CN105504019A - 一种抗内毒素的偶联生物分子及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗内毒素的偶联生物分子，所述偶联生物分子为通式Y-CLP-19-amPEG所示化合物，其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子；Y选自氢、酰基、C1-C18的烷基、芳基苄基和烯丙基中的一种；amPEG的分子量为500，1000，2000，4000，6000，12000或20000。用本发明所获得的经PEG修饰的CLP-19较未修饰CLP-19，其直接抗菌活性更优或相当，但前者显著提升了与LPS的亲和力，具有更好的中和LPS特性，较CLP-19具有显著的进步，有望开发成为新型的脓毒症治疗候选药物。

Description

一种抗内毒素的偶联生物分子及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体的涉及一种抗内毒素的偶联生物分子及其制备和应用
背景技术
内毒素(endotoxin)，又称脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成分之一，在细胞增殖或死亡的时候会释放到细胞外环境中。游离的LPS可被LPS结合蛋白(LPSbindingprotein，LBP)识别并形成复合物，与宿主细胞膜上的模式识别受体(PRR)—Toll样受体4(TLR4)、MD-2和CD4复合物结合，引起MyD88-依赖性和MyD88-非依赖性信号通路激活。在巨噬细胞中，该通路可促进多种炎症因子释放，例如：TNF-α[10-12]，IL-1β[13-16]和IL-6等。正常情况下，LPS被宿主细胞识别后引起的免疫反应可受精确调控，包括细胞因子产生和释放、补体激活和其他后续生物学效应。这些反应可提高机体对有害病原体侵袭的抵御、杀灭和清除能力。但大量LPS产生和累积会过度刺激TLR介导的免疫应答，导致炎症因子失控性表达和释放，引起严重的细胞和组织损伤；且过量炎症因子会导致机体发生临床常见危重病症—脓毒症(Sepsis)，有资料显示该病症的死亡率可达50％以上。目前，国内外众多科研团队针对有效预防和治疗LPS所致脓毒症方面做了大量的探索和研究，但目前尚无一种安全有效的特异性中和LPS的制剂。
宿主防御肽(Hostdefensepeptides，HDPs)是由多细胞有机体免疫系统产生的一类阳离子小肽，有着广泛的生物学活性，例如：直接杀灭病原微生物、调节机体免疫系统和其他生物学反应作用。目前，大量研究均表明：HDPs具有调节过量细菌感染诱发的宿主免疫系统过度炎症反应作用，因此非常有希望作为脓毒症预防和治疗的新型药物应用到临床实践中。大量源于动物、植物甚至细菌的HDPs被提取和研究；其中较成功的有多粘菌素B、细菌穿透蛋白，CAP-18和黄蜂毒素肽等，他们均显示出强大的体外中和LPS作用和体内提高致死剂量脓毒症休克模型小鼠生存率的作用。
源于海洋节肢动物中国鲎和美洲鲎蓝色血液中的HDPs-鲎抗内毒素因子(Limμlusanti-LPSfactor，LALF)，因具有抑制LPS诱导的炎症连锁反应作用而受到我们关注。课题组前期分析研究了LALF的核心功能区域(第31到52氨基酸残基)，对其结构进行优化、改造和活性筛选后得到一段具有优良抗LPS作用的新型环状肽-CLP-19。CLP-19由19个氨基酸残基组成，首尾环化，具有阳离子、两亲性结构。CLP-19活性研究表明：CLP-19具有直接中和内毒素的作用，并能显著提高内毒素休克小鼠模型和急性腹膜炎小鼠的生存率。但是其生物半衰期不足1h，存在生产成本高、绝对用量大等问题。
因此，有必要提供一种新的具有更长的半衰期、更低廉的成本、和更少用量的宿主防御肽分子，以用来治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒症性休克等疾病或症状。
发明内容
本发明的第一个目的，在于提供一类半衰期长、成本低、用量少的预防或治疗内毒素脓毒症、脓毒症性休克等疾病或症状的偶联生物分子。
本发明的第二个目的在于提供制备所述抗内毒素的偶联生物分子的方法。
本发明的第三个目的在于提供上述偶联物分子及其氮端衍生物的医学应用。
为了达到本发明的第一个目的，本发明的发明人选取中国专利200510057195.4中的(RREMP)：CRKPTFRRLKWKIKFKFKC作为母体分子(重新命名为：CLP-19)，对其碳端进行amPEG修饰，从而提供了一种抗内毒素的偶联生物分子，所述偶联生物分子为通式(1)所示化合物，
Y-CLP-19-amPEG(1)
其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子；Y选自氢、酰基、C1-C18的烷基、芳基苄基和烯丙基中的一种；amPEG的分子量为500-20000Da。
可选的，Y为氢、酰基。
可选的，amPEG的分子量为500-2000Da。
本发明还提供了所述偶联生物分子的药用盐。
