KR101351978B1 - 참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 장관계 면역 시스템에서 일어나는 면역관용을 유도함으로써 부작용 없이 관절에 특이적으로 일어나는 자가 면역반응 및 염증을 효과적으로 제어하여 관절염을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물{Pharmaceutical and Food Compositions for Preventing or Treating Arthritis Comprising Crush of Tuna Eyeball as Active Ingredients}

본 발명은 참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

관절염은 우리나라 인구의 5%가 앓고 있는 만성 질환으로서 관절 활액막에 염증이 발생하여 부종과 통증을 유발되는 질환이다. 관절염은 진행성 질병이고 관절 변형 및 장애를 일으켜 치료되지 않을 경우 계속 악화되고 심각한 결과를 초래한다.

관절염이 유발되는 직접적 원인은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았으며, 치료를 위해서 코르티손 및 다른 부신피질 호르몬과 같은 스테로이드계, 아스피린, 피록시캄 및 인도메타신과 같은 비스테로이드계 항염증제, 클로로퀴논제제 및 D-페니실아민과 같은 항류마티스제, 콜치신과 같은 통풍억제제, 그리고 시클로포스프아미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 레바미솔과 같은 면역 억제제를 포함한 다양한 치료제가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 이러한 화학적 치료제들은 근본적인 치료 효과를 나타내지 않으며 스테로이드 호르몬제의 경우에는 부작용으로 인해 사용이 제한되고 있다. 또한, 관절 통증을 완화시키거나 염증을 제거하는 약제로서 널리 사용되고 있는 아스피린제 및 브타졸린제 등은 사람의 위에 치명적인 영향을 주므로 관절염을 치료하는데 필요한 양을 계속적으로 복용하는 것은 불가능하다.

기존의 이러한 화학요법적 약제는 약제의 장기간 사용을 어렵게 하는 부작용, 장기 사용 시 항염증 효과의 감소와 같은 결점을 가지고 있었다. 현재는 진통작용이 우수한 인도메타신 및 푸르페낭산과 비스테로이드성의 각종 소염제 정도가 사용되고 있는 실정이다.

따라서, 이러한 문제를 해결함과 동시에 염증성 증상과 통증에 대해 효과를 보여주는 관절염 치료제의 개발이 요망되고 있으며, 관절염 치료약제는 장기간 복용이 필요하므로 부작용이 적은 약제를 개발하는 것이 매우 중요하다. 또한, 기존 약제 중 일부는 정맥 주사나 복강 주사로 투여하는 경우가 있는데, 이 경우에는 번거로울 뿐 아니라, 앨러지, 쇼크 및 위생상의 문제도 생길 수 있으므로, 복용이 간편하면서 안전한 치료제가 필요한 실정이다.

현재까지 관절염 치료를 위한 대부분의 건강식품이 연골 구성성분을 주원료로 하고 있다. 한국특허공개 제2001-0018321호에는 류마티스 관절염 환자를 위한 건강식품 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2005-0078080호에는 관절염 치료용의 제약학적 조성물 및 그 제조방법이 개시되어 있고, 한국 특허출원 제10-2003-00433119호에는 글루코사민 40-50%, 뮤코 다당 단백질30%, 비타민 C, 우슬, 모과, 두충 및 상어연골 추출분말을 포함하는 퇴행성관절염 치료용 건강보조식품 조성물에 관한 내용이 기재되어 있다.

