CN1308086A - 抗菌/抗内毒素模拟肽、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过计算机模拟设计、人工合成的66个抗菌/抗内毒素模拟肽,根据对BPIN端三个LOOP区的空间构象分析及物理化学性质分析,在计算机辅助下进行模拟多肽的分子设计,设计出具有中和LPS活性的多肽分子,用固相多肽化学合成方法合成抗菌/抗内毒素模拟肽,本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽具有全部或部分BPI的生物功能,可以用于治疗G－细菌感染、人内毒素血症,具有分子量小、可以稳定重复生产的特点。
Description
本发明涉及抗菌/抗内毒素模拟肽、其制备方法及其在医药学上的应用，特别是通过计算机模拟设计、人工合成的抗菌/抗内毒素模拟肽，以及用于治疗G-细菌感染、人内毒素血症。
革兰氏阴性(G-)杆菌脓毒症和休克是导致临床病人死亡的主要原因之一，特别是伴有严重内毒素(Lipopolysaccharide,endotoxin,LPS)血症的G-杆菌的感染。G-菌菌血症的病死率为20～30％，而由菌血症发展而来的脓毒症休克其病死率可高达50-80％。而针对内毒素血症的治疗，临床上尚无有效措施，因此导致感染性疾病的治疗更为棘手，因此研究其发病机理并寻找有效的治疗措施一直是临床医学关注的焦点。
近年来，随着对G-杆菌感染研究的深入，存在于G-杆菌外膜上内毒素的作用日益受到重视。LPS被认为是脓毒症休克病人死亡原因——失控性炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome.SIRS)和代偿性抗炎症综合征(Compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS)的启动子。进入血中的内毒素其主要生物学作用包括以下几个方面①与巨噬细胞接触后能诱生、释放多种炎症介质如TNF、IL-1等，通过这些介质直接或间接发挥局部及全身效应。②同时内毒素分子亦可与多种组织、实质细胞结合直接导致细胞损伤。③激活凝血、纤溶、补体系统，诱发DIC。④作用于α-受体，促使肾上腺儿茶酚胺分泌，导致微循环障碍、血浆外渗，直至发生休克以及其它如发热、白细胞减少，Shwartzman反应等。在复杂的炎症反应网络中，分别针对TNF、IL-1等各种炎症因子的调控措施也不断提出，但结果令人失望，其主要原因在于各种不同的炎症因子相互作用密不可分，仅针对某个或数个细胞因子并不能解决问题。因此抓住矛盾的主要方面——LPS，寻找解决问题的突破点意义重大。
国内外有关内毒素的研究发现：内毒素存在于G-杆菌的细胞膜上，其主要化学成分为脂多糖。其基本构成为O-特异性侧链，核心多糖、类脂A三部分。其中类脂A是毒素的活性中心。主要生物学作用为刺激单核-吞噬细胞系统诱生、释放多种炎症介质如TNF、IL-1等，通过这些介质启动炎症反应网络并直接或间接发挥局部及全身效应。
近十余年来，国际上针对G-杆菌感染所伴随的内毒素血症及SIRS的防治研究，主要有抗内毒素核心糖脂(Lipid A)的多抗、单抗、各种抗细胞因子抗体及受体拮抗剂，如抗TNF抗体、抗白细胞介素Ⅰ(IL-1)抗体、抗IL-6抗体以及NO拮抗剂等。在动物实验研究中，上述制剂对脓毒症所致的脏器损伤有一定的保护作用，但在临床试验中都因疗效不确切而未获美国FDA批准。
杀菌性/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeabilityincreasing protein,BPI)是一种存在于人及哺乳动物PMN嗜天青颗粒中的带正电荷的阳性蛋白质，分子量约55kDa，由456个氨基酸组成，具有杀灭G-细菌和中和LPS的能力，是目前最有希望成为应用于临床的制剂，受到国外众多学者和制药企业的关注。目前已证实BPI对许多G-细菌包括大肠杆菌属、绿脓杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、奈瑟氏菌属等发挥杀菌作用；BPI还可与G-细菌胞膜上的LPS特异结合，抑制游离LPS的活性。BPI N-末端1-199个氨基酸残基片段(BPI23)具有完整BPI的全部生物活性，其变构体BPI21除具有BPI23的生物活性外，对部分G+球菌如耐药金葡菌、链球菌具有杀菌活性，并且结构更稳定。由美国研制的重组BPI23/21已进入临床研究，初步临床研究表明BPI可明显降低血内细菌数、改善心脏指数、动脉氧分压、血压、降低血浆内毒素水平、提高动物生存率。国外重组BPI23(rBPI23，见1992,Infect.Immun.60:4754-4761)及其突变体(rBPI21)的开发研究已进入Ⅲ期临床试验，初步结果证明，rBPI23和rBPI21对严重G-细菌感染有显著疗效。但是rBPI23和rBPI21对G-细菌感染和LPS血症的治疗，存在用药量大、成本居高不下，难以推广的问题。
中国专利申请94191894和94194835涉及杀菌性通透性增强蛋白的功能区的生物活性肽及其应用，其中公开了具有的氨基酸序列为人杀菌/增强通透性蛋白质(BPI)功能区的氨基酸序列或其亚序列的肽，以及该序列的变异体或其亚序列，它们具有至少一种BPI的生物学活性，如肝素结合、肝素中和、LBS结合、LPS中和或杀菌活性，并提供了用于各种治疗用途的肽和该肽的药用组合物。
尽管对内毒素的研究较多，但临床上尚无一种能够安全有效地用于治疗内毒素血症的药物。因此，将重点放在中和内毒素上从而达到降低感染死亡率的目的具有非常重要的意义。
本发明的目的在于提供一系列抗菌/抗内毒素模拟肽，具有杀菌和中和LPS活性。
本发明的另一个目的在于采用固相多肽化学合成方法，合成上述抗菌/抗内毒素模拟肽，得到具有生物学活性的多肽分子。
本发明的再一个目的在于研究抗菌/抗内毒素模拟肽用于治疗G-细菌感染、人内毒素血症，以便探索既能杀菌又能中和内毒素的新药物。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：通过目前已知在自然界生物体内存在的具有结合内毒素活性的物质，如BPI、LBP、LAF等，对其进行同源性分析，在BPI三维结构的基础上，通过计算机模拟研究推测其可能的结构功能关系，并在计算机辅助下进行模拟多肽的分子设计。发现人和兔的内毒素结合蛋白BPI与LBP的同源性最高；对BPI分子的一级序列亲疏水性分析发现，BPI分子的一级序列主要由疏水性氨基酸组成；对BPI分子的三维结构分析发现，BPI分子(456 aa)是一个13.5nm×3.5nm×3.5nm大小的回飞棒形(boomerang-shaped)蛋白，其由两个结构相似的结构域组成，之间由一个脯氨酸富集的21肽连锁连接，并测定了BPI分子N端LOOP的三维结构图；另外，本发明还对BPI分子的表面静电势进行了计算分析，发现N端的3个LOOP区集中了不少正电氨基酸，其表面静电势正电分布更显著；对其一级结构乃至三级结构进行分析比较，找出与内毒素结合的结构域为N端结构域LOOP区，在计算机辅助下进行模拟多肽的分子设计，模拟设计出具有更强杀菌和中和LPS活性的多肽分子。
