBP-EK1/HR1P复合物的Tm值(C)。
图7显示了IBP-EK1多肽与S309单抗联用抑制Delta假病毒感染的剂量降低情况。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。
如本文中使用，“冠状病毒”是具包膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，是自然界广泛存在的一大类病毒。SARS-CoV-2是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。
如本文中使用，“长效化”指使药物(例如多肽)在延长的时间内发挥功效。长效化方法包括化学修饰、聚乙二醇(PEG)修饰、糖基修饰、与人血清白蛋白融合、与抗体Fc片段融合、微囊包埋等。在本文中，发明人采用IBP多肽，将其融合或缀合到多肽的末端来实现多肽的长效化。
如本文中使用，“冠状病毒多肽类治疗剂”指可用于抑制冠状病毒生长、预防或治疗冠状病毒相关疾病或症状的多肽类药物。在本文中，冠状病毒多肽类治疗剂是冠状病毒多肽类融合抑制剂，其是抑制冠状病毒介导的细胞间融合的抑制剂。这种抑制剂可以是多肽类抑制剂，其在本领域中已经有广泛报道(如中国专利申请202180001804.1)。例如，冠状病毒多肽类治疗剂包含选自如下SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
SLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKEL(SEQ ID NO:1)
DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL(SEQ ID NO:2)
ANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ(SEQ ID NO:3)
如本文中使用，“IgG Fc结合肽”在本文中指具有IgG Fc结合能力的多肽。该IgGFc结合肽可以是SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。SEQ ID NO:4的序列为DCAWHLGELVWCT。
如本文中使用，“融合多肽”与融合物或融合蛋白等用语可互换使用，指两个以上具有相同或不同功能的多肽连接在一起。在一个实施方案中，融合多肽具有以下氨基酸序列：
DCAWHLGELVWCTSLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKEL(SEQ ID NO:5)。
如本文中使用，氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1-5中任一项的C端或N端添加氨基酸，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
如本文中使用，氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1-5中任一项的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
如本文中使用，氨基酸插入指在氨基酸序列例如SEQ ID NO:1-5中任一项的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
如本文中使用，氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1-5中任一项的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。
在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与SEQ ID NO:1-5任一项的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。
在本发明的上下文中，保守取代可以根据以下三个表中的一个或多个中反映的氨基酸类别内的取代来定义：
表1：保守取代的氨基酸残基类别
表2：备选保守氨基酸残基取代类别
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
表3：氨基酸残基的备选物理和功能分类
如本文中使用，冠状病毒可以是任何种类的冠状病毒。例如，冠状病毒是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。
本发明的多肽或组合物可以单独使用或组合使用，或者结合其他具有抗冠状病毒活性或冠状病毒抑制活性的药剂组合使用。例如，这些药剂可以是现有报道对冠状病毒具有抑制活性或对冠状病毒疾病，例如冠状病毒感染具有治疗效果的药剂，例如法匹拉韦、奈非那韦、阿比朵尔、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、达芦那韦或瑞德西韦等等。抗冠状病毒药物可以是抗体或小分子药物。抗体可以是安巴韦单抗、罗米司韦单抗、sotrovimab、imdevimab、casirivimab、tixagevimab、cilgavimab、bamlanivimab、etesevimab、amubarvimab和/或romlusevimab。小分子药物可以是莫诺拉韦、奈玛特韦、利托纳韦和/或阿兹夫定。
在本文中，本发明的多肽可以制备成组合物形式进行应用。组合物可以包含合适的载体，例如药学可接受的载体。此类组合物可以是外用的，例如用作外用制剂，外用涂抹制剂，例如外用凝胶剂或外用浸润制剂。此类组合物可以涂覆在需要抑制病毒的物品上，例如但不限于口罩、纸巾、手套、衣物，例如防护服等上。或者，可以作为活性成分添加到洗手用品，例如洗手液、沐浴露等中。可以使用此类多肽或多肽衍生物在体外抑制冠状病毒以防止和/或减少病毒感染。可以使用此类多肽或多肽衍生物预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病。
本发明的多肽或组合物也可以制备成药物或药物组合物。此类药物可以是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂。可以通过各种施用方式应用这些药物或药物组合物，例如注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等，腔道给药，如经直肠、阴道和舌下，呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药，或者表面给药，等等。