본 발명자들은 여러 종류의 어류 안구 파쇄물 용도에 대해서 연구한 결과, 어류 안구 파쇄물이 피부 미백 효과, 피부탄력 개선 효과, 세포활성화 효과가 우수하여 피부 재생 및 피부 상처 치유에 유용하게 사용될 수 있음을 밝혀내 특허출원한 바 있다. 그러나 현재까지 관절염의 예방 또는 치료와 관련하여 어류 안구 파쇄물이 사용된 구체적인 보고는 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 참치 안구 파쇄물이 콜라겐으로 유발한 동물 모델에서 발적 및 부종을 감소시키고, 관절염의 원인이 되는 것으로 확인된 사이토카인 분자들의 혈중 수치를 감소시키는 것을 확인하여 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 참치 안구 파쇄물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 관절염 예방 치료 효능이 우수하면서도 부작용이 크게 감소된 관절염 예방 및 치료용 조성물을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 관절염의 발병에서 참치 안구 파쇄물을 투여하는 경우에는 면역관용(tolerance) 반응이 크게 증대되어, 관절염 특이적 염증반응이 크게 감소됨으로써, 결국 관절염 예방 및 치료 효능을 달성할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물에서 기본적인 유효성분은 참치 안구 파쇄물이다. 본 발명의 유효성분인 참치 안구 파쇄물은 비타민 A, B2 등이 많이 함유되어 있으며, 특히 안구 뒤쪽에는 비타민 B1이 많이 들어있어 당질대사를 도와주는 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 본 발명자들은 참치 안구 파쇄물이 콜라겐에 의해 유도되는 면역관용 반응을 상승적(synergic)으로 증가시키는 작용을 한다는 것을 발견하였다. 본 발명의 조성물은 이러한 신규한 발견에 기초하여 조성된 것이다. 또한, 본 발명의 조성물에서 참치 안구 파쇄물은 Foxp3, IL-10 및 TGF-β 같은 항염증 사이토카인의 생성을 촉진하고, IL-12, TNF-α 및 IL-1β와 같은 친염증 사이토카인의 생성을 억제하는 작용을 한다.

한편, 본 명세서에서 용어 "안구"는 시각정보를 수집하고 이를 전기화학정보로 변환하여 시신경이라는 통로를 통하여 뇌로 전달하는 기관을 의미한다. 하기에 나타나는 바와 같이, 참치의 안구는 가장 바깥쪽에 공막(수정체 앞쪽에서는 각막으로 존재함)이 있고, 그 안쪽에는 맥락막, 또 그 안쪽에는 망막이 있으며, 앞 부분에는 수정체와 홍채가 있으며, 수정체의 앞쪽에는 수양액, 뒤쪽에는 유리액으로 채워져 있으며, 그 밖에 낫 돌기(사람의 모양체와 유사한 역할을 함), 근육, 색소층 등으로 이루어져 있다.

[참치의 안구 구조]

그리고 본 명세서에서 용어 "파쇄물"는 본 발명의 참치 안구를 파쇄한 결과물을 의미한다. 구체적으로는 참치의 머리부분에서 안구를 떼어내고 안구의 공막 부분에 붙어 있는 근육조직을 분리하여 깨끗하게 분리된 안구를 준비한 후, 안구 내부에 존재하는 수정체 등 안구의 하부 기관이나 그 기관을 구성하고 있는 물질들을 외부에 노출시키는 것이며, 당업계에서 일반적으로 사용되는 믹서나 호모게나이져를 이용하여 파쇄한 것이다. 이때, 바람직하게는 인체내부에 흡수가 용이한 1㎛ 내지 5mm크기로 균질하게 처리되는 것이 좋다. 또한, 본 발명의 참치 안구 파쇄물은 참치의 안구를 상기와 같이 균질하게 파쇄한 후 여과시킨 여과액일 수도 있다.

