KR101463091B1 - 봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 목 및 허리 디스크를 포함하는 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 목 및 허리 디스크를 포함하는 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size)를 갖는 셀룰로스(cellulose) 막으로 여과시킨 봉독 정제물은 봉독 내 알러지 유발 물질 및 세균 내 독소가 효과적으로 제거됨을 확인하였고, 대식세포에서 세포증식 억제 및 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라 우수한 임상효과를 확인함으로써, 본발명의 조성물은 관절 질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 목 및 허리 디스크를 포함하는 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 및 이의 제조 방법{Composition comprising the purified fraction isolated from bee venom for preventing and treating a joint disease comprising a cervical and lumbar disc or inflammatory disease and manufacturing method thereof}
본 발명은 봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
보통 무릎 관절이라고도 불리는 슬관절은 위쪽으로는 대퇴골(넓적따리뼈), 아래쪽으로는 경골(정강이뼈)과 슬개골 세 가지로 구성되어 있다. 대퇴골과 경골을 연결하는 뼈 부위는 매끈한 연골로 덮여져 있어 활액과 함께 굽혔다 폈다 하는 관절운동을 원활하게 하고 걷거나 달릴 때에 충격을 흡수하는 작용을 하게 된다.
관절염 관련 질환은 전세계 인구의 약 12％가 고통을 겪고 있는 대표적인 퇴행성, 난치성 질환으로 국내에도 약 200만명 이상의 환자가 있다.
관절염은 신체의 근 골격 및 결합 조직에 염증성 변화가 생겨 근 골격계에 전신 증상이 나타나는 것을 총칭하는 병명이다. 상기 질환은 관절, 뼈, 연골 조직 또는 척수에 영향을 주어, 종종 영구적인 조직 손상, 기형, 퇴화 및 장애를 일으키는 만성 염증을 특징으로 한다(Hofbause, LC, Heufelder, AE, Arthritis and Rheumatism 44:253-259, 2001). 주로 연골에 해당하는 물렁뼈가 다양한 이유로 인해 정상적인 작용을 못하게 되는 경우인데 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 등 관절염에는 다양한 종류가 있다.
퇴행성 관절염은 관절을 보호하고 있는 연골의 손상 또는 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 장기간에 걸쳐 비가역적으로 연골조직이 파괴, 즉 닳아 없어짐으로써 생기는 질환이다. 비가역적 연골손상은 관절운동 능력을 소실함으로써 활동장애를 일으키며 염증과 통증을 수반한다. 특히 이 질환은 관절부위의 외상, 관절의 과다 사용, 또는 과체중으로 인해 관절과 연골에 과도한 부담이 있을 때 잘 생기며 이 질환이 지속되면 통증과 관절의 기형이 유발되는데, 특히 무릎의 퇴행성 관절염은 만성적으로 신체의 장애를 유발하는데 55세 이상인 경우에는 약 80%, 75세인 경우에는 거의 전 인구가 이 질환을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 전신적인 증상을 동반하는 류머티스성 관절염과는 달리 퇴행성 관절염은 관절염이 발생한 관절 부위의 국소적인 통증을 동반하며 통증 초기에는 해당 관절을 움직일 때 심해지는 양상을 보이다 병이 진행되면 움직임 여부에 관계없이 지속적으로 통증이 나타난다. 특히 퇴행성 관절염 초기에는 약한 동통을 동반하면서 춥거나 습기가 많은 날 악화된다. 또한 운동시 피로를 쉽게 느끼고, 운동장애나 종창 및 관절 주의의 압통을 느낄 수 있다. 이 질환이 장기화되면 체중 부하가 많은 관절에 심한 운동장애가 나타나고, 관절의 변형으로 인해 운동할 때 마찰음이 생긴다. 퇴행성 관절염은 일반적으로 무릎관절을 생각하기 쉬우나 손가락, 발가락, 고관절, 무릎관절, 척추 등 모든 관절에서 나타나는 질환이다. 현재 퇴행성 관절염은 전 세계적으로 매년 6천만 명 정도의 환자가 발생하고 있으며, 퇴행성 관절염 치료제 시장 규모는 연간 600억 달러 정도로 추정되고 있다. 또한, 아직까지 완치를 가능하게 하는 의약품이 개발되어 있지 않은 관절염 치료제 시장은 관절염 환자의 지속적인 증가와 혁신적인 치료제의 등장으로 급성장이 예상되는 분야이다. 관절염 관련 시장은 연평균 14%가량씩 증가해 2005년 200억 달러, 2010년에는 약 350억 달러 규모에 이를 전망이다. 하지만, 지금까지는 소염진통제를 통한 통증 감소나 자연 연골 재생을 기대하는 치료법이 전부였기 때문에 좀 더 선택적이고 완벽한 치료제의 개발이 요구되고 있다.
류마티스 관절염은 면역체계의 이상으로 자신의 면역 세포가 주로 관절의 활막 조직을 침범하는 만성 염증성 자가면역질환이다. 유병률은 약 1%로 자가면역질환 중에서는 비교적 흔한 질환이지만 다른 만성질환과 비교했을 때는 유병률이 낮은 편이다. 그러나 비교적 젊은 나이에 발생하여 심각한 장애가 유발되고 일상생활에 막대한 지장을 줄 수 있어 질병 자체의 영향력이 매우 큰 질환이다. 이러한 류마티스 관절염에 대한 인식은 기원 전부터 있었다. 나쁜 물질이 흘러다니면서 관절을 붓고 아프게 만든다고 생각하였고 여러 문헌에서도 활막염과 관절변형을 묘사한 그림과 기록을 찾을 수 있다. 1859년에 류마티스 관절염이라는 용어가 처음 소개되었고 이후 20세기 초반부터 1980년대까지 자가면역기전, 스테로이드의 항염 효과, 류마티스 인자, 염증성 시토카인, HLA-DR 유전자와 류마티스 관절염과의 연관성 등이 발견되었다. 그리고 경구 프레드니솔론과 다양한 진통소염제가 개발되었으며, 메토트렉세이트(methotrexate), 경구 금제제, 설파살라진 등의 항류마티스제제가 도입되고, 류마티스 관절염의 분류 기준의 제정 등, 류마티스 관절염의 병태생리와 발병원인에 대한 이해, 진단 방법 및 치료 방법에 있어서 오랜 기간 동안 점진적인 발전이 있었다.