本发明提供了预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病的方法，其包括施用本发明的多肽或组合物。本发明还提供了在预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病中使用的多肽或多肽衍生物。
本发明还涉及预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病的方法，其包括给受试者/患者施用本发明所述的多肽或组合物，
本发明还涉及多肽、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物，用于预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病。
本发明还涉及用于预防或治疗受试者/患者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病的多肽、核酸、载体、宿主细胞、多肽或组合物，例如药物组合物和试剂盒。
可以采用常规的药物实践来提供合适的配制剂或组合物，以施用于患有冠状病毒感染的受试者。可以采用任何合适的施用途径，例如，胃肠外的、静脉内的、皮下的、肌肉内的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、脊柱内的、鞘内的、脑池内的、腹膜内的、鼻内的、气雾、表面的或口服施用。治疗用配制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服施用，配制剂可以是片剂或胶囊的形式；对于鼻内的配制剂，可以是粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式。优选地，在本文中，本发明的多肽或组合物用于静脉内施用。
本领域公知的制备配制剂的方法可以见例如“Remington’sPharmaceuticalSciences”(第19版)，A.Gennaro编，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa。胃肠外施用的配制剂可以例如含有赋形剂、无菌水或盐水、聚(亚烃基)二醇诸如聚乙烯乙二醇、植物油或氢化的萘。生物相容的、生物可降解的丙交脂聚合物、丙交脂/乙交脂共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。其它潜在有用的胃肠外投递系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统、和脂质体。
假病毒制备
本文中可以使用本领域已知的方法制备假病毒。例如，如先前所述(L.Lu,Q.Liu,Y.Zhu,K.-H.Chan,L.Qin,Y.Li,Q.Wang,J.F.-W.Chan,L.Du,F.Yu,C.Ma,S.Ye,K.-Y.Yuen,R.Zhang,S.Jiang,Structure-based discovery of Middle East respiratory syndromecoronavirus fusion inhibitor.Nat.Commun.5,3067(2014))，用质粒转染293T细胞所得，质粒包括HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R-.E-和不同SARS-CoV-2突变株S蛋白表达质粒。不同SARS-CoV-2突变株S蛋白的氨基酸序列是已知的。表4中提供了多种SARS-CoV-2变异株S蛋白表达质粒。本文中可以使用表4中列出的一种或多种SARS-CoV-2突变株S蛋白的氨基酸序列。
表4:
效应细胞的制备
本文中可以使用本领域已知的方法制备效应细胞，即用于细胞-细胞融合实验所需293T/冠状病毒S蛋白/GFP细胞。例如，如现有技术文献(Xia,S.et al.A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirusspike.Sci Adv 5,eaav4580,doi:10.1126/sciadv.aav4580(2019))所述，可以用内切酶将不同冠状病毒S蛋白的基因序列从pcDNA3.1载体上切下，连接至pAAV-IRES-GFP载体中，得到如下不同冠状病毒的融合质粒(编码GFP和冠状病毒S蛋白，分别表达在胞浆和细胞膜表面)：pAAV-SARS-2-IRES-GFP；pAAV-SARS-IRES-GFP；pAAV-MERS-IRES-GFP；pAAV-WIV1-IRES-GFP；pAAV-OC43-IRES-GFP；pAAV-NL63-IRES-GFP；pAAV-229E-IRES-GFP。S蛋白的氨基酸序列见表5。然后，可以用构建的载体转染293T细胞。
表5
方法
本发明提供了冠状病毒多肽类治疗剂的长效化的方法，该方法包括将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
本发明提供了用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效的方法，该方法包括将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
本发明提供了用于增加IgG Fc结合肽对IgG蛋白的结合能力的方法，该方法包括将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgGFc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。
在本文中，IgG蛋白可以是IgG1蛋白、IgG2蛋白、IgG3蛋白或IgG4蛋白。
IgG Fc结合肽可以偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端。IgG Fc结合肽可以与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者接头偶联。接头的类型可以没有特别限制，可以是柔性接头或刚性接头。例如，接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数。冠状病毒多肽类治疗剂可以是冠状病毒多肽类融合抑制剂。
