KR100483496B1 - 봉독 수용성분을 함유하는 소염 및 진통용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 봉독요법에 관한 것으로서 봉독분획의 제조방법, 봉독분획의 제제화 및 용도에 관한 것이다. 봉독의 부작용성분을 제거하여 효능을 극대화하고자 한다.

Description

봉독 수용성분을 함유하는 소염 및 진통용 조성물{ANTIINFLAMMATORY AND ANALGESIC COMPOSITION CONTAINING AN AQUEOUS FRACTION OF BEE VENOM}

봉독요법(bee venom therapy)은 관절염과 같은 자가면역성, 염증성 및 통증성 질환을 완화할 목적으로 사용되어 왔다 (Billingham, M.E. et al., Nature, 245:163-164(1973)). 기존에는 살아있는 벌에 쏘이는 방법을 사용하여 봉독요법을 시행하였으나 최근에는 전기적 충격요법으로 봉독을 채집한후 주사제의 형태로 주입하는 방법을 널리 이용하고 있다 (특 1992-0006709). 현재 임상적으로 봉독요법은 관절질환(류마티스관절염, 골관절염, 통풍, 건선관절염, 강직성 척추염) 및 통증질환(근육통, 근막장애 통증군, 테니스 엘보우, 골프엘보우, 오십견, 신경통, 편두통) 및 염증질환(활액남염, 근섬유염 건염, 연조직과 골조직의 만성외과적 염증, 말초신경염) 등을 치료하는데 이용되고 있다 (황유진, 이병철, 대한침구학회지, 17(4):149-159(2000)). 봉독은 멜리틴(melittin), 아파민 (apamin), 아돌라핀 (adolapin), 비만탈과립화 펩타이드 (mast cell degranulating peptide)등과 같은 다양한 펩타이드 성분과 포스포리파제 (phospholipase) A2, 히아유로니다제 (hyaluronidase)등과 같은 효소성분 및 히스타민, 도파민 및 노르에피네피린과 같은 생리적 활성 아민으로 구성되어 있다 (Larviere W.R. and Melzack R., Pain, 66:221-227(1996)). 지금까지 봉독의 각각의 성분에 대한 효능 연구가 이루어져, 이중 아돌라핀과 비만세포 탈과립 펩타이드에 대한 소염·진통효능이 보고되고 있으나(Billingham, M.E. et al., 상기문헌참조; Koburova K.L. et al., Acta Physiol. Pharm. Bulg., 11:50-55(1985)), 상기 성분이 전체 봉독에서 각각 1-2%만이 함유되어 있어 봉독전체의 치료효능을 대표하기는 미약한 것으로 생각되어 지고 있다. 따라서 봉독의 치료효능은 단일구성성분에 의해서 이루어지기보다는 일반적인 천연물이 그러하듯이 구성성분의 복합적인 상승작용에 의해 기인되어질 것으로 생각되어 진다.

봉독의 임상적용시 다양한 염증성 질환에 대한 치료효과에 반하여 나타나는 대표적인 부작용은 급성면역과민반응인 아나필락시스이다. 최근이 보고에 따르면 봉독에 의한 아나필락시스의 발생 빈도가 3만명 중의 10명꼴로 그 빈도는 크게 높지않으나 치명적이어서 환자가 봉독요법을 꺼리는 요인으로 작용하고 있다 (황유진, 이병철, 대한침구학회지, 17(4):149-159(2000)). 따라서 봉독의 치료효능은 유지시키면서 부작용을 격감시킬 필요성이 있으며 이를 위해 효과적인 추출물의 발굴이 필요하다.