현재까지 관절염은 근원 치료가 불가능하며, 지금까지 개발된 치료제들은 통증을 완화하고, 염증을 억제하며, 가능한 한 기능을 보전하는 방향으로 치료가 이루어지고 있다. 또한, 이러한 치료제들은 전형적으로, 장기간에 걸쳐 투여되고, 장기 복용 시 위장계, 중추 신경계, 조혈 기관, 신장, 간 등에 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다(Langenegger T, Michel BA. Clin Orthop. 366:22-30. 1999).
추간판 탈출증(椎間板脫出症, Spinal disc herniation) 또는 추간판 헤르니아는 탈장의 일종이며, 흔히 디스크라고 한다. 추간판의 일부가 피막을 찢고 탈출한 상태를 말한다. 요추 추간판 탈출증의 경우 한쪽 다리에 통증이 심하지만, 어느 정도 진행된 헤르니아의 경우는 양쪽 모두에 증상이 나타난다. 다리 통증은 해당 추간판 헤르니아에 의한 신경근 압박에 의해 발생한다. 허리 통증 외에 마비나, 경우에 따라서는 부종이나 운동신경 마비에 따른 근력 저하 현상이 일어나기도 한다. 드물게 배변 장애가 나타나기도 한다. 추간판 헤르니아는 요추나 경추에 많이 일어나고, 흉추에는 거의 일어나지 않는다.
추간판 탈출증 환자에서 나타나는 하지 통증, 즉 좌골 신경통(sciatica)은 신경근성 통증(radicular pain)과 비 신경근성 통증(non-radicular pain)으로 나눌 수 있다. 신경근성 통증은 흔히 방사통(radiating pain)이라 일컬어지며 탈출된 추간판에 의해 신경근이 이환되어 대퇴 신경이나 좌골신경을 통하여 각 신경근의 피부 고유감각 영역에 통증이 전달되는 것을 말하고, 비 신경근성 통증은 연관통(referred pain)이라 일컬어지며 섬유륜, 인대, 관절낭, 골막 등의 자극에 의하여 요배부 및 둔부, 하지 근위부에 나타나는 경계가 불분명한 통증을 말한다. 요추 추간판 탈출증에서 나타나는 이러한 통증은 환자의 일상 생활에 불편을 주고, 비교적 젊은 연령에서 발생하여 노동력의 손실을 야기하며, 사회 전체적인 의료비 상승을 유발하기 때문에 진단과 치료에 있어서 많은 관심의 대상이 되어 왔다. 특히 방사통은 환자의 일상 생활을 저해하는 주요한 증상이다.
봉독(蜂毒, Bee Venom)은 꿀벌(Apis mellifera)의 산란관에서 나오는 독액으로, 비중이 1.3이고 pH가 5.2이며 쓴맛이 있고 약한 방향성을 가진다. 봉독의 75 %는 단백질이며 기타 성분으로는 칼륨 나트륨, 마그네슘, 인, 알라닌, 발린, 아르기닌, 트립토판, 메티오닌, 히스티딘 등 다양한 물질이 함유되어 있다. 봉독은 NO, PGE2, TNF-α 등이 염증반응을 일으키는 과정을 차단하고 염증성 유전자가 발현되는 과정을 차단하여 소염작용을 나타내는 것으로 신경통, 류머티즘, 요통의 효과가 있다(Dong Ju Son, et al., Pharmacol. Therapeutics, 115, pp.246-270, 2007). 이뿐만 아니라 돼지나 어린 송아지의 호흡기 질환과 설사예방에도 효과가 크며, 성장 후 산유량 증가 및 항생작용으로 효과를 보고 있다. 기존 사용하던 항생제는 잔류하여 문제가 야기 되었지만 봉독을 사용할 경우 안전한 축산물 생산이 가능할 뿐 아니라 사료 효율 개선과 방역비 등 가축 질병관리 비용까지 절감할 수 있어 1석 2조의 효과가 있다.
봉독을 실온에서 증발시키면 약 30%의 건조물이 남으며, 약 75%는 단백질로 그 성분은 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 포스포리파제(phospholipase), 아돌라핀(adolapine), 히알우로니다제(hyaluronidase), 히스티딘(histidine) 및 히스타민(histamine) 등 다양한 물질이 함유되어 있다(Meier J, et al., CRC Press, Inc., 1995). 이들은 봉독의 항균, 항염, 진통, 항암, 단순포진, 다발성경화증, 종양, 해열과 ACTH 분비촉진 등에 작용기전이 된다(An et al., 2006; Kim et al., 2006; Kwon et al., 2007; Kim et al., 2009). 이러한 성분 중에서 멜리틴은 건조 봉독의 약 50%를 차지하는 주성분으로 진통 소염작용이 매우 우수하다.
