CN101148470A - 聚乙二醇修饰的抗菌/中和内毒素变构肽分子、其合成方法及医学用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及聚乙二醇(PEG)修饰的抗菌/中和内毒素变构肽BNEP分子、其合成方法及其医学用途。本发明采用多肽固相合成法、多肽液相合成法以及这两种方法的组合，将抗菌/中和内毒素变构肽BNEP以具有安全无毒、免疫原性极低、可以延长药物血浆半衰期等优异特性的PEG修饰，合成了一类amPEG修饰的BNEP衍生物：Y－BNEP－Z－amPEG生物活性检测表明，该衍生物不仅保留了BNEP的中和内毒素活性，而且延长了BNEP的体内半衰期，显示了进一步开发成为新型中和内毒素药物的潜力，为由革兰阴性杆菌(G－)引起的全身性炎症反应综合征、脓毒症和脓毒性休克等危重患者的治疗提供新的治疗药物或方法。
Description
技术领域
本发明涉及一类用以治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒性休克等疾病或症状的高分子修饰的多肽分子、其制备方法和医学用途。
背景技术
脓毒症(sepsis)是感染所致的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，进一步发展可导致严重感染、脓毒性休克(septic shoek)及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。美国疾病控制中心的统计调查结果[Angus DC，et al.Cri.Care Med.，2001，29(7)：1303～1310]显示：美国每年大约有75万人感染脓毒症，超过21万人因此而丧生：全身性感染已成为美国老年人十大死因之一，每年投入全身性感染的医疗费用高达1亿美元。在中国，多发伤、严重创伤、外科大手术后全身性感染、严重感染、MODS的患病率及死亡率较国外报道略高。虽然国内外临床上广泛采用了综合疗法，但其死亡率仍居高不下，脓毒症仍是导致危重病人死亡的第一因素。
革兰阴性菌细胞外膜内含有脂多糖(LPS)，也称内毒素，当它释放入血后可引起宿主的炎症瀑布效应并导致内毒素血症甚至死亡。目前普遍认为，内毒素是介导G-菌脓毒症的重要启动子，通过其调节蛋白或结合受体的作用，诱导宿主多种细胞因子的释放，激发机体一系列病理生理改变。国内外针对G-细菌感染所伴随的内毒素血症的防治研究已进行了数十年，但目前尚无一种安全有效的特异性中和LPS的制剂。
杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是一个分子量介于50～60kD之间的阳性蛋白。大量动物实验证实，BPI具有强大的杀灭G-细菌及中和LPS活性，被国外学者誉为“超级抗生素”。1992年获得BPI重组功能性的N-末端1～199个氨基酸片段(rBPI23)。临床研究表明，rBPI23及其突变体rBPI21兼有杀菌、中和内毒素作用，与内毒素具有很高的亲和力；rBPI21与抗菌素合用，效应增强；rBPI21发生生物效应时，对机体不产生任何损害。因此rBPI21存在着广阔的应用前景，最有希望成为特异性中和LPS的药物[Levy O.Expert.Opin.Investig.Drugs，2002，11(2)：159～167；Lin Y，et al.Antimicrob.Agents Chemother.，1996，40(1)：65～69]。但是rBPI21易于被肝脏降解或从肾脏排泄，生物半衰期不足1小时，存在生产成本高、绝对用量大、难以广泛应用于临床等问题[Levin M，et al.Lancet，2000，356：961～967]。
中国专利申请94191894和94194835涉及杀菌性通透性增强蛋白的功能区的生物活性肽及其应用，其中公开了人杀菌/通透性增强蛋白质(BPI)功能区的氨基酸序列或其亚序列的肽，以及该序列的变异体或其亚序列，它们具有至少一种BPI的生物学活性，如肝素中和、LBS结合/中和或杀菌活性。中国授权专利CN 01104591公开了BPI模拟肽BNEP(Bactericidal/Neutralizing-endotoxin peptide)的变异体及其序列，它们具有LPS中和或杀菌活性。与rBPI21类似，BNEP仍然存在半衰期较短、需要连续给药的问题。
我们在中国公开专利200410028159.0中，选取中国授权专利01104591.4中的BPI模拟肽BNEP9901315：KTKGG WLIQL FHKK作为母体分子(BNEP)，对其碳端(C-terminal)、氮端(N-端)进行化学修饰，并采用多肽固相合成法、液相合成方法以及这两种方法的组合，合成了具有R1-BNEP-X(R3)n通式的一系列多肽衍生物；同时，选取具有穿膜效应(cell penetrating effect)的穿膜肽(CMT)RKKRRQ RRR orYGRKK RRQRRR作为另一活性部位(CMT)，与BNEP共同组成母体，必要时对其C-端、N-端进行化学修饰，得到具有下列通式的系列衍生物：
R1-BNEP-CMT-X(R3)n R1-CMT-BNEP-X(R3)n
R1-BNEP-Z-CMT-X(R3)n R1-CMT-Z-BNEP-X(R3)n
体外试验表明，许多这些变构肽的抗菌/中和LPS活性增强。这是BPI类型多肽的全新改造方式，但是半衰期仍然不长。
大量文献报道，解决半衰期较短、需要连续给药问题的方法，最常见的是剂型改造和分子结构修饰或改造。一般而言，药学上的方法是先进行分子结构修饰或改造，如有必要再利用剂型改造进一步延长半衰期并增强生物活性。分子结构修饰或改造，常见的有化学、生物和基因修饰等方法，其中化学修饰应用最为广泛。在使用的众多修饰剂中，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、葡聚糖、聚蔗糖、聚氨基酸、聚酸酐等应用最为普遍，最为成功的是PEG修饰技术，迄今已有6个采用该项技术的蛋白药物获得美国FDA批准进入市场，另有20多个药物正在进行临床研究[孙汉栋，等.儿科药学杂志，2004，10(4)：7～10]。PEG具有优异的生物相容性，在体内能溶于组织液中，能被机体迅速排除体外而不产生任何毒副作用，是一种安全无毒的聚合物，得到了美国食品与药物管理局(FDA)的认可。此外，PEG具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)等有机溶剂，有利于修饰反应的进行和产物的分离纯化。更难得的是，PEG通过共价联结至多肽分子上进行化学修饰，即聚乙二醇化(PEGylation)，不仅它的许多优良性质随之转移到结合物中，而且可改变多肽分子某些生物化学特性，包括分子大小、疏水性及电荷等，增加多肽分子水溶性和稳定性。已有大量事实证明，PEG化蛋白既能保留天然蛋白质的生物学活性，也能有效地克服蛋白质类药物在临床应用中的一些缺点，如可以延长血浆半衰期、增强生物利用度、提高药物疗效及安全性等[王良友，刘克良.有机化学，2003，23(11)：1320～1323；Roberts MJ，et al.Adv.Drug Deliv.Rev.，2002，54：459～476；Veronese FM.Biomaterial，2001，22：405～417]。利用PEG化技术来进行蛋白药物的二次开发正成为新药开发的热点。
本发明仍然选取中国授权专利01104591.4中的BNEP9901315作为母体分子(BNEP)，对其碳端进行PEG修饰，合成了一类BNEP的amPEG偶联物；通过多浓度鲎试验、生物传感器亲和力试验、细胞因子刺激试验、体外抗菌试验，获得了具有较理想中和内毒素活性的BNEP多肽的amPEG偶联物，显示了进一步开发成为新型中和内毒素药物的潜力。
技术内容
本发明的目的之一在于提供一类治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒性休克等疾病或症状的高分子修饰的多肽分子(见下)。
本发明的另一个目的在于提供合成上述多肽BNEP的amPEG偶联物分子及其氮端衍生物的方法。
本发明的再一个目的在于提供上述多肽BNEP的amPEG偶联物分子及其氮端衍生物的医学用途。
本发明选取中国授权专利01104591.4设计的BNEP 9901315：KTKGG WLIQLFHKK作为母体分子(BNEP)，对其碳端进行amPEG修饰，并采用多肽固相合成法、多肽液相合成法以及这两种方法的组合，合成具有下列通式的amPEG修饰的母体分子及其衍生物：
Y-BNEP-Z-amPEG
其中，Y是氢或其它修饰基团，包括但不限于酰基、C1-C18烷基、芳基苄基、烯丙基；Z是各种连接基，包括但不限于-NH(CH2)nCO-(n＝1-8)、-NH(CH2)nX(n＝1-10，X＝O，S，NH，etc)，也可以没有连接基；amPEG的分子量包括但不限于2000，4000，6000，12000和20000。
