CN1704431A - 蜂毒肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌/抗内毒素的氨基酸类型的小分子多肽—蜂毒肽，结构式为INLKAIAALAKKLL－NH2。本发明可应用于制备杀灭细菌的药物和治疗脓毒症的药物。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸类型的小分子多肽及其应用，更具体地说是一种蜂毒肽以及在用于制备通过杀菌、中和内毒素(lipopolysaccharide，LPS)和抑制呼吸爆发达到治疗脓毒症药物中的应用。
背景技术
脓毒症是导致临床危重病人死亡的主要原因，特别是伴有严重LPS血症的革兰氏阴性(G-)杆菌的感染。G-菌菌血症的病死率为20～30％，而由菌血症发展而来的脓毒症休克其病死率可高达50～80％。目前针对脓毒症的治疗，临床上尚无有效措施，因此导致感染性疾病的治疗更为棘手，研究其发病机理并寻找有效的治疗措施一直是临床医学关注的焦点。
近年来，随着对脓毒症研究的深入，存在于G-杆菌外膜上LPS的作用日益受到重视。LPS被认为是脓毒症休克病人死亡原因—失控性炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)和代偿性抗炎症综合征(compensatoryanti-inflammatory response syndrome，CARS)的主要启动子。进入血中的LPS其主要生物学作用包括以下几个方面：(1)与巨噬细胞接触后能诱生、释放多种炎症介质如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、自细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等，通过这些介质直接或间接发挥局部及全身效应。(2)可与多种组织、实质细胞结合直接导致细胞损伤。(3)激活凝血、纤溶、补体系统，诱发DIC。(4)作用于α受体，促使肾上腺儿茶酚胺分泌，导致微循环障碍、血浆外渗，直至发生休克以及其它如发热、白细胞减少，Shwartzman反应等。在复杂的炎症反应网络中，分别针对TNF、IL-1等各种炎症因子的调控措施也不断提出，但结果令人失望。其主要原因在于各种不同的炎症因子相互作用密不可分，仅针对某个或数个细胞因子并不能解决问题。因此抓住矛盾的主要方面——LPS，寻找解决问题的突破点意义重大。
国内外有关LPS的研究发现：LPS存在于G-杆菌的细胞膜上，化学成分为脂多糖，其基本构成为O-特异性多糖链、核心多糖、类脂A三部分。其中类脂A是LPS的活性中心。LPS主要生物学作用为刺激单核-吞噬细胞系统诱生、释放多种炎症介质如TNF-α、IL-1、IL-6等，通过这些介质启动炎症反应网络并直接或间接发挥局部及全身效应。
尽管针对LPS的研究较多，但临床上尚无一种能够安全有效地用于治疗脓毒症的药物。因此，将重点放在中和LPS上从而达到降低感染死亡率的目的具有非常重要的意义。
近十余年来，国际上脓毒症的防治研究，主要有抗LPS核心糖脂(Lipid A)的多抗、单抗、各种抗细胞因子抗体及受体拮抗剂，如抗TNF抗体，抗IL-1抗体、抗IL-6抗体以及NO拮抗剂等。在动物实验研究中，上述制剂对脓毒症所致的脏器损伤有一定的保护作用，但在临床试验中都因疗效不确切而未获美国FDA批准。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌/抗内毒素的氨基酸类型的小分子多肽—蜂毒肽。
本发明的另一目的在于提供蜂毒肽在用于制备杀菌、中和拮抗内毒素、抑制细胞呼吸爆发达到治疗脓毒症的药物中的应用。
蜂毒肽是一类来源于昆虫的由十余个氨基酸组成的小分子多肽，经过研究得知：蜂毒肽具有广泛的生物学活性，如激活G蛋白和改变细胞内外Ca2+的分布，具有扩血管、促进胰岛素分泌和促肾上腺皮质激素的释放等功能。但在失控性炎症反应和脓毒症中，蜂毒肽对炎症反应细胞呼吸爆发有无影响及其在炎症反应中的作用，却知之甚少。
本发明人根据LPS是一阴离子，其生物学活性的发挥依赖于其二糖骨架上带负电荷的阴离子基团与其受体中带正电荷的氨基酸残基的结合而实现，以及LPS的抑制剂多粘菌素B(PMB)、杀菌性/通透性增加蛋白、鲎抗内毒素因子等均为阳离子的特点，对天然蜂毒肽氨基酸序列进行改进，期望能筛选出拮抗脓毒症的新型多肽，以达到上述发明目的。