예로부터 민간에서는 벌침요법 혹은 봉침요법이라 하여 이미 오래 전부터 살아있는 벌을 환부나 경혈에 자극하여 질병을 치료하는 방법을 사용해 왔으며, 현재에도 상당수의 양봉가가 시술하고 있는 것으로 알려지고 있다. 그러나, 벌을 그대로 잡아 경혈에 사용하는 직침법의 경우 시술 상황에서 벌의 움직임에 의해 정확한 취혈이 어려울 뿐만 아니라 이러한 방법은 계절이나 벌의 일령에 따라 지니고 있는 독의 함량 변화가 많아 자극량의 정량적 객관화가 곤란하다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 보완하고자 살아 있는 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 봉독을 전기 자극 등으로 추출하여 건조한 후 정제 가공한 다음, 이를 질병과 유관한 부위 및 경혈에 주입함으로써 자침의 효과와 벌의 독이 지니고 있는 생화학적 약리 작용을 질병의 치료에 이용하는 봉약침요법이 현재 널리 사용되고 있다. 이러한 봉약침 요법의 약리작용은 소염작용, 진통작용, 면역계의 조절작용, 혈액순환 촉진작용, 항암작용 등이 있어서 임상적으로 요추간판탈출증, 근위축증, 류마티스 관절염, 슬관절염 등에 유효한 것으로 보고되고 있다. 그러나, 치료의 과정에서 발생하는 다양한 형태의 알러지 반응은 시술자나 환자에게 있어서 부담으로 작용하며, 특히 봉독에 대한 과민성을 지닌 경우에 발생하는 전신즉시형 반응인 과민성 쇼크(anaphylactic shock)는 봉약침 시술에서 가장 큰 장애가 되고 있다. 봉독의 알러지 반응에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 효소들로서, 특히 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)가 주요 알러지 유발 효소로 알려져 있다. 특히 PLA2는 효소성분의 대부분을 차지하는 물질로, 봉독에 민감한 사람들의 90% 정도에서 이에 대한 IgE 항체가 발견된다. 또한, 봉독 정제물을 임상에서 사용하면서 발생할 수 있는 알러지를 원천적으로 차단할 수 있는 방법이 연구 개발 중에 있으나, 봉독에서 멜리틴은 건물량 기준으로 약 40~50% 함유되어 있으며, PLA는 약 10~12% 함유되어 있어, 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 PLA가 함유되는 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 인체에 부작용이 없고, 안전한 봉독 정제물을 제조하기 위해 노력한 결과, 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size)를 갖는 셀룰로스(cellulose) 막으로 여과시킨 정제물이 봉독 내 알러지 유발 물질 및 세균 내 독소가 효과적으로 제거됨을 확인하였고, 대식세포에서 세포증식 억제 효과 및 항염증 효과 및 우수한 임상효과를 확인함으로써, 상기 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물은 이를 포함하는 조성물을 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size)를 갖는 셀룰로스(cellulose) 막으로 여과시킨 봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 관절 질환 또는 염증 질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 봉독을 멸균수에 용해시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 용해물을 염도 및 pH를 보정한 후 교반시키는 단계;
3) 상기 단계 2의 혼합물을 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size), 0.05 내지 0.2 m2의 필터 영역(filter area) 및 5 내지 10 ℓ/h의 투과력(permeate)을 가지고 셀룰로스(cellulose) 막으로 구성된 필터에 통과시켜 1차 여과시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 여과물을 멸균된 폴리이서설폰(polyethersulfone;PES) 막으로 구성된 필터에 통과시켜 2차 여과시켜 정제물을 수득하는 단계를 포함하는 봉독 정제물의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 PLA2가 제거된 봉독 정제물을 제공한다.
본 발명은 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size)를 갖는 셀룰로스(cellulose) 막으로 여과시킨 정제물이 봉독 내 알러지 유발 물질 및 세균 내 독소가 효과적으로 제거됨을 확인하였고, 대식세포에서 세포증식 억제 효과 및 항염증 효과 및 우수한 임상효과를 확인함으로써, 상기 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물은 이를 포함하는 조성물을 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 봉독 정제물(BV)의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)의 (A) 멜리틴(melittin), 아파민(apamin) 및 (B) 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)의 함량을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)의 세균 내 독소(엔도톡신)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제(BV)물의 대식세포(Raw264.7)에서 세포증식억제 및 산화질소(NO) 생성 억제효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)의 허리디스크 환자들에서 임상적 효과를 나타낸 도이다.
(LBP는 Low back pain의 약어이며 요통통증지수를 의미하고, Rad는 radiculopathy의 약어이며 방사통을 의미하고, ODI는 Oswestry disability index의 약어이며 요통관련장애지수를 의미하고, Flex는 flexion의 약어이며 환자의 운동범위를 나타내는 척도를 의미하고, Ext는 extension의 약어이며환자의 운동범위를 나타내는 척도를 의미하고, physical fuc은 생리학적 기능(physical functioning)이며, SF는 Short Form (SF)-36 환자의 생활만족지수를 의미한다.)
도 6은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)의 목 디스크 환자들에서 임상적 효과를 나타낸 도이다.
(VAS는 Visual analogue scale의 약어이며 통증의 시각적등급지수를 의미하며, NDI는 neck disability index의 약어이며 경부통증지수를 의미하고,ROM은 range of motion의 약어이며 환자의 경부가동범위를 의미하며, f는 flexion의 약어로 경부가동범위 중 굴곡을, e는 extension의 약어로 경부가동 범위 중 신전, l은 left lateral flexion의 약어로 경부가동 범위 중 좌측면굴곡을, r은 right lateral flexion의 약어로 경부가동 범위 중 우측면굴곡을 의미한다.)
도 7은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)의 골(슬)관절염 환자들에서 임상적 효과를 나타낸 도이다.
(WOMAC은 Western Ontarioand Mc Master Universities index of Osteoarthritis의 약어이며 골관절염 치료평가를 의미하고, ROM은 range of motion의 약어이며 환자의 운동범위를 의미한다.)
도 8은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)의 류마티스 관절염 환자들에서 임상적 효과를 나타낸 도이다.
(TJC는 tender joint count의 약어이며 압통관절수를 의미하고, SJC는 swelling joint count의 약어이며 부종관절수를 의미하고, Pain은 Patient assessment of pain의 약어이며 환자의 통증평가를 의미하고, ESR F는 Erythrocyte Sedimentation rate female의 약어이며 여성의 적혈구 침강속도를 의미하고 ESR M은 Erythrocyte Sedimentation rate male의 약어이며 남성의 적혈구 침강속도를 의미한다.)
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 봉독을 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size)를 갖는 셀룰로스(cellulose) 막으로 여과시킨 정제물을 유효성분으로 포함하는 관절 질환 또는 염증 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 여과는 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size), 0.05 내지 0.2 m2 필터 영역(filter area) 및 5 내지 10 ℓ/h의 투과력(permeate)을 가지고 셀룰로스(cellulose) 막으로 구성된 필터를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 여과는 Hydrosart® Ultrafiltration cassettes를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계에서 얻은 정제물은 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)의 함량이 여과 전 봉독에 비해 90 내지 100% 제거된 것을 특징으로 한다. 봉독의 알러지 반응에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 효소들로서, PLA2가 주요 알러지 유발 효소로 알려져 있으며, 특히 본 발명의 제조방법으로 제조된 봉독 정제물은 효소성분의 대부분을 차지하는 PLA2가 제조 전보다 90%이상 제거되었다. 또한, 상기 단계에서 얻은 정제물은 활성 성분들인 멜리틴(melittin)의 함량이 전체 중량에 대해 40 내지 50 중량부, 아파민(apamin)의 함량이 1 내지 3 중량부 및 PLA2 0.1 내지 3 중량부를 포함하는 정제물임을 특징으로 한다.
본 발명에서 정의되는 관절 질환은 허리디스크, 목디스크, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 오십견으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 염증성 질환은 근육통, 대상포진을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 봉독 정제물은 하기와 같은 제조방법으로 제조돌 수 있다.
