CN109988225B

CN109988225B - 具抗菌活性的多肽及其应用

Info

Publication number: CN109988225B
Application number: CN201811435030.XA
Authority: CN
Inventors: 杨莉
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2034-05-30
Also published as: CN104036155A; CN109988224A; CN104036155B; CN109988224B; CN105801670A; CN109988225A; CN105801670B

Abstract

本发明属于多肽领域，具体涉及具抗菌活性的多肽及其应用。本发明的目的是克服目前抗菌肽广谱抗菌性不佳的缺点。本发明解决其技术问题采用的技术方案是采用抗菌肽抗菌活性预测方法，获得了一类具有广谱抗菌活性的多肽，其具有有如下所示的氨基酸序列：VQWRIRIAVIRX1，X1＝A或K。实验表明对多种敏感菌以及临床分离耐药菌具有很好的抑菌效果，并对测试的多种人体正常细胞均具有较低的毒性，具有很好的应用前景。

Description

具抗菌活性的多肽及其应用

本申请是申请号为201410241068.9，申请日为2014年05月30日，发明创造名称为“抗菌肽抗菌活性预测方法及抗菌肽”的发明专利申请的分案申请“具抗菌活性的多肽及其应用”(申请号为201610201285.4,分案提交日为2016年03月31日)的分案申请。

技术领域

本发明属于多肽领域，具体涉及具抗菌活性的多肽及其应用。

背景技术

当前，细菌性感染和疾病呈上升趋势，细菌耐药性的形成是一个重要的原因。由耐药性细菌，如耐药性结核杆菌、大肠杆菌和被称为“超级细菌”耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等对人和动物造成的危害日趋严重。抗菌素耐药性的蔓延可能会使上个世纪药物治疗方面的许多突破不复存在。传染性病原体对目前使用的药物已产生越来越强的耐药性，但至今尚未开发出足够的药物解决这一问题。因此，许多传染病可能有一天会变得无法控制，并可在世界各地迅速蔓延。耐药性细菌的出现致使现有抗菌药物对细菌感染治疗的疗效低下或无效，形成的危害日益严重。随着现有药物耐药性问题日趋严重，抗生素管道濒临枯竭，迫切需要开发出新型的抗菌制剂。科研工作者们正努力寻求新的抗菌策略，这些策略包括：合理应用抗生素；改造现有抗生素或研发新的抗生素；微生态制剂的研究与应用；噬菌体制剂研究与应用；中草药细菌耐药抑制剂研究与应用；抗菌肽研究与应用等。其中高效、低毒、广谱的抗菌肽作为最有希望代替抗生素的新药制剂倍受国内外科研工作者的关注，成为当前的研究热点。

抗菌肽一般由生物体内各器官产生来抵抗微生物感染，并且许多抗菌肽都具有免疫调节作用。为了增强抗菌肽的抗菌作用与免疫调节作用，缓解各类菌种日益增强的耐药性，科学家们发展了许多设计合成或改造天然抗菌肽的方法。虽然不同的抗菌肽有多种长度、氨基酸组成或二级结构等特征，但在两亲性、电荷性等方面具有相似性，并可能有其它一些无法直观寻找的共同特征，这些特征对抗菌肽的抗菌活性可能都具有重大影响。基于此，科学家们建立了许多生物信息学工具与预测方法来寻找与抗菌肽活性相关的规律，大多数的方法都在一定程度上与高活性抗菌肽的相似性有关。

当优化一个已经具有较好的抗菌活性的抗菌肽时，进行序列上的大幅度改变往往会造成抗菌活性的巨大变化，并由于其中的变量太多而难以确定影响活性的因素。而只改变少量的氨基酸时，由于两者的序列相似度太高，大部分活性预测方法都不能很好的区分两者的活性。为了解决以上问题并寻找一个预测方法能够辨别相似度较高的多肽序列并能成功对对现有多肽进行改造或者直接判断新构建多肽的抗菌活性，是本领域目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是克服目前抗菌肽抗菌活性预测相对复杂，不具备操作性的缺点，提供一种抗菌肽抗菌活性预测方法。

本发明解决其技术问题，采用的技术方案是，抗菌肽抗菌活性预测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、获取已知的抗菌肽序列及其抗菌活性数据，并对所有抗菌肽的抗菌活性数据采用抗菌活性标准化换算得到抗菌活性标准化数值，随机选取其中一部分的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为训练集，将剩余部分的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为测试集；

步骤2、将训练集的抗菌肽序列转换为由氨基酸在抗菌肽中的位置及氨基酸名称构成的氨基酸矩阵；

步骤3、根据训练集的抗菌活性标准化数值与氨基酸矩阵，计算得到每个氨基酸在每个位置时对整段抗菌肽活性的贡献值，根据该贡献值建立预测模型；

步骤4、将测试集代入预测模型，计算得到预测活性值；

步骤5、计算所有预测活性值与测试集的抗菌活性标准化数值的线性关系，比较其回归系数，选择至少两个回归系数最大的预测模型，作为标准预测模型；

步骤6、将需要预测的多肽氨基酸序列代入标准预测模型，得到抗菌活性预测值。

具体的，步骤1中，所述抗菌活性标准化换算的方法为：将抗菌活性数据中以质量多少来体现活性强弱的mg/L为单位的IC50值换算成以能体现单个多肽活性的单位摩尔每升(M/L)的活性值，再将该活性值转换为越大越好且线性分布的抗菌活性标准化数值。