在本发明中，所述的药用盐为药物可接受的盐形式。“药物可接受的盐”指适合于与人或动物的组织接触，无过多的毒性、刺激、变态反应等。药物可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明的化合物肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将游离的碱或酸与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于醋酸、三氟乙酸、二己酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、丙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐。优选的，所述盐为所述偶联生物分子的醋酸盐、三氟乙酸盐，特别优选的，所述盐为所述偶联生物分子的醋酸盐。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括本发明所述的偶联生物分子或其药用盐。可选的，所述药物组合物还包括药物可接受的载体。所述药物组合物的形式可以为注射液或微乳液。可以根据药物组合物的形式选择使用本领域常用的药物可接受的载体物质。在所述药物组合物中，活性成分的含量不低于85％。所述载体物质的种类包括但不限于生理盐水。
本发明还提供了该偶联生物分子在制备细菌杀灭药物或内毒素血症治疗药物中的应用
本发明还提供了所述偶联生物分子的合成方法，包括以下步骤：
(1)母体树脂Fmoc-CLP-19-CTC合成
称取多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，以10％-50％的DMF溶液脱除多肽合成氨基酸树脂的Fmoc保护基团；依照CLP-19的氨基酸序列进行后续偶联，循环完成整个CLP-19肽链的合成，得到母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC；
(2)氮端衍生物Y-CLP-19-CTC制备
将Fmoc-CLP-19-CTC母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干后加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合成的CLP-19肽衍生物树脂，置于冻干机中冻干，得Y-CLP-19-CTC；
(3)采用逐步合成法或片段合成法进行Y-CLP-19-amPEG分子的合成。
可选的，所述逐步合成法包括以下步骤：
(1)全保护Y-CLP-19-amPEG的制备
脱除Fmoc步骤：在圆底烧瓶中加入Fmoc-AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-14的整数，再加入15-50％六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min；旋蒸后用无水乙醚析出沉淀，抽滤获得DCM-EtOH/Et2O后重结晶2次，用P2O5真空干燥获得去Fmoc保护的AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-13的整数；
偶联步骤：在圆底烧瓶中加入AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-13的整数；保护氨基酸Fmoc-AAx-OH，其中x取自2-19的整数；催化剂DMAP和DCM，溶解后加入DIC；20-40℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程；反应停止后进行旋蒸，用无水乙醚析出沉淀，对沉淀进行抽滤并用无水乙醚洗涤3次，再用DCM/Et2O或DCM-EtOH/Et2O重结晶2次，茚三酮监测，应与空白颜色相同或相似，用P2O5真空干燥获得全保护的肽树脂Fmoc-AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-14的整数，称重计算收率；
重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，称重计算收率；
(2)CLP-19-amPEG制备
A.Fmoc-CLP-19-amPEG制备：全保护Fmoc-CLP-19-amPEG1g，冰冷下加入10ml各组分体积比为90：5：3：2的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，用无水乙醚沉淀后离心；DCM溶样，无水乙醚沉淀，离心分出固体；再重复2次，冻干，得到侧链无保护Fmoc-CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干、得到纯品，用氨基酸组成分析等方法确证结构；
B.CLP-19-amPEG制备：将1g全保护Fmoc-CLP-19-amPEG除去Fmoc保护基后，按上述A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得到全保护的-CLP-19-amPEG粗品；该粗品以适量水溶解后用乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品；HPLC纯化，冻干，得纯品；用氨基酸组成分析等方法确证结构。
可选的，所述片段合成法包括以下步骤：
A.脱除树脂：在母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC加入三氟乙醇裂解试剂，15-30℃反应60-120min后过滤，以DCM、THF依次洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出；加入H2O析出白色固体后加入THF溶解，溶解后加饱和食盐水溶液进行分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护Fmoc-CLP-19-OH；