본 발명의 참치 안구 파쇄물은 면역관용 반응을 유도하는 자가 항원으로 작용한다. 관절염은 면역반응에 관계되는 자가 항원의 종류가 매우 다양하여 특이적인 치료제 개발이 불가능하였다. 본 발명의 핵심 원리는 생체 내 장 관계 면역 시스템(Gut Associated Lymphoid Tissue: GALT)에서 일어나는 면역 관용을 이용하는 것이다. 면역관용이란, 경구를 통해 전달된 물질에 대해 소장의 상피세포 아래에 존재하는 면역시스템(GALT)이 선택적인 면역 억제 반응을 일으키는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 글루코사민, 콘드로이틴 또는 이의 조합을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 글루코사민 및 콘드로이틴은 모두 연골 구성성분이다. 따라서, 참치 안구 파쇄물 이외에 자가 항원으로 작용할 수 있는 다른 연골 구성성분(글루코사민 및 콘드로이틴)을 이용하면 보다 향상된 면역관용 반응을 유도할 수 있다. 또한, 글루코사민은 연골형성과 재생을 촉진하는 작용을 한다. 콘드로이틴은 면역관용 반응을 유도하는 것뿐만 아니라 연골을 파괴하는 효소들을 억제하여 연골 보호 작용을 한다.

본 발명의 관절염 예방 또는 치료 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 면역관용 반응을 유도하여 효능을 발휘하여야 하기 때문에 경구로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 0.01 내지 2000mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 관절염 예방 또는 치료 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 참치 안구 파쇄물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프록토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 관절염의 치료 또는 예방에 매우 유용하다.

여기서, 본 발명의 식품 조성물은 상기 참치 안구의 파쇄물을 조성물 총중량에 대해 0.0001 ~ 90중량% 함유하는 것이 좋은데, 0.0001중량% 미만으로 첨가하는 경우에는 그 효과를 기대하기 힘들고, 90중량%를 초과하여 첨가되는 경우에는 뚜렷한 효능 효과의 상승이 보이지 않는다.

하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 면역관용 반응을 유도함으로써 친염증 사이토카인(proinflammatory cytokines), 예컨대, TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 발현량을 감소시키고, 항염증 사이토카인(antiinflammatory cytokines), 예컨대, IL-10, Foxp3 및 TGF-β의 발현량을 증가시켜, Th2 타입 면역반응을 증가시키며 이는 Th1 타입 면역반응을 감소시키게 된다. 결국, 관절 특이적으로 발생하는 자가 면역반응 및 염증반응이 격감됨으로써 관절염 예방 또는 치료 효능을 발휘한다.

본 발명의 조성물은 관절염(골관절염 및 류마티스성 관절염), 바람직하게는 자가면역 질환의 일종으로서 염증성 질환인 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료에 매우 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 성분들은 이미 안전성이 인정된 것이기 때문에 본 발명의 조성물의 인체에 대한 안전성도 매우 우수하다. 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분들은 식품 원료로서 인정된 안전성이 우수한 것으로서, 이러한 성분들에 의해 종래의 의약(예컨대, 메토트렉세이트)보다 우수한 관절염 예방 또는 치료 효능을 발휘하는 것은 놀라운 것이다.

종래 관절염 치료의 한계성은 면역 반응에 관여하는 자가 항원의 종류가 매우 다양하여 관절염 특이적인 치료제 개발이 어렵고, 개발되어 있는 종래의 관절염 치료제는 단순히 염증 반응만을 억제하는 의약들이며 이들은 장기간 복용 시 안전성 문제와 같은 여러 부작용이 존재하는 문제점이 있었다. 또한, 대부분의 관절염 치료용 건강식품들은 연골구성 성분 중의 하나인 글루코사민 복합체 및 상어 연골 추출물 등을 주원료로 하는 단편적인 기능을 갖고 있었다. 이에 반해, 본 발명의 조성물은 장 관계 면역 시스템에서 일어나는 면역관용을 유도함으로써 부작용 없이 관절에 특이적으로 일어나는 자가 면역 반응 및 염증을 효과적으로 제어하여 관절염을 예방 및 치료할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 장관계 면역 시스템에서 일어나는 면역관용을 유도함으로써 부작용 없이 관절에 특이적으로 일어나는 자가 면역반응 및 염증을 효과적으로 제어하여 관절염을 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 조성물의 관절염 예방 효능을 AIA(adjuvant induced arthritis) 유도된 래트를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능을 AIA 유도 래트를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효능을 각각의 조성물, 본 발명의 혼합조성물 및 관절염 치료제(메토트렉세이트:MTX)와 비교한 실험 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 조성물의 친염증(proinflammatory) 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 혼합 림프구를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 조성물의 세포 증식에 미치는 영향을 관절 주위 혼합 림프구를 이용하여 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[ 실시예 1] 참치 안구 패쇄물 제조