融合多肽
本发明提供了融合多肽，其包含冠状病毒多肽类治疗剂和IgG Fc结合肽，所述冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。融合多肽可以用于冠状病毒多肽类治疗剂的长效化，用于增加IgG Fc结合肽对IgG蛋白的结合能力和/或用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效。
IgG Fc结合肽可以偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端。IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者通过接头偶联。接头没有特别限制，可以是柔性接头或刚性接头。接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数。融合多肽可以包含SEQID NO:5所示的氨基酸或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体。冠状病毒多肽类治疗剂可以是冠状病毒多肽类融合抑制剂。
组合物
本发明的各组分，例如融合多肽、核酸、载体和/或宿主细胞可以制备成组合物或者包含于试剂盒中。该组合物或试剂盒可以包含药学可接受的载体以便于各组分的应用。组合物还包含一种或多种另外的抗冠状病毒药物。抗冠状病毒药物可以是抗体或小分子药物，例如目前或将来商品化的药物。例如，抗体是10933单抗、S309单抗、安巴韦单抗、罗米司韦单抗、Sotrovimab、imdevimab、casirivimab、tixagevimab、cilgavimab、bamlanivimab、etesevimab、amubarvimab和/或romlusevimab。小分子药物可以是莫诺拉韦、奈玛特韦、利托纳韦和/或阿兹夫定。
本发明的融合多肽或组合物可以配制为合适的剂型，例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉的形式。本发明的融合多肽或组合物可以用于治疗各种冠状病毒或相关疾病。冠状病毒可以选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
治疗方法
本发明提供了在细胞中抑制冠状病毒增殖的体外方法，其包括将细胞与本文的融合多肽或组合物接触。
本发明提供了抑制冠状病毒增殖、治疗和/或预防由冠状病毒引起的疾病或症状的方法，其包括对受试者(例如人或哺乳动物)施用本文的融合多肽或组合物。
冠状病毒可以选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
本发明还提供了本文的融合多肽或组合物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于抑制冠状病毒增殖、治疗和/或预防由冠状病毒引起的疾病或症状。冠状病毒可以选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
本发明还提供了本文的融合多肽或组合物，用于抑制冠状病毒增殖、治疗和/或预防由冠状病毒引起的疾病或症状。冠状病毒可以选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在这些方法和用途中，药物可以为片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉的形式。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：多肽制备、假病毒的包装和效应细胞的制备
1.长效冠状病毒融合抑制剂多肽IBP-EK1的制备
选取一条可与人IgG Fc结构域的CH2和CH3界面特异性结合的短肽，命名为IBP。IBP由13个氨基酸组成，序列为N-DCAWHLGELVWCT-C(SEQ ID NO:4)。冠状病毒融合抑制剂多肽EK1序列为SLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKEL(SEQ ID NO:1)。长效冠状病毒融合抑制剂多肽IBP-EK1由49个氨基酸组成，具体氨基酸序列为：N-DCAWHLGELVWCTSLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKE L-C(SEQ ID NO:5)；其中N-表示N端，C-表示C端。以上多肽委托外包商合成制备(南京杰肽生物科技有限公司)。
2.冠状病毒假病毒的包装
假病毒用质粒转染293T细胞所得，质粒包括HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R-.E-和不同SARS-CoV-2突变株S蛋白表达质粒，见表4；构建方式的文献报告见：L.Lu,Q.Liu,Y.Zhu,K.-H.Chan,L.Qin,Y.Li,Q.Wang,J.F.-W.Chan,L.Du,F.Yu,C.Ma,S.Ye,K.-Y.Yuen,R.Zhang,S.Jiang,Structure-based discovery of Middle East respiratory syndromecoronavirus fusion inhibitor.Nat.Commun.5,3067(2014)。具体地，本专利中所有假病毒的包装的步骤如下：
1)在转染前24h消化293T细胞，用含10％ FBS的DMEM培养基调整至适当浓度，以12mL/皿铺至100mm的细胞培养皿中，置于5％ CO2，37℃细胞培养箱培养，使24h后细胞接合率约为60-70％。
2)每个100mm培养皿中所加质粒总量为25μg，EZ trans转染试剂量为55μL。载体质粒pNL4-3.Luc.R-.E-与冠状病毒的S蛋白表达质粒的转染比例为4：1，即20μg载体质粒和5μg表达质粒/皿。将两种质粒加至330μL的无血清DMEM培养基并混匀，并将EZ trans也用无血清DMEM培养基稀释至330μL并混匀，将质粒稀释液和转染试剂稀释液均于室温静置5min。
3)将转染试剂稀释液逐滴加入质粒稀释液中，轻轻混匀，室温静置15min。