本发明采用Merrifield创建的固相多肽化学合成方法，通过Fmoc保护的氨基酸方法或Tboc保护的氨基酸方法人工合成或通过自动多肽合成仪进行本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽的合成，得到一系列本发明设计的抗菌/抗内毒素模拟多肽。得到的多肽须经过高压液相(HPLC)纯化，并经质谱鉴定和生物活性鉴定。
本发明还通过测定本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的体内外杀菌活性、体外拮抗内毒素活性、体外抑制内毒素诱导的人单核细胞肿瘤坏死因子(TNF-a)和白细胞介素6(IL-6)产生的活性、对内毒素攻击小鼠的死亡保护作用、对大鼠内毒素血症的治疗作用、模拟肽对大肠杆菌攻击小鼠的死亡保护作用、模拟肽对大鼠脓毒症的治疗作用，以便研究其用于治疗G-细菌感染和人内毒素血症。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
附图说明：
图1．BPI及其同源蛋白的一级序列的多重序列对比结果
图2．BPI分子的一级序列亲疏水性分析
图3．BPI分子的三维结构分析
图4．BPI分子的三维结构分析
图5．BPI分子N和C端LOOP的三维结构分析
图6．BPI分子N端LOOP的三维结构图
图7．BPI分子的表面静电势分布
图8．抗菌/抗内毒素模拟肽BNEP9800892的体外杀菌活性
图9．抗菌/抗内毒素模拟肽对J5大肠杆菌的体外杀菌活性
图10．抗菌/抗内毒素模拟肽体内杀灭大肠杆菌的活性
图11．抗菌/抗内毒素模拟肽降低体内血清TNF-a浓度的活性
图12．抗菌/抗内毒素模拟肽体外拮抗内毒素活性定性实验
图13．抗菌/抗内毒素模拟肽体外拮抗内毒素活性定量实验
图14．抗菌/抗内毒素模拟肽对LPS诱导的THP-1细胞TNF-a分泌的影响
内毒素刺激细胞2小时后不同剂量模拟肽抑制TNF-a分泌情况
图15．抗菌/抗内毒素模拟肽对LPS诱导的THP-1细胞IL-6分泌的影响
内毒素刺激细胞2小时后不同剂量模拟肽抑制IL-6分泌情况
图16．不同抗菌/抗内毒素模拟肽对LPS诱导的大鼠TNF-a释放抑制情况
图17．不同抗菌/抗内毒素模拟肽对LPS诱导的大鼠IL-6释放抑制情况
图18．BNEP9801042肽样品的质谱分析图
图19．BNEP9901537肽样品的质谱分析图
图20．BNEP9901536肽样品的质谱分析图
下面是本发明的详细描述。
本发明中计算机模拟所用工作站为SGIIndigo2系列Solid Impact R1000图形工作站，模拟系统为Biosym/MSI分子模拟系统。所有工作均在INSIGHT Ⅱ工作平台上进行，静电势计算所用软件为DelPhi。蛋白质一级序列搜索所用软件为FASIA程序，蛋白序列库为EMBL(European Molecular Biology Laboratory)的SWISS-PROT蛋白序列库(Release 34,October 1996)。
本发明在BPI三维结构的基础上，通过计算机模拟研究推测其可能的结构功能关系，并在计算机辅助下进行模拟多肽的分子设计。通过同源性分析、BPI分子的一级序列亲疏水性分析、BPI分子的三维结构分析、BPI分子的表面静电势计算分析等模拟结果表明，BPI的生物学功能区主要定位在N端的三个LOOP区，而且其与受体的主要作用方式是静电作用。因此根据对BPI N端三个LOOP区的空间构象分析及物理化学性质分析制定的模拟肽设计方案为：1．两端为强正电势分布的螺旋结构；2．正电势分布的转角螺旋结构；3．正电势分布的强螺旋折叠倾向结构；4．BPI N端LOOP区天然肽段的改善型结构。通过计算机模拟得到适合本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽。本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽序列最短者为7个氨基酸多肽，序列最长者为28个氨基酸多肽；类型为氨基酸；拓扑结构为线性；分子类型为肽；分子的序列由氨基酸的一字简码组成。如表1所示。
表1本发明的66个抗菌/抗内毒素模拟多肽分子的序列
编号 序列 理论值 实测值BNEP9600139: KSKAQKRFLK MW:1233.5 1233BNEP9600257: KIKGGFLFHKK MW:1302.6 1302.4BNEP9600258: KRPSVTSPRK MW:1155.3 1356BNEP9600301: KSKVLGK MW:758.9 761BNEP9600307: KSKVLGKAQKRFLK MW:1631.0 1630.5BNEP9600308: KSKVLGKRFLK MW:1303.6 1302.8BNEP9700031: KGKVLGKAQKRFLK MW:1600.9 1602BNEP9700032: KGKVLGKFLK MW:1117.4 1118.1BNEP9700055: KGKVLGK MW:728.9 728.5BNEP9700145: KTKVLGK MW:773.0 773.0BNEP9700146: KLKVLGK MW:785.0 784.2BNEP9701047: RRAKVFIKM MW:1148.4 1150.1BNEP9800431: RLKLILKSK MW:1098.4 1100.1BNEP9800433: KSVLILWKSK MW:1201.5 1202.5BNEP9800637: KSKVGILLQLVRKR MW:1638.0 1637.5BNEP9800638: KSKFVILLQLGHKFK MW:1786.2 1786.4BNEP9800723: KSKVGWLIQLFHKKKTKGGWLIQLFHKK MW:3378.0 3380BNEP9800892: KIKHLGKKSKVGFLQLLFHKK MW:2478.0 2482.3BNEP9800895: KIKHLGKKTKGGWLIQLFHKK