进一步的，所述抗菌活性标准化换算的公式为：f(a)＝-ln(a/K×10^-3)，其中，f(a)为抗菌活性标准化数值，a为该抗菌肽的IC50值，单位为mg/L，K为该抗菌肽的分子量，单位为mol/kg。

具体的，步骤3中，所述根据训练集的抗菌活性标准化数值与氨基酸矩阵，计算得到每个氨基酸在每个位置时对整段抗菌肽活性的贡献值的方法为：采用公式

进行计算，其中，n为该抗菌肽肽链的氨基酸个数，i的取值范围为任意20个值，每一个值代表20种天然氨基酸中的一种氨基酸，j为该i氨基酸在该抗菌肽中的从氮端到碳端的位置，取值范围为1到n之间的正整数；Bj为该抗菌肽中j位置氨基酸的常系数，当该j位置有氨基酸时，Bj为1，当该j位置无氨基酸时，Bj为0；Xij为i氨基酸在抗菌肽中j位置时对整段抗菌肽活性的贡献值。

再进一步的，步骤3中，若由于已知f(a)的数量不足够解出所有的Xij时，根据氨基酸的性质，将性质最相近的氨基酸所代表的Xij进行最少的合并后计算。

具体的，所述性质包括电荷性及亲水性。

再进一步的，步骤1中，所述随机选取其中一部分的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为训练集是指随机选取其中80％～90％的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为训练集。

具体的，还具有以下步骤：

步骤7、对需要预测的抗菌肽序列，根据其每个氨基酸自身的电荷大小，计算该抗菌肽的等电点值，筛选出合适等电点值的抗菌肽。

再进一步的，步骤7中，所述合适等电点值为11～13。

本发明在上述方法的基础上，提供了一类多肽，其氨基酸序列为：

V-Q-W-R-I-R-X1-X2-V-I-R-X3(SEQ ID No.17)，其中X1＝I或V，X2＝A或C，X3＝A、R或K；或者为：

V-Q-L-R-I-R-V-X4-V-I-R-X5(SEQ ID No.18)，其中X4＝A或C，X5＝R或K。

本发明中，如无特殊说明，所有的氨基酸序列从左到右均为从氮端到碳端。

进一步的，该多肽具有表1中SEQ ID No.1～SEQ ID No.16所示的任一条氨基酸序列：

表1

本发明同时提供了上述的多肽在制备抗菌药物中的用途。

当然的，本发明还提供了以上述的的多肽为主要活性成分制成的抗菌药物。

其中，上述的抗菌药物是指能抗细菌和抗真菌。

其中，所述的细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia colibacillus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanmii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)或伤寒杆菌(Salmonella typhi)。其中，所述的真菌为白色念珠菌(Canidia Albicans)或近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)。

本发明利用基于氨基酸活性贡献度的理论来建立一个机器学习方法以预测多肽的活性，尤其是随机突变得到的大量数量的多肽。在这个方法中通过计算，获得每个不同的氨基酸在多肽的不同相对位置对于多肽的抗菌活性的不同作用，而整个多肽的抗菌活性就是其中每个氨基酸的抗菌活性的总和的体现。通过这个预测方法，本发明方法可以预测现有多肽以及新构建的多肽的抗菌活性，并以此为依据筛选可能的高抗菌活性的抗菌肽。

本发明的有益效果在于：虽然都是基于模版的抗菌肽活性研究与设计方法，但相对于对通过统计序列的大量相关数据并用计算机来选出特征性的描述符，并将描述符与活性想关联的QSAR预测方法以及遗传算法等预测方法，本发明的预测算法模型具有更明确的原理与可操作性及可重复性。

用计算机来选择特征性描述符的方法主要基于高活性的抗菌肽都会有一些共同特征，在并不清楚是哪些特征起主要作用以及每个特征和活性的关联程度高低的情况下，用计算机来计算其关联性可以将这个问题解决，并取得了和实验相符合的结果，这也是本发明方法的一个重要突破。

本发明方法通过对使用设计的抗菌肽活性预测算法建立的抗菌肽活性预测模型，对模板多肽进的多个氨基酸进行随机突变得到的一系列多肽，然后对得到的进行多肽活性预测与筛选，筛选得到数个抗菌肽，命名为DP系列抗菌肽。本发抗菌肽具有明显的抗细菌和抗真菌的作用，实验表明对多种敏感菌以及临床分离耐药菌具有很好的抑菌效果，对细菌感染的动物具有较好的治疗效果，并对测试的多种人体正常细胞均具有较低的毒性。且多肽活性实验结果和本发明抗菌肽多肽活性预测方法的预测结果具有一致性。

附图说明

图1、抗菌肽活性预测模型的回归系数示意图。

图2、新型抗菌肽DP7的体内感染细菌小鼠治疗效果。抗菌肽DP7和HH2在腹腔给药浓度分别为20、40、60mg/kg时，检测24小时后腹腔内细菌含量，对照阳性药物为20mg/kg的万古霉素。