B.偶联amPEG：在全保护Fmoc-CLP-19-OH中加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入体积比4-6倍的HOBt，冰水冷却下加入体积比为4-8倍的DIC；搅拌，加入含有体积比1-4倍的amPEG的DMF溶液；撤除水浴，15-30℃搅拌18h后，置于25-40℃油浴搅拌反应，TLC跟踪反应进程；反应结束后转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et2O，搅拌后静置；静置后抽滤并用无水Et2O洗涤，真空干燥获得产物；上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌后抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG；
C.除去Fmoc全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，加入piperidine的DMF溶液，25-40℃油浴搅拌反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et2O，搅拌并抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥后加入EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌后抽滤，用无水Et2O洗涤，真空干燥，得到侧链全保护的CLP-19-amPEG；
D.裂解去保护：冰冷下在侧链全保护CLP-19-amPEG中加入各组分体积比为94∶3∶2∶1的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降后离心；用DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干获得纯品。
本发明选取中国专利200510057195.4的RREMP作为母体分子(CLP-19)，对其碳端进行PEG修饰，合成了一类CLP-19的amPEG偶联物；通过多浓度鲎试验、生物传感器亲和力试验、细胞因子刺激试验、体外抗菌试验，获得了具有较理想的中和内毒素活性的CLP-19多肽的amPEG偶联物，显示了进一步开发成为新型中和内毒素药物的潜力。利用本发明所获得的经PEG修饰的CLP-19较未修饰CLP-19，其直接抗菌活性更优或相当，但前者显著提升了与LPS的亲和力，具有更好的中和LPS特性，较CLP-19具有显著的进步，有望开发成为新型的脓毒症治疗候选药物。
附图说明
图1、本发明的CLP-19-amPEG的色谱图(精肽)。
图2、本发明的CLP-19--amPEG的质谱图。
图3、本发明的Ac-CLP-19-amPEG的色谱图(精肽)。
图4、本发明的Ac-CLP-19--amPEG的质谱图。
图5、本发明的CLP-19--amPEG、Ac-CLP-19-amPEG对LPS致炎的RAW264.7细胞TNF-amRNA水平的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例涉及Fmoc-CLP-19-CTC的固相合成用于说明本发明的CLP-19-amPEG的片段合成法。下述操作仅仅是为了说明，而不是限制本发明。
1.1Fmoc-CLP-19-CTC肽树脂的合成
称取6.8g(2mmol，Sub0.314mmol/g)Fmoc-Lys(Boc)-CTCResin倒入合成柱中，称取55mLDCM-DMF溶胀。30min后抽出溶剂，以35mL30％六氢吡啶的DMF溶液脱除多肽合成氨基酸树脂的Fmoc保护基团，15min后用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。DCM，DMF依次洗涤，除去六氢吡啶(piperidine)。称取5gFmoc-Lys(Boc)-OH于锥形瓶中，加入DMF溶解，加入19mLDIC，1.183gHOBt和55mL25％二异丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮检测反应过程。偶联完成后，除去反应液，以DCM，MeOH，DMF，DCM，DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢咄咤的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM，MeOH，DMF，DCM，DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。按照类似的方法，投入后续Fmoc保护的氨基酸、DIC及HOBt，进行后续偶联，如此循环完成整个肽链的合成，得到Fmoc-CLP-19-CTC肽树脂9.673g；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，从合成柱中取出树脂，置冻干机中冻干，备用。