采用多肽可溶性聚合物液相合成法，逐步偶联合成得到全保护的
-Z-amPEG后(逐步合成法)，又采用固相合成法得到全保护的BNEP肽树脂，去除碳端树脂、与预先合成的Z-amPEG液相偶联(片段合成法)，又得到了纯度更高的
-Z-amPEG，裂解后得到目标分子之一BNEP-Z-amPEG。通过类似方法，合成了中国专利申请94191894中的BPI.13(SEQ ID No：15 KSKVG WLIQL FHKK)与amPEG的偶联物BPI-Z-amPEG，作为活性研究的对照物之一。必要时，合成上述分子的氮端衍生物。一般采用高效液相色谱法(HPLC)确定纯度，基质辅助激光解吸释间飞行质谱(MALDI-TOF MS)测定分子量，氨基酸组成测定进一步确定结构。
上述BNEP-Z-amPEG偶联物分子可以表现为多肽的药学上可接受的各种无机酸、有机酸的盐类，诸如三氟醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐和氨基酸盐等。
再一方面，本发明涉及联合制剂，该联合制剂包括一种中和内毒素功能多肽的amPEG偶联物，或其药物学上可接受的盐，和一种在药物学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的BNEP-amPEG偶联物的制备方法
1、母体肽树脂Fmoc-
-CTC合成通法
称取适量Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂或其它多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂(DCM，DMF，or DCM/DMF)溶胀，以10％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，检测后抽滤至干，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。称取本发明的抗菌/中和内毒素变构肽BNEP的氨基酸序列C端第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH于适宜的容器中，加入适量DMF溶解，然后加入偶联剂(如TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt，DIC/HOBt，DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，etc)和适量氮甲基吗啉或二异丙基乙胺的DMF溶液。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。按照常规多肽固相化学合成方法(必要时有所改变)，依照本发明的BNEP的氨基酸序列进行后续偶联，如此循环完成整个BNEP肽链的合成，得到母体肽树脂Fmoc-
-CTC；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，从合成柱中取出合成的肽树脂，置冻干机中冻干，备用。
2、氮端衍生物Y-
-CTC制备
氮端衍生物最常见的是酰基化分子。酰基化试剂很多，最常见的试剂组合有：(RCO)2O/pyridine；RCO2H/activating reagent(激活剂)。常见的激活剂有：DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt，DIC/HOBt，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，DIC/HOSu，PyBOP/HOSu。
将Fmoc-
-CTC母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干，加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合成的BNEP肽衍生物树脂，置冻干机中冻干，得Y-
-CTC。
3、BNEP-amPEG分子的合成
BNEP-amPEG的合成，主要采用了2种方法：从自制amPEG开始的逐步合成法；固相合成Fmoc-
-CTC全保护肽，除去CTC树脂后得到侧链保护羧基游离的Fmoc-
-OH，然后于溶液中与amPEG偶联的片段合成法。
3.1逐步合成法
本发明的逐步合成法基本上和常规的液相合成法相似，但采用了可溶于DCM但在Et2O中不溶的高分子树脂amPEG，因此具有液相合成法的省料和高分子树脂的方便。
3.1.1全保护
-amPEG制备通法
脱除Fmoc圆底烧瓶中加入设计量的Fmoc-AAn....AA1-amPEG(n＝1，2，3...14)，适量15-50％六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min。旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，DCM-EtOH/Et2O重结晶两次，P2O5真空干燥得去Fmoc保护的AAn....AA1-amPEG(n＝1，2，3...13)。
偶联圆底烧瓶中加入设计量的AAn....AA1-amPEG(n＝1，2...13)，2倍量的保护氨基酸Fmoc-AAx-OH(x＝2，3...14)，0.02倍量的催化剂DMAP和适量DCM，溶解后加入计算量的DIC。20-40℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程。反应毕，停止反应。旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，无水乙醚洗涤3次，DCM/Et2O或DCM-EtOH/Et2O重结晶2次，茚三酮监测(应与空白颜色相同或相似)，P2O5真空干燥得全保护的肽树脂Fmoc-AAn....AA1-amPEG(n＝2，3...14)，称重计算收率。重复(必要时适当改变)上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护Fmoc-
-amPEG，称重计算收率。
3.1.2BNEP-amPEG制备
A.Fmoc-BNEP-amPEG制备全保护Fmoc--amPEG 1g，冰冷下加入10mL裂解试剂(TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v))，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得侧链无保护Fmoc-BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品。氨基酸组成分析等方法确证结构。
B.BNEP-amPEG制备将1g全保护Fmoc-
-amPEG除去Fmoc保护基后，按上述A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得全去保护的BNEP-amPEG粗品。该粗品以适量水溶解，乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品。HPLC纯化，冻干，得纯品。氨基酸组成分析等方法确证结构。
3.2片段合成法
A.脱除树脂计算量母体肽树脂Fmoc--CTC，加入适量三氟乙醇裂解试剂，r.t反应60-120min，过滤，适量DCM、THF洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出。加入适量H2O，析出大量白色固体，加入适量THF溶解固体，加饱和食盐水溶液，分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护Fmoc-
-OH。
B.偶联amPEG全保护Fmoc-
-OH加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入4-6倍HOBt，冰水冷却下加入4-8倍DIC。搅拌，加入含有1-4倍自制amPEG的DMF溶液。撤除水浴，室温搅拌18h后，置于25-40℃油浴搅拌反应。TLC跟踪反应进程。反应结束，转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et2O，搅拌，静置。抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥，得到全保护Fmoc-
-amPEG。
C.除去Fmoc全保护Fmoc-
-amPEG，加入piperidine的DMF溶液，25-40℃油浴搅拌反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et2O，搅拌，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物，加入适量EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥，得到侧链全保护的