通过目前具有杀菌活性的天然蜂毒肽，对其氨基酸序列进行分析，发现第11、12位氨基酸为赖氨酸的多肽其杀菌活性较强，通过改变其它位置的氨基酸合成多条多肽，进一步通过生物传感器和动物实验，筛选出与LPS的结合作用最强，其抗脓毒症模型小鼠效果最好的蜂毒肽。
为了实现上述目的，本发明提供的蜂毒肽，类型为氨基酸；分子类型为肽；分子的序列由氨基酸的一字简码组成，表示如下：INLKAIAALAKKLL-NH2。
Merrifield创建的固相多肽化学合成方法(Merrifield RB.1963 J Am ChemSoc.85：2149)已发展成为一种成熟的众所周知的固相多肽化学合成技术。应用该技术，本发明采用Merrifield创建的固相多肽化学合成方法，通过Fmoc保护的氨基酸方法或Tboc保护的氨基酸方法人工合成或通过自动多肽合成仪进行合成，得到一系列的抗菌/抗内毒素蜂毒肽。得到的多肽经过高压液相(HPLC)纯化，并经生物活性鉴定。再通过初步的拮抗脓毒症动物试验，最后筛选出效果最好的本发明所述的蜂毒肽。
本发明通过测定上述蜂毒肽的体外杀菌活性、体外结合、中和LPS和抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-6产生的活性、体外抑制LPS刺激的巨噬细胞呼吸爆发的活性、所述蜂毒肽对大肠杆菌ATCC25922/LPS攻击小鼠的死亡保护作用以及所述蜂毒肽对脓毒症模型大鼠脏器的改善情况等一系列试验表明：本发明所述的蜂毒肽对细菌/PS攻击造成的脓毒症模型动物具有保护作用，具体表现在：①所述蜂毒肽对大肠杆菌ATCC25922等细菌具有一定的杀菌活性；②所述蜂毒肽具有一定的结合、中和LPS的活性，可抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、TNF-a和IL-6mRNA的表达；③所述蜂毒肽抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞的呼吸爆发。
故本发明所述的蜂毒肽可用于制备抗细菌药物。
本发明所述的蜂毒肽可用于制备抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和奇异变形杆菌感染药物。
本发明所述蜂毒肽可用于制备内毒素所致疾病中对内毒素进行中和拮抗的药物。
本发明所述蜂毒肽可用于制备内毒素所致疾病中抑制细胞呼吸爆发的药物。
本发明所述蜂毒肽可用于制备治疗脓毒症的药物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明及其效果作进一步说明
图1蜂毒肽(3mg/kg)对细菌和LPS(20mg/kg)攻击小鼠的保护作用
图2蜂毒肽与LPS结合的亲和力测定
图3PMB与LPS结合的亲和力测定
图4蜂毒肽和PMB中和LPS的活性比较
图5蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞TLR4 mRNA表达的抑制
图6蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达的抑制
图7蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞IL-6mRNA表达的抑制
图8肝的病理切片，其中8-1为LPS对照组，8-2为蜂毒肽/LPS处理组
图9肠粘膜的病理切片，其中9-1为LPS对照组，9-2为蜂毒肽/LPS处理组
图10肺的病理切片，其中10-1为LPS对照组，10-2为蜂毒肽/LPS处理组
图11肾的病理切片，其中11-1为LPS对照组，11-2为蜂毒肽/LPS处理组。
在图5中M：Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3：LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4：LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5：LPS+蜂毒肽(40μmol/L)
在图6中M：Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3：LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4：LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5：LPS+蜂毒肽(40μmol/L)