4)将上述混合液缓慢、均匀地滴加在细胞培养皿中293T细胞的表面，轻轻摇匀，置于培养箱中培养。
5)转染后约9-10h，轻轻吸去皿中的培养基，换液为新鲜的含10％ FBS的DMEM培养基，继续培养约48h，使假病毒包装并释放至上清中。
6)吸出培养皿中的上清，经0.45μm无菌滤器过滤至50mL无菌离心管中，用EP管或15mL离心管分装(避免多次冻融)，冻存于-80℃冰箱备用。
3.细胞-细胞融合实验所需293T/冠状病毒S蛋白/GFP细胞(效应细胞)的制备
用内切酶将不同冠状病毒S蛋白的基因序列从pcDNA3.1载体上切下，连接至pAAV-IRES-GFP载体中，得到如下不同冠状病毒的融合质粒(编码GFP和冠状病毒S蛋白，分别表达在胞浆和细胞膜表面)：pAAV-SARS-2-IRES-GFP；pAAV-SARS-IRES-GFP；pAAV-MERS-IRES-GFP；pAAV-WIV1-IRES-GFP；pAAV-OC43-IRES-GFP；pAAV-NL63-IRES-GFP；pAAV-229E-IRES-GFP(例如见Xia,S.et al.A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1domain of human coronavirus spike.Sci Adv 5,eaav4580,doi:10.1126/sciadv.aav4580(2019))。S蛋白的氨基酸序列见表5。
1)于转染前24h消化293T细胞，以适当密度铺至6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，充分晃匀后放入5％ CO2，37℃细胞培养箱培养，使24h后细胞接合率约为60％。
2)转染前2h，将六孔板中的细胞上清轻轻吸去，换液为2mL/孔新鲜的DMEM培养基(含10％ FBS)。
3)六孔板每孔所加质粒量为5μg，Vigofect转染试剂的量为2μL。将5μg pAAV-SARS-2-IRES-GFP(或其他冠状病毒的融合质粒)质粒和2μL转染试剂分别滴加至100μL无血清的DMEM培养基中，室温分别静置5min。将转染试剂稀释液逐滴加入质粒稀释液中，轻轻混匀，室温静置15min。
4)将上述的约200μL混合液均匀地滴加在六孔板中293T细胞的表面，轻轻摇匀，置于培养箱中培养，使293T细胞的胞浆中表达绿色荧光蛋白(GFP)，细胞膜表面表达SARS-CoV-2S蛋白。
5)转染后6～8h，再次给293T细胞换液为每孔2mL新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)。
6)继续置于培养箱中培养24～36h，在荧光显微镜下观察并确认细胞内GFP的表达，以进行后续细胞-细胞融合实验。
实施例2：通过ELISA实验检测多肽与猴IgG结合的能力
通过ELISA实验检测多肽IBP、EK1和IBP-EK1与猴IgG结合的能力，如先前所述(参考文献：Du L,Kou Z,Ma C,Tao X,Wang L,Zhao G,Chen Y,Yu F,Tseng CT,Zhou Y,JiangS.A truncated receptor-binding domain of MERS-CoV spike protein potentlyinhibits MERS-CoV infectionand induces strong neutralizing antibodyresponses:implication for developing therapeutics and vaccines.PLoSOne.2013Dec 4；8(12):e81587)。
具体实验过程如下。
(1)用PH为9.6的0.05M NaHCO3包被缓冲溶液分别稀释相应多肽(多肽IBP、EK1和IBP-EK1)至5μg/mL，并以50μL/孔包被到96孔板中，4℃过夜。
(2)每孔加入2％牛奶150μL，37℃封闭2h，随后洗板三次。
(3)将恒河猴IgG(本实验室内部制备，用天地人和生物科技有限公司的rProteinG柱材根据产品说明书从恒河猴血清中纯化)的浓度稀释为100μg/mL，然后倍比稀释，37℃孵育1h，随后洗板三次。
(4)每孔加入50μL 1：4000稀释的羊抗猴IgG-Fc-HRP(购自Abcam)，37度孵育1h，洗板5次。
(5)每孔加入50μL TMB显色液，显色3-10min，随后每孔加入50μL 1MH2SO4终止反应，然后用Ultra386(Tecan)检测在450nm处的吸光度(OD450)。
图1显示了IBP-EK1与猴IgG结合的吸光度随猴IgG的浓度增加而增加。IBP与EK1的偶联保留了IBP的IgG结合能力。IBP-EK1在450nm处的吸光度(OD450)与猴IgG的浓度呈正相关，表明IBP-EK1确实能与猴IgG结合，且显著强于单独的IBP与IgG的结合。
实施例3：多肽在恒河猴体内的药物代谢动力学实验
测定了多肽IBP、EK1和IBP-EK1在恒河猴体内的药物代谢动力学，如先前文献描述(参考文献：Su S,Rasquinha G,Du L,Wang Q,Xu W,Li W,Lu L,Jiang S.APeptide-BasedHIV-1Fusion Inhibitor with Two Tail-Anchors and Palmitic Acid ExhibitsSubstantially Improved In Vitro and Ex Vivo Anti-HIV-1Activity and ProlongedIn Vivo Half-Life.Molecules.2019Mar21；24(6):1134.)。
具体实验过程如下。
(1)恒河猴的静脉注射前，采取血清作为阴性对照。
(2)通过静脉注射(单次)，给予恒河猴10mg/kg IBP-EK1。
(3)在完成静脉注射后的2h、4h、6h、24h、72h、144h分别取血。
(4)样本室温静置后，分离血清，冻存于负80度冰箱。
(5)将每个时间点的血清倍比稀释，检测对于SARS-CoV假病毒(本实验室内部制备，HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R-.E-和SARS-CoV S蛋白表达质粒转染293T细胞所得，具体构建方式如上文所述)的抑制情况，并计算抑制50％假病毒的血清稀释倍数(DF-IC50)。