MW:2489.0 2490.1BNEP9800993: KKVGWLIQLFHKKIE MW:1876.2 1875.5BNEP9801013: KSKVGFLQLLFHKKLRGSLTKLKG MW:2727.3 2728.0BNEP9801042: SKVGWLILLFHKKIE MW:1811.2 1810.1BNEP9801043: KSKVGWLILLFHKK MW:1697.0 1696.1BNEP9801047: KIKHLGLFHKK MW:1348.1 1385.0BNEP9801087: KSKVGFLIQLFHKK MW:1673.0 1675.1BNEP9801095: KTKVGFLIQLFHKK MW:1687.0 1685.1BNEP9801161: KGKVGFLIQLFHKK MW:1643.0 1645.2BNEP9801174: KSKGGWLQLLFHKK MW:1670.0 1668.4BNEP9801175: KGKGGWLQLLFHKK MW:1639.0 1642.0BNEP9801286: KTKGGFLQLLFHKK MW:1643.0 1641.2BNEP9801287: KGKGGFLQLLFHKK MW:1600.9 1600.5BNEP9801289: KSKGGFLQLLFHKK MW:1630.9 1629BNEP9901311: KGKGGWLIQLFHKK MW:1639.9 1641.5BNEP9901312: KSKGGWLIQLFHKK MW:1670.0 1669.5BNEP9901315: KTKGGWLIQLFHKK MW:1684.0 1682.8BNEP9901317: KGKVGFLQLLFHKK MW:1643.0 1643.0BNEP9901318: KTKVGFLQLLFHKK MW:1687.0 1688.5BNEP9901319: KSKVGWLQLLFHKK MW:1712.0 1715.8BNEP9901320: KGKVGWLQLLFHKK MW:1682.0 1688.2BNEP9901321: KTKVGWLQLLFHKK MW:1726.1 1729.5BNEP9901496: KIKHLGKAQKRFLK MW:1695.1 1692.5BNEP9901501: KSKSGFLQLLFHKK MW:1661.0 1661.5BNEP9901534: KSKAAWLLQLFHKK MW:1698.0 1689.7BNEP9901536: KSKSAFLLQLFGKK MW:1594.9 1596.4BNEP9901537: KSKAAFLQLAFKSK MW:1566.9 1568.3BNEP9901538: RSKAAFLQLAFKSK MW:1594.9 1596.1BNEP9901539: RSKSAFLLQLFGKK MW:1622.9 1621.4BNEP9901541: RSKSAFLLQLFGKR MW:1650.9 1653.4BNEP9901595: RSKAAFLQLAFKSR MW:1622.9 1622.8BNEP9901602: FCKIKHLGKCY MW:1339.6 1338.5BNEP9901603: FCKIKHLGKCR MW:1332.6 1335.4BNEP2001606: KCKIKHLGKCR MW:1313.6 1315.2BNEP2001627: FCKIKHLGKCKK MW:1432.8 1435.7BNEP2001628: KCKIKHLGKCKK MW:1413.8 1417.8BNEP2001629: KCKIKHLGKCY MW:1320.6 1324.7BNEP2001630: FCKIKHLGKCR MW:1332.6 1332.6BNEP2001671: KCAQKRFLKMCK MW:1483.9 1485.2BNEP2001677: YCAQKRFLKMCY MW:1553.9 1552.8BNEP2001678: RCAQKRFLKMCY MW:1546.9 1548.1BNEP2001681: KCKNLQRPLKLNQKCR MW:1970.3 1972.5BNEP2001695: KGKGGFLIQLFHKK MW:1600.9 1602.1BNEP2001708: RRPLIQLVKK MW:1250.5 1253.4BNEP2001756: KKKILQLLKK MW:1239.6 1242.1BNEP2001757: RRPILPRR MW:1063.3 1063.8BNEP2001758: KSKHLGKAQKRFLK MW:1669.0 1671.8BNEP2001784: KIKVLFHKSK MW:1227.5 1228.6
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽，还可以是上述66个多肽中，至少两个相同或不同的肽相连组成的多肽。
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽，还可以是端基或侧链经过化学修饰的上述66个多肽，如生物学可接受的上述抗菌/抗内毒素模拟肽的盐、酯、酰胺、杂环、烷基等。
Merrifield创建的固相多肽化学合成方法(Merrifield RB.1963 J Am Chem Soc.85:2149)已发展成为一种成熟的众所周知的固相多肽化学合成技术。应用该技术，可以合成本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽，具体为：
1．肽树脂的合成
称取适量Fmoc-L-Lys-PEG-PS树脂(或其它多肽合成树脂)倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，按照本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽的氨基酸序列依次称取适量的Fmoc-氨基酸于适宜的容器中。按照merrifield发明的固相化学合成方法依照本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成柱中加入含20％六氢吡啶的DMF Deblock液脱肽树脂Fmoc保护基团、加入适量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分别加入适量二异丙基乙胺(DIPEA)和氮杂苯并三唑甲基脲六氟磷酸盐(HATU)的DMF溶液于柱中进行偶连反应、偶连后合成柱中的肽树脂用DMF洗去残余的Fmoc-氨基酸、惰性气体吹干等制备过程，如此循环完成整个抗菌/抗内毒素模拟肽的肽链形成而得到其肽树脂；从合成柱中取出合成的抗菌/抗内毒素模拟肽树脂，置到冷冻干燥机中冻干，得到肽树脂备用。