图3、新型抗菌肽DP7对人体正常细胞的毒性。X轴为抗菌肽从起始浓度开始的二倍梯度稀释药物浓度变化。Y轴为多肽处理后的溶血情况或多肽处理后人体细胞的生存率。(A)为通过测定血红素的释放量计算得到的红细胞裂解程度，人上皮成纤维细胞(B)，人成纤维细胞株MRC-5(C)，人体正常细胞株HEK293(D)在多肽处理后用CCK-8细胞活性测定试剂盒检测细胞存活率；图中标记了3次不同实验之间的标准差。

图4、采用扫描电镜及透射电镜检测新型抗菌肽DP7对细菌形态的影响。(a)为金黄色葡萄球菌被不同浓度的DP7处理1个小时后扫描电镜观察的结果(×50,000)。随DP7浓度增加，细菌表面由平滑变得褶皱并出现裂痕，如箭头所示。(b)(c)为金黄色葡萄球菌被相同浓度的DP7处理不同时间后透射电镜观察的结果(×10,000)。

具体实施方式

下面结合附图及实施例，详细描述本发明的技术方案。

以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例一、本发明抗菌肽抗菌活性预测方法及其原理

本例的抗菌肽抗菌活性预测方法中，其具体包括以下步骤：

步骤1、获取已知的抗菌肽序列及其抗菌活性数据，并对所有抗菌肽的抗菌活性数据采用抗菌活性标准化换算得到抗菌活性标准化数值，随机选取其中一部分的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为训练集，将剩余部分的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为测试集。

本步骤中，抗菌活性标准化换算的方法可以为：将抗菌活性数据中以质量多少来体现活性强弱的mg/L为单位的IC50值换算成以能体现单个多肽活性的单位摩尔每升(M/L)的活性值，再将该活性值转换为越大越好且线性分布的抗菌活性标准化数值。抗菌活性标准化换算的公式可以为：f(a)＝-ln(a/K×10^-3)，其中，f(a)为抗菌活性标准化数值，a为该抗菌肽的IC50值，单位为mg/L，K为该抗菌肽的分子量，单位为mol/kg。

随机选取其中一部分的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为训练集是指随机选取其中80％～90％的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值作为训练集。

所获取的抗菌肽序列及其抗菌活性标准化数值如下：

步骤2、将训练集的抗菌肽序列转换为由氨基酸在抗菌肽中的位置及氨基酸名称构成的氨基酸矩阵。

本步骤中，所获取的氨基酸矩阵举例如下：

K 0 K 0 0 S 0 K Q L W K 0 R

M 0 I N 0 R 0 V 0 R L R 0 W

……

其中，每个非0的字母代表该位置的某字母指代的氨基酸。

步骤3、根据得到的抗菌活性标准化数值与氨基酸矩阵，计算得到每个氨基酸在每个位置时对整段抗菌肽活性的贡献值，根据该贡献值建立预测模型。

本步骤中，根据得到的抗菌活性标准化数值与氨基酸矩阵，计算得到每个氨基酸在每个位置时对整段抗菌肽活性的贡献值的方法可以为：采用公式

进行计算，其中，n为该抗菌肽肽链的氨基酸个数，i的取值范围为任意20个值，每一个值代表20种天然氨基酸中的一种氨基酸，j为该i氨基酸在该抗菌肽中的从氮端到碳端的位置，取值范围为1到n之间的正整数；Bj为该抗菌肽中j位置氨基酸的常系数，当该j位置有氨基酸时，Bj为1，当该j位置无氨基酸时，Bj为0；Xij为i氨基酸在抗菌肽中j位置时对整段抗菌肽活性的贡献值，其中，步骤2中的由氨基酸在抗菌肽中的位置及氨基酸名称构成的氨基酸矩阵即是指由Xij组成的氨基酸矩阵。若由于已知f(a)的数量不足够解出所有的Xij时，根据氨基酸的性质，将性质最相近的氨基酸所代表的Xij进行最少的合并后计算，该性质包括电荷性及亲水性等。

即得出如步骤2举例中的各非0字母在各位置的值。

步骤4、将测试集代入预测模型，计算得到预测活性值。

本步骤中，计算得到的预测活性值如下：

肽1活性值＝R+W+M+G+V+I+I+K+Y

肽2活性值＝A+V+K+G+C+P+G+K+C

肽3活性值＝F+D+M+G+L+I+O+K+N

……

步骤5、计算所有预测活性值与测试集的抗菌活性标准化数值的线性关系，参见图1，比较其回归系数，选择至少两个回归系数最大的预测模型，作为标准预测模型。

步骤6、将需要预测的抗菌肽序列代入标准预测模型，得到预测值。

还可以具有以下步骤：

本步骤中，合适等电点值为11～13。

下面对上述所采用的方法或算法的原理进行详细说明：

1.抗菌肽预测模型

具有一定活性的抗菌肽，每个位置氨基酸的改变都会影响其活性的高低，预测模型的算法将整个抗菌肽的活性视为其上每个位置氨基酸对整个抗菌肽的活性贡献的总和，通过完整的抗菌肽上每个氨基酸的点突变数据，可以得到每个抗菌肽位置上每一种氨基酸对整个抗菌肽的活性贡献值，预测模型通过氨基酸活性贡献值形成的矩阵，可计算新构建的抗菌肽序列上所有氨基酸的贡献值之和来得到其预测的活性值。