참치(참다랑어 급)를 급랭하여 육질과 깨끗하게 분리한 후 참치 안구를 준비하였다. 준비된 참치 안구를 식염수로 깨끗하게 세척한 후, 호모게나이져를 이용하여 균질하게 파쇄하여, 와트만(whatman) No. 10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 최종 여과하여 최종적으로 참치 안구 파쇄물을 제조하였다(실시예 1-1).

참치 안구를 대신하여 소 안구를 사용한 것을 제외하고 상기 참치 안구 파쇄물 제조방법과 동일한 방법을 사용하여 소 안구 파쇄물(비교예 1)을 제조하였다.

[ 실험예 1] 본 발명 조성물의 관절염 예방 및 치료 효능 분석

콜라겐 유도 관절염(collagen induced arthritis: CIA) 동물 모델은 관절 구성성분인 II형 콜라겐에 의해서 유도되는 관절염으로 사람의 류마티스 관절염과 병리학적, 임상적 및 면역학적으로 여러 측면에서 유사함을 보인다. 이 동물모델은 콜라겐 특이적인 면역 반응을 가지는 T 세포와 콜라겐과 같은 자가 항원에 대한 항체에 의해 자가면역 질환을 나타낸다.

어쥬번트 유도 관절염(adjuvant induced arthritis: AIA) 동물 모델은 자가 항원이 아닌 결핵균에 의해서 유도되는 관절염으로 만성 관절염의 병리학적 상태를 보인다. 정확한 자가 항원으로 작용하는 것은 알려져 있지 않지만, 면역반응 T 세포에 의해 관절의 염증이나 조직 파괴와 같은 자가면역 질환을 나타낸다. 이 동물모델은 사람에게서 자연적으로 일어나는 관절염과 비슷하다.

류마티스 관절염의 직접적인 원인이 정확히 알려져 있지 않기 때문에 이 2가지의 동물 모델을 가지고 실험을 함으로써 효능을 더욱 효과적으로 평가할 수 있다.

실험예 1-1: 콜라겐 유도 관절염 동물 모델의 제조

콜라겐 유도 관절염(collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델은 류마티스 관절염의 원인으로 여겨지는 콜라겐을 주입하여 하기와 같이 제조하였다.

닭의 II 형 콜라겐(Sigma) 4mg을 100mM 아세트산 1ml에 혼합하여 4℃에서 하루 동안 용해시켰다. 이를 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 4mg/ml이 들어있는 프로인트 완전 어쥬번트(Freund's complete adjuvant, DIFCO) 1ml에 혼합하여 에멀젼화한 후, 6 내지 8주령의 Lewis 래트의 꼬리 부위에 150㎕(300㎍)을 피내 주사하여 면역시켰다. 1차 면역 후 7일째에 닭의 II형 콜라겐 4mg을 100mM 아세트산 1ml에 혼합하여 4℃에서 하루 동안 용해한 후 이를 프로인트 불완전 어쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, DIFCO) 1ml에 혼합하여 에멀젼화 시켰다. 상기 에멀젼의 150㎕(300㎍)를 꼬리 부위에 피내 주사하여 2차 면역(boosting) 반응을 유도하였고, 2차 면역 후 1-2주가 경과하자 관절염 증상인 홍반이나 부풀어 오름이 점차적으로 나타나기 시작하였다.