2．肽树脂的裂解
取上述肽树脂于容器中，加入裂解液：4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1,2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩后，加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用适量冰醋酸溶解，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽。
3．粗肽的纯化
取BNEP粗肽加入适量无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％的三氟乙酸，混匀，用C18反相柱，流动相A：100％H2O+0.1％三氟乙酸；流动相B：100％乙晴+0.1％三氟乙酸，0→15min梯度洗脱纯化，得BNEP精肽。
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽也可以采用适合本发明的其他化学、仪器或生物化学方法合成。
体内外试验表明，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽在体外对E.coli β+-HI、E.coli J5、E.coli V517、MSSA25923、PSPNC49619、PA103等细菌和大肠杆菌均有不同程度的杀菌活性；动物实验表明，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽可明显降低血清中TNF-α高峰浓度，具有延长脓毒症动物生存时间、提高动物生存率的作用；在体外，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对LPS在体外均具有不同程度有中和作用，不同的BNEP对LPS的中和作用存在差异，对内毒素诱导的人单核细胞肿瘤TNF-α和IL-6的分泌均具有不同程度的抑制作用；动物试验表明，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对内毒素攻击小鼠均具有不同程度的保护作用，对内毒素介导的大鼠TNF-α和IL-6的产生均具有不同程度的抑制作用，对大鼠内毒素血症具有治疗作用。可以用于治疗G-细菌感染和人内毒素血症。
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽可以辅以药用稀释剂、佐剂及载体制成药用组合物，如片剂、粉剂、丸剂、溶液或悬浮剂，通过口含、注射或其他方式给药，用于治疗G-细菌感染和内毒素血症；本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽还可以与其他药物复合，用于治疗G-细菌感染和内毒素血症。
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽作为稀释剂、佐剂及载体用于治疗G-细菌感染和人内毒素血症。
至少两个相同或不同的本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽相连成一个肽，用于治疗G-细菌感染和内毒素血症。
另外，至少两个相同或不同的本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽相连成一个肽，可以作为稀释剂、佐剂及载体用于治疗G-细菌感染。
下面是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
实施例1
1．同源性分析
为了更深入理解具有结合内毒素活性BPI分子的生物学功能及其与蛋白质三维结构之间的相关性，本发明以BPI分子的一级序列为探针在PDB库和SWISS-PROT序列库中进行同源搜索并对找到的同源蛋白序列进行多重序列对比。结果发现有6个同源蛋白序列，它们分别是牛的BPI分子，人和鼠的磷脂转移蛋白(PhospholipidTransfer Protein PLTP)分子，人和兔的内毒素结合蛋白(Lipopolysacchride BindingProtein LBP)分子及兔的胆甾醇脂转移蛋白(Cholesteryl Ester Transfer Protein CETP)分子，如图1所示，其中BPI与LBP的同源性最高。图1中列出BPI探针与6种具有明显同源性的蛋白序列的序列联配的结果。
2．BPI分子的一级序列亲疏水性分析
BPI分子的一级序列亲疏水性分析如图2所示，其中的横坐标为氨基酸残基的序列标号，纵坐标为疏水性分值。横线以上为亲水区域，横线以下为疏水区域。可见BPI分子的一级序列主要由疏水性氨基酸组成。
3．BPI分子的三维结构分析
见图3-5，根据测定的BPI三维结构，全长BPI分子(456aa)是一个13.5nm×3.5nm×3.5nm大小的回飞棒形(boomerang-shaped)蛋白。其由两个结构相似的结构域组成，即N端结构域(1～229)和C端结构域(251～456)，两个结构域之间由一个脯氨酸富集的21肽linker连接。两个结构域形成三个结构单元，一个中央β折叠片和N端C端两个桶状结构(10～193和260～421)，每个桶状结构包含三个二级结构单元，一个短α螺旋，一个包含5个折叠股的反向平行的β折叠片和一个长的α螺旋。两个结构域的结构叠合显示二者相对方位角度为173°,169个Cα原子的距离均方偏差(RMSD,root-mean-square deviation)为0.3nm，但两个结构域的LOOP区的构象相差较大。LOOP区的构象差异可能反映了两个结构域功能上的不同，因为N端结构域具有LPS结合能力而C端不具备这种活性。N端结构域LOOP区由分别位于第17～45,65～99和142～169区域内的部分氨基酸序列呈花瓣状组成，见图6。尽管BPI分子N端结构域和C端结构域很相似，但其氨基酸序列的同源性残基百分比却不足20％。因此两个结构域的这种不寻常的结构相似性可能还具有更深一层的意义，即它们很可能共有某种目前还未发现的生物学功能。
4．BPI分子的表面静电势计算分析