2.比模板短的抗菌肽活性预测方法

构建与天然抗菌肽性质相似的抗菌肽序列，即使序列氨基酸组成不同，序列长度不同，但也能够达到甚至优于原来的抗菌活性。在预测算法中，将短肽视为长肽删除序列前面或后面的氨基酸后所产生的序列，然而较短的序列与模板序列比，并不知道短肽缺失的是前面的残基或后面的残基或前后都有残疾缺失，我们对短肽在所有位置缺失残疾后的活性都进行预测，并将获得预测得到活性最高的缺失模式作为其实际上的氨基酸缺失模式，其活性即作为此短肽的预测活性。

3.抗菌活性的标准化换算

由于实验直接测量得到的抗菌活性值(IC50值)不具有较好的线性关系，而加和的计算形式并不适用于值越小活性越高的关系。而为了避免不同的抗菌肽所具有的不同的分子量的影响，需要将原来以质量多少来体现活性强弱的mg/L为单位的IC50值换算成能体现单个多肽活性的单位摩尔每升(M/L)。因此预测算法将多肽的活性通过以下公式进行换算优化以更适于用方程进行模拟：F(a)＝-ln(a/M×10^-3)。式中M为多肽的分子量，a为抗菌肽的IC50值，a/M×10^-3将活性单位换算成为摩尔每升，ln将将原来指数分布的表示越小越好的活性值转换成为越大越好且线性分布的数值。

4.活性贡献值计算方法

由于并不确定抗菌肽序列中的各个氨基酸之间的作用更近似于数学中的加、乘、还是其他模式，为简化运算，本专利以加法来模拟每个氨基酸对抗菌肽活性的贡献。为得到序列所有位置所有种类氨基酸的活性贡献值，要以抗菌肽序列每个位置的每种氨基酸活性贡献作为未知数，抗菌肽的活性作为已知数，因此需要一个能够解矩阵分布的未知数的方程，在本专利采用了如下的N元一次方程作为活性计算公式：

方程中f(a)为当前抗菌肽的活性，n为该抗菌肽肽链的氨基酸个数，即肽链的长度，i的取值范围为任意20个值，每一个值代表20种天然氨基酸中的一种氨基酸，j为该i氨基酸在该抗菌肽中的从氮端到碳端的位置，取值范围为1到n之间的正整数；Bj为该抗菌肽中j位置氨基酸的常系数，Xij为i氨基酸在抗菌肽中j位置时对整段抗菌肽活性的贡献值。i与j形成了一个氨基酸种类与氨基酸在抗菌肽中位置互成横列的氨基酸活性贡献值的矩阵，可知Xij的值根据序列的不同以及氨基酸的不同而不同。

在预测抗菌肽活性时，若当前位置非空则Bj为1，Xij取氨基酸贡献值，若当前位置为空(如预测比模板长度短的抗菌肽时)则Bj为零，当前位置无氨基酸贡献值。因为序列越短的肽活性数值加和缺失越多，因此长度不同的多肽预测活性结果直接不能进行比较，预测的活性结果只适用于同样长度的多肽的比较，此预测方法预测的目标多肽的长度也只能小于等于建立模型用最长多肽长度。

5.其它抗菌肽性质的计算

(1)抗菌肽等电点的估算

根据每个氨基酸自身的电荷大小，计算整体抗菌肽的等电点值。由于阳离子肽对细菌细胞壁的亲和力更强，而过于强的电荷对动物体细胞的毒性会很强，因此算法在对抗菌肽的等电点进行计算后，筛选等电点值在11～13的抗菌肽进行结果输出。

(2)抗菌肽分子量计算

根据每个氨基酸的分子量大小，计算整个抗菌肽的分子量。

6.性质相似的氨基酸的简并

计算氨基酸活性贡献值矩阵时，一个n个氨基酸长度的抗菌肽总共需要解n×20(20种氨基酸)个未知数，由于一个方程解一个未知数，因此需要至少n×20个方程，即需要至少n×20个已知抗菌肽序列及其活性。当遇到建立模型的多肽数据比较有限，并非在序列的每个位置上具有每种氨基酸时，用上述的预测方法会具有局限，因此为解决这个问题而提出了性质相似的氨基酸的简并。氨基酸根据有带电荷性，亲水性的不同，按照这些性质的相近情况将所有氨基酸中性质比较相近的氨基酸进行合并。按具备的已有氨基酸数据的多少，选择合并的程度的大小，即多少个相近的氨基酸合并成为一个参数进行计算，合并的种类根据氨基酸的性质自行判断，合并的数量根据是否有解进行选择。氨基酸的简并能够解决由于数据量不足导致的没有足够方程解所有未知数的问题。但合并的程度过大会使准确度降低。

实施例二、预测模型的建立以及新型抗菌肽的设计和活性预测

1、获取已知的抗菌肽序列及其抗菌活性数据，以用于预测模型的建立。在所有已知序列数据中，随机选取80％-90％的序列数据作为训练集来建立预测模型，剩余的10％-20％的序列数据作为测试集验证建立的模型的预测准确度。本次建模中，使用了180条已知的抗菌肽，其氨基酸序列和活性数据均来源于专利文献WO 2008/022444，为12个氨基酸的抗菌肽。每次训练随机用抗菌肽序列174条，每次测试用训练剩余的14条抗菌肽序列。