프로스타글란딘 H2 합성효소(Prostaglandin H2 synthase (PGHS))의 대사물인 프로스타글란딘류는 불포화 지방산으로 건선증, 흉막염, 복막염, 관절염, 연골연화 등 주로 만성 염증질환에 관여하는 화학전달물질이며, 또한 천식 등의 알러지성 질환에서도 대량으로 관찰된다(Lian Y. C. et al., Carcinogenesis, 20 (10):1945-1952(1999)). 프로스타글란딘을 합성하는 효소 가운데 하나인 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2 (COX-2))는 염증반응이 일어나는 동안 특정 자극에 의해서 발현되는 것으로 보고되고 있다(Simon L. S., The American J. Medicine, 106(5B): 7S-42S(1999)). 실제로 COX-2는 단구(monocytes)와 섬유아세포(fibroblasts) 같은 특정 세포유형에서 성장 인자, 사이토카인 그리고 엔도톡신 등과 같은 염증 매개인자(inflammation mediator)들에 의해서 합성이 유도되는 것으로 보고되고 있다.

사이토카인은 감염, 면역반응, 염증 그리고 외상에 반응하는 숙주의 조절 인자이다. 사이토카인 중 활성화된 대식세포에서 생성되는 강력한 염증전 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 A형 TNF-α와 IL-1β가 COX-2의 생성을 유도한다는 것이 보고되었으며 사람에게 주입하였을 경우 발열, 염증 그리고 조직 파괴와 같은 증상을 일으키며 심할 경우 쇼크나 사망까지 일으킨다고 보고되었다(Dinarello C. A., CHEST, 118: 503-508(2000)). 따라서 A형 TNF-α와 IL-1β의 생성을 억제하는 것이 류마티즘성 관절염 환자에게 효과적인 치료가 될 수 있다는 것이 제안되었다 (Dinarello, 상기 문헌 참조).

봉독의 소염 및 진통효능을 빠르고 효과적으로 평가하기 위한 시험관내 모델로 염증 및 통증관련 효소인 사이클로옥시게나제(COX)에 대한 억제능과 염증관련 사이토카인(TNF-alpha, 인터루킨1)을 생산억제능을 평가하고자 하였으며, 시험관내 모델의 검증후에 더 자세한 효능을 입증하기 위해 백서(rat)에서 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)를 사용한 모델을 사용하였다. 이 모델은 사람에서의 자가면역질환인 류마티스 관절염과 유사할 뿐만 아니라 기타 염증질환 및 통증질환과 유사하여 이들 질환의 치료제 개발을 위한 약물검색모델로 사용되고 있다. 이 모델에서 한쪽 발바닥에 프로인트 보조제를 주입하면 자가면역학적인 병리기전에 의해 다른쪽 발에 관절파괴현상 및 염증현상이 관찰된다. 또한 프로인트 보조제에 의한 염증반응으로 발목부종과 혈중 염증성 사이토카인(예: 인터루킨 6)이 증가된다. 한편 이 모델에서는 관절염으로 유발되는 통증에 의해 열 통각과민성 (thermal hyperalgesia) 및 기계적 통각과민성 (mechanical hyperalgesia)이 증대되고, 척수내의 신경세포의 활성증가로 Fos 단백질의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.봉독은 여러 염증질환, 면역질환 및 신경성 질환에서 민간의학적인 방법으로 사용되고 있지만 아직까지 의약품으로서의 안정성과 효능이 입증되지 못하고 있다. 이에 본 발명은 봉독의 부작용성분을 제거한 유효성분을 추출하여 안정성 및 효능을 확보된 새로운 봉독요법을 확립하고자 하였다. 봉독유효성분을 추출하기 위해 봉독을 분획하여 시험관내 시험(in vitro)에서 활성이 있는 분획을 선택한 후 선택된 분획을 다시 분자량에 따라 분리하는 방법을 사용하였다.

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본 발명에서는 봉독을 헥산층, 에틸아세테이트층 그리고 수용층으로 분획하여 시험관내(in vitro)에서 활성이 있는 분획을 선택한 후 선택된 분획을 이용하여 프로인트 보조제를 이용한 관절염 유발 모델동물에서 소염 및 진통효과를 발목관절의 부종, 혈중 염증성 인터루킨-6의 변화측정, 방사선학적 병리변화 검증, 열 통각과민과 기계적 통각과민 및 척수내 신경세포 활성변화를 측정함으로써 검증하였다. 또한 봉독의 분획물들 중에서 소염, 진통 효능이 가장 우수한 봉독 수용성분을 분자량에 따라 더욱 분획하여 활성이 우수한 물질을 얻음으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 소염, 진통 효능이 우수한 봉독 분획물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 봉독 분획을 포함하는 소염, 진통용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

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상기 목적에 따라, 본 발명에서는 봉독을 헥산 추출하여 헥산 가용물을 제거한 후, 이를 다시 에틸 아세테이트로 추출하여 에틸 아세테이트 가용물을 제거한 수용성 분획으로부터 얻어진 분자량 10 KDa 이하의 물질로 구성된 소염, 진통 효과를 갖는 봉독 분획을 제공한다.