-amPEG。
D.裂解去保护侧链全保护-amPEG，冰冷下加入裂解试剂(TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，)，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品。
本发明设计的BNEP-Z-amPEG多肽的生物活性研究
本发明还通过测定BNEP-Z-amPEG多肽对部分人源病菌的体外杀菌活性、多浓度鲎试验、生物传感器亲和力试验、细胞因子刺激试验，研究其用于G-细菌感染、人内毒素血症治疗防治的可能性，以便探索既能杀菌又能中和内毒素的新药物。
体外抗菌试验表明，本发明的BNEP-Z-amPEG多肽在体外对金葡ATCC 25923、金葡318MRS、金葡464、金葡465、表葡370、表葡372、大肠ATCC 25922、大肠249、大肠339、大肠355、绿脓ATCC 27853、绿脓328、绿脓451、绿脓460、肺克353、肺克452、肺克461和肺克468等细菌均有不同程度的抑菌活性；以相同重量给药时，多数情况下经amPEG修饰的BNEP、BPI较未经修饰的BNEP抑菌活性要强；BNEP-amPEG-041108、BPI-amPEG-041108抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304；BNEP-amPEG-041108(逐步合成产品)抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304(片段合成产品)。如果按照等摩尔量给药，修饰肽的抑菌活性显然要比未经修饰的BNEP抑菌活性强得多。
多浓度鲎试验结果结合统计学分析证实，BNEP-amPEG-050304(2#)，BNEP-amPEG-041108(3#)在各浓度水平均有不同程度的内毒素中和活性，而BNEP-031112(1#)对内毒素不具有中和作用。
多肽样品与LPS的亲和力测定显示，amPEG修饰的多肽与LPS亲和力最强者为BNEP-amPEG-050304，最弱者为amPEG；亲和力高低依次为BNEP-amPEG-050304＞BNEP-031112＞BNEP-amPEG-041108＞BPI-amPEG-041108＞amPEG。
通过初步体外拮抗内毒素活性测定，发现该衍生物在体外对内毒素诱导的小鼠RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)具有很强的抑制作用；更为重要的是，初步的体内活性测试显示，体内半衰期较BNEP更长、中和内毒素活性较BNEP更强。
上述结果表明，采用片段合成法得到的修饰肽BNEP-amPEG-050304，有望开发为新型中和内毒素的药物。
附图说明
图1-1、本发明的BNEP-031112的MALDI-TOF MS图谱(粗肽)
图1-2、本发明的BNEP-031112的MALDI-TOF MS图谱(精肽)
图2-1、本发明的BNEP-amPEG-050304的MALDI-TOF MS图谱
图2-2、本发明的BNEP-amPEG-050304的氨基酸组成分析图谱
图3-1、本发明的BNEP-amPEG-041108的MALDI-TOF MS图谱
图3-2、本发明的BNEP-amPEG-041108的氨基酸组成分析图谱
图4-1、LPS O55：B5在疏水样品池中的包被曲线
图4-2、多肽样品与LPS的亲和力检测
具体实施方式
下面是本发明的具体实施例，所述的优选实施例是用于描述本发明而不是限制本发明。
实施例1
本实施例涉及Fmoc-
-CTC的固相手工合成以及BNEP-amPEG-050304的液相合成，用以说明本发明的BNEP-amPEG的片段合成法。下述操作仅仅是为了说明，而不是限制本发明。
1.1Fmoc-
-CTC肽树脂的合成
称取6.370g(2mmol，Sub 0.314mmol/g)Fmoc-Lys(Boc)-CTC Resin倒入合成柱中，加入55mL DCM-DMF(1∶2，v/v)溶胀。30min后抽出溶剂，以35mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，15min后用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶(piperidine)。称取3.750g Fmoc-Lys(Boc)--OH于100mL锥形瓶中，加入10mL DMF溶解，加入19mL DIC、1.183g HOBt和55mL 25％二异丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮检测反应过程。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。按照类似的方法，投入后续Fmoc保护的氨基酸、DIC及HOBt(见表1)，进行后续偶联，如此循环完成整个肽链的合成，得到Fmoc-
-CTC肽树脂9.673g；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，从合成柱中取出树脂，置冻干机中冻干，备用。
表1.1固相手工合成Fmoc-
-CTC
| Fmoc-AA-OH | AA投料比 | Fmoc-AA/g | DIC(1.5)/mL | HOBt(1.1)/g | ||||
| 理论量 | 实际量 | 理论量 | 实际量 | 理论量 | 实际量 | |||
| 1 | F-Lys(Boc)-OH | 4 | 3.748 | 3.750 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.183 |
| 2 | F-His(Trt)-OH | 4 | 4.958 | 4.957 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.185 |
| 3 | F-Phe-OH | 4 | 3.099 | 3.095 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.188 |
| 4 | F-Leu-OH | 4 | 2.828 | 2.285 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.183 |
| 5 | F-Gln(Trt)-OH | 4 | 4.886 | 4.885 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.188 |
| 6 | F-Ile-OH | 4 | 2.828 | 2.827 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.183 |
| 7 | F-Leu-OH | 4 | 2.828 | 2.824 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.195 |
| 8 | F-Trp(Boc)-OH | 4 | 4.213 | 4.217 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.187 |
| 9 | F-Gly-OH | 4 | 2.378 | 2.377 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.180 |
| 10 | F-Gly-OH | 4 | 2.378 | 2.375 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.193 |
| 11 | F-Lys(Boc)-OH | 4 | 3.748 | 3.751 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.183 |
| 12 | F-Thr(tBu)-OH | 4 | 3.180 | 3.187 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.187 |
| 13 | F-Lys(Boc)-OH | 4 | 3.748 | 3.752 | 1.9 | 1.9 | 1.189 | 1.185 |
取出0.5gFmoc-