取出0.5gFmoc-CLP-19-CTC肽树脂，加入2mLDCM溶胀，30min后抽干，加入5mL30％六氢吡啶的DMF溶液脱除肽树脂的Fmoc保护基团，以DCM，MeOH，DMF，DCM，DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶，冻干。常规裂解[裂解剂(ReagentR):TFA/Thioanisole/EDT/anisole90:5:3:2，v/v，15mL；室温，3h]，无水乙醚多次沉降得粗肽，粗肽纯度88.27％，进行MALDI-TOFMS检测证明母体合成成功。
1.2乙酰化Fmoc-CLP-19-CTC肽树脂的合成
取Fmoc-CLP-19-CTC肽树脂4.072g；以DCM-DMF溶胀，加入使用8倍量同等的乙酸酐和DIEA，溶剂是DMF和DCM(3：1)的配比，室湿下反应时间45min，然后充分洗涤，MeOH收缩，抽干，从合成柱中取出树脂，置冻干机中冻干，备用。
1.3CLP-19-amPEG的合成和乙酰化-CLP-19-amPEG的合成
称取7.980gFmoc-NEP-CTC肽树脂，置于250mL的圆底烧瓶中，配制好的裂解液70mL，r.t反应90min，过滤树脂，DCM(3x80mL)，THF(2x60mL)洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出。加入80mLH20，析出大量白色固体，加入220mLTHF，固体溶解，加饱和食盐水溶液，分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥。最终得Fmoc-NEP-OH(碳端数基游离、氮端及侧链全保护)6.5g，收率93.44％。
Fmoc-NEP-OH2.6g，加入DMF30mL、THF20mL，搅拌，得无色透明溶液；加入HOBt400mg(4x0.701mmol)，搅拌，冰水冷却下加入DIC0.6mL10min后，加入4.184gamPEG的DMF溶液30mL。撤除水浴，室温搅拌18h后，置于35℃油浴搅拌反应。反应结束，转入1000mL圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入500mLEt2O，搅拌30min，静置1h。抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物，加入50mLDCM，20mLEtOH，搅拌全溶后加入冷冻Et2O800mL，搅拌20min，抽滤，无水Et2。洗涤(3X100mL)，真空干燥，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG6.3g。
全保护Fmoc-CLP-19-amPEG6.3g，加入DMF100mL，piperidine40mL，经搅拌反应，1h后转入1000mL圆底烧瓶，加入冷冻的800mLEt2O，搅拌30min，抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥。上述产物，加入50mLEtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O800mL，搅拌40min，抽滤，无水Et2O洗涤(4x100mL)，真空干燥，得到侧链全保护的CLP-19-amPEG5.5g。
取CLP-19-amPEG1g，冰冷下加入10mL裂解试剂(TFA/Thioanisole/EDT/anisole，90:5:3:2，v/v，25mL)，电磁搅拌3h，氮气吹去大部分TFA，200mL无水乙醚沉降，离心；10mLDCM溶样，100mL无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品。
Ac-CLP-19-amPEG的合成反应的方法和配比同CLP-19-amPEG的合成。待获得乙酰化CLP-19-amPEG粗品后，HPLC纯化、冻干，得纯品。
CLP-19-amPEG的色谱图(精肽)如图1所示，质谱图如图2所示。Ac-CLP-19-amPEG的色谱图(精肽)如图3所示；CLP-19--amPEG的质谱图如图4所示。
实施例2
本实施例涉及实施例1制备获得的CLP-19-amPEG和Ac-CLP-19-amPEG对部分人源病菌的抑制试验。
1.实验菌株
实验所用菌株为用标准菌大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213、铜绿假单胞菌ATCC27853。
2.培养基和试剂
Mueller-Hinton(MH)培养基(液体、固体)，中国药品生物制品检定所产品(批号010925)；磷酸盐缓冲液((PBS):磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水1000mL，用0.1NNaOH调pH为6.0。
3.仪器
多点接种仪(日本仓光株式会社生产)
电子天平(Sartorius，德国)
pH计(Beckman21，USA)
可调移液器(eppendorf，USA)
4.实验方法
4.1供试液制备
精密分别称取待测多肽样品于2mL容量瓶中，分别用pH6.0磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成主药含量为3840mg/L储备液。
4.2试验菌液制备