본 발명의 봉독 수용성 분획은 동결건조된 봉독을 유기 용매로 추출한 후 남은 수용층으로서 얻어질 수 있으며, 여기에서 유기용매로서는 헥산, 에틸 아세테이트 등을 예시할 수 있다. 구체적으로는, 증류수에 동결 건조된 봉독을 녹인 후 동량의 헥산을 사용하여 상온에서 24 내지 48 시간씩 1회 이상 추출한 후 헥산층을 분리하고, 나머지 층에 다시 동량의 에틸 아세테이트를 넣고 24 내지 48 시간씩 1회 이상 추출한 후 에틸 아세테이트층을 분리함으로써 나머지 층을 봉독 수용성 분획으로 얻을 수 있다.

또한, 봉독 수용성 분획을 분자량의 차이에 따라 다시 세 개의 분획으로 분획하여 분자량 20 KDa 이상의 물질을 포함하는 분획(분획 1) 또는 10 KDa 이하의 물질만을 각각 포함하는 분획(분획 3)을 소염, 진통 효과가 우수한 분획으로 얻을 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 먼저 봉독 수용성 분획을 아세트산에 녹인 후 10 KDa의 분자량 차단크기(cut-off size)를 갖는 여과지를 이용하여 분자량 10 KDa 이하의 펩타이드성 물질 (분획 3)을 분리한다. 나머지 층은 세파덱스 G-100 컬럼에 넣고 2 % 아세트산을 용출액으로 하여 6 ㎖/cm²/hr의 유속으로 250 ㎕씩 분획한 후 PAGE 상에서 각각의 분획을 확인하고 분자량 20 KDa 이상의 물질을 포함하는 분획을 얻는다. 이러한 추출방법에 의해 도 1에서와 같이 봉독수용성분획(A), 20KDa 이상분획 (분획 1), 10KDa 내지 20KDa 분획 (분획 2), 10KDa 이하분획(분획 3)으로 효과적으로 분획되는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 봉독 분획물은 봉독을 용해도에 따라 수용성(A), 에틸아세테이트용해성(E) 및 핵산용해성(H)으로 분리하여 수득되며, 시험관내 모델인 사이클로옥시게나제 효소 억제시험 결과 수용성(A)분획에서 억제능이 가장 탁월하고, 사이토카인 (TNF-a, 인터루킨1) 생산억제시험을 실시한 결과, 역시 수용성(A)분획에서 억제효능을 보인다. 수용성 분획의 구체적인 효능은 프로인트 보조제 동물모델에서도 검증하였다. 동물모델에서 자가면역적인 병리기전에 의해 유발되는 발목부종이 감소시키는 것으로 관찰되어 이 분획은 기타 자가면역질환에도 적용될 수 있을 것으로 생각되어진다. 또한 관절염에 의한 뼈의 손상 및 연골파괴현상이 억제되는 것으로 관찰되어 관절질환에 효과를 보인다. 또한 염증에 의해 유리되는 사이토카인(인터루킨-6)의 혈중농도가 현저히 억제되는 것으로 보아 염증성 질환에도 효과적이다. 뿐만 아니라 열 통각과민성 및 기계적 통각과민성이 현저히 억제되며 척수내의 신경활성(Fos 단백질의 수)도 현저히 감소하는 것으로 보아 우수한 진통효능을 가짐을 확인하였다.