1) 봉독을 멸균수에 용해시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 용해물을 염도 및 pH를 보정한 후 교반시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size), 0.05 내지 0.2 m2의 필터 영역(filter area) 및 5 내지 10 ℓ/h의 투과력(permeate)을 가지고 셀룰로스(cellulose) 막으로 구성된 필터에 통과시켜 1차 여과시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 여과물을 멸균된 폴리이서설폰(polyethersulfone;PES) 막으로 구성된 필터에 통과시켜 2차 여과시켜 정제물을 수득하는 단계를 통하여 본 발명의 효능이 우수한 봉독 정제물(이하 "BV"라 함)을 수득할 수 있다.
따라서, 상기 단계 2)의 염도는 NaCl을 첨가하고, pH는 Na2HPO4를 첨가하여 보정시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 여과는 Hydrosart® Ultrafiltration cassettes 필터를 가지고 1차 여과하고, 0.1 ㎛의 공극 크기(pore size) 및 0.005 내지 0.03 m2의 필터 영역(filter area)을 가지고 있는 PES 막으로 구성된 필터로 2차 여과하여 PLA2의 함량이 여과 전 봉독에 비해 90 내지 100% 제거된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 봉독의 알러지 반응에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 효소들로서, PLA2가 주요 알러지 유발 효소로 알려져 있으며, 특히 본 발명의 제조방법으로 제조된 봉독 정제물은 효소성분의 대부분을 차지하는 PLA2가 제조 전보다 90%이상 제거되었다.
또한, 상기 단계에서 얻은 정제물은 활성 성분들인 멜리틴(melittin)의 함량이 전체 중량에 대해 40 내지 50 중량부, 아파민(apamin)의 함량이 1 내지 3 중량부 및 PLA2 0.1 내지 3 중량부를 포함하는 정제물임을 특징으로 한다.
또한, 상기 봉독 정제물(BV)을 용기에 충전한 후 실링(sealing)하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(도 1참조).
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 PLA2가 제거된 봉독 정제물(BV)을 제공한다. 봉독의 알러지 반응에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 효소들로서, PLA2가 주요 알러지 유발 효소로 알려져 있으며, 특히 본 발명의 제조방법으로 제조된 봉독 정제물은 효소성분의 대부분을 차지하는 PLA2가 제조 전보다 90%이상 제거되었다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 멜리틴(melittin)의 함량이 1g 내 40 내지 55%이고 아파민(apamin)의 함량이 1g 내 2 내지 2.5% 이고 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)의 함량이 1g 내 2 내지 2.5%인 최종 수득한 봉독 정제물(BV)를 수득하였다(도 2참조).
본 발명의 정제물(BV)은 생물학적내독소 시험법(Limulus Amebocyte Lysate;LAL Test)을 사용한 겔화법(gel clot)을 이용하여 세균 내 독소(엔도톡신)를 확인한 결과, 엔도톡신 음성 반응을 나타내는 것을 확인하였고(도 3 참조), 대식세포주인 Raw264.7 세포를 사용하여 MTT 분석한 결과, 양성대조군인 멜리틴(melittin)보다 효과적으로 Raw264.7 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하였다(도 4A 참조). 또한, 본 발명의 봉독 정제물(BV)은 양성대조군인 멜리틴(melittin)과 유사하게 산회질소(NO) 형성에 있어서 음성 대조군에 비교해서 90% 이상 억제되는 것을 확인하였다(도 4B 참조).
또한, 본 발명에 따른 봉독 정제물(BV)은 임상에서 효과를 확인하기 위하여, 상기 봉독 정제물(BV)을 3 내지 12개월 동안 허리디스크의 경우 신수, 대장수, 환도, 명문, 요양관, 기해수 등의 혈자리와 환부 부위에, 목디스크의 경우 풍지, 곡지, 합곡, 후계 등의 혈자리와 환부 부위에, 골(슬)관절염 및 류마티스 관절염 경우 양릉천, 삼음교, 양슬안, 혈해 등의 혈자리와 환부 부위에 근육(또는 피하)주사하였고, 치료효과를 일반적인 임상 지표를 각 질환별 진단 기준에 따라 실험 전, 후에 측정하였으며, 상기 임상 지표의 측정은 1명의 평가자에 의해 면담을 통하여 이루어졌으며, 실험 전과 실험 후 평가를 통하여 비교한 결과, 허리디스크 환자에 있어서 봉독 정제물(BV)은 요통통증지수(LBP) 및 방사통(radiculopathy;Rad)의 점수가 치료 전보다 90% 감소된 것을 확인하였고, 요통관련장애지수(ODI)는 치료 전보다 60% 감소된 것을 확인하였다. 또한, 환자의 운동범위(range of motion;ROM)는 수축 및 이완의 정도가 각각 10% 및 5% 개선되었고 환자의 생활만족지수는 치료 전보다 2배 이상 개선한 것을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 목디스크 환자에 있어서 봉독 정제물(BV)은 통증척도(Visual Analogue Scale;VAS) 및 경부통증지수(Neck Disability Index;NDI)는 각각 80% 및 50% 치료 전보다 감소된 것을 확인하였고, 환자의 운동범위는 10% 개선하였다. 또한, 환자의 생활만족지수는 치료 전보다 1.5배 이상 개선한 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 골(슬)관절염 환자에 있어서 봉독 정제물(BV)은 WOMAC(Western Ontario and McMasters Universities) 지수는 80% 감소하였고, 운동범위는 30% 개선하였다. 또한, 환자의 통증도 80% 감소하는 것을 확인하였다(도 7 참조). 또한, 류마티스 관절염 환자에 있어서 봉독 정제물(BV)은 압통관절 수(tender joint count; TJC) 및 부종관절 수(swelling joint count; SJC)가 각각 13점 및 12점 감소하는 효과를 확인하였고, 통증의 환자 평가(Patient assessment of pain;Pain) 및 질병에 대한 환자의 전반적인 평가(Patien's global assessment of disease)가 80% 감소하여 개선된 것을 확인하였다. 또한, 적혈구 침강속도(Erythrocyte Sedimentation rate;ESR)는 남자(ESR M), 여자(ESR F) 모두 90% 이상 감소하여 개선된 것을 확인하였다(도 8 참조).