(6)根据体外的IC50估算血清中的多肽浓度，并根据MODFIT软件计算出半衰期(t1/2)。
图2显示了IBP-EK1在血浆中的浓度随时间变化的曲线。根据IBP-EK1抑制SARS-CoV假病毒的体外IC50值，以及所测得的血清样本的DF-IC50(左图)，估算在给药后不同时间点，恒河猴血清样本中活性多肽的浓度(右图)。根据浓度-给药时间曲线，用MODFIT软件拟合出IBP-EK1的血清半衰期(t1/2)，为39.72h，比之前报道的EK1半衰期延长了约21倍。
实施例4：多肽抑制SARS-CoV-2假病毒感染实验
进行了多肽抑制SARS-CoV-2假病毒感染实验，如先前所述(参考文献：Xia S,YanL,Xu W,Agrawal AS,Algaissi A,Tseng CK,Wang Q,Du L,Tan W,Wilson IA,Jiang S,Yang B,Lu L.Apan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain ofhuman coronavirus spike.Sci Adv.2019Apr10；5(4):eaav4580)。
具体实验过程如下。
(1)消化靶细胞并计数(本实验室保藏的Caco-2细胞：6000个细胞/孔；Caco-2(人结肠腺癌细胞系)为本实验室保存于液氮，复苏后置于5％ CO2，37℃培养箱，用含有10％FBS的DMEM培养基培养)，每孔100μL加入96孔细胞培养平板中。置于37摄氏度培养箱中孵育24h，使细胞生长及贴壁完全。
(2)将多肽IBP、EK1和IBP-EK1原液用无血清DMEM稀释并涡旋混匀，加至96孔圆底稀释板的首行，每个多肽设置三个复孔。另外设置三个不加药物的病毒对照孔和三个不加病毒的细胞对照孔。
(3)倍比稀释药物，并在除细胞孔之外的每孔中加入预包装好的冠状病毒假病毒(本实验室内部制备。假病毒用质粒转染293T细胞所得，包括HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R-.E-和不同SARS-CoV-2突变株S蛋白表达质粒；构建方式如上文所述)，置于37摄氏度培养箱中孵育45min。
(4)弃掉细胞培养板中的上清，将96孔圆底板中的多肽-假病毒混合液吹打混匀，吸取100μl对应转移至96孔细胞板中，置于37摄氏度培养箱孵育。
(5)孵育10～12h之后换液为有血清的DMEM培养基。
(6)继续孵育48h之后，弃净细胞上清，向每孔中加入50μL裂解液，置于摇床上室温裂解45min。
(7)从96孔板的每孔中吸取30μL裂解产物，对应转移至96孔不透明白板。
(8)从首行至末行依次加入30μL luciferase底物，将白板放入酶标仪，读出每孔数值。
(9)根据病毒孔和细胞孔的数值计算出不同浓度下多肽对假病毒感染的抑制率。
图3的B图显示了多肽IBP、EK1和IBP-EK1抑制SARS-CoV-2假病毒感染的百分比。将IBP与EK1融合形成IBP-EK1没有影响EK1抑制SARS-CoV-2假病毒感染的能力。表6显示了IBP-EK1对SARS-CoV-2突变株(尤其是Omicron亚谱系毒株)假病毒感染的抑制活性。
表6是IBP-EK1对SARS-CoV-2突变株(尤其是Omicron亚谱系毒株)假病毒感染的抑制活性。
表6
根据本发明方法制备的长效冠状病毒多肽类融合抑制剂IBP-EK1，对SARS-CoV-2的抑制活性不受变异株突变位点的影响(如表6和图4所示)。与EK1相比，IBP-EK1的IC50进一步降低，这是出乎意料的。
实施例5：多肽对SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞融合的抑制实验
进行了多肽IBP、EK1和IBP-EK1对SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞融合的抑制实验，如先前所述(参考文献：Xia S,Yan L,Xu W,Agrawal AS,Algaissi A,Tseng CK,WangQ,Du L,Tan W,Wilson IA,Jiang S,Yang B,Lu L.Apan-coronavirus fusion inhibitortargeting the HR1 domain of human coronavirus spike.Sci Adv.2019Apr 10；5(4):eaav4580)。
具体实验过程如下：
(1)消化293T细胞(293T(人胚肾细胞系)为本实验室保存于液氮，复苏后置于5％CO2，37℃培养箱培养，用含有15％ FBS的DMEM培养基培养)，以适当密度铺至6孔板中，放置37摄氏度培养箱中孵育，使细胞贴壁。
(2)24h后，用SARS-CoV-2融合质粒pAAV-SARS-2-IRES-GFP(本实验室保藏，构建方式可见：Xia,S.et al.Apan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domainof human coronavirus spike.Sci Adv 5,eaav4580,doi:10.1126/sciadv.aav4580(2019))转染293T细胞。转染后6h换液为10％血清的DMEM，继续37摄氏度孵育36～48h，观察绿色荧光的表达情况。
(3)在抑制实验前的12h消化靶细胞，25000个细胞/孔，每孔100μL加入96孔细胞培养平板中，置于37摄氏度培养箱，使细胞贴壁。
(4)将多肽原液用无血清DMEM稀释并涡旋混匀，加至96孔圆底稀释板的首行，每个多肽设置三个复孔。另外设置三个不加药物的病毒(293T)对照孔和三个不加病毒(293T)的细胞对照孔。
(5)消化293T细胞，用无血清DMEM重悬，稀释至合适密度。于96孔圆底板中倍比稀释药物，在除细胞孔之外的每孔中加入表达各冠状病毒S蛋白(见表4)的293T细胞，置于37摄氏度培养箱中孵育45min。
(6)弃掉细胞培养板中的上清，将96孔圆底板中的多肽-细胞混合液吹打混匀，吸取100μL对应转移至96孔细胞板中，置于37摄氏度培养箱孵育。
(7)每两个小时观察一次，直到未加多肽的病毒对照孔发生明显的细胞-细胞融合迹象。
(8)向96孔板的每孔中加入100μL 4％的多聚甲醛溶液，终止融合并固定细胞。
(9)将荧光显微镜调至GFP通道，每孔随机挑选4个视野拍摄细胞-细胞融合图片。