在图7中M：Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3：LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4：LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5：LPS+蜂毒肽(40μmol/L)
具体实施方式
下面是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
实施例1：蜂毒肽的合成
1.1蜂毒肽树肽脂的合成：称取Fmoc-L-Lys-PEG-PS树脂(或其它多肽合成树脂)0.05mmol倒入合成柱中，加入约15ml精制二甲基甲酰胺(DMF)溶胀30min，另取1.0mmol二异丙基乙胺(DIPEA)50ml(8.7mlDIPEA+41.3ml DMF)、0.5mmol氮杂苯并三唑甲基脲六氟磷酸盐(HATM)50ml(9.5g HATM+40.5ml DMF)和含20％六氢吡啶的DMF(Deblock液)适量分别加入试剂瓶中，再按本发明所述蜂毒肽氨基酸序列依次称取2mmol的Fmoc-氨基酸于适宜的容器中。按照merrifield发明的固相化学合成方法依照蜂毒肽氨基酸序列从C端开始依次进行在合成柱中加入Deblock液脱肽树脂Fmoc保护基团、加入适量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分别加入适量DIPEA、HATM于柱中进行偶连反应、偶连后合成柱中的肽树脂用DMF洗去残余的Fmoc-氨基酸、惰性气体吹干等制备过程，如此循环完成整个蜂毒肽的肽链形成而得到其肽树脂；从合成柱中取出蜂毒肽肽树脂，置到冷冻干燥机中冻干，得到肽树脂备用。
1.2蜂毒肽肽树脂的裂解
取上述肽树脂0.5g于适宜的容器中，加入5ml裂解液(4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1，2-乙二硫醇)，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩至1/2体积后，滴加入10倍量预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清，沉淀用适量冰醋酸溶解，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽。
1.3蜂毒肽粗肽的纯化
取蜂毒肽粗肽加入适量无热源水溶解，得到0.5mg/ml的样品溶液，用针头式过滤器过滤样品液，收集滤液于一小烧杯中；将乙腈及无热源水用0.45μ滤膜过滤，分别加入0.1％的三氟乙酸，混匀，按以下色谱条件进行纯化：
柱：C18反相柱
流动相A：100％H2O+0.1％三氟乙酸
流动相B：100％乙晴+0.1％三氟乙酸(0→15min梯度洗脱)
得蜂毒肽INLKAIAALAKKLL-NH2，精肽60mg。
以下实施例2-实施例8为采用实施例1所述的方法制得的蜂毒肽进行的实验，用于说明蜂毒肽的药用效果。
实施例2：蜂毒肽对大肠杆菌ATCC25922活菌/LPS攻击小鼠的保护作用
2.1实验方法：将昆明系小鼠随机分为5组，每组20只，蜂毒肽对照组、活菌对照组和LPS对照组分别经尾静脉注射蜂毒肽(3mg/kg)、大肠杆菌ATCC25922(2×109CFU/20g体重)和LPS 20mg/kg；蜂毒肽/活菌处理组在注射活菌(2×109CFU/20g体重)20s内注射蜂毒肽(3mg/kg)，蜂毒肽/LPS处理组在注射蜂毒肽3mg/kg 10秒后注射LPS 20mg/kg。注射总体积为200μl/20g体重。观察小鼠3天内死亡情况。
2.2实验结果：蜂毒肽处理组小鼠精神状态一度萎靡但恢复较快，食欲、活动度及对外界刺激的反应性在较短时间内得到改善，并好于活菌/LPS对照组，其3天存活率与活菌/LPS对照组相比有显著性差别。蜂毒肽对照组与正常小鼠相比无明显改变。效果对比见图1。
实施例3：蜂毒肽的抗菌作用