2、用抗菌活性标准化方法将抗菌活性数据进行标准化，并将抗菌肽的序列转化为由Xij构成的氨基酸矩阵。

3、所有抗菌肽的抗菌活性标准化数值代入活性计算公式的左边，并将相应的抗菌肽的氨基酸矩阵代入活性计算公式的右边。

4、求解所有矩阵方程，计算所有Xij的值，并用Xij建立抗菌肽活性预测模型。

5、用抗菌肽活性预测模型预测测试集的活性，并计算得到的预测活性值与测试集本身的标准化活性值的线性关系，回归系数越大，线性关系越好，表示预测准确率越高(参见图1)。反复随机挑选训练集与测试集的数据进行，以获得准确率较高的预测模型。

6、选取待优化的模板多肽序列，进行数个氨基酸所有排列组合的替换，并相应产生所有新的抗菌肽序列。

7、用预测准确度最高的两个抗菌肽活性预测模型对这些新抗菌肽序列进行活性预测，并取两个预测模型同时具有高预测活性的抗菌肽作为高活性抗菌肽，预测模型同时计算其等电点、分子量等性质。

实施例三使用本发明方法预测和筛选抗菌肽

本发明以已知的多肽VQLRIRVAVIRA(HH2)出发，使用计算机在各个氨基酸残基位点进行了随机的改变，删除或添加等突变，各个突变都为天然氨基酸，得到了具有1324256个多肽序列的待选多肽序列库。

使用包括模板多肽在内的上述待选多肽序列库导入实施例二建立得到的两个准确度最高的预测模型分别进行运算，获得其中各条多肽的活性，即进行新多肽序列的抗菌活性预测。并取两个预测模型同时具有高预测活性的抗菌肽作为高活性抗菌肽，预测模型同时计算其等电点、分子量等性质，筛选等电点值在11～13的抗菌肽进行结果输出。获得了50条模型1和模型2预测活性都明显高于模板多肽的多肽，命名为DP1～DP50，并通过化学合成方法得到相应的多肽。

使用本发明方法进行预测与筛选的结果见表2：

表2、预测与筛选结果

实施例四、筛选出的多肽的抗菌活性检测

1.细菌体外抑菌实验

(1)培养基配制

MHB肉汤培养基与MHA肉汤固体培养基，分别按说明配方，加入去离子水溶解，120℃高压灭菌20分钟后4摄氏度保存待用。

(2)菌种准备

加入5ml的MHB肉汤培养基于实管中，加入20μl菌种保种液(包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌25923(购自美国菌种保藏中心ATCC)以及革兰氏阴性菌：大肠杆菌25922、绿脓杆菌PAO-1(均购自ATCC)及伤寒杆菌RE88(加拿大斯克里普斯研究所惠赠)，220RPM，37℃摇床培养16小时后，涂于MHA平板，37℃细菌培养箱培养18小时后用封口膜封口，4℃保存待用，保存时间为1周。

(3)抗菌药物存储液准备

所有药物配制成10mg/ml的存储液。抗菌肽类药物先用终体积20％的DMSO溶解，然后加入剩余体积的无菌水溶解至目标浓度。化学药物按药物要求进行溶解，并稀释至目标浓度。

(4)悬菌液的准备与稀释

将实验用的菌种从固体培养基中挑取一个形态良好、直径1mm左右的菌落挑取3个克隆于1ml的液体培养基中。用分光光度计(3毫升悬菌液)或酶标仪(200μl悬菌液/孔)在600nm下测量吸光度值，减去同等量的培养基对照的吸光度值计算得到菌液的吸光度值，根据前期的结果按1OD值与CFU的比值进行换算，并将菌液稀释至1×10⁷CFU/ml。

(5)抗菌药物的稀释

取10个0.5ml离心管，第1管加入培养基335.64μl，第2至10管分别加入170μl培养基，取药物的存储液4.36μl至第1管，混合均匀后吸取170μl至第2管混合，依次操作第10管。获得的药物浓度从第一孔至第十孔为128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25μg/ml。对照阳性药物庆大霉素、利奈唑胺、左氧氟沙星从8μg/毫升开始进行二倍梯度稀释。

(6)对照组的准备：

第十孔与第十一孔加入50μl培养基(若受试药物为抗菌肽则加入培养基335.64μl，4.36μl的20％DMSO无菌水溶液，分别加入对照孔，50μl/孔)

(7)菌液的接种：

按稀释顺序从稀释好抗菌药物溶液吸取50μl加入96孔板的第二排，第三排，第四排(三复孔)，然后在第一列至第十一列的孔中加入50μl1×10⁷CFU/ml的悬菌液，第十一孔加入50μl的培养基。最终结果为：第一列至第十列为抗菌药物64μg/ml至0.125μg/ml的实验组，第十一列为培养基对照组，各三个复孔。第十二列加入100μl培养基作为空白组，最后将上述接种后的96孔板至于37摄氏度细菌培养箱培养20小时。