-CTC肽树脂，加入2mL DCM溶胀，30min后抽干，加入5mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除肽树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶，冻干。常规裂解[裂解剂(Reagent R)：TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，15mL；室温，3h]，无水乙醚多次沉降得粗肽，粗肽纯度87.53％，MALDI-TOF MS 1684.055；证明母体合成成功。见附图1-1，1-2。
1.2BNEP-amPEG的合成
称取7.980g Fmoc-
-CTC肽树脂，置于250mL的圆底烧瓶中，加入按投料表(见表2)配制好的裂解液70mL，r.t反应90min，过滤树脂，DCM(3×80mL)、THF(2×60mL)洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出。加入80mLH2O，析出大量白色固体，加入220mLTHF，固体溶解，加饱和食盐水溶液，分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥。最终得Fmoc-
-OH(碳端羧基游离、氮端及侧链全保护)5.467g，收率92.77％。
表1.2Fmoc-
-CTC的三氟乙醇(TFE)裂解投料表
| 树脂 | 裂解试剂(2∶2∶6，v/v/v) | ||
| TFE | AcOH | DCM | |
| 7.980g | 14mL | 14mL | 42mL |
Fmoc-
-OH 2.066g(0.7010mmol)，加入DMF 30mL、THF 20mL，搅拌，得无色透明溶液；加入HOBt 380mg(4×0.701mmol)，搅拌，冰水冷却下加入DIC 0.5mL(4×0.701mmol)。10min后，加入4.184g自制amPEG的DMF溶液30mL。撤除水浴，室温搅拌18h后，置于35℃油浴搅拌反应。TLC跟踪反应进程。反应结束，转入1000mL圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入500mL Et2O，搅拌30min，静置1h。抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物，加入50mL DCM、20mL EtOH，搅拌全溶后加入冷冻Et2O 800mL，搅拌20min，抽滤，无水Et2O洗涤(3×100mL)，真空干燥，得到全保护Fmoc-
-amPEG 5.208g。
全保护Fmoc-
-amPEG 5.208g，加入DMF60mL、piperidine 26mL，35℃油浴搅拌反应，1h后转入1000mL圆底烧瓶，加入冷冻的800mL Et2O，搅拌30min，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物，加入50mL EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O800mL，搅拌40min，抽滤，无水Et2O洗涤(4×100mL)，真空干燥，得到侧链全保护的
-amPEG 4.853g。
实施例2
本实施例涉及本发明的BNEP-amPEG-041108的液相逐步合成。下述操作仅仅是为了说明，而不是限制本发明。
2.1方法研究
2.1.1Fmoc-Lys(Boc)-amPEG(简称F-
-amPEG)制备
2倍氨基酸投料
A法：100mL圆底烧瓶中加入1g(0.2mmol)amPEG-5000，184mg(0.4mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，DCM溶解，冰盐浴冷却，滴加1滴DIC，18℃室温搅拌。反应过夜。TLC检测，停止反应。
旋蒸浓缩至粘稠，加入无水乙醚100mL，慢慢析出黄白色蜡状固体，抽滤，收集滤饼。硅胶柱层析，流动相先丙酮后甲醇。收集Rf＝0.1的产物(n-Bu-OH/HOAc/H2O4∶1∶1，V/V；简称sysA)组分，减压浓缩，加入无水乙醚，析出较好晶型的产品，抽滤干燥后得浅黄色与白色固体共407mg，收率37.7％。茚三酮检查，几无色变。替代度检测，黄色样品sub＝0.189mmol/g，白色样品sub＝0.241mmol/g。
B法：100mL圆底烧瓶中加入4.43g(0.9mmol)amPEG-5000，843mg(1.8mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，22mg(0.18mmol)DMAP，40mL DCM溶解，冰盐浴冷却，滴加0.6mL(3.6mmol)DIC，28℃搅拌。TLC显示不再有明显变化，停止反应。
向反应瓶中加入200mL乙醚，电磁搅拌，沉降完全后静置30min，抽滤，得白色固体。以30mL DCM溶解上述白色固体，加入2.5mL乙醇后得透明溶液，搅拌下加入250mL乙醚，沉降完全后冷藏30min，抽滤，乙醚洗3次，真空干燥，得白色固体4.391g，收率90.6％。
5倍氨基酸投料
2g(0.4mmol)amPEG，0.937g(2mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，少量DMAP，加入25mLDCM溶解，冰浴下加入DIC后渐渐固化，补加20mL DCM至全溶，撤除冰浴，21℃搅拌15min后，30℃恒温搅拌。反应过夜，TLC不再有明显变化，停止反应。抽滤除去反应液中不溶物，旋蒸滤液至粘稠，加少量DCM便固化聚集在瓶底，瓶于热水中放置，补加少量DCM，清亮后加入乙醚，至混浊出现为止。室温(18℃)冷却，析出白色与浅黄色的大粒状沉淀，TLC显示Rf＝0(EtOAc，简称sys C)，0.15(sys A)。抽滤，DCM/乙醚重结晶，得略带浅黄色白色固体。再重结晶1次，抽滤干燥后得白色固体2.087g，收率95.7％。
3倍氨基酸投料
5g(1mmol)amPEG5000，1.406g(3mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，36mg(0.3mmol)DMAP于圆底烧瓶中，加入40mL DCM，搅拌下滴加0.5mL(3mmol)DIC，恒温30℃搅拌过夜。反应液旋蒸至粘稠，补加少量DCM，加入适量无水乙醚，置冰箱放置，待沉淀完全后抽滤，干燥，得白色粉末状物品5.622g。DCM-EtOH/乙醚重结晶2次，抽滤干燥后得白色固体5.310g，收率97.4％。
F--amPEG的DBLK反应
于50mL圆底烧瓶中加入407mg(0.075mmol)F-K-amPEG，10mL DCM溶解后加入4mL六氢吡啶，30℃振荡50min。加入适量无水乙醚，析出沉淀，静置，抽滤，无水乙醚洗涤。取样，DCM溶解，点样，紫外灯下TLC板斑点显色非常微弱；茚三酮检查，深蓝色。得白色片状固体
-amPEG 268mg，收率68.7％。
2.1.2F-
-amPEG制备
TBTU/2eq投料法
268mg(0.049mmol)
-amPEG于100mL圆底烧瓶中，加入10mL DCM，溶解后加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(50mg，0.1mmol)，TBTU(39mg，0.12mmol)，HOBt(16mg，0.12mmol)，30℃室温搅拌(14∶00)过夜。旋蒸反应液至粘稠，加入少量DCM溶解瓶壁粘稠物后，加入适量的无水乙醚，瓶底析出浅褐色粉末固体，收集干燥得F-
-amPEG76mg，收率27.3％。送测替代度有Fmoc吸收，1H-NMR图谱确证。
DIC/5eq投料法
2.004g(0.368mmol)
-amPEG，1g(2mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，48mg(0.4mmol)DMAP，30mL DCM溶解；加入0.5mL(3mmol)DIC，20℃搅拌，反应过夜，次日停止反应。滤去不溶物，TLC分析有残余的原料点，拌样柱层析分离，EtOAc洗脱，除去大部分杂质(TLC板中上部斑点)，EtOAc/CH3OH＝2∶1(v/v)洗脱其余杂质，最后以CH3OH-DCM直接浸泡，抽滤，滤液旋蒸浓缩，加Et2O析出，收集，干燥后得固体F-
-amPEG 775mg，收率68.2％。
DIC/2eq投料法
5.6g(1.028mmol)F-
-amPEG于圆底烧底中，加入25％Piperidine/DCM 40mL，室温搅拌30min，沉降抽滤，DCM/Et2O重结晶两次，干燥后得3.990g(0.732mmol)H2N-
-amPEG。加入0.656g(1.4mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、17mg(0.14mmol)DMAP、55mL DCM、0.25mL(1.4mmol)DIC，30℃油浴中搅拌反应。次日停止，无水乙醚析出沉淀后，CH2Cl2/Et2O重结晶两次，干燥得浅黄色粉末状固体F-