静电势计算发现，BPI分子的C端(250～465)的静电势分布主要是负电势，而N端(1～230)则主要为正电势，见图7。蛋白之间的相互作用主要通过表面残基来实现，因此我们着重分析BPI分子的表面静电势分布情况，BPI分子的溶剂及表面用Connolly法生成，即用一半径为0.14nm的探针分子(水分子大小)在BPI分子的表面滚动，滚动中探针分子的中心所形成的表面即为BPI分子的溶剂可及表面，BPI分子的表面静电势分布仍然是N端正、C端负。图中浅色代表正静电势区，深色代表负静电势区，见图7。特别是N端的3个LOOP区集中了不少正电氨基酸，其表面静电势正电分布更显著。
实施例2
本实施例涉及抗菌/抗内毒素模拟肽的分子设计及合成方法
本发明在BPI三维结构的基础上，通过计算机模拟研究推测其可能的结构功能关系，并在计算机辅助下进行模拟多肽的分子设计。模拟结果表明BPI的生物学功能区主要定位在N端的三个LOOP区，而且其与受体的主要作用方式是静电作用。因此根据对BPI N端三个LOOP区的空间构象分析及物理化学性质分析制定的模拟肽设计方案为：1．两端为强正电势分布的螺旋结构；2．正电势分布的转角螺旋结构；3．正电势分布的强螺旋折叠倾向结构；4．BPIN端LOOP区天然肽段的改善型结构。
通过计算机模拟，本发明共得到66个抗菌/抗内毒素模拟多肽分子，序列见表1。
实施例3
以BNEP 9901315为例，说明本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的合成方法。
1.0.05mmolBNEP 9901315肽树脂的合成
称取Fmoc-L-Lys-PEG-PS树脂(或其它多肽合成树脂)0.05mmol倒入合成柱中，加入约15ml精制二甲基甲酰胺(DMF)溶胀30min，另取1.0mmol二异丙基乙胺(DIPEA)50ml(8.7mlDIPEA+41.3ml DMF)、0.5mmol氮杂苯并三唑甲基脲六氟磷酸盐(HATU)50ml(9.5g HATU+40.5ml DMF)和含20％六氢吡啶的DMF(Deblock液)适量分别加入试剂瓶中，再按BNEP 9901315氨基酸序列依次称取2mmol的Fmoc-氨基酸于适宜的容器中。按照merrifield发明的固相化学合成方法依照BNEP 9901315氨基酸序列从C端开始依次进行在合成柱中加入Deblock液脱肽树脂Fmoc保护基团、加入适量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分别加入适量DIPEA、HATU于柱中进行偶连反应、偶连后合成柱中的肽树脂用DMF洗去残余的Fmoc-氨基酸、惰性气体吹干等制备过程，如此循环完成整个BNEP9901315的肽链形成而得到其肽树脂；从合成柱中取出BNEP 9901315肽树脂，置到冷冻干燥机中冻干，得到肽树脂0.391g备用。
2.BNEP9901315肽树脂的裂解
取上述肽树脂0.391g于适宜的容器中，加入5ml裂解液(4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1,2-乙二硫醇)，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩至1/2体积后，滴加入10倍量预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清，沉淀用适量冰醋酸溶解，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽73.9mg，收率为87.97％。
3．BNEP9901315粗肽的纯化
取BNEP粗肽加入适量无热源水溶解，得到0.5mg/ml的样品溶液，用针头式过滤器过滤样品液，收集滤液于一小烧杯中；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％的三氟乙酸，混匀，按以下色谱条件进行纯化：
柱：C18反相柱
流动相A：100％H2O+0.1％三氟乙酸
流动相B：100％乙晴+0.1％三氟乙酸(0→15min梯度洗脱)
得BNEP9901315精肽58.85mg，收率为79.63％。
实施例4-70
参照实施例3的方法合成表1中列出的其他65种抗菌/抗内毒素模拟多肽，质谱结果见表1。图18-20为BNEP9801042、BNEP9901537和BNEP9901536肽样品的质谱分析图。
实施例71
本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的体内外杀菌活性
1．本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的体外杀菌活性
1.1实验方法
将E.coli β+-HI、E.coli J5、E.coli V517、MSSA25923、PSPNC49619、PA103等细菌分别接种于M-H培养基中，37℃培养18小时，再转移至新鲜培养基中培养4小时，用M-H培养基调整细菌浓度至105cfu/ml。
表2抗菌/抗内毒素模拟肽样品倍比稀释后各管浓度
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 对照管 |
| 菌液(105cfu/ml)(ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 模拟肽样品(μg/ml) | 128 | 64 | 32 | 16 | 8 | 4 | 2 | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.125 |
取试管11支为1组并编号，除第一管加入细菌悬液2ml外，其余每管加入菌液1ml；在第一管内加入待测定样品128μg，混匀后用菌液等倍稀释至第11管，每管样品浓度见表2。37℃孵育30分钟后各取10μl均匀涂布于M-H固体培养基上37℃，培养18～24小时后进行菌落计数。
1.2实验结果
结果表明，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对所用细菌均有不同程度的杀菌活性，不同细菌对BNEP的敏感性存在较大差异；不同的BNEP对大肠杆菌J5的杀菌活性也存在差异(见图8-9)。
2．本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的体内杀菌活性
2.1实验方法