따라서, 본 발명의 제조방법으로 제조된 봉독 정제물(BV)은 봉독 내 알러지 유발 물질 및 세균 내 독소가 효과적으로 제거됨을 확인하였고, 대식세포에서 세포증식 억제 효과 및 항염증 효과 및 우수한 임상효과를 확인함으로써, 본 발명에 따른 봉독 정제물(BV)을 관절 질환 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 관절 질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 정제물(BV)을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.
본 발명의 봉독으로부터 분리된 봉독 정제물(BV)을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 봉독 정제물(BV)을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태, 바람직하게는 현탁제, 동결건조제제, 비수성 주사제, 또는 수성 주사용액의 형태, 더욱 바람직하게는 멸균 주사용액제제로 제형화하여 사용될 수 있으며, 봉독 정제물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 당업계에서 통상적으로 사용하는 용제, 용해보조제, 완충제, 등장화제, 안정제, 항산화제, 무통화제, 현탁화제 등을 사용하여 조제가능하며, 상기 용제, 첨가제 및 희석제로는 멸균증류수, 생리식염수, pH 조절제, 알부민, 염화나트륨, 만니톨, 링겔주사액, 포도당 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 봉독으로부터 분리된 봉독 정제물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 봉독으로부터 분리된 봉독 정제물(BV)은 1일 8 마이크로그램 내지 5 밀리그램, 바람직하게는 8 마이크로그램 내지 2 밀리그램, 보다 바람직하게는 16 마이크로그램 내지 1 밀리그램의 투여량으로, 바람직하게는 주사제, 보다 더 바람직하기로는 근육내 주사법으로 투여하는 것이 바람직할 것이다. 투여 회수는 1일 1회, 1일 수회, 2일 내지 1주일간 1회 등으로 투여가능하나, 그 투여횟수에는 그 제한이 없다. 상기 투여량, 투여횟수 및 투여방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 봉독으로부터 분리된 봉독 정제물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 봉독 정제물 제조
꿀벌(Apis meliffera L.)로부터 채취하여 건조한 봉독(청진바이오텍, 한국)을 2 g을 20리터 멸균수에 녹인후, 0.9% NaCl과 Na2HPO4(pH 7.1~7.3)를 이용하여 상기 봉독 수용액을 보정하였다. 보정된 봉독 수용액을 1시간동안 상온에서 교반하였다. 상기 교반 종료후, Cogent M(Satorius, 독일)의 카세트 필터(Hydrosart® Ultrafiltration cassettes filter)(filter area 0.1 m2, permate 8 ℓ/h)를 이용하여 여과하였고, 상기 수득된 여과물을 멸균된 capsule filter(폴리이서설폰(polyethersulfone;PES) 재질, pore size 0.1 ㎛)를 이용하여 2차 여과 후, 얻어진 봉독 정제물(이하 'BV' 이라함)을 하기 실험예에 사용하였다. 또한, 임상에 사용하기 위한여 봉독 정제물(BV)을 용기에 충전한 후 실링(sealing)하여 사용전가지 보관하였다.
<실험예 1> 봉독 정제물의 성분 비교
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 성분 함량을 측정하기 위하여, 제조전 건종 봉독과 제조후 BV를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 성분 변화를 비교하였다. 상기 제조된 BV의 성분 가운데 주요성분인 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin), 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)를 Waters HPLC DAD(다파장측정기)(Waters Alliance, 미국)를 사용하여 제조사의 측정하였다. 대조군은 시판되고 있는 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)의 표준품 Melittin (91.8%) Sigma W2272-5.0mg, Apamin (99.9%) Sigma A1289-0.5mg, PLA2 (87%) Sigma P9279-1.0mg을 사용하였다. 검액 및 표준품은 220 nm 파장의 UV를 이용하여 검출하고 35℃의 온도에 컬럼에서 검액 시료를 50 ㎕씩 1.5 ℓ/min의 유속으로 주입하고 이동상 A(Mobile phase A)는 0.1% TFA (water)를 이동상 B(Mobile phase B)는 0.1% TFA (ACN : water = 8 : 2)를 사용하였다. 이때, 이동상의 구배 프로필(Gradient profile=A(%):B(%))은 0에서 95:5, 40에서 20:80의 조건을 사용하였다. 실험 후 하기 [수학식 1]에 기재된 방법으로 성분의 함량을 구하였다.
[ 수학식 1]
Figure 112013022721619-pat00001
A : 표준품 주입 부피(㎕), B : 표준품 Area, C : 표준품 희석농도(㎎/㎖), D : 표준품 순도(%), E : 검액 시료 Area, F : 검액 시료 주입 부피(㎕)
그 결과, 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 제조된 봉독 정제물(BV)에서 멜리틴(melittin)과 아파민(apamin)은 함량이 거의 유지되는(도 2A) 반면에, 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)는 90% 이상 여과된 것(도 2B)을 확인하였다(도 2 및 표 1).
제조 전과 후의 정제물의 주요성분 비교
성분 제조 전 (㎎/㎖) 함량(1g내) 제조 후 (㎎/㎖) 함량(1g 내)
Melittin (50)
Apamin (3)
PLA2 (12) 		2.511
0.128
1.220 		50.2 %
2.6 %
24.4 % 		2.502
0.121
0.117 		50.00 %
2.4 %
2.34 %
< 실험예 2> 봉독 정제물의 생물학적 내독소( 엔도톡신 ) 측정
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 세균 내 독소(엔도톡신)를 확인하기 위하여, 생물학적 내독소 시험법(Limulus Amebocyte Lysate;LAL Test)을 사용한 겔화법(gel clot)을 이용하여 확인하였다. 상기 생물학적 내독소(엔도톡신) 시험법은 참게(Limuluspolyphemus또는 Tachypleus tridentatus)의 혈구추출성분으로 만든 라이세이트(Lysate) 시약을 써서 그람음성균에서 유래되는 엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법으로 겔화법을 사용하였으며, 시험에 쓰는 모든 유리제 및 기타 내열성 기구는 유효한 방법으로 250℃에서 30 분간 건열처리 하였다. 마이크로플레이트, 마이크로피펫용팁 등의 플라스틱제품은 엔도톡신이 검출되지 않고 이 시험법에 대하여 간섭이 없는 것이 확인된 것을 사용하였다. 상기 시험법의 정밀도 및 유효성을 보증하기 위하여 예비시험으로 라이세이트 시약의 표시감도확인시험 및 반응간섭인자시험을 진행하였고, 반응감도가 0.25 EU/㎖ 인 1회용 제품을 사용하였다. 반응 키트에 200 ㎕의 검액을 첨가하여 60±2 분 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응 후 약 180˚로 가만히 돌려 내용물을 관찰하였다. 흘러내리지 않는 견고한 겔이 형성되어 있을 때 양성으로 하며 겔이 형성되지 않거나 형성된 겔이 흘러내릴 때 음성으로 판정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 제조된 봉독 정제물(BV)는 엔도톡신 음성 반응을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).