3.1实验方法：采用微量稀释法，检测蜂毒肽对18株细菌的抗菌活性并与其它抗生素比较。①取大肠杆菌ATCC25922接种于LB培养液中，37℃培养18h，再转移至新鲜培养液中培养4h，用LB培养液调整菌液浓度至1×105CFU/ml。②取96孔培养板，以8孔为一列，共计12列。第一列加菌液200μl，第2列至第11列加菌液100μl，最后一列加LB培养液100μl作阴性对照。③取蜂毒肽及6种等抗生素，各以生理盐水稀释为10.24mg/ml。④第一行为蜂毒肽倍比稀释用，第1孔加入10μl的蜂毒肽，混匀后吸出100μl加到第2孔中，依次倍比稀释至第10孔，吸出100μl弃去。第11孔未加抗生素作为阳性对照。各孔蜂毒肽的最终含量依次为512，256，128，64，32，16，8，4，2，1μg/ml。同法处理其它抗生素，每一行作为一种药物对该细菌的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)测定。⑤培养板置35℃孵育20h后阅读结果：读取阳性和阴性对照管，见阴性对照孔清亮，阳性对照孔混浊，再读取MIC。抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对细菌的MIC。⑥MBC读取：将培养板继续置35℃孵育20h后阅读结果，抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对细菌的MBC。⑦同法观察蜂毒肽和其它抗生素对其余菌株的MIC及MBC。
3.2实验结果：如表1所示。
表1 蜂毒肽对18株细菌的MIC和MBC检测
| 菌种 | 蜂毒肽 | 青霉素钠 | 头孢唑啉钠 | 头孢拉定 | 头孢噻肟 | PMB | 泰能 |
| 大肠杆菌1#大肠杆菌2#大肠杆菌3#大肠杆菌4#大肠杆菌5#大肠杆菌35218大肠杆菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC25923金黄色葡萄球菌1#金黄色葡萄球菌2#金黄色葡萄球菌3#铜绿假单胞菌ATCC27853铜绿假单胞菌1#肺炎克雷伯杆菌1#肺炎克雷伯杆菌2#鲍曼不动杆菌#阴沟肠杆菌#奇异变形杆菌# | 64/12832/128＞512326416/328/168/16128164/864/12864/12812864/12816/3264＞512 | ＞512＞512＞512＞512＞512＞512128/256512＞51232/256256＞512＞512＞512＞512＞5l2＞512256/512 | 512512＞51216/64＞512648/1282＞5128512＞512＞512＞512＞512＞512＞51216/64 | 512512＞51216＞51232/12816/324/8＞5124/322＞512＞512＞512＞512＞512＞51216/32 | ＞512＞512＞5121＞51211/21/25122232/64256/512＞512512/＞512128/512512/＞5122 | 14/32＞51216/644/164/162/3264/25632128128＞51232/648/168/32256/5121＞512 | 111/21/21/411/21/28/16112/816/642/44/324/82/84/8 |
注：数据以MIC/MBC表示，无“/”表示MIC同MBC，”#”为临床分离菌株。
实施例4：蜂毒肽对小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发的抑制
4.1实验方法：分离纯化小鼠腹腔巨噬细胞于24孔培养板，其LPS的刺激浓度为400ng/ml，蜂毒肽的干预浓度分别为5、10、20、40μmol/L，依照细胞色素C还原法，用紫外分光光度计检测超氧阴离子(O2 -·)产量和NADPH氧化酶活性；另莹光法检测过氧化氢(H2O2)产量。
4.2实验结果：蜂毒肽对小鼠腹腔巨噬细胞活性氧的产生有抑制作用，同时对其细胞膜上NADPH氧化酶有显著的抑制作用，这可能是其抑制活性氧产生的机制，见表2。
表2 蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞产生活性氧和NADPH氧化酶活性的抑制
| 组别 | O2 -·(μmol/L) | H2O2(μmol/L) | NADPH氧化酶活性(％) |
| 对照组LPS组蜂毒肽处理组5μmol/L10μmol/L20μmol/L40μmol/L | 0.94±0.25▲▲3.22±0.18**2.32±0.16**▲1.38±0.36▲▲1.23±0.31▲▲0.69±0.23▲▲ | 15.18±4.13▲▲72.03±4.81**60.85±6.48**▲49.93±3.50**▲▲44.98±3.75**▲▲36.15±7.01**▲▲ | 31.91±6.91▲▲100±12.05**78.03±9.08**▲72.64±10.01**▲62.05±11.97**▲▲39.98±6.86▲▲ |