(10)用ImageJ软件计数每张图片发生融合的细胞数及细胞总数，得出每张图片的融合率＝发生融合的细胞数/细胞总数×100％。进而计算每孔的平均融合率＝每孔4个视野融合率均值。
(11)根据病毒孔和细胞孔的融合率计算出不同浓度下多肽对细胞-细胞融合的抑制率(病毒对照孔的融合率-多肽孔的融合率)/(病毒对照孔的融合率-细胞对照孔的融合率)×100％。
图3的A图显示了多肽IBP、EK1和IBP-EK1对SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞融合的抑制。与EK1相比，IBP-EK1对SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞融合的抑制效果得到改善，这是出乎意料的。
表7是IBP-EK1对不同冠状病毒S蛋白介导的细胞-细胞融合及假病毒感染的抑制活性。IC50即半数抑制浓度，是指能抑制50％假病毒感染/细胞-细胞融合的药物浓度。
表7.
实施例6：多肽细胞毒性的检测
对于多肽IBP、EK1和IBP-EK1，进行了多肽细胞毒性的检测，如先前所述(参考文献：Xia S,Yan L,Xu W,Agrawal AS,Algaissi A,Tseng CK,Wang Q,Du L,Tan W,WilsonIA,Jiang S,Yang B,Lu L.Apan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1domain of human coronavirus spike.Sci Adv.2019Apr 10；5(4):eaav4580)。
具体实验过程如下：
(1)消化靶细胞并计数(Caco-2细胞：7000个细胞/孔；Huh7细胞：10000个细胞/孔；Huh-7(人肝癌细胞系)为本实验室保存于液氮，复苏后置于5％CO2，37℃培养箱，用含有15％ FBS的DMEM培养基培养)，每孔100μL加入96孔细胞培养平板中。置于37摄氏度培养箱中孵育24h，使细胞生长及贴壁完全。
(2)将多肽原液稀释至目的浓度并涡旋混匀，加至96孔圆底稀释板的首行，每个多肽设置三个复孔。另外设置三个不加药物的细胞对照孔。
(3)倍比稀释药物。吸取100μL对应转移至已弃去上清的96孔细胞板中，置于37摄氏度培养箱孵育。
(4)48h后，弃去细胞上清，每孔加入100μL CCK8稀释液，置于37摄氏度培养箱孵育2-3h；
(5)用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度(OD450)。
细胞存活率的计算方式＝多肽孔的OD450/细胞对照孔的OD450×100％。
根据本发明方法制备的长效冠状病毒多肽类融合抑制剂IBP-EK1，对靶细胞均不存在明显的细胞毒性(如图5所示)。
实施例7：圆二色谱测定多肽复合物的二级结构及熔解温度
通过圆二色谱测定多肽复合物的二级结构及熔解温度，如先前所述(参考文献：BiW,Xu W,Cheng L,Xue J,Wang Q,Yu F,Xia S,Wang Q,Li G,Qin C,Lu L,Su L,JiangS.IgG Fc-binding motif-conjugated HIV-1fusion inhibitor exhibits improvedpotency and in vivo half-life:Potential application in combination with broadneutralizing antibodies.PLoS Pathog.2019Dec5；15(12):e1008082)。
具体实验过程如下：
本部分研究中使用的SARS-CoV-2HR1P和HR2P多肽均在上海吉尔生化有限公司合成，经过HPLC检测，纯度超过95％。序列如下：HR1P：ANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ；HR2P：DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL。
(1)用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释多肽(HR1P，EK1和IBP-EK1)，使每条多肽的终浓度均为10μM，4度孵育过夜。
(2)将空白的磷酸盐缓冲液加入0.1cm的石英比色皿内，并放入机器卡槽中，作为空白对照校准。然后将混合物(HR1P+IBP，HR1P+HR2P，HR1P+EK1，或HR1P+IBPEK1)加入石英比色皿中。检测从260nm至200nm范围内CD值的变化。
(3)在仪器自带的软件中，根据多肽浓度和氨基酸个数，将CD结果转换为摩尔椭偏率。
(4)在222nm处，从20至98摄氏度升温(5℃/min)，测定混合物(HR1P+EK1，或HR1P+IBPEK1)在此过程中CD值的变化，获得相应的熔解曲线。通过仪器自带软件，获得熔解曲线的中点温度，即Tm值。
图6显示了摩尔椭偏率。图6的A图：IBP-EK1呈现出和EK1相似的208和222nm处的双负峰谱图，表明两种多肽具有含量相当的α螺旋结构。而IBP本身呈现无规结构。这一结果说明与IBP偶联并不会改变EK1原有的二级结构。图6的B图：相比于单独的EK1或IBP-EK1，与HR1P混合后的EK1或IBP-EK1均在208和222nm处形成明显加深的双负峰，表明两者相互作用形成α螺旋含量很高的复合物，说明IBP-EK1能和HR1P结合形成异源的六螺旋束(6-HB)。这一结果提示IBP-EK1利用与EK1相同的抑制机制对抗冠状病毒感染。图6的C图：当温度逐渐升高，CD的信号减弱，即复合物的六螺旋结构逐渐变性解体，最终趋于一个相对稳定的值。通过仪器自带软件，获得熔解曲线的中点温度，即熔解温度(Tm值)。IBP-EK1与HR1P形成复合物的Tm值高于EK1与HR1P形成的复合物，表明IBP-EK1与HR1P形成的复合物热稳定性更好。
实施例8：多肽与抗体联用抑制Delta变异株假病毒感染实验
进行了多肽与抗体联用抑制Delta变异株假病毒感染实验(参考文献：Pan C,CaiL,Lu H,Qi Z,Jiang S.Combinations of the first and next generations of humanimmunodeficiency virus(HIV)fusion inhibitors exhibit a highly potentsynergistic effect against enfuvirtide-sensitive and-resistant HIV type1strains.JVirol.2009Aug；83(16):7862-72)。