2.1.1大白鼠称重后肌肉注射1％戊巴比妥钠(0.5ml/kg体重)，待动物完全麻醉后，消毒大鼠尾静脉，静脉注射大肠杆菌J5，给予量为2×108cfu/kg体重，该大肠杆菌菌液总体积为1ml，5分钟内注射完毕。随机将250只大白鼠分为5组：(1)单纯脓毒症组(简称对照组)：仅给予大肠杆菌和生理盐水；(2)脓毒症模拟肽治疗组除给予大肠杆菌外，同时给予抗菌/抗内毒素模拟肽20mg/kg体重。分别在给予细菌或细菌+模拟肽后0、1、2、3、4、5小时观察动物生存率，幸存大鼠活杀取下腔静脉血。
2.1.2血液标本的处理
(1)10μl新鲜血液用生理盐水稀释一定倍数后，均匀涂布于M-H固体培养基，37℃培养18～24小时后作细菌菌落计数。
(2)不抗凝血：立即离心，2000rpm，15分钟，取血清，放置-70℃冰箱中待测。
(3)抗凝血：待血凝固后，2000rpm，15分钟，取血浆，置-70℃冰箱中待测。
2.1.3实验指标
(1)动物存活率的观察：观察各时相点各组动物存活情况。
(2)全血细菌计数：取新鲜血液10μl，用生理盐水梯度稀释后，吸取10μl，均匀涂布于M-H平板上，37℃孵育18～24小时，作菌落计数。
(3)血清TNF-α浓度的测定：按大鼠TNF-α酶联试剂盒说明操作(TNF-α试美国Biosource公司产品)。。
2.2实验结果
(1)本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽对大鼠脓毒症动物生存率的影响
本实验中给予大鼠的大肠杆菌J5菌量为2×108cfu/kg体重，菌量很大，一般大鼠4～5小时即全部死亡，给予模拟肽量为20mg/kg体重。从表3中可见，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽具有延长动物生存时间、提高动物生存率的作用。
表3本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对大鼠脓毒症动物生存率的影响
| 时间(小时) | 对照组 | 存活率(％) | |||
| 9901315 | 9901289 | 9901501 | 9901286 | ||
| 1.02.03.04.05.0 | 10010067200 | 1001001009080 | 10010010010090 | 10010010010090 | 100100100100100 |
(2)．全血大肠杆菌计数
大剂量大肠杆菌J5注入大鼠静脉后，大鼠全血细菌计数很快达到峰值，随即下降，抗菌/抗内毒素模拟肽治疗组动物全血中细菌计数仅为对照组的1/4，说明抗菌/抗内毒素模拟肽对降低全血细菌数量有很强的作用见图10。
3．血清TNF-α浓度的测定
血清TNF-α浓度在注射大肠杆菌J5 2小时后达到高峰，而本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽可明显降低TNF-α高峰浓度，并使TNF-α浓度一直处于较低的水平(图11)。
实施例72
本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的体内外中和LPS活性
1本发明的抗菌/抗内毒素模拟多肽的体外中和LPS活性
1.1实验方法
将LPS 0111:B4 1000pg加入去热原的10支玻璃试管中，再分别加入待鉴定的抗菌/抗内毒素模拟肽样品100μg，加入无热原生理盐水至终体积1ml，另设试剂对照和空白对照管，37℃孵育30分钟后按定量基质显色法鲎试剂盒(日本生化学工业株式会社)说明书进行操作，反应结束后用DU-7 Beckman紫外分光光度计545nm比色测定OD值。
同期进行标准曲线的制作：取LPS 1000pg于第一管，以等倍梯度稀释10管，LPS测定同上。
1.2．实验结果
结果表明，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对LPS在体外均具有不同程度有中和作用，不同的BNEP对LPS的中和作用存在差异(图例12-13)。
2．模拟肽体外抑制内毒素诱导的人单核细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)产生的能力
2.1实验方法
采用RPMI1640培养人单核细胞株(THp-1)，实验前一天调整细胞浓度为2×105/ml，接种于48孔培养板，分别设(1)对照组：采用LPS 0111:B4 2ng/ml刺激细胞；(2)处理组：取试管11支并编号，分别加入等倍稀释的待测样品，浓度从128μg/ml至0.125μg/ml；然后每管中再分别加入LPS 0111:B4，使其终浓度为lng/ml；37℃孵育30分钟后分别加于48孔培养板中，37℃,5％CO2下培养；分别于培养后0、1、2、4、6、8、12小时取上清测定TNF-α和IL-6浓度(TNF-α和IL-6试剂盒分别为法国Diaclone公司、美国Biosource公司产品)。
2.2结果
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对内毒素诱导的人单核细胞肿瘤TNF-α和IL-6的分泌均具有不同程度的抑制作用(图例14-15)。
3．本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对内毒素攻击小鼠死亡的保护作用
3.1实验方法
清洁级昆明种小鼠100只，雌雄各半，体重18-22g，随机分为10组：分别为对照组、地塞米松处理组和7个模拟肽处理组。对照组：单纯尾静脉注射LPS O111:B4 20mg/kg；地塞米松处理组：尾静脉注射LPSO111:B4 20mg/kg后注射地塞米松10mg/kg；模拟肽处理组：尾静脉注射LPS 20mg/kg后注射模拟肽5mg/kg。所有动物给药体积均为0.2ml/20g，共给药一次。
观察指标为动物7天死亡率。
3.2结果
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对内毒素攻击小鼠均具有不同程度的保护作用，见表例4。
表4本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对内毒素攻击小鼠的保护作用
| 分组 | 剂 量(mg/kg) | 实验动物(只) | 死亡动物(只) | P值 |
| LPS | - | 10 | 10 | |
| 地塞米松 | 10 | 10 | 2 | ＜0.01 |
| BNEP2001695 | 5 | 10 | 0 | ＜0.01 |
| BNEP9801287 | 5 | 10 | 1 | ＜0.01 |
| BNEP9901317 | 5 | 10 | 0 | ＜0.01 |
| BNEP9901315 | 5 | 10 | 5 | ＞0.05 |