与对照组比较：*P＜0.05** P＜0.01；与LPS组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01
实施例5：蜂毒肽与LPS亲和力的检测
5.1实验方法：根据Thermo公司疏水样品池的包被流程，将LPS包被在疏水样品池中，分别以不同浓度的蜂毒肽(750、375、187.5、93.75、46.9nmol/L)、PMB(130、65、32.5、16.3、8.2、4.1、2.05nmol/L)为流动相，与疏水样品池中的LPS结合，并通过FASTplot和FASTfit作图，测定其亲和力。
5.2实验结果：结果见图2、图3，在不同浓度蜂毒肽与LPS发生结合反应的亲和图基础上，通过FASTfit程序计算其与LPS结合的Kd值为4.84×10-7M，而PMB的Kd值为1.89×10-8M。
实施例6：蜂毒肽体外中和LPS的活性
6.1实验方法：将相应终浓度的蜂毒肽和PMB(均为5、10、20、40μmol/L)分别与终浓度为2ng/ml的LPS 37℃孵育30min后，采用动态浊度法鲎试验检测孵育后的LPS值，对照组加等量无热原水，依据上述浓度药物孵育后所测得的LPS值计算蜂毒肽和PMB对LPS的中和率，每个浓度重复检测4次。具体操作按EDS-99细菌内毒素测定系统说明书进行。
6.2实验结果：蜂毒肽具有中和LPS的活性，其中和作用弱于PMB，在40μmol/L水平约为PMB的一半。统计学分析表明蜂毒肽在5μmol/L水平对2ng/ml的LPS有显著的中和作用(P＜0.05)，在20μmol/L水平其中和作用非常显著(P＜0.01)(见图4)。
实施例7：蜂毒肽对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、TNF-α和IL-6mRNA表达的抑制
7.1实验方法：分离纯化小鼠腹腔巨噬细胞，置于6孔细胞培养板中，每孔3×106个细胞。将腹腔巨噬细胞与不同浓度的蜂毒肽(0、10、20、40μmol/L)预先孵育2h后，加入LPS(终浓度100ng/ml)继续孵育4h后，提取腹腔巨噬细胞RNA采用RT-PCR进行mRNA表达的测定。
7.2实验结果：如图5、6、7所示，蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞的TLR4、TNF-α、IL-6mRNA的表达有明显的抑制作用。
实施例8：蜂毒肽对脓毒症模型大鼠的脏器保护作用
8.1实验方法：将大鼠随机分为2组，每组8只，LPS对照组经静脉注射LPS 1mg/kg；蜂毒肽/LPS处理组在注射蜂毒肽3mg/kg 10秒后注射LPS 1mg/kg。观察大鼠3天后肝、肠、肺、肾的病理变化。
8.2实验结果：LPS对照组大鼠肝、肠、肺、肾总体上充血明显，蜂毒肽/LPS处理组则充血、炎症细胞浸润情况明显改善，详见图8-图11对照情况。
经过上述具体实施例的详细说明，我们能够得出：本发明所述的蜂毒肽可用于制备抗细菌药物；可用于制备抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和奇异变形杆菌感染药物；可用于制备内毒素所致疾病中对内毒素进行中和拮抗药物；可用于制备内毒素所致疾病中抑制细胞呼吸爆发的药物；最后达到治疗脓毒症疾病的效果。
Claims (6)
1、蜂毒肽，类型为氨基酸；分子类型为肽；分子的序列由氨基酸的一字简码组成，表示如下：INLKAIAALAKKLL-NH2。
2、权利要求1所述的蜂毒肽在用于制备抗细菌药物中的应用。
3、权利要求1或2所述的蜂毒肽在用于制备抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和奇异变形杆菌感染药物中的应用。
4、权利要求1所述的蜂毒肽在用于制备内毒素所致疾病中对内毒素进行中和拮抗药物中的应用。
5、权利要求1所述的蜂毒肽在用于制备内毒素所致疾病中抑制细胞呼吸爆发的药物中的应用。
6、权利要求1所述的蜂毒肽在用于制备治疗脓毒症药物中的应用。
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