实验前，从保存菌种的半固体培养基(或料面)上取适量的菌苔，接种在MH培养基上，于37℃培养16-18h，再挑取新鲜的单个菌落接种在MH肉汤培养基中，于37℃增菌培养16-18h，取出，每管菌液用MH肉汤培养基分别稀释为0.5麦氏比浊标准(含菌量107-8CFU/mL)，保持菌液最终接种量为每点104-5CFU。
4.3最低抑菌浓度((MIC)测定
采用琼脂二倍稀释法，将药物含量为3840mg/L的储备液用pH6.0PBS倍比稀释成系列浓度，分别取1mL放入直径90mm的平皿中，加入14mL熔化的MH琼脂培养基，混匀，即得主药含量分别为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125mg/L的系列琼脂平皿，待琼脂凝固后，用多点接种仪在含药琼脂平皿及空白琼脂平皿表面点种细菌，37℃孵育24h观察结果，未见细菌生长的平皿内的最小药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。实验结果见下表1(肽CLP-19-amPEG，Ac-CLP-19-amPEG和CLP-19对部分人源病菌的抑制试验(MIC:mg/L))。
表1
实验结果表明，以相同重量给药时，多数情况下经amPEG修饰的CLP-19-amPEG和Ac-CLP-19-amPEG对于大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌具有较强的抑菌活性，且抑菌活性相似；但其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较差。
实施例3
本实施例涉及本发明经amPEG修饰的变构肽CLP-19-amPEG和Ac-CLP-19-amPEG对LPS致炎的RAW264.7细胞的影响。由于细胞受到内毒素LPS攻击时，会主动应激发生炎症反应，产生一系列炎症因子如肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6，IL-8等。为明确CLP-19和经amPEG修饰的变构肽对LPS致炎的RAW264.7细胞的TNF-a水平的影响，开展本实验。
1.1材料与主要仪器
1.1.l合成肽：CLP-19-amPEG、Ac-CLP-19-amPEG、CLP-19、amPEG(分子量500)
1.1.2其它试剂
细胞株：RAW264.7细胞株由第三军医大学免疫学教研室提供；
LPS7261：Sigma公司产品；MDEM培养液：Invitrogen公司产品；
定量PCR试剂盒：BIO-RAD公司产品；
1.1.3主要仪器
恒温孵育箱:ThermoFormaModel3111电子天平：SartoriusBP61
96孔细胞培养板：corning移液枪：eppendorf
定量PCR仪：BIO-RADCFX-96
倒置显微镜：OLYMPUSCX31
1.1.4主要试剂
氯仿、异丙醇、无水乙醇TRIZOL
反转录试剂BIO-RADiScriptTMcDNASynthesisKit
定量试剂BIO-RADSsoFastTMEvaGreenSupermix
1.2实验方法
1.2.1细胞试验：
培养RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度为1x106/ml，取1ml于6孔板内，置37℃，5％CO2培养箱培养过夜；用PBS清洗1次后加入LPS(终浓度100ng/ml)或LPS与多肽CLP-19-amPEG、Ac-CLP-19-amPEG、CLP-19(终浓度均为20μg/ml)，置37℃，5％CO2培养箱继续培养4h后，提取细胞RNA，检测TNF-a含量；每组设3复孔。
1.2.2RNA提取及反转cDNA：
RNA提取按照TRIZOL-氯仿-异丙醇-乙醇提取法，最后每个样品用25μlDEPC水溶解后，取1μl检测RNA浓度、纯度。取1μg总RNA反转成cDNA，反转体系为：5xiScriptreactionmix，4μl；iScriptreversetranscriptase，1μl；RNAtemplate，1μg；Nuclease-freewater，upto20μl；，25℃5min，42℃30min，85℃5min，holdat4℃；反转完成后样品加入Nuclease-freewater20μl，混合均匀，-20℃保存，备用。
1.2.3TNF-a定量检测：
以反转的cDNA为模板，以β-actin为内参，用定量PCR试剂盒检测样品中TNF-a在不同浓度处理下表达变化情况。步骤按照试剂盒说明书操作，简要如下，定量体系为：2xSsoFastEvaGreensupermix，10μl；Forwardprimer0.3μl；Reverseprimer0.3μl；cDNA2μl；RNase-freewater7.4μl；混合均匀后，定量检测，每组设3复孔。定量PCR循环扩增程序为：94℃5min，94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，ReadPlate，Goto2to44cycles，MeltCurve；定量软件分析结果。
1.2.4实验结果
合成肽抗炎效应试验结果见附图5。
实验结果分析：多肽PAP-2对LPS诱导的细胞活化具有不同程度抑制作用，呈现出浓度依耐性。其中在高浓度(100μg/ml)，具有抑制作用，而2#尽管具有一定的活性但结果不具有量效关系，其活性有待进一步研究。