< 실험예 3> 봉독 정제물의 염증 반응 억제 효과
<3-1> MTT 분석법에 의한 봉독 정제물(BV)의 대식세포주(Raw264.7)에서 세포 증식 억제
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 염증 반응 억제 효과를 확인하기 위하여, 대식세포주인 Raw264.7 세포를 사용하여 MTT 분석을 사용하였다. 96 웰 프레이트(well plate)에 세포를 5 x 103 cells/100 ㎕ 농도로 분주하여 37℃, CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 검액 시료는 음성 대조군으로 생리식염수를 사용하였고 멜리틴(melittin) 표준품 Melittin (91.8%) Sigma W2272-5.0mg을 양성대조군으로 사용하여 각 well에 50 ㎕씩 1, 5, 10 및 15 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 넣어주고 24시간 배양하였다. 각 시료와 배양된 플레이트에 DPBS로 희석한 MTT 시약(10 ㎎/㎖) 20 ㎕를 각 well에 첨가하고 다시 4시간 배양하고 DMSO 50 ㎕를 첨가하여 약간 흔들어주었다. 30분 후, ELISA reader(TECAN Austria, 호주)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 봉독 정제물(BV)은 양성대조군인 멜리틴(melittin)보다 효과적으로 Raw264.7 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하였다(도 4A).
<3-2> 봉독 정제물(BV)의 대식세포주(Raw264.7)에서 NO 활성 억제
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 염증 반응 억제 효과를 확인하기 위하여, 대식세포주인 Raw264.7 세포를 사용하여 산화질소(NO) 형성을 확인하였다. 96 웰 프레이트(well plate)에 세포를 103 cells/100 ㎕농도로 분주하여 37℃, CO2 세포배양기에서 12시간 배양하였다. 배양된 세포에 LPS를 50 ng/well이 되게 각 well에 분주하고 2시간 배양하였다. 검액 시료는 음성 대조군으로 생리식염수를 사용하였고 멜리틴(melittin) 표준품을 양성대조군으로 사용하여 각 well에 10 ㎍/㎖로 분주하고 Gress reagent용액 50 ㎕을 첨가하고 실온에서 반응하였다. ELISA reader(TECAN Austria, 호주)를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 0.1, 1, 10, 20, 50, 100 및 150 μM sodium nitrite를 sodium nitroprusside dehydrate(SND)으로 발색반응을 실시하여 표준농도를 구하여 비교분석하였다.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 봉독 정제물(BV)은 양성대조군인 멜리틴(melittin)과 유사하게 산화질소(NO) 형성에 있어서 음성 대조군에 비교해서 90% 이상 억제되는 것을 확인하였다(도 4B).
< 실험예 4> 봉독 정제물의 임상적 효과
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 관절질환 환자들에 대한 임상적 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
봉독 정제물(BV)을 3일에 1회, 1회에 0.05 내지 0.2 ㎎/㎖의 용량을 3 내지 12개월 동안 허리디스크의 경우 신수, 대장수, 환도, 명문, 요양관, 기해수 등의 혈자리와 환부 부위에, 목디스크의 경우 풍지, 곡지, 합곡, 후계 등의 혈자리와 환부 부위에, 골(슬)관절염 및 류마티스 관절염 경우 양릉천, 삼음교, 양슬안, 혈해 등의 혈자리와 환부 부위에 근육(또는 피하) 주사하였다. 봉독 정제물(BV)의 관절 질환 치료효과는 하기에 따른 일반적인 임상 지표를 각 질환별 진단 기준에 따라 실험 전, 후에 측정하였다. 상기 임상 지표의 측정은 1명의 평가자에 의해 면담을 통하여 이루어졌으며, 실험 전과 실험 후 평가를 통하여 [표 2] 내지 [표 5]에 기재된 임상 지표의 변화를 비교하였다.
허리 디스크 평가
측정 척도 의 의
LBP : 요통통증지수
(Visual analogue scale;VAS)		 요통통증지수는 요통을 가시적으로 표시
VAS는 통증의 강도를 시각 통증 등급으로 나타낸 지수
Rad : 방사통(radiculopathy)
(Visual analogue scale;VAS)		 VAS를 사용하여 방사통(발생부위와 관계없는 곳에서도 통증)을 측정.
ODI : 요통관련 장애지수
(ODI)		 ODI는 통증으로 동반된 활동 및 기능 장애를 포괄하는 척도로 환자의 디스크 진단 및 통증 강도, 기능 장애를 측정
Flex(flexion) (각도) 환자의 운동범위를 나타내는 척도
Ext(extension) (각도) 환자의 운동범위를 나타내는 척도
SF-36
(Physical func. 포함)		 생활만족지수로 측정 항목은 육체적, 정신적 관련된 여러 가지 항목으로 구성되어 있으며, 종합적으로 환자의 호전도를 평가하여 환자의 삶에 대한 만족도 측정.
목 디스크 평가
측정 척도 의 의
Neck Disability IndexNDI
(Visual analogue scale;VAS)		 경부통증과 기능장애에 관한 척도
VAS는 통증의 강도를 시각 통증 등급으로 나타낸 지수
목디스크 통증
(Visual analogue scale;VAS)		 통증 지수
VAS는 통증의 강도를 시각 통증 등급으로 나타낸 지수
Range of motion;ROM
(각도)		 가동범위 : 굴곡 신전 좌우측면 (각도)
SF-36 생활만족지수로 측정 항목은 육체적, 정신적 관련된 여러 가지 항목으로 구성되어 있으며, 종합적으로 환자의 호전도를 평가하여 환자의 삶에 대한 만족도 측정.