실험예 1-2: 어쥬번트 유도 관절염 동물 모델의 제조

어쥬번트 유도 관절염(adjuvant induced arthritis, AIA) 동물 모델 역시 사람의 류마티스 관절염과 유사한 병리적 특성을 보이는 동물 모델로서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델과 같이 널리 사용되고 있다.

결핵균 10mg을 분쇄기로 분말상태로 분쇄한 후, 1ml의 프로인트 불완전 어쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, DIFCO)에 혼합하였다. 이중 100㎕(1mg)를 6-8 주령의 Lewis 래트의 꼬리 부위에 피내 주사하여 면역시켰다. 면역 후 1주가 지나자 관절염 증상이 점차적으로 나타나기 시작하였다.

실험예 1-3: 본 발명 조성물의 관절염 예방 및 치료 효능 분석

면역 반응 유도 익일부터 매일 식이용 거치대를 이용하여 실험물질을 경구 투여하였다. 그룹 당 10 마리의 Lewis 래트를 선택한 후, 한 그룹은 어쥬번트 유도 관절염 동물 모델을 이용하여 분말 상태의 사료와 실시예 및 비교예의 혼합물을 하루 25 g씩(11.5 g/kg) 투여하였고, 또 다른 그룹은 음성대조군으로는 분말 사료만을 투여한 어쥬번트 유도 관절염 동물 모델을 사용하였다. 이 후 관절 부위 종창(joint swelling), 관절의 붓기 정도(paw thickness), 홍반과 같은 육안적 소견을 통한 관절염의 진행 정도, 몸무게 변화 추이를 측정하여 각각의 그룹을 비교하였다.

관절염 예방 효과를 확인하기 위하여, 실시예 및 비교예의 조성물을 경구투여한 후 2주 경과한 시점에서 AIA 유도 면역화 반응을 실시하였다. 실험은 총 9주를 실시하였다. 또한, 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, AIA 유도 1차 면역화 반응을 실시한 바로 직후 실시예 1의 조성물을 경구 투여하였다. 실험은 총 9주를 실시하였다. 그룹 당 10 마리의 래트를 이용하였다.

각각의 그룹에 속하는 래트의 각 발마다 관절과 마디의 붓기 정도, 홍반 등을 관찰하고, 표 1와 표 2에 기재된 점수체계(scoring index)에 따라 임상점수를 계산하였다. 표 1은 CIA 모델의 점수체계이고, 표 2는 AIA 모델의 점수체계이다.

점수	병의 경과 상태
0	홍반과 부풀어 오름이 나타나지 않음
1	발 중간부분 또는 발목관절에 한해 홍반과 약간의 부풀어 오름이 나타남
2	발목관절로부터 발 중간부분에 걸쳐 홍반과 약간의 부풀어 오름이 나타남
3	발목관절에서 중족골관절에 걸쳐 홍반과 중간정도의 부풀어 오름이 나타남
4	발목, 발 및 발가락을 포함하여 홍반과 심한 부풀어 오름이 나타남

점수	병의 경과 상태
0	홍반과 부풀어 오름이 나타나지 않음
1	발가락이나 손가락 중 하나에 약간의 홍반이나 부풀어 오름이 나타남
2	발가락이나 손가락 중 하나 이상에 홍반이나 부풀어 오름이 나타남
3	발목 또는 손목에 홍반이나 부풀어 오름이 나타남
4	발가락 또는 손가락 및 발목 또는 손목에 완전한 홍반 및 부풀어 오름이 나타나고 발목 또는 손목을 구부릴 수 없음