-amPEG 3.877g，收率96.9％。
2.2全保护-amPEG制备通法
DBLK反应于圆底烧瓶中加入0.4mmol-1.2mmol F-AAn....AA1-amPEG(n＝2，3...13)，适量(25mL-60mL)15-40％六氢吡啶的二氯甲烷溶液，室温搅拌30-60分钟。旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，DCM-EtOH/Et2O重结晶两次，P2O5真空干燥得去Fmoc保护的AAn....AA1-amPEG(n＝2，3...13)。
Coupling向上圆底烧瓶中加入设计量的AAn....AA1-amPEG(n＝1，2...13)，2倍量的保护氨基酸F-AAx-OH(x＝2，3...14)，0.02倍量的催化剂DMAP和适量DCM，溶解后加入计算量的DIC。30℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程。反应毕，停止反应。旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，无水乙醚洗涤3次，DCM/Et2O或DCM-EtOH/Et2O重结晶两次，茚三酮监测(应与空白颜色相同或相似)，P2O5真空干燥得全保护的肽树脂F-AAn....AA1-amPEG(n＝2，3...14)或全保护Fmoc-
-amPEG，称重计算收率。
实验结果及条件见Table2.1，Table2.2，Table2.3，Table2.4，Table2.5。
Table2.1 Preparative conditions and results of F-K-amPEG
| No | method | amPEG | F-Lys(Boc)-OH | temp(℃) | time(h) | weight(mg) | yield(％) | ||
| w(g) | n(mmol) | w(mg) | n(mmol) | ||||||
| 1 | DIC | 1.0 | 0.2 | 184 | 0.4 | 18 | 20 | 407 | 37.3 |
| 2 | DIC/DMAP | 4.43 | 0.9 | 843 | 1.8 | 28 | 14 | 4391 | 90.6 |
| 3 | DIC/DMAP | 2.0 | 0.4 | 937 | 2.0 | 30 | 17 | 2087 | 95.7 |
| 4 | DIC/DMAP | 5.0 | 1.0 | 1406 | 3.0 | 30 | 17 | 5310 | 97.4 |
| 5 | DIC | 1.0 | 0.2 | 75 | 0.16 | 18 | 20 | 209 | 24.0 |
| 6 | DIC/DMAP | 5.0 | 1.0 | 703 | 1.5 | 28 | 62.5 | 4500 | 85.7 |
Table2.2 Preparative conditions and results of F-
-amPEG
*为去Fmoc的K-amPEG
Table2.3 preparative conditions and results of F--amPEG
Table2.4 preparative conditions and results of F-AAn...AA1-amPEG(2倍投料)
| No | AAx | F-AAn...AA1-amPEG | F-AAx-OH | temp(℃) | time(h) | weight(g) | yield(％) | ||
| w(mg) | n(mmol) | w(mg) | n(mmol) | ||||||
| 4 | Phe | 4300 | 0.710 | 551 | 1.42 | 30 | 58 | 4397 | 99.8 |
| 5 | Leu | 4367 | 0.704 | 497 | 1.41 | 30 | 18 | 4330 | 97.4 |
| 6 | Gln(Trt) | 4305 | 0.682 | 832 | 1.36 | 29 | 33 | 4398 | 96.5 |
| 7 | Ile | 4353 | 0.651 | 455 | 1.31 | 30 | 39.5 | 4403 | 99.5 |
| 8 | Leu | 4363 | 0.642 | 478 | 1.39 | 28 | 42.5 | 4182 | 94.3 |
| 9 | Trp(Boc) | 4152 | 0.600 | 647 | 1.20 | 30 | 59.5 | 4218 | 97.6 |
| 10 | Gly | 4199 | 0.582 | 369 | 1.18 | 30 | 43 | 4177 | 98.9 |
| 11 | Gly | 4127 | 0.587 | 370 | 1.15 | 30 | 40.5 | 4166 | 99.9 |
| 12 | Lys(Boc) | 3418 | 0.467 | 527 | 1.13 | 30 | 42 | 3438 | 97.5 |
| 13 | Thr(tBu) | 3406 | 0.451 | 370 | 0.91 | 30 | 58 | 3473 | 99.9 |
| 14 | Lys(Boc) | 3466 | 0.459 | 432 | 0.90 | 30 | 59.5 | 3508 | 98.3 |
Table2.5 preparative conditions and results of F-AAn...AA1-amPEG(1.5倍投料)
| No | AAx | F-AAn...AA1-amPEG | F-AAx-OH | temp(℃) | time(h) | weight(g) | yield(％) | ||
| w(mg) | n(mmol) | w(mg) | n(mmol) | ||||||
| 4 | Phe | 4400 | 0.726 | 422 | 1.09 | 30 | 21 | 4299 | 95.4 |
| 5 | Leu | 4300 | 0.700 | 371 | 1.05 | 30 | 27 | 4372 | 98.9 |
| 6 | Gln(Trt) | 4372 | 0.692 | 638 | 1.04 | 30 | 24.5 | 4479 | 96.8 |
| 7 | Ile | 4479 | 0.670 | 374 | 1.00 | 29 | 59.5 | 4549 | 99.9 |
| 8 | Leu | 4549 | 0.670 | 389 | 1.02 | 30 | 44 | 4529 | 95.0 |
| 9 | Trp(Boc) | 4300* | 0.642 | 507 | 0.96 | 30 | 39 | 4574 | 98.9 |
| 10 | Gly | 4490* | 0.800 | 357 | 1.20 | 29 | 40 | 4428 | 95.0 |
| 11 | Gly | 4584* | 0.651 | 290 | 0.98 | 30 | 40 | 4314 | 90.5 |
| 12 | Lys(Boc) | 4314 | 0.624 | 439 | 0.94 | 30 | 41 | 4472 | 99.9 |
| 13 | Thr(tBu) | 4300 | 0.587 | 350 | 0.88 | 29 | 64 | 4442 | 97.8 |
| 14 | Lys(Boc) | 4523 | 0.600 | 422 | 0.90 | 30 | 46 | 4720 | 99.2 |
*为去Fmoc的AAn...AA1-amPEG
2.3BNEP-amPEG制备
A.侧链无保护F-BNEP-amPEG制备全保护Fmoc-
-amPEG 1g，冰冷下加入10mL裂解试剂(TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v))，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得侧链无保护F-BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品465mg，40.45％。结构确证(氨基酸组成分析，等)
B.全去保护BNEP-amPEG制备将1g全保护Fmoc-
-amPEG按照2.2除去Fmoc保护基的方法脱除Fmoc，然后按上述A法裂解去侧链保护基，沉降、离心、重结晶后得全去保护的BNEP-amPEG-041108粗品。该粗品以适量水溶解，乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品。HPLC纯化，冻干，得纯品450mg，收率39.0％。MALDI-TOF图谱见附图3-1、氨基酸组成分析图谱见附图3-2.