골(슬)관절염 평가
측정 척도 의 의
WOMAC(Western Ontarioand Mc Master Universities index of Osteoarthritis) 관절염, 관절질환에 관한 설문하여 치료 결과와 기능적 장애 정도를 여러 항목으로 측정
관절 통증
(Visual analogue scale ;VAS)		 통증 지수
VAS는 통증의 강도를 시각 통증 등급으로 나타낸 지수
Range of motion;ROM 운동범위
류마티스 관절염 평가
측정 척도 의 의
미국류마티스학회
(American College of Rheumatology;ACR) 지수		 항류마티스 약물에 대한 가장 널리 쓰이는 임상적 평가 지수이다. 7항목이 있으며, 필수 항목 2가지와 나머지 5가지 중 3가지 이상이 호전되면 임상적으로 유의성 있음을 인정.
압통관절 수
(tender joint count;TJC)		 ACR 필수항목
부종관절 수
(swelling joint count;SJC)		 ACR 필수항목
통증의 환자 평가
(Patient assessment of pain)
(VAS)		 ACR 선택항목
적혈구 침강속도(Erythrocyte Sedimentation rate;ESR) ACR 선택항목
질병에 대한 환자의 전반적인 평가
(Patien's global assessment of disease)
(VAS)		 ACR 선택항목
<4-1> 허리 디스크
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 허리디스크 환자들에 대한 임상적 효과를 확인하기 위하여, 남자 20명과 여자 10명에게 상기와 같은 방법으로 24주간 실험하였다.
그 결과, 표 6 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 봉독 정제물(BV)은 요통통증지수(LBP) 및 방사통(radiculopathy;Rad)의 점수가 치료 전보다 90% 감소된 것을 확인하였고, 요통관련장애지수(ODI)는 치료 전보다 60% 감소된 것을 확인하였다. 또한, 환자의 운동범위(range of motion;ROM)는 수축 및 이완의 정도가 각각 10% 및 5% 개선되었고 환자의 생활만족지수는 치료 전보다 2배 이상 개선한 것을 확인하였다(표 6 및 도 5).
허리 디스크 임상 지표 측정 결과
LBP 　 　
median(IQR) p-value
LBP 0 주 4.45 (6.65, 3.35) <0.0001
LBP 24 주 0.85 (1.95, 0.3)
n=30 　 　
Rad 　 　
　 median(IQR) p-value
Rad 0 주 7.35 (7.96, 5.8) <0.0001
Rad 24 주 0.9 (2.25, 0.3)
n=30 　 　
ODI 　 　
　 median(IQR) p-value
ODI 0 주 42 (52, 32) <0.0001
ODI 24 주 14 (14, 7.76)
n=30 　 　
physical fun . 　
　 median(IQR) p-value
P. F. 0 주 40 (50, 25) <0.0001
P. F. 24 주 82.5 (90, 63.8)
n=30 　 　
Flex 　 　
　 median(IQR) p-value
Flex 0 주 65 (90, 50) 0.008
Flex 24 주 80 (90, 80)
n=30 　 　
Ext 　 　
　 median(IQR) p-value
Ext 0 주 11 (15, 10) 0.03
Ext 24 주 15 (15, 15)
n=30 　 　
SF -36 　 　
　 median(IQR) p-value
SF-36 0 주 29 (41.5, 24) <0.0001
SF-36 24 주 59.5 (71.3, 48.5)
n=30 　 　
(LBP는 Low back pain의 약어이며 요통통증지수를 의미하고, Rad는 radiculopathy의 약어이며 방사통을 의미하고, ODI는 Oswestry disability index의 약어이며 요통관련장애지수를 의미하고, Flex는 flexion의 약어이며 환자의 운동범위를 나타내는 척도를 의미하고, Ext는 extension의 약어이며환자의 운동범위를 나타내는 척도를 의미하고, physical fuc은 생리학적 기능(physical functioning)이며, SF는 Short Form (SF)-36 환자의 생활만족지수를 의미한다.)
<4-2> 목 디스크
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 목디스크 환자들에 대한 임상적 효과를 확인하기 위하여, 남자 10명과 여자 13명에게 상기와 같은 방법으로 12주간 실험하였다.
그 결과, 표 7 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 봉독 정제물(BV)은 통증척도(Visual Analogue Scale;VAS) 및 경부통증지수(Neck Disability Index;NDI)는 각각 80% 및 50% 치료 전보다 감소된 것을 확인하였고, 환자의 운동범위는 10% 개선하였다. 또한, 환자의 생활만족지수는 치료 전보다 1.5배 이상 개선한 것을 확인하였다(표 7 및 도 6).
목 디스크 임상 지표 측정 결과
VAS 　 　
median(IQR) p-value
VAS 0 주 7 (8.3, 6.5) <0.0001
VAS 12 주 2.1 (3.2, 1.4)
n=23 　 　
NDI 　 　
　 median(IQR) p-value
NDI 0 주 28 (35, 25) <0.0001
NDI 12 주 15 (17, 11)
n=23 　 　
ROM f 　 　
　 median(IQR) p-value
ROM f 0 주 48 (51, 44) <0.0001
ROM f 12 주 61 (67, 56)
n=23 　 　
ROM e 　 　
　 median(IQR) p-value
ROM e 0 주 55 (64, 50) <0.0001
ROM e 12 주 63 (69, 59)
n=23 　 　
ROM l 　 　
　 median(IQR) p-value
ROM l 0 주 32 (37, 30) <0.0001
ROM l 12 주 45 (48, 42)
n=23 　 　
ROM r 　 　
　 median(IQR) p-value
ROM r 0 주 36 (40, 32) <0.0001
ROM r 12 주 48 (49, 46)
n=23 　 　
(VAS는 Visual analogue scale의 약어이며 통증의 시각적등급지수를 의미하며, NDI는 neck disability index의 약어이며 경부통증지수를 의미하고,ROM은 range of motion의 약어이며 환자의 경부가동범위를 의미하며, f는 flexion의 약어로 경부가동범위 중 굴곡을, e는 extension의 약어로 경부가동 범위 중 신전, l은 left lateral flexion의 약어로 경부가동 범위 중 좌측면굴곡을, r은 right lateral flexion의 약어로 경부가동 범위 중 우측면굴곡을 의미한다.)
<4-3> 퇴행성 골(슬)관절염
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 퇴행성 골관절염 환자들에 대한 임상적 효과를 확인하기 위하여, 남자 7명과 여자 12명에게 상기와 같은 방법으로 24주간 실험하였다.
그 결과, 표 8 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 봉독 정제물(BV)은 WOMAC(Western Ontaro and McMasters Universities) 지수는 80% 감소하였고, 운동범위는 30% 개선하였다. 또한, 환자의 통증도 80% 감소하는 것을 확인하였다(표 8및 도 7).