具体实验过程如下：
(1)用Expi293细胞表达S309单抗(PDB ID：6WS6)，并用protein G的柱材纯化。随后用50kD的超滤管将缓冲液体系置换为PBS。
S309 Fab重链：
1qvqlvqsgae vkkpgasvkv sckasgypft sygiswvrqa pgqglewmgwistyngntny61aqkfqgrvtm ttdtstttgy melrrlrsdd tavyycardy trgawfgesl iggfdnwgqg
121tlvtvssast kgpsvfplap sskstsggta algclvkdyf pepvtvswns galtsgvhtf
181pavlqssgly slssvvtvps sslgtqtyic nvnhkpsntk vdkkvepksc
S309 Fab轻链：
1eivltqspgt lslspgerat lscrasqtvs stslawyqqk pgqaprlliy gassratgip
61drfsgsgsgt dftltisrle pedfavyycq qhdtsltfgg gtkveikrtv aapsvfifpp
121sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskdstyslsstlt181lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec10933Fab重链：
1qvqlvesggg lvkpggslrl scaasgftfs dyymswirqa pgkglewvsy itysgstiyy
61adsvkgrfti srdnakssly lqmnslraed tavyycardr gttmvpfdywgqgtlvtvss121astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgvhtfpavlqss181glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkt10933Fab轻链：
1diqmtqspss lsasvgdrvt itcqasqdit nylnwyqqkp gkapklliya asnletgvps
61rfsgsgsgtd ftftisglqp ediatyycqq ydnlpltfgg gtkveikrtv aapsvfifpp
121sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskdstyslsstlt181lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec
(2)消化靶细胞并计数(Caco-2：6000个细胞/孔)，每孔100μL加入96孔细胞培养平板中。置于37摄氏度培养箱中孵育24h，使细胞生长及贴壁完全。
(3)根据预先测得的IBP-EK1多肽和S309单抗抑制Delta假病毒的IC50，计算多肽和抗体恰当的起始浓度。
(4)分别稀释多肽样品管、抗体样品管和多肽/抗体联用样品管至恰当起始浓度，立即涡旋混匀。加至96孔圆底稀释板的首行，每个样品设置三个复孔。另外设置三个不加药物的病毒对照孔和三个不加病毒的细胞对照孔。
(5)倍比稀释药物，并在除细胞孔之外的每孔中加入预包装好的Delta假病毒，置于37摄氏度培养箱中孵育45min。
(4)弃掉细胞培养板中的上清，将96孔圆底板中的药物-假病毒混合液吹打混匀，吸取100μl对应转移至96孔细胞板中，置于37摄氏度培养箱孵育。
(5)孵育10～12h之后换液为有血清的DMEM培养基。
(6)继续孵育48h之后，弃净细胞上清，向每孔中加入50μL裂解液，置于摇床上室温裂解45min。
(7)从96孔板的每孔中吸取30μL裂解产物，对应转移至96孔不透明白板。
(8)从首行至末行依次加入30μL luciferase底物，将白板放入酶标仪，读出每孔数值。
(9)根据病毒孔和细胞孔的数值计算出多肽/抗体/多肽-抗体联用对假病毒感染的抑制率。
(10)根据CalcuSyn，得出多肽-抗体联用在不同抑制率时的CI值及剂量降低数值(参考文献Chou,T.C.Theoretical basis,experimental design,and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies.PharmacolRev 58,621-681,doi:10.1124/pr.58.3.10(2006))。
根据本发明方法制备的长效冠状病毒多肽类融合抑制剂IBP-EK1，可与靶向SARS-CoV-2不同表位的抗体联合用药。IBP-EK1与S309单抗联用抑制SARS-CoV-2及其VOC突变株，协同指数最低可至0.1；联用后S309单抗的用量普遍降低了至少10倍(如表3和图7所示)。该协同效果是出乎意料的。除了靶向RBD的3类抗体S309，本文还选用靶向RBM的1类抗体10933(PDB ID：6XDG)；均使用本实验室保藏的单抗重链和轻链(序列见上文)表达质粒转染Expi293细胞，并用rProtein G柱材纯化所得。
表8是IBP-EK1多肽与10933单抗或S309单抗联用在50％抑制假病毒感染时的协同系数和联合用药的剂量降低数值。CI，即协同系数。
表8
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.冠状病毒多肽类治疗剂的长效化的方法，该方法包括将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体；
优选地，其中IgG Fc结合肽偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端；
优选地，其中IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者经接头偶联；
优选地，其中接头是柔性接头或刚性接头；
优选地，其中接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数；