实施例3
本实施例涉及氨基酸组成分析。下述操作仅仅是为了说明，而不是限制本发明。
3.1、AccQ-Tag方法测定氨基酸原理
本法使用衍生剂为6-氨基喹啉N-(羟基琥珀酰亚胺基)氨基甲酸酯(AQC)，在pH8～10的条件下，可与各种氨基酸定量反应生成单一产物。反应如下：
该衍生物有很强的紫外吸收，可以用紫外检测器检测λmax＝248nm。
3.2、仪器与试剂
3.2.1.仪器
DIONEX公司-HPLC系统：P680系列四元泵、紫外/可见检测器、四元脱气装置、柱温箱、手动/自动进样器、氨基酸分析柱、CHROMELEON色谱工作站。
3.2.2.辅助品
微量内衬管小瓶、15mL水解管、pH计、恒温箱、溶剂过滤器、样品过滤器、微量注射器或可变量程微量移液器(10～100μL)。
3.2.3.化学试剂及配制
氨基酸标样(2.5μmol/mL)；
氨基酸衍生试剂AQC；
EDTA-2Na溶液：称取100mgEDTA-2Na溶解于100mL纯水中；
稀磷酸溶液：磷酸∶水＝1∶1；
流动相A：称取NaAc·3H2O19.04g溶解于1000mL纯水中，用1∶1的稀磷酸溶液调节pH到约5.2，加1mL EDTA-2Na溶液，精确加入三乙胺2.37mL，边加边搅拌。用稀磷酸溶液调pH＝4.95，用0.45μm滤膜过滤，备用。使用之前超声波脱气20min。
流动相B：乙腈/水＝3∶2，混匀。使用之前超声波脱气20min。
3.3、实验步骤
3.3.1.衍生试剂准备：AccQ-Tag Fluor Reagent Kit(试剂盒)，临用前，吸1mL乙腈移入2A#瓶中，盖紧盖子，摇10秒，55℃恒温箱加热使粉末完全溶解。
3.3.2.氨基酸标样与样品的衍生
3..3.2.1氨基酸标样的衍生
取氨基酸标样储备液(2.5μmol/mL)，临用时用水(1∶10)稀释成氨基酸标样工作液100pmol/μL，用微量注射器精确吸取10μL工作液，加入微量内衬管小瓶底部，用另一支微量注射器精确吸取pH8.8的硼酸盐缓冲液70μL，加入小瓶中，在漩涡振荡器上混合后，再用一支微量注射器精确吸取AQC溶液20μL，将小瓶放在漩涡混合器上边振荡混合边加入AQC溶液。用封口胶带将瓶口封好，放到55℃恒温箱内保温5～10min，取出放置至室温。
3.3.2.2样品的衍生
多肽样品5～10mg，加入1mL 6M HCl，110℃加热20h。减压蒸干后，加入1mL20mM HCl，过滤。取滤液0.1mL，加入到1mL 20mM HCl溶液中，混匀。取该液40μL，加入硼酸盐缓冲液210μL，摇匀，50μL AQC边加边搅拌，然后于55℃水浴中放置5～10min，取出待用。
3.3.3氨基酸组分的分析
分别取衍生后的氨基酸标样和样品20μL注入液相色谱仪，按下表中的色谱条件，在248nm波长下检测。并以外标法计算样品中各氨基酸组分数。
| Time(min) | 0 | 15 | 16 | 21 | 29 | 34 | 39 | 44 | 45 | 55 |
| Flow(mL/min) | 1.0 | 1.2 | 1.0 | 1.0 | 0.8 | 0.7 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| B％ | 0 | 0 | 10 | 15 | 28 | 33 | 100 | 100 | 0 | 0 |
3.4实验结果
将合成的样品BNEP-amPEG-041108(2当量投料，液相逐步合成法)，BNEP-amPEG-050304(液相片段合成法)，BPI-amPEG-041108(2当量投料，液相逐步合成法)，分别称取10mg左右，按上述方法水解、衍生，测定。所得氨基酸组成分析结果表明，没有缺损氨基酸，氨基酸比例合理，不过片段法合成结果更好。(见附图2-2，附图3-2)。
实施例4
本实施例涉及本发明的BNEP-amPEG对部分人源病菌的抑制试验。
1.实验菌株
实验所用菌株均为2004年6月～2004年8月第三军医大学西南医院临床分离致病菌，由西南医院检验科分离并鉴定。其中金黄色葡萄球菌4株、铜绿假单胞菌4株、表皮葡葡球菌2株、大肠埃希菌4株、肺炎克雷伯菌4株，共计18株。用标准菌大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853作质控菌。
2.培养基和试剂
Mueller-Hinton(MH)培养基(液体、固体)，中国药品生物制品检定所产品(批号010925)；磷酸盐缓冲液(PBS)：磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水1000mL，用0.1N NaOH调pH为6.0。
3.仪器
多点接种仪(日本仓光株式会社生产) 电子天平(Sartorius，德国)
pH计(Beckman 21，USA) 可调移液器(eppendorf，USA)
4.实验方法
4.1供试液制备
精密称取1-10号待测多肽样品于2mL容量瓶中，分别用pH6.0磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成主药含量为3840mg/L储备液。
4.2试验菌液制备
实验前，从保存菌种的半固体培养基(或斜面)上取适量的菌苔，接种在MH培养基上，于37℃培养16～18h，再挑取新鲜的单个菌落接种在MH肉汤培养基中，于37℃增菌培养16～18h，取出，每管菌液用MH肉汤培养基分别稀释为0.5麦氏比浊标准(含菌量107-8CFU/mL)，保持菌液最终接种量为每点104-5CFU。
4.3最低抑菌浓度(MIC)测定
采用琼脂二倍稀释法，将药物含量为3840mg/L的储备液用pH6.0 PBS倍比稀释成系列浓度，分别取1mL放入直径90mm的平皿中，加入14mL熔化的MH琼脂培养基，混匀，即得主药含量分别为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125mg/L的系列琼脂平皿，待琼脂凝固后，用多点接种仪在含药琼脂平皿及空白琼脂平皿表面点种细菌，37℃孵育24h观察结果，未见细菌生长的平皿内的最小药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。实验结果见下表。
Table4.1 amPEG修饰的BNEP对部分人源病菌的抑制试验(MIC：mg/L)
| BNEP-031112 | amPEG | BNEP-amPEG-041108 | BNEP-amPEG-050304 | BPI-amPEG-041108 | |
| 金葡ATCC 25923 | 128 | ＞256 | 64 | 32 | 32 |
| 金葡318MRS | 256 | ＞256 | 128 | 64 | 128 |
| 金葡464 | 128 | ＞256 | 32 | 16 | 32 |
| 金葡465 | 128 | ＞256 | 64 | 32 | 32 |
| 表葡370 | 64 | ＞256 | 64 | 16 | 32 |
| 表葡372 | 64 | ＞256 | 32 | 4 | 16 |
| 大肠ATCC 25922 | 128 | ＞256 | 256 | 128 | 128 |
| 大肠249 | 128 | ＞256 | 256 | 128 | 128 |
| 大肠339 | 256 | ＞256 | 128 | 64 | 128 |
| 大肠355 | 128 | ＞256 | 128 | 32 | 64 |
| 绿脓ATCC 27853 | 256 | ＞256 | 256 | 128 | 256 |
| 绿脓耐药328 | 256 | ＞256 | 256 | 128 | 128 |
| 绿脓451 | 128 | ＞256 | 64 | 16 | 32 |
| 绿脓460 | 256 | ＞256 | 256 | 64 | 64 |
| 肺克353 | 256 | ＞256 | 128 | 64 | 64 |
| 肺克452 | 256 | ＞256 | 256 | 128 | 128 |
| 肺克461 | 256 | ＞256 | 128 | 32 | 64 |
| 肺克468 | 256 | ＞256 | 256 | 128 | 128 |
实验结果表明，以相同重量给药时，多数情况下经amPEG修饰的BNEP、BPI较未经修饰的BNEP抑菌活性要强；BNEP-amPEG-041108、BPI-amPEG-041108抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304；BNEP-amPEG-041108(逐步合成产品)抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304(片段合成产品)。如果按照等摩尔量给药，修饰肽的抑菌活性显然要比未经修饰的BNEP抑菌活性强得多。这是对我们的极大鼓舞。
实施例5
本实施例涉及本发明的BNEP-amPEG进行多浓度鲎试验。
将BNEP-031112(1#)，BNEP-amPEG-050304(2#)，BNEP-amPEG-0411084(3#)分设15、30、60μM 3个终浓度进行鲎试验。每浓度3复管，另设阳性对照3复管和空白对照1管。
1、材料