관절염 예방 효과에 대한 실험 결과인 도 1의 임상점수를 보면, 음성 대조군은 어쥬번트 유도 관절염 모델로서, 면역반응을 유도한 후 약 14일부터 관절염 증상이 나타나는 것을 알 수 있으며, 약 28일이 지나면 점차 증세가 약해지는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 실시예 1-1군에서는 대조군과 달리 스코어가 매우 낮아 그 관절염 증세가 많이 억제되어있는 것을 알 수 있었고, 음성 대조군에 비해 발이 부풀어 오르는 것이 많이 억제되어 있는 것을 알 수 있다. 그러나 소의 안구 파쇄물을 투여한 비교예 1군에서는 음성대조군과 큰 차이가 없으며 오히려 32일 경과 후에는 음성대조군에 비하여 관절염 증상이 높음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 참치 안구 파쇄물을 포함하는 조성물은 관절염에 대한 우수한 예방 효능을 발휘하고 있음을 알 수 있었다.

관절염 치료 효과에 대한 실험 결과인 도 2의 임상점수를 보면, 대조군은 어쥬번트 유도 관절염 모델로서, 면역반응을 유도한 후 약 14일부터 관절염 증상이 나타나는 것을 알 수 있으며, 약 35일이 지나면 점차 증세가 약해지는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 실시예 1-1군에서는 음성 대준군과 달리 스코어가 매우 낮아 관절염 증세가 많이 억제 되어있는 것을 관찰할 수 있었고, 발이 부풀어 오르는 것도 많이 억제되어 있는 것을 알 수 있었다. 그러나 소의 안구 파쇄물을 투여한 비교예 1군에서는 음성대조군과 큰 차이가 없으며 오히려 32일 경과 후에는 음성대조군에 비하여 관절염 증상이 높음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 참치 안구 파쇄물을 포함하는 조성물은 관절염에 대한 우수한 치료 효능을 발휘하고 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 관절염 치료 효능 비교 실험

상기 실험예 1에서 효능이 우수한 것으로 판명된 실시예 1-1의 조성물을 이용하여, 보다 정밀하게 관절염 예방 또는 치료 효능을 분석하였다.

실험 방법은 상기 실험예 1-3과 유사하다. 각각의 군에 대하여 10 마리의 래트를 이용하였다.

음성 대조군은 비투여군이고, 양성대조군에 투여된 MTX는 종래에 관절염 치료제로 이용되고 있는 메토트렉세이트 처리군이며, 래트 1마리 당 약 60㎍씩 일주일에 두 번 투여하였다.

각 조성물을 2주간 먼저 경구투여한 후, 콜라겐을 이용한 1차 면역반응을 유도하였다. 일주일후 2차 면역반응을 유도하였고 임상 점수 및 발두께를 측정하여 각각의 그룹을 비교하였다. 도 3 및 도 4에서 볼 수 있듯이, CIA 유도 면역반응 후 약 2주 후부터 관절염 증상이 나타났고, 실시예 1-1은 음성대조군, 비교예에 비하여 스커어가 내무 낮아 관절염 치료 및 예방 효능이 우수함을 알 수 있었다. 한편, 5주까지의 급성단계에서는 MTX의 효과가 실시예 1-1보다 뛰어났지만 그 이후의 만성단계(chronic phase)에서는 오히려 실시예 1-1이 더 뛰어나 본 발명의 조성물은 만성 관절염의 치료 및 예방 효능이 매우 우수함을 알 수 있었다(도 3).

따라서, 본 발명의 조성물은 종래의 관절염 치료제인 MTX 보다 동등한 또는 우수한 관절염 치료 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다.

실험예 3: 친염증 ·항염증 사이토카인 발현에 미치는 영향분석(관절주위 림프구 이용)

상기 실험예 2와 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 75일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 관절 주위에 있는 슬와부(popliteal) 림프노드와 서혜부(inguinal) 림프노드만 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다.