(8)结果读取：

然后96孔板至于酶标仪，于600nm波长下测量吸光度值，三复孔测得的值取平均值，并计算抑菌率：

以抑菌率大于或等于80％的抗菌药物浓度作为其对这种细菌的MIC值。

2.真菌体外抑菌实验

(1)培养基的准备：

a)沙氏培养基固体培养基：

成分：酵母粉10g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，用去离子水溶解至目标体积，120℃高压灭菌20分钟后倒于玻璃平板，使培养基厚度5mm。

b)沙氏液体培养基：

酵母粉10g/L，葡萄糖40g/L，用去离子水溶解至目标体积，120℃高压灭菌20分钟后4℃保存。

c)RPMI 1640培养基：

10.4g/L RPMI 1640粉末，34.53g/L MOPS(终浓度0.165mol/L)，用1mol/L NaOH调整pH至7.0。过滤除菌后加无菌水至目标体积，4℃保存。

(2)药物存储液：

多肽药物粉末用20％DMSO的无菌水溶解使其浓度为10mg/ml。

氟康唑药物粉末用无菌水溶解使其浓度为10mg/ml。

(3)菌种准备：

从白色念珠菌菌种(购自美国ATCC)保种液取20μl至于5ml RPMI 1640培养基于37℃细菌孵箱培养48小时，当天获得菌液当天使用。

(4)接种液准备：

将菌种从菌悬液中取20μl，划线法接种在沙氏固体培养基上，培养48小时后，挑取1mm左右的菌落3个，悬浮于1ml 8.5g/L的无菌氯化钠溶液(0.85％)中，调整浊度到0.5麦氏标准(1x10⁶～5x10⁶cfu/ml)。然后用RPMI 1640培养基1:20稀释，再继续以1:100稀释，此时菌液浓度为5x10²～2.5x10³cfu/ml，作为待接种菌液。

(5)药物的稀释：

将药物稀释成浓度为256mg/ml的稀释药物。方法为：取药物存储液15.128μl加入614.872μl的RPMI 1640培养基，然后以每孔200μl做3个复孔加入96孔板第二列中，然后从此浓度开始进行梯度稀释至第十孔，药物的终浓度为128μg/ml至0.5μg/ml，第十一孔为不加药的阴性对照，第十二孔为不加菌的培养基对照，其它边缘孔加入300μl的无菌水。

(6)接种：

取接种菌液100μl至已加入100μl药物溶液的孔中，最终菌液浓度为2.5×10²～1.25×10³cfu/ml。

(7)培养与结果观察：

将孔板置于37℃孵箱48小时孵育后，用酶标仪测量菌液浓度，抑菌率80％以上的最低浓度作为多肽的MIC，抑菌率50％的浓度作为氟康唑的MIC。若真菌形成菌落，则用肉眼观察不生长菌的最低浓度为药物的MIC。

3.细菌及真菌体外抑菌实验结果

DP1-50系列多肽对以上细菌和真菌的最小抑菌浓度MIC值见表3。实验重复至少3遍，表中显示的MIC值为所有结果中的中位值。其中的命名为Indolicidin的多肽为与DP系列抗菌肽同批合成。

表3抗菌肽的MIC值检测结果

实验结果表明：通过设计筛选得到的多肽比模板多肽在针对以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌为代表的常见的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，以及以白色念珠菌代表的真菌总体上具有更好的抑菌效果。而以上菌种均是抗细菌和抗真菌研究的模式菌种，可以推知上述多肽对其余的细菌和真菌也具有一定的作用，是一种广谱的抗菌多肽。

根据上面的结果，我们发现抗菌活性显著更高的多肽为表4所示。

表4活性较佳的抗菌肽

这些抗菌活性显著更高的多肽具有相似的结构，氨基酸序列可在下式中表示：

V-Q-W-R-I-R-X1-X2-V-I-R-X3(SEQ ID No.17)，其中X1＝I或V，X2＝A或C，X3＝A、R或K；以及V-Q-L-R-I-R-V-X4-V-I-R-X5(SEQ ID No.18)，其中X4＝A或C，X5＝R或K。

再将其中4个抗菌活性高的多肽DP3、5、7、8进行进一步的临床分离株(针对不同抗生素的耐药株)的抗菌效果的验证。临床分离株的来源为重庆市西南医院烧伤研究所临床分离得到。每种菌株取临床分离株10株，实验重复至少3遍，表5中显示的MIC值为所有结果中的中位值，括号中为对所有测试菌株的MIC范围。

表5优选的多肽对临床分离耐药菌的抑菌效果

DP3、DP5、DP7、DP8的结果表明，其对各种临床分离耐药菌的综合抑菌效果均好于HH2多肽，尤其是DP7的效果更为显著，与HH2相比，其对各种菌株的MIC值降低了4至8倍。

3.去中性粒细胞小鼠肌肉感染细菌模型的治疗实验

(1)感染前一天用MHB培养基摇床培养金黄色葡萄球菌(ATCC：29213)，220rpm，37℃，18小时。

(2)感染当天测菌液的OD值估算菌液浓度，3000rpm 5分钟离心后去培养基用PBS重悬菌液，再次离心后用PBS重悬至菌液浓度1×10⁸CFU/ml。

(3)在小鼠后腿左腿大腿肌肉内测注射0.1ml的29213菌液，细菌接种量为10⁷CFU/点。

(4)感染24小时后处死小鼠，按需要数量取离心管，向每一管中加入6颗研磨用小磁珠与600μl PBS溶液，称重。取感染的大腿肌肉，初步剪碎后置于事先称重的离心管中，每条腿一管，然后称重并计算肌肉的重量进行记录。