鲎试剂：湛江安度斯公司生产，批号0310310，灵敏度：0.015EU/ml。
多肽样品：BNEP-031112，BNEP-amPEG-0411084，BNEP-amPEG-05030
内毒素检测专用水，湛江安度斯公司生产，批号0411300。
内毒素标准品E.coli O111：B4，美国Sigma公司，批号69H4157。
EDS99-内毒素定量检测仪，湛江正杰科学仪器有限公司生产。
2、方法
1)每支鲎试剂加入1.25ml的检查用水稀释、混匀；
2)取检测试管，每一试管中加入100μl鲎试剂稀释液；
3)将LPS O111：B4用检查用水稀释为100ng/ml，在旋涡振荡器上持续振荡1h；
4)将多肽样品以检查用水分别稀释为3mM；
5)实验设LPS组和药物处理组，LPS组为1ng/ml的LPS溶液，药物处理组为同终浓度的LPS溶液中分别加入多肽样品。
6)每个辐照EP管中加入200μl检查用水，LPS组仅加入2μl的LPS(100ng/ml)，药物组分别加入1、2、4μl的多肽样品(3mM)，再分别加入2μl的LPS(100ng/ml)，如此观察不同浓度的多肽样品(15、30、60μM)对LPS(1ng/ml)的中和效果；
7)反应体系设阴性对照，为200μl检查用水；
8)取阴性对照、LPS组及药物处理组待检测样品100μl，分别加入各试管中的鲎试剂稀释液中，将检测试管置于EDS-99细菌内毒素测定系统中进行检测；
9)每一浓度的待测样品各做3复管；
10)检测结果以系统设定的单位(EU/ml)表示。
实验结果分析
结合统计学分析，BNEP-amPEG-050304(2#)，BNEP-amPEG-041108(3#)在各浓度水平均有不同程度的内毒素中和活性，而BNEP-031112(1#)对内毒素不具有中和作用。详情见表5.1。
表5.1本发明多肽中和LPS鲎试验结果
注：P为各肽各浓度组与阳性对照组间比较。
实施例6
本实施例涉及本发明的变构肽BNEP、BNEP-amPEG细胞因子刺激试验。众所周知，细胞受到内毒素LPS攻击时，会主动应激发生炎症反应，产生一系列炎症因子如肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6，IL-8等。TNF-a的检查，可考察BNEP衍生物多肽对LPS攻击细胞的保护作用。
1.1材料与主要仪器
1.1.1合成肽：送样编号为2(BNEP)、48(BNEP-ampeg-041108)多肽；
1.1.2其它试剂
细胞株：THP-1/CD14细胞株由第一军医大学免疫学教研室提供；
LPS 7261：Sigma公司产品；IMDM培养液：Invitrogen公司产品
TNF-α检测试剂盒：eBioscience公司产品；
多粘菌素B(polymyxin B sulfate，PB)：购自深圳晶美公司；
1.1.3主要仪器
恒温孵育箱：Thermo Forma Model 3111 电子天平：Sartorius BP61
96孔细胞培养板：Falcon 移液枪：GILSON
酶联免疫测定仪(ELISA A450值测定仪)：BIO-RAD Model 550
倒置显微镜：COIC XDS-1(重庆光学仪器厂)
1.2实验方法
1.2.1细胞试验：培养RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/ml，取0.25ml于96孔板内，置37℃、5％CO2培养箱培养2h；实验分对照组(Medium)和药物处理组，对照组不加任何试剂，药物处理组每孔加入多肽样品(终浓度为15、30、60μM)继续培养1h；药物处理组加入LPS(终浓度100费ng/ml)，置37℃，5％CO2培养箱继续培养4h和12h后，取上清分别检测TNF-α和IL-6浓度；每组设3复孔。
1.2.2TNF-α和IL-6的测定(ELISA法)：取出所需的酶标板条，恢复至室温，每孔中加入待测样本100μl，37℃孵育1.5h，洗涤液洗板4次；加入1∶100的生物素抗体工作液100μl，37℃孵育1h，弃去工作液，洗板4次；加入1∶100的酶结合工作液，37℃孵育30min，洗板4次；加入100μl显色液，避光显色15min，加入100μl终止液，立即测定OD450时各孔吸光值。按酶标仪上读取不同浓度的标准品相应的吸光度值，绘制标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程。将测得的不同标本的OD值带入直线回归方程中，即得到相应的细胞因子TNF-α和IL-6的含量。
1.2.3实验结果
合成肽抑制试验结果报告如下.
表6-1多肽样品对LPS诱导RAW264.7细胞活化的影响(n＝3，x±s)
| 组别 | TNF-α(pg/ml) | P值 | IL-6(pg/ml) | P值 |
| Medium组LPS组2# | 88.6±18.33467.6±176.1 | 277.0±1.81516.5±163.4 |
| 15μM30μM60μM0304#15μM30μM60μM1108#15μM30μM60μM | 3171.2±199.33229.3±126.93361.2±138.63386.9±323.81444.4±151.21110.4±75.63590.2±113.73459.1±159.02889.6±1123.8 | 0.190.190.530.770.00020.000060.4540.960.51 | 1469.9±217.21508.7±199.31461.7±156.71259.4±120.1958.3±42.9483.3±117.21451.9±175.41377.2±152.81492.1±156.6 | 0.820.960.740.140.00090.0020.720.430.88 |
实验结果分析
三种多肽对LPS诱导的细胞活化具有不同程度抑制作用，其中以0304#的活性具有量效关系且效果较为稳定，1108#仅在高浓度(60μM)具有抑制作用，而2#尽管具有一定的活性但结果不具有量效关系，其活性有待进一步研究。详情见表6-2。统计学分析结果仅支持0304#肽具有抑制内毒素诱导细胞活化效果。
实施例7
本实施例涉及采用生物传感器检测BNEP-Z-amPEG多肽与LPS的亲和力。
1.材料
含有BNEP的多肽：1#Ac-CMT-Ahx-BNEP-030812；2#BNEP-031112；
3#C17H35CO-BNEP-Ahx-CMT-030728；4#BNEP-Ahx-CMT-030625；
9#Ac-BNEP-Ahx-CMT-030625；11#BNEP-Tat-031222；
0304#BNEP-amPEG-050304；1108#BNEP-amPEG-041108；
PEG#amPEG-71；BPI#BPI-amPEG-041108。
LPS 055：B5，美国Sigma公司；
无热原磷酸缓冲液(PBS)，按照无菌技术称取磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水100ml，用0.1mol/L NaOH调pH为7.0，再经滤器过滤除热原；
生理盐水(NS)，pH7.0，西南医院药理基地生产；
漩涡震荡仪，XW-80A，上海医科大学仪器厂生产；
生物传感器及其疏水样品池，美国Thermo公司；
YJ-875SA型超净工作台，上海复星高科技有限公司。
2.方法
2.1生物传感器疏水样品池LPS的包被
根据Thermo公司疏水样品池的包被流程，将LPS包被在疏水样品池中，并计算包被的LPS量。具体步骤如下：根据包被的要求，仪器包被温度设定为22℃，搅拌速率设定为85次/sec，数据采集设定为2次/sec；放入疏水样品池，异丙醇清洗50μl×5，收集数据曲线1min；PBS/AE清洗60μl×7，采集数据10min；异丙醇清洗50μl×7，采集数据曲线1min；加入2mg/ml的LPS氯仿溶液20μl(用前超声10sec)，留置1min；PBS/AE清洗50μl×7，采集数据5min；1M HCl清洗50μl×5，留置1min；PBS/AE清洗60μl×7，采集数据5min；10mM NaOH清洗50μl×5，留置1min；PBS/AE清洗60μl×7，采集数据5min，计算包被值；5mg/ml BSA 90μl，保留5min；PBS/AE清洗60μl×5，保留1min；检查包被后的共掁图形。
2.2多肽样品与LPS的亲和力测定
用PBS(pH7.0)配制模拟肽进行生物传感器检测。以不同的模拟肽溶液为流动相，分别与疏水样品池中的LPS进行结合、解离、再生反应。具体步骤如下：将模拟肽配制为100μM浓度液；生物传感器搅拌速率设定为98次/sec，数据采集设定为3次/sec，温度设定为25℃；包被LPS的疏水样品池加入50μl的pH6.0、0.02M PBS，冲洗5次，保留至基线平衡后吸出；结合反应：加入PBS 45μl，再加入5μl待测样品，结合反应平衡后吸出待测样品；解离反应：PBS冲洗50μl×3，解离反应平衡后吸出；再生反应：0.1N的HCl 50μl×3，再生反应平衡后吸出；PBS冲洗50μl×3，曲线回至基线后加入45μl PBS，开始新的循环；储存实验数据。
3.结果
3.1生物传感器疏水样品池的包被