优选地，其中冠状病毒多肽类治疗剂是冠状病毒多肽类融合抑制剂。
2.融合多肽，其包含冠状病毒多肽类治疗剂和IgG Fc结合肽，所述冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体；
优选地，其中IgG Fc结合肽偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端；
优选地，其中IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者通过接头偶联；
优选地，其中接头是柔性接头或刚性接头；
优选地，其中接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数；
优选地，其中融合多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体；
优选地，其中冠状病毒多肽类治疗剂是冠状病毒多肽类融合抑制剂。
3.核酸，其编码根据权利要求2所述的融合多肽。
4.载体，其包含根据权利要求3所述的核酸，
任选地，其中所述载体包含编码纯化标签的核苷酸、编码前导物的核苷酸和/或调节元件；
优选地，其中纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签；
优选地，其中调节元件选自启动子、终止子和/或增强子。
5.宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸或根据权利要求4所述的载体；
优选地，其中宿主细胞是真核细胞或原核细胞；
优选地，其中真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，和/或原核细胞是大肠杆菌细胞。
6.组合物，其包含根据权利要求2所述的融合多肽、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求4所述的载体和/或根据权利要求5所述的宿主细胞以及药学可接受的载体；
优选地，其中组合物包含另外的抗冠状病毒药物；
优选地，其中组合物为片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉的形式；
优选地，其中所述抗冠状病毒药物是抗体或小分子药物；
优选地，其中冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2；
优选地，其中抗体是安巴韦单抗、罗米司韦单抗、Sotrovimab、imdevimab、casirivimab、tixagevimab、cilgavimab、bamlanivimab、etesevimab、amubarvimab和/或romlusevimab；
优选地，其中小分子药物是莫诺拉韦、奈玛特韦、利托纳韦和/或阿兹夫定。
7.IgG Fc结合肽用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效的用途，其中将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ IDNO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体；
优选地，其中IgG Fc结合肽偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端；
优选地，其中IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者接头偶联；
优选地，其中接头是柔性接头或刚性接头；
优选地，其中接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，n为1-20的整数；
优选地，其中冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2；
优选地，其中冠状病毒多肽类治疗剂是冠状病毒多肽类融合抑制剂。
8.在细胞中抑制冠状病毒增殖的体外方法，其包括将细胞与权利要求2的融合多肽或权利要求8的组合物接触；
优选地，其中冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
9.权利要求2的融合多肽或权利要求8的组合物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于抑制冠状病毒增殖、治疗和/或预防由冠状病毒引起的疾病或症状；
优选地，其中冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物为片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉的形式。
11.用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效的方法或用于增加IgG Fc结合肽对IgG蛋白的结合能力的方法，该方法包括将IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂偶联，其中冠状病毒多肽类治疗剂包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体，并且IgG Fc结合肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其取代、插入、缺失或添加一个或多个氨基酸的变体；
优选地，其中IgG Fc结合肽偶联至冠状病毒多肽类治疗剂的N端或C端；
优选地，其中IgG Fc结合肽与冠状病毒多肽类治疗剂直接或者接头偶联；
优选地，其中接头是柔性接头或刚性接头；
优选地，其中接头是(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、或(GGGGS)n，n为1-20的整数；
优选地，其中冠状病毒多肽类治疗剂是冠状病毒多肽类融合抑制剂。
12.权利要求2的融合多肽用于增加冠状病毒多肽类治疗剂对冠状病毒的功效的用途或用于增加IgG Fc结合肽对IgG蛋白的结合能力的用途。
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