(5)将装有肌肉组织的离心管置于fastprep组织研磨机进行研磨，参数设置为最大，研磨60sec，两次。

(6)从匀浆中取20μl进行等10倍稀释，用10³，10⁴，10⁵倍稀释液涂MHA固体培养基，于细菌培养箱37℃培养过夜。

(7)在固体培养基上进行菌落计数，得到的计数结果乘以稀释倍数后除以组织重量计算每克组织含有的细菌量。

4.小鼠腹腔感染并取腹水实验

(1)实验前一天用MHB活化菌株金黄色葡萄球菌(ATCC：33591)。

(2)实验当天取活化后的菌株，3600rpm离心5min，去培养基用生理盐水重悬。

(3)继续离心去上清，用10ml生理盐水重悬后取200μl菌液，200μl二倍稀释后的菌液，测OD₆₃₀吸光度，并计算原液有多少菌。

(4)再次离心去上清后加入指定体积生理盐水重悬至指定浓度。

(5)实验用小鼠每组6只进行随机分组，用33591感染小鼠腹腔，每只小鼠腹腔注射菌液0.5ml。

(6)感染1小时后腹腔给各指定浓度的多肽药物，0.5ml/只，阴性对照组每只小鼠腹腔内注射0.5ml的生理盐水。

(7)24小时后向小鼠腹腔注射5ml的生理盐水，轻柔腹部，并处死，用75％酒精消毒，5min后剪开腹腔上皮，在腹腔开个小口，用1ml注射器从中吸取尽量多的腹水，然后转移至无菌的EP管中混匀。

(8)取20ml，用生理盐水进行10倍的梯度稀释，如稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍等，并取三个合适的浓度的菌液20μl，涂MHA平板，细菌孵箱培养过夜。

(9)挑取一个20～200个菌落的平板鼠菌落数并计算原来5ml腹水中每毫升的菌量。

对金黄色葡萄球菌腹腔感染的小鼠的抗菌肽治疗实验结果见图2。图中显示为抗菌肽DP7和HH2在腹腔给药浓度分别为20、40、60mg/kg时，24小时后腹腔内细菌含量，对照阳性药物为20mg/kg的万古霉素(vanc)。

实验结果表明：HH2与DP7治疗时，小鼠腹腔中细菌残留量与给药剂量存在剂量依存性，给药浓度越大，治疗效果越好。同浓度腹腔给药时，DP7比模板多肽HH2要有更好的治疗效果，并且60mg/kg给药DP7具有和阳性对照组万古霉素给药20mg/kg的效果相近。

实施例五、本发明多肽的细胞毒性试验

1、对红细胞的毒性检测

(1)取抗凝血加等量的生理盐水，混匀，2000rpm离心5min，去上清。

(2)用PBS(含9mM磷酸钠的150mM NaCl溶液，PH7.0)将红细胞洗涤3次，前2次2000rpm离心5min，末次2000rpm离心10min，去上清。

(3)用PBS稀释，获得20％(v/v)红细胞/PBS溶液，细胞溶液可立即使用或于4摄氏度保存。

(4)取100μl多肽药物于96孔板中，用PBS等二倍稀释(640mg/L、320mg/L、160mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L、10mg/L)。

(5)取20％的RBC溶液以1：20溶于PBS。加入96孔板，阳性对照用100μl 2％的吐温20达到溶血，阴性对照加入100μl PBS。37℃摇动孵育1h。

(6)3000rpm离心5min，取上清160μl加入到96孔板中，在OD 450nm处读取血红蛋白浓度。

(7)溶血比例计算：[(多肽处理组A405-PBS处理组A450)/(吐温20处理组A450–PBS处理组A450)]×100％，溶血比例在50％的多肽浓度为HC50值。抗菌肽对红细胞裂解情况见图3a。图中显示随着药物处理浓度的上升，红细胞的裂解率呈上升趋势。随浓度增加时，DP7的曲线上升趋势更为缓慢，HH2的上升则更快，说明抗菌肽DP7对红细胞的毒性低于HH2。

2、对人体正常体细胞毒性检测

(1)将293TD或人成纤维细胞培养皿中细胞消化后用DMEM培养基重悬，计数，并稀释至50000个细胞/ml。

(2)将100μl细胞悬液加入96孔板中，5000个细胞/孔，细胞培养箱继续培养20小时。

(3)取DP7与HH2的多肽存储液(10mg/ml)90μl加入610μlDEMM培养基中，配成1₂₈₀mg/L的多肽DMEM溶液700μl，取100μl，分别在96孔板的两种细胞细胞培养基上轻轻吹吸做1:1的二倍梯度稀释(7个梯度，最低浓度为10mg/L)，每种细胞做3复孔，每种细胞再设置3孔无细胞的blank对照与3孔含细胞但不加多肽处理的对照。然后置于细胞培养箱继续培养24小时。