그런 다음, 혼합 림프구를 24-웰 플레이트에 5 x 10⁶ 세포/웰로 분주한 후 타입 II 콜라겐 40 ㎍/웰을 첨가하여 24시간 동안 자극을 주었다. 그러고 나서, 세포를 수집하고, 여기에 Trizol을 처리하여 총 RNA를 수득하였다. 각 실험군의 RNA 1㎍으로부터 oligo dT 프라이머와 역전사효소(Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어, 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 각 사이토카인에 대한 10pmol의 프라이머 및 SYBR premix를 이용하여 정량적 실시간 PCR를 실시하여, 사이토카인 발현 수준을 분석 및 비교하였다(도 4). 정량적 실시간 PCR은 95℃ 10분간 인큐베이션한 후, 95℃ 30초, 62℃ 30초 및 72℃ 30초의 40 사이클을 거치면서 매 사이클마다 정량을 하였다.

도 4의 데이터는, 하우스 키핑 유전자인 -액틴에 대한 값을 정량한 후 대조군인 비처리군의 값을 100으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 값이다. 친염증 사이토카인인 IL-12, TNF-α 및 IL-1β의 발현량이 실시예 1-1의 투여군에서 현격히 낮은 것을 확인할 수 있다. 특히, IL-12 및 IL-1β의 경우, 실시예 1-1 투여군은 음성 대조군보다 50% 이상 발현이 감소하는 것을 알 수 있다. 또한 항-염증 기능을 가지고 있는 Foxp3, IL-10 및 TGF-β의 발현량을 보면, 실시예 1-1 투여군이 현격하게 높음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명 조성물에 의해 관절 주위의 림프구에서 경구 면역관용이 유도되었음을 알 수 있다. 특히 조절 T 세포 마커인 Foxp3의 발현량이 증가되었을 뿐만 아니라, 억제(suppression) 기능을 가지고 있는 사이토카인인 TGF-의 발현량도 크게 증가하였다.

위의 결과들을 종합하면, 관절염에 직접적으로 연관되어 있는 관절 주위의 림프노드에서 본 발명의 조성물은 경구 면역관용을 유도하고, 이는 Foxp3, IL-10 및 TGF-β 같은 항염증 사이토카인의 발현량을 증가시키고, IL-12, TNF-α 및 IL-1β와 같은 친염증 사이토카인의 발형량을 억제한다는 것을 파악할 수 있다.

실험예 4: 세포 증식 분석

상기 실험예 2와 같이 관절염 치료 효능 실험을 진행하였다. 관절염 유도 면역화 반응 후 75일째 각 실험군에서 평균값의 임상점수를 보이는 래트를 희생시켜 관절 주위에 있는 슬와부(popliteal) 림프노드와 서혜부(inguinal) 림프 노드만 분리한 후, 이들 조직을 그라인딩하여 혼합 림프구(mixed lymphocytes)를 얻었다. 그런 다음, 혼합 림프구를 96-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰로 분주한 후 타입 II 콜라겐 40㎍/웰을 첨가하여 56시간 동안 자극시켰다.

그런 다음, 0.5Ci[³H]티미딘(Perkin Elmer)을 첨가하여 16시간 동안 펄스를 준 후 티미딘 혼입량을 측정하였다(도 5). 도 5의 데이터는 음성대조군을 10으로 하였을 때 그에 대한 상대적인 수치로 표시한 것이다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1-1 투여군에서, 가장 낮은 티미딘 혼입량을 나타내었다. 이 결과는, 관절염에 직접적으로 연관되어 있는 관절 주위의 림프노드에서 본 발명의 조성물은 경구 면역관용을 유도하고, 결국 콜라겐에 대한 면역반응이 크게 억제된다는 것을 파악할 수 있었다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하며,
   상기 참치 안구 파쇄물은 참치의 안구를 믹서 또는 호모게나이저로 파쇄한 후 여과시킨 여과액인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 참치 안구 파쇄물을 유효성분으로 포함하며,
   상기 참치 안구 파쇄물은 참치의 안구를 믹서 또는 호모게나이저로 파쇄한 후 여과시킨 여과액인 것을 특징으로 하는 관절염 개선용 식품 조성물.
   
   
   

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