퇴행성 골(슬)관절염 임상 지표 측정 결과
WOMAC 　 　
　 median(IQR) p-value
WOMAC 0 주 49 (52, 44) 0.0001
WOMAC 24 주 15 (18, 12)
n=19 　 　
ROM 　 　
　 median(IQR) p-value
ROM 0 주 　 0.0001
ROM 24 주 　
n=19 　
VAS
　 median(IQR) p-value
VAS 0 주 8 (8.6, 7.5) 0.0001
VAS 24 주 2.2 (2.8, 1.5)
n=19 　 　
(WOMAC은 Western Ontarioand Mc Master Universities index of Osteoarthritis의 약어이며 골관절염 치료평가를 의미하고, ROM은 range of motion의 약어이며 환자의 운동범위를 의미한다.)
<4-4> 류마티스 관절염
상기 <실시예 1>에서 수득한 봉독 정제물(BV)의 퇴행성 류마티스 관절염 환자들에 대한 임상적 효과를 확인하기 위하여, 남자 10명과 여자 12명에게 상기와 같은 방법으로 12개월 실험하였다.
그 결과, 표 9 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 봉독 정제물(BV)은 압통관절 수(tender joint count; TJC) 및 부종관절 수(swelling joint count; SJC)가 각각 13점 및 12점 감소하는 효과를 확인하였고, 통증의 환자 평가(Patient assessment of pain;Pain) 및 질병에 대한 환자의 전반적인 평가(Patien's global assessment of disease)가 80% 감소하여 개선된 것을 확인하였다. 또한, 적혈구 침강속도(Erythrocyte Sedimentation rate;ESR)는 남자(ESR M), 여자(ESR F) 모두 90% 이상 감소하여 개선된 것을 확인하였다(표 9 및 도 8).
류마티스 관절염 임상 지표 측정 결과
TJC 　 　
　 median(IQR) p-value
TJC 0 년 16 (18, 14.75) <0.0001
TJC 1 년 3 (3.3, 2)
N= 22 　 　
SJC 　 　
　 median(IQR) p-value
SJC 0 년 15 (17, 13.8) <0.0001
SJC 1 년 3 (3, 2)
N=22 　 　
Pain 　 　
　 median(IQR) p-value
Pain 0 년 8.7 (8.3, 8.8) <0.0001
Pain 1 년 2 (2.4, 1.7)
N=22 　 　
Patien's global assessment of disease
　 median(IQR) p-value
0 년 8.5 (8.8, 8.3) <0.0001
1 년 2.95( 3.4, 2.65)
N=22 　 　
ESR M 　 　
　 median(IQR) p-value
0 년 61 (69, 53) 0.002
1 년 6 (7, 4.3)
N=10 　 　
ESR F 　 　
　 median(IQR) p-value
0 년 74.5 (76, 74.5) 0.004
1 년 4 (5, 3)
N=12 　 　
(TJC는 tender joint count의 약어이며 압통관절수를 의미하고, SJC는 swelling joint count의 약어이며 부종관절수를 의미하고, Pain은 Patient assessment of pain의 약어이며 환자의 통증평가를 의미하고, ESR F는 Erythrocyte Sedimentation rate female의 약어이며 여성의 적혈구 침강속도를 의미하고 ESR M은 Erythrocyte Sedimentation rate male의 약어이며 남성의 적혈구 침강속도를 의미한다.)
< 실험예 5> 통계 분석
각 각의 임상지표 측정 결과를 중간값과 4분위범위로 표시하였으며, 통계처리는 SPSS12.0(IBM, 미국)을 사용하여 분석하였다. 치료 전과 치료 후의 비교는 Wilcoxon Signed Ranks Test를 사용하였고 p값은 0.05 미만을 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

Claims (14)

  1. 봉독을 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 수득할 수 있는 공극 크기(pore size)를 갖는 셀룰로스(cellulose) 막으로 여과시킨 정제물을 유효성분으로 포함하는 허리디스크 또는 목디스크 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 여과는 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 여과할 수 있는 공극 크기(pore size), 0.05 내지 0.2 m2 필터 영역(filter area) 및 5 내지 10 ℓ/h의 투과력(permeate)을 가지고 셀룰로스(cellulose) 막으로 구성된 필터를 이용하여 수행하는 허리디스크 또는 목디스크 예방 및 치료용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 정제물은 포스포리파제 A2(Phospholipase A2;PLA2)의 함량이 여과 전 봉독에 비해 90 내지 100% 제거된 것을 특징으로 하는 허리디스크 또는 목디스크 예방 및 치료용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 정제물은 전체 정제물 100 중량부에 대해 멜리틴(melittin)의 함량이 40 내지 50 중량부, 아파민(apamin)의 함량이 1 내지 3 중량부 및 PLA2 0.1 내지 3 중량부를 포함하는 허리디스크 또는 목디스크 예방 및 치료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 1) 봉독을 멸균수에 용해시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 용해물을 염도 및 pH를 보정한 후 교반시키는 단계;
    3) 상기 단계 2의 혼합물을 7 내지 10 kDa의 분자량의 물질을 수득할 수 있는 공극 크기(pore size), 0.05 내지 0.2 m2의 필터 영역(filter area) 및 5 내지 10 ℓ/h의 투과력(permeate)을 가지고 셀룰로스(cellulose) 막으로 구성된 필터에 통과시켜 1차 여과시키는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 여과물을 멸균된 폴리이서설폰(polyethersulfone;PES) 막으로 구성된 필터에 통과시켜 2차 여과시켜 정제물을 수득하는 단계를 포함하는 봉독 정제물의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 염도는 NaCl을 첨가하고 pH는 Na2HPO4를 첨가하여 보정시키는 것을 특징으로 하는 봉독 정제물의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제 8항에 있어서, 상기 단계 4)의 필터는 0.1 ㎛의 공극 크기(pore size) 및 0.005 내지 0.03 m2의 필터 영역(filter area)을 가지고 있는 PES 막으로 구성된 필터인 것을 특징으로 하는 봉독 정제물의 제조방법.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 봉독 정제물은 PLA2의 함량이 여과 전 봉독에 비해 90 내지 100% 제거된 것을 특징으로 하는 봉독 정제물의 제조방법.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 단계 4)의 정제물을 용기에 충전한 후 실링(sealing)하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 봉독 정제물의 제조방법.
  14. 삭제
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