实施例4
本实施例涉及采用生物传感器检测CLP-19-amPEG、Ac-CLP-19-amPEG、CLP-19、amPEG与LPS的亲和力。
1.材料
本方案采用CN200710092699.9中所述，测定实施例1和2中制备的多肽与LPS的亲和力
2.方法
2.1生物传感器疏水样品池LPS的包被
根据Thereto公司疏水样品池的包被流程，将LPS包被在疏水样品池中，并计算包被的LPS量。具体步骤如下:根据包被的要求，仪器包被温度设定为22℃，搅拌速率设定为85次/sec，数据采集设定为2次/sec；放入疏水样品池，异丙醇清洗50μlx5，收集数据曲线1min；PBS/AE清洗60μlx7，采集数据10min；异丙醇清洗50μlx7，采集数据曲线1min；加入2mg/ml的LPS氯仿溶液20u1(用前超声10sec)，留置1min；PBS/AE清洗50μlx7，采集数据5min；1MHCl清洗50μlx5，留置1min；PBS/AE清洗6μlx7，采集数据5min；10mMNaOH清洗5Oμlx5，留置1min；PBS/AE清洗60μlx7，采集数据5min，计算包被值；5mg/mlBSA90μl，保留5min；PBS/AE清洗60μlx5，保留1min；检查包被后的共根图形。
2.2多肽样品与LPS的亲和力测定
用PBS(pH7.0)配制模拟肽进行生物传感器检测。以不同的模拟肽溶液为流动相，分别与疏水样品池中的LPS进行结合、解离、再生反应。具体步骤如下:将模拟肽配制为100uM浓度液；生物传感器搅拌速率设定为98次/sec，数据采集设定为3次/sec，温度设定为25C；包被LPS的疏水样品池加入50u1的pH6.0，0.02MPBS，冲洗5次，保留至基线平衡后吸出；结合反应:加入PBS45以，再加入5μl待测样品，结合反应平衡后吸出待测样品；解离反应:PBS冲洗50μlx3，解离反应平衡后吸出；再生反应:O.1N的HCl50μlX3，再生反应平衡后吸出；PBS冲洗50μlX3，曲线回至基线后加入45μlPBS，开始新的循环；储存实验数据。
3.结果
3.1生物传感器疏水样品池的包被
LPSO55:B5在疏水样品池中的包被量为201.2arcsecond(A，B两点间差的绝对值)，为脂类物质在疏水样品池中包被量的理想范围。根据厂商提供的检测方法，包被后的基线为锐利对称的单峰图形，证明所包被的LPS在疏水样品池中形成均匀的单层脂膜。
3.2多肽样品与LPS的亲和力测定
与LPS亲和力最强者为Ac-CLP-19-amPEG，最弱者为PEG，亲和力高低依次为Ac-CLP-19-amPEG(7.681uM)>CLP-19-amPEG(8.415uM)>CLP-19(16.243uM)>PEG(143.22uM)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种抗内毒素的偶联生物分子，其特征在于，所述偶联生物分子为通式(1)所示化合物，
Y-CLP-19-amPEG(1)
其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子；Y选自氢、酰基、C1-C18的烷基、芳基苄基和烯丙基中的一种；amPEG的分子量为500-20000Da。
2.根据权利要求1所述的偶联生物分子，其特征在于，Y为氢或酰基。
3.根据权利要求1或2所述的偶联生物分子，其特征在于amPEG的分子量为500-2000Da。
4.权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子的药用盐。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子或权利要求4所述的药用盐。
6.权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子或权利要求4所述的药用盐在制备细菌杀灭药物或内毒素血症治疗药物中的应用。
7.权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)母体树脂Fmoc-CLP-19-CTC合成：
称取多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，以10％-50％的DMF溶液脱除多肽合成氨基酸树脂的Fmoc保护基团；依照CLP-19的氨基酸序列进行后续偶联，循环完成整个CLP-19肽链的合成，得到母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC；
(2)氮端衍生物Y-CLP-19-CTC制备：
将Fmoc-CLP-19-CTC母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干后加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合成的CLP-19肽衍生物树脂，置于冻干机中冻干，得Y-CLP-19-CTC；
(3)采用逐步合成法或片段合成法进行Y-CLP-19-amPEG分子的合成。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述逐步合成法包括以下步骤：
(1)全保护Y-CLP-19-amPEG的制备：