LPS O55：B5在疏水样品池中的包被量为183.2arc second(A、B两点间差的绝对值)，为脂类物质在疏水样品池中包被量的理想范围。根据厂商提供的检测方法，包被后的基线为锐利对称的单峰图形，证明所包被的LPS在疏水样品池中形成均匀的单层脂膜，见图4-1。
3.2多肽样品与LPS的亲和力测定
与LPS亲和力最强者为3#，最弱者为PEG，亲和力高低依次为3#＞9#＞11#＞4#＞1#＞0304＞2#＞1108＞BPI＞PEG，见图4-2。
Claims (8)
1.聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：具有下列结构通式，Y-BNEP-Z-amPEG
其中，Y是氢或其它修饰基团，包括但不限于酰基、C1-C18烷基、芳基苄基、烯丙基；Z是各种连接基，包括但不限于-NH(CH2)nCO-(n＝1-8)、-NH(CH2)nX(n＝1-10，X＝O，S，NH，etc)，或者没有连接基；amPEG的分子量包括但不限于2000，4000，6000，12000或20000。
2.根据权利要求1中所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：表现为多肽的药学上可接受的各种无机酸或有机酸的盐类。
3.根据权利要求1中所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：表现为多肽的链中或端位环肽。
4.根据权利要求3所述的抗菌、抗内毒素变构肽分子，其特征在于：表现为各种多肽的链中或端位环肽的药学上可接受的各种无机酸、有机酸的盐类。
5.权利要求1-4任一项所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子用于制备治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒性休克疾病或症状药物的用途。
6.权利要求1-4中所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、母体肽树脂
合成通法
称取Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂或其它多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂DCM、DMF或DCM/DMF溶胀，以10％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，检测后抽滤至干，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶；称取抗菌/中和内毒素变构肽BNEP的氨基酸序列C端第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH于适宜的容器中，加入DMF溶解，然后加入偶联剂和氮甲基吗啉或二异丙基乙胺的DMF溶液；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶；按照常规多肽固相化学合成方法，依照中国授权专利01104591.4中的BNEP9901315的氨基酸序列进行后续偶联，如此循环完成整个BNEP肽链的合成，得到母体肽树脂
充分洗涤，MeOH收缩，抽干，从合成柱中取出合成的肽树脂，冻干机中冻干，备用；
(2)、氮端衍生物
制备
将
母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干，加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合成的BNEP肽衍生物树脂，置冻干机中冻干，得
(3)、BNEP-amPEG分子的合成
选择采用以下两种方法之一：
(3.1)从自制amPEG开始的逐步合成法
(3.1.1)全保护
制备通法
脱除Fmoc圆底烧瓶中加入设计量的Fmoc-AAn....AA1-amPEG，其中n＝2，3...14，15-50％六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min；旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，DCM-EtOH/Et2O重结晶两次，P2O5真空干燥得去Fmoc保护的AAn....AA1-amPEG，其中n＝1，2，3...13；
偶联圆底烧瓶中加入的AAn....AA1-amPEG，其中n＝1，2...13，2倍量的保护氨基酸Fmoc-AAx-OH，其中x＝2，3...14，0.02倍量的催化剂DMAP和DCM，溶解后加入的DIC；20-40℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程；反应毕，停止反应；旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，无水乙醚洗涤3次，DCM/Et2O或DCM-EtOH/Et2O重结晶2次，茚三酮监测，应与空白颜色相同或相似，P2O5真空干燥得全保护的肽树脂Fmoc-AAn....AA1-amPEG，其中n＝2，3...14，称重计算收率；重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护
称重计算收率；
3.1.2)BNEP-amPEG制备
A.Fmoc-BNEP-amPEG制备 全保护
1g，冰冷下加入10mL裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得侧链无保护Fmoc-BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品，用氨基酸组成分析等方法确证结构；
B.BNEP-amPEG制备将1g全保护
除去Fmoc保护基后，按上述A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得全去保护的BNEP-amPEG粗品；该粗品以适量水溶解，乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品；HPLC纯化，冻干，得纯品；用氨基酸组成分析等方法确证结构；
或，(3.2)从自制
的片段合成法
A.脱除树脂 计算量母体肽树脂
加入三氟乙醇裂解试剂，r.t反应60-120min，过滤，DCM、THF洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出；加入H2O，析出大量白色固体，加入THF溶解固体，加饱和食盐水溶液，分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护
B.偶联amPEG全保护
加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入4-6倍HOBt，冰水冷却下加入4-8倍DIC；搅拌，加入含有1-4倍自制amPEG的DMF溶液；撤除水浴，室温搅拌18h后，置于25-40℃油浴搅拌反应，TLC跟踪反应进程；反应结束，转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et2O，搅拌，静置。抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥，得到全保护
C.除去Fmoc全保护
加入piperidine的DMF溶液，25-40℃油浴搅拌反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et2O，搅拌，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥；上述产物，加入EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥，得到侧链全保护的
D.裂解去保护 侧链全保护
冰冷下加入裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品。
7.根据权利要求6所述的合成方法，所述步骤(1)中所述偶联剂为TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt、DIC/HOBt、DCC/HOBt、DCC/HOSu、TBTU/HOSu、PyBOP/HOBt或BOP/HOBt。
8.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于所述步骤(2)所述酰基化试剂选自(RCO)2O/pyridine或RCO2H/激活剂；所述的激活剂为DCC/HOBt、DCC/HOSu、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt、DIC/HOBt、TBTU/HOSu、PyBOP/HOBt、BOP/HOBt、DIC/HOSu或PyBOP/HOSu。
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