(4)在96孔板的所有孔中加入10μl CCK-8溶液，置于孵箱处理2h。

(5)由于高浓度多肽会使部分细胞死亡产生沉淀，3000rpm离心5min后吸取70μl的上清液至洁净的96孔板中，用酶标仪测量OD450的值，然后计算细胞活力：

抗菌肽对几种正常人体细胞的毒性情况见图3。随HH2或DP7的给药浓度增加，几种正常细胞的存活率逐渐降低。在正常的MIC浓度范围内(8-32mg/L)，抗菌肽对正常细胞的毒性不大。当多肽浓度较高(>80mg/L)时，与HH2相比，DP7对以成纤维细胞、血红细胞、胚胎肾细胞为代表的人体正常细胞均具有更低的毒性。

实施例六、本发明多肽的抗菌机制初步探索

1、相同浓度抗菌肽以不同时间处理细菌后扫描电镜观察

(1)将分离纯化的金黄色葡萄球菌菌体挑入合适的液体培养基药瓶中，震荡培养12h；

(2)培养后吸取800μl菌液离心，3000rpm离心3min，去上清，加入500μl的1×PBS洗2～3次；

(3)在沉淀中加入4％戊二醛1ml，充分混匀，4℃静置4h；

(4)3000rpm离心3min，去上清；加入500μl的1×PBS洗2～3次；

(5)在沉淀中缓慢加入2％戊二醛500μl，充分混匀，4度放置1h；

(6)3000rpm离心3min，去上清；加入500μl的1×PBS洗2～3次；

(7)乙醇梯度脱水，20％，50％，80％，100％；每次脱水10min，3000rpm离心3min；

(8)用100％叔丁醇置换100％乙醇2～3次，乙醇菌液离心后，去上清，加200μl100％叔丁醇4度放置30min，再溶于适量100％叔丁醇送样。滴一滴菌悬液在锡箔纸上分散，干燥后即进行扫描电镜样品处理和观察。结果见图4a，图中可见随DP7浓度的增加，金黄色葡萄球菌的细胞壁出现了明显的褶皱，在高浓度下多肽处理下出现许多裂痕。

2、不同浓度抗菌肽以相同时间处理细菌后透射电镜观察

(2)培养后取菌液，配制100μl的1×10⁸cfu/ml左右的菌液3500rpm离心5分钟，去上清，加入100μl的PBS洗三次。

(3)在沉淀中加入4％戊二醛1ml，充分混匀，4度静置4h(时间应尽量延长，或过夜)后送样至分析测试中心进行电镜样品处理和观察。电镜观察结果见图4b。图中可见随DP7处理时间的延长，金黄色葡萄球菌的细胞壁出现了明显的破裂，且背景中的絮状物增多；在未处理组合处理10分钟组，细菌分裂时的隔膜清晰而稳定，但在处理30分钟以上时隔膜被扰乱并变得模糊，如图4c中箭头所示。

本实验结果表明：DP7能够通过破坏微生物的细胞壁结构来起到抑菌杀菌作用。这同时也初步解释了DP7广谱抗菌的原因，大多数菌类均具有以多糖为主的细胞壁结构，针对细胞壁的抑菌作用对多种微生物均能有一定的效果。而由于本发明多肽之间的结构具有较高的相似性，故也能初步解释本发明DP系列多肽具有广谱抗菌活性的原因。

序列表

<110> 四川大学

<120> 具抗菌活性的多肽及其应用

<130> A181258K

<160> 53

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Arg

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (7)..(7)

<223> X为I或V

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> X为A或C

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> X为A、R或K

<220>

<221> UNSURE

<222> (7)..(7)

<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (7)..(7)

<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (7)..(7)

<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 17

Val Gln Trp Arg Ile Arg Xaa Xaa Val Ile Arg Xaa

1 5 10

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> X为A或C

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> X为R或K

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 18

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Xaa Val Ile Arg Xaa

1 5 10

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Val Gln Leu Arg Ile Arg Ile Ala Val Cys Arg Ala

1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Val Cys Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Lys Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Lys Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Val Gln Leu Arg Cys Arg Val Cys Val Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Cys Arg Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Val Gln Trp Arg Cys Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Val Gln Trp Arg Trp Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Val Gln Trp Arg Ile Arg Cys Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Cys Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Ala Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Lys Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Arg Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Val Lys Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Trp Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Lys Arg Ala

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Val Gln Leu Arg Trp Arg Val Ala Val Cys Arg Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Val Gln Trp Arg Ile Arg Asn Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Tyr Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Tyr Arg Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Asn

1 5 10

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val His Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Thr Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Val Gln Leu Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Arg Arg Ala

1 5 10

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Arg Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Cys Arg Arg

1 5 10

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Trp Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Val Tyr Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Val Lys Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 49

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Val Gly Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Cys Arg Lys

1 5 10

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Tyr Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

Val His Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala

1 5 10

Claims

1.多肽，其特征在于氨基酸序列为下表中任一条氨基酸序列所示：

序列编号氨基酸序列 SEQ ID No.2 VQWRIRIAVIRA SEQ ID No.6 VQWRIRIAVIRK

。

2.权利要求1所述的多肽在制备抗菌药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的抗菌药物为抗细菌药物或抗真菌药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或绿脓杆菌。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的真菌为白色念珠菌。

6.由权利要求1所述的多肽为主要活性成分制成的抗细菌或抗真菌的药物。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述的细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或绿脓杆菌。

8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述的真菌为白色念珠菌。