| BMEP9801161 | 5 | 10 | 4 | ＞0.05 |
| BNEP9901321 | 5 | 10 | 1 | ＜0.01 |
| BNEP9801286 | 5 | 10 | 3 | ＜0.05 |
| BNEP9801174 | 5 | 10 | 6 | ＞0.05 |
| BNEP9801013 | 5 | 10 | 1 | ＜0.01 |
4．本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对大鼠内毒素血症的治疗作用
4.1实验方法
采用大鼠留置心导管术进行给药和取血
A：大鼠留置心导管术：动物经1％戊巴比妥钠4mg/100g体重腹腔麻醉后，每只动物先测量颈部切口至心脏的距离，以确定插管长度，颈部皮肤经常规备皮、消毒后，于颈外侧下颌至心脏的中点作一长约0.5cm的横切口，暴露颈外静脉后行静脉插管，导管固定后经皮下遂道至颈后引出并固定，管内注射12500u/100ml肝素0.2ml抗凝。
B：给药和取血
已置心导管24小时的Wistar大鼠28只，清洁级，雌雄各半，体重220-260g，随机分为7组，每组动物4只。对照组：经心导管注射LPS O111:B4 10mg/kg；模拟肽处理组：先经心导管注射LPS O111:B4 10mg/kg，后注射模拟肽10mg/kg。所有动物均共给药一次。于注射药物后0、1、2、4、6、12、24、48小时采血测TNF-α、IL-6(TNF-a和IL-6试剂盒分别为法国Diaclone公司、美国Biosource公司产品)。
4.2结果
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽对内毒素介导的大鼠TNF-α和IL-6的产生均具有不同程度的抑制作用(图例16-17)。
本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽，是分子量小、可以稳定重复生产的BPI模拟肽，本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽，是活性多肽分子，具有全部或部分BPI的生物功能，如杀菌和中和内毒性等活性，是一种及有前途的治疗G-细菌感染、人内毒素血症的药物，填补了该领域的空白。
Claims (9)
1．抗菌/抗内毒素模拟肽，其多肽序列为7-28个氨基酸多肽；类型为氨基酸；拓扑结构为线性；分子类型为肽；分子的序列由氨基酸的一字简码组成，66个模拟肽表示如下：
BNEP9600139: KSKAQKRFLK MW:1233.5
BNEP9600257: KIKGGFLFHKK MW:1302.6
BNEP9600258: KRPSVTSPRK MW:1155.3
BNEP9600301: KSKVLGK MW:758.9
BNEP9600307: KSKVLGKAQKRFLK MW:1631.0
BNEP9600308: KSKVLGKRFLK MW:1303.6
BNEP9700031: KGKVLGKAQKRFLK MW:1600.9
BNEP9700032: KGKVLGKFLK MW:1117.4
BNEP9700055: KGKVLGK MW:728.9
BNEP9700145: KTKVLGK MW:773.0
BNEP9700146: KLKVLGK MW:785.0
BNEP9701047: RRAKVFIKM MW:1148.4
BNEP9800431: RLKLILKSK MW:1098.4
BNEP9800433: KSVLILWKSK MW:1201.5
BNEP9800637: KSKVGILLQLVRKR MW:1638.0
BNEP9800638: KSKFVILLQLGHKFK MW:1786.2
BNEP9800723: KSKVGWLIQLFHKKKTKGGWLIQLFHKK MW:3378.0
BNEP9800892: KIKHLGKKSKVGFLQLLFHKK MW:2478.0
BNEP9800895: KIKHLGKKTKGGWLIQLFHKK MW:2489.0
BNEP9800993: KKVGWLIQLFHKKIE MW:1876.2
BNEP9801013: KSKVGFLQLLFHKKLRGSLTKLKG MW:2727.3
BNEP9801042: SKVGWLILLFHKKIE MW:1811.2
BNEP9801043: KSKVGWLILLFHKK MW:1697.0
BNEP9801047: KIKHLGLFHKK MW:1348.1
BNEP9801087: KSKVGFLIQLFHKK MW:1673.0
BNEP9801095: KTKVGFLIQLFHKK MW:1687.0
BNEP9801161: KGKVGFLIQLFHKK MW:1643.0
BNEP9801174: KSKGGWLQLLFHKK MW:1670.0
BNEP9801175: KGKGGWLQLLFHKK MW:1639.0
BNEP9801286: KTKGGFLQLLFHKK MW:1643.0
BNEP9801287: KGKGGFLQLLFHKK MW:1600.9
BNEP9801289: KSKGGFLQLLFHKK MW:1630.9
BNEP9901311: KGKGGWLIQLFHKK MW:1639.9
BNEP9901312: KSKGGWLIQLFHKK MW:1670.0
BNEP9901315: KTKGGWLIQLFHKK MW:1684.0
BNEP9901317: KGKVGFLQLLFHKK MW:1643.0
BNEP9901318: KTKVGFLQLLFHKK MW:1687.0
BNEP9901319: KSKVGWLQLLFHKK MW:1712.0
BNEP9901320: KGKVGWLQLLFHKK MW:1682.0
BNEP9901321: KTKVGWLQLLFHKK MW:1726.1
BNEP9901496: KIKHLGKAQKRFLK MW:1695.1
BNEP9901501: KSKSGFLQLLFHKK MW:1661.0
BNEP9901534: KSKAAWLLQLFHKK MW:1698.0
BNEP9901536: KSKSAFLLQLFGKK MW:1594.9
BNEP9901537: KSKAAFLQLAFKSK MW:1566.9
BNEP9901538: RSKAAFLQLAFKSK MW:1594.9