脱除Fmoc步骤：在圆底烧瓶中加入Fmoc-AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-14的整数，再加入15-50％六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min；旋蒸后用无水乙醚析出沉淀，抽滤获得DCM-EtOH/Et2O后重结晶2次，用P2O5真空干燥获得去Fmoc保护的AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-13的整数；
偶联步骤：在圆底烧瓶中加入AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-13的整数；保护氨基酸Fmoc-AAx-OH，其x取自2-19的整数；催化剂DMAP和DCM，溶解后加入DIC；20-40℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程；反应停止后进行旋蒸，用无水乙醚析出沉淀，对沉淀进行抽滤并用无水乙醚洗涤3次，再用DCM/Et2O或DCM-EtOH/Et2O重结晶2次，茚三酮监测，应与空白颜色相同或相似，用P2O5真空干燥获得全保护的肽树脂Fmoc-AAn…AA1-amPEG，其中n取自1-14的整数，称重计算收率；
重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，称重计算收率；
(2)CLP-19-amPEG制备
A.Fmoc-CLP-19-amPEG制备：全保护Fmoc-CLP-19-amPEG1g，冰冷下加入10ml各组分体积比为90：5：3：2的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，用无水乙醚沉淀后离心；DCM溶样，无水乙醚沉淀，离心分出固体；再重复2次，冻干，得到侧链无保护Fmoc-CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干、得到纯品，用氨基酸组成分析等方法确证结构；
B.CLP-19-amPEG制备：将1g全保护Fmoc-CLP-19-amPEG除去Fmoc保护基后，按上述A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得到全保护的-CLP-19-amPEG粗品；该粗品以适量水溶解后用乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品；HPLC纯化，冻干，得纯品；用氨基酸组成分析等方法确证结构。
9.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述片段合成法包括以下步骤：
A.脱除树脂：在母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC加入三氟乙醇裂解试剂，15-30℃反应60-120min后过滤，以DCM、THF依次洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出；加入H2O析出白色固体后加入THF溶解，溶解后加饱和食盐水溶液进行分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护Fmoc-CLP-19-OH；
B.偶联amPEG：在全保护Fmoc-CLP-19-OH中加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入体积比4-6倍的HOBt，冰水冷却下加入体积比4-8倍的DIC；搅拌，加入含有体积比1-4倍的amPEG的DMF溶液；撤除水浴，15-30℃搅拌18h后，置于25-40℃油浴搅拌反应，TLC跟踪反应进程；反应结束后转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et2O，搅拌后静置；静置后抽滤并用无水Et2O洗涤，真空干燥获得产物；上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌后抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG；
C.除去Fmoc全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，加入piperidine的DMF溶液，25-40℃油浴搅拌反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et2O，搅拌并抽滤，无水Et2O洗涤，真空干燥后加入EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2O，搅拌后抽滤，用无水Et2O洗涤，真空干燥，得到侧链全保护的CLP-19-amPEG；
D.裂解去保护：冰冷下在侧链全保护CLP-19-amPEG中加入各组分体积比为94∶3∶2∶1的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降后离心；用DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干获得纯品。
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