BNEP9901539: RSKSAFLLQLFGKK MW:1622.9
BNEP9901541: RSKSAFLLQLFGKR MW:1650.9
BNEP9901595: RSKAAFLQLAFKSR MW:1622.9
BNEP9901602: FCKIKHLGKCY MW:1339.6
BNEP9901603: FCKIKHLGKCR MW:1332.6
BNEP2001606: KCKIKHLGKCR MW:1313.6
BNEP2001627: FCKIKHLGKCKK MW:1432.8
BNEP2001628: KCKIKHLGKCKK MW:1413.8
BNEP2001629: KCKIKHLGKCY MW:1320.6
BNEP2001630: FCKIKHLGKCR MW:1332.6
BNEP2001671: KCAQKRFLKMCK MW:1483.9
BNEP2001677: YCAQKRFLKMCY MW:1553.9
BNEP2001678: RCAQKRFLKMCY MW:1546.9
BNEP2001681: KCKNLQRPLKLNQKCR MW:1970.3
BNEP2001695: KGKGGFLIQLFHKK MW:1600.9
BNEP2001708: RRPLIQLVKK MW:1250.5
BNEP2001756: KKKILQLLKK MW:1239.6
BNEP2001757: RRPILPRR MW:1063.3
BNEP2001758: KSKHLGKAQKRFLK MW:1669.0
或：
BNEP2001784: KIKVLFHKSK MW:1227.5。
2.根据权利要求1所述的抗菌/抗内毒素模拟肽，优选：
BNEP9800892: KIKHLGKKSKVGFLQLLFHKK MW:2478.0
BNEP9700031: KGKVLGKAQKRFLK MW:1600.9
BNEP9801013: KSKVGFLQLLFHKKLRGSLTKLKG MW:2727.3
BNEP9801087: KSKVGFLIQLFHKK MW:1673.0
BNEP9801095: KTKVGFLIQLFHKK MW:1687.0
BNEP9801286: KTKGGFLQLLFHKK MW:1643.0
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或：
BNEP2001758: KSKHLGKAQKRFLK MW:1669.0。
3．根据权利要求1所述的抗菌/抗内毒素模拟肽，还可以是66个多肽中，至少两个相同或不同的肽相连组成的多肽。
4．根据权利要求1所述的抗菌/抗内毒素模拟肽，还可以是端基或侧链经过化学修饰的66个多肽。
5．制备权利要求1所述抗菌/抗内毒素模拟肽的方法，通过目前已知在自然界生物体内存在的具有结合内毒素活性的物质，进行同源性对BPI，对BPI分子的一级序列亲疏水性、三维结构和表面静电势分布情况进行分析，模拟结果表明BPI的生物学功能区主要定位在N端的三个LOOP区，确定与内毒素结合的结构域为N端结构域LOOP区，而且其与受体的主要作用方式是静电作用，制定的模拟肽设计方案为：a．两端为强正电势分布的螺旋结构；b．正电势分布的转角螺旋结构；c．正电势分布的强螺旋折叠倾向结构；d．BPI N端LOOP区天然肽段的改善型结构；在计算机辅助下进行模拟多肽的分子设计，模拟设计出具有更强杀菌和中和LPS活性的多肽分子，用Merrifield固相多肽化学合成方法合成抗菌/抗内毒素模拟肽。
6．权利要求5所述的制备抗菌/抗内毒素模拟肽的方法，其特征在于计算机模拟所用工作站为SGI Indigo2系列Solid Impact R1000图形工作站，模拟系统为Biosym/MSI分子模拟系统，所有工作均在INSIGHT Ⅱ工作平台上进行，静电势计算所用软件为DelPhi，蛋白质一级序列搜索所用软件为FASIA程序，蛋白序列库为EMBL。
7．根据权利要求5所述的制备抗菌/抗内毒素模拟肽的方法，其特征在于Merrifield固相多肽化学合成方法为：
a．肽树脂的合成
称取适量Fmoc-L-Lys-PEG-PS树脂(或其它多肽合成树脂)倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，按照本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽的氨基酸序列依次称取适量的Fmoc-氨基酸于适宜的容器中；按照merrifield发明的固相化学合成方法依照本发明的抗菌/抗内毒素模拟肽的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成柱中加入含20％六氢吡啶的DMFDeblock液脱肽树脂Fmoc保护基团、加入适量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分别加入适量二异丙基乙胺(DIPEA)和氮杂苯并三唑甲基脲六氟磷酸盐(HATU)的DMF溶液于柱中进行偶连反应、偶连后合成柱中的肽树脂用DMF洗去残余的Fmoc-氨基酸、惰性气体吹干等制备过程，如此循环完成整个抗菌/抗内毒素模拟肽的肽链形成而得到其肽树脂；从合成柱中取出合成的抗菌/抗内毒素模拟肽树脂，置到冷冻干燥机中冻干，得到肽树脂备用；
b．肽树脂的裂解
取上述肽树脂于容器中，加入裂解液：4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1,2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩后，加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用适量冰醋酸溶解，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽；
c．粗肽的纯化
取BNEP粗肽加入适量无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％的三氟乙酸，混匀，用C18反相柱，流动相A：100％H2O+0.1％三氟乙酸；流动相B：100％乙晴+0.1％三氟乙酸，0→15min梯度洗脱纯化，得BNEP精肽。
8．权利要求1所述的抗菌/抗内毒素模拟肽在杀灭细菌上的应用。
9．权利要求1所述的抗菌/抗内毒素模拟肽用于治疗内毒素血症。
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