전통적으로 봉독은 통증부위나 침자리에 주입하였으며, 질병에 따라서 봉독은 크림이나 주사제 형태로 사용되어 왔다. 봉독에 의한 자극은 일반적인 침자극과는 달리 자극이 오래 지속되고 처치하기가 간편하기 때문에 효과적으로 침자리를 자극할 수 있다는 장점을 가진다. 또한 봉독의 수용성 분획 및 이로부터 분리된 분획 3은 봉독이 지니는 자극효과를 극대화하면서 부작용을 줄일 수 있으므로 유용한 약침재료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 따라, 본 발명은 봉독의 수용성 분획 중 추출정제된 10KDa 이하의 조성물을 유효성분으로 하는 소염 및 진통용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 필요에 따라 적절히 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말, 파스, 젤, 연고 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 피내, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 주사제의 형태로 본원의 약학 조성물을 투여하는 경우에는, 특히 침자리에 주입함으로써 약리효과를 증진시킬 수 있다.

사람의 경우 봉독 분획의 통상적인 1일 투여량은 성인기준 1㎍ 내지 50 ㎎, 바람직하게는 10㎍ 내지 10 ㎎의 범위로 하며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예: 통계분석

실시예에서의 모든 결과는 평균±표준 편차로 나타내었다. 전체적인 통계분석은 ANOVA 테스트를 사용하였으며 페어드 t-테스트(Paired t-tests)를 사용하여 유의차를 검증하였다.

실시예 1: 봉독 분획의 제조

동결건조된 봉독(유밀봉독, 전남화순)을 헥산층, 에틸 아세테이트층 및 수용층으로 분획하기 위해, 증류수 1 ℓ에 동결 건조된 봉독 1 g을 녹인 후 동량의 헥산을 사용하여 상온에서 24 시간씩 3회 추출하였다. 헥산층을 분리하고, 나머지 층에 다시 동량의 에틸 아세테이트를 넣고 24 시간씩 3회 추출한 후 에틸아세테이트층을 분리하였다. 각 분획의 양을 측정한 결과, 헥산층은 전체 봉독의 2.7%, 에틸 아세테이트층은 4.3% 그리고 나머지 수용층은 93%를 차지하고 있었다.

나머지 봉독 수용층을 분자량의 차이에 따라 다시 세 개의 분획으로 분획하였다. 먼저 봉독 수용층을 2 % 아세트산에 녹인 후 10 KDa의 분자량 차단크기(cut-off size)를 갖는 여과지(Minitan filter paltes(Milipore사))를 이용하여 10 KDa 이하의 펩타이드성 물질(분획 3)을 분리하였다. 나머지층은 세파덱스(Sephadex) G-100 컬럼(Sigma사)에 넣고 2 % 아세트산을 용출액으로 하여 6 ㎖/cm²/hr의 유속으로 250 ㎕씩 분획한 후 15 % SDS-PAGE 상에서 각각의 분획을 확인하고, 분자량 20 KDa 이상의 분획(분획 1)과 분자량 10 KDa 내지 20 KDa의 분획(분획 2)를 얻었다. 각 분획들을 동결건조한 후 냉장 보관하였다.

봉독 수용층과 분획 1 내지 3을 15 % SDS-PAGE로 분석하여 도 1과 같은 결과를 얻었으며, 도 1에서 레인 1은 표준 분자량 크기 표지이고, 레인 2는 봉독 수용층이고, 레인 3은 분획 1이고, 레인 4는 분획 2이고, 레인 5는 분획 3이다. 도 1의 결과로부터, 봉독 수용층이 분자량 10 KDa 이하의 펩타이드성 물질 및 효소와 같은 단백질을 다량 포함하고 있음을 알 수 있으며, 분획 1 내지 3의 분자량도 확인할 수 있다.

실시예 2: 봉독 분획의 시험관내 활성 검색

실시예 1에서 봉독으로부터 얻은 헥산층, 에틸 아세테이트층 및 수용층 중 소염 활성이 탁월한 분획을 선별하기 위해, 염증과 관련있는 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 효소 활성, TNF-α와 IL-1β의 생성에 미치는 영향을 다음과 같이 시험관내(in vitro) 실험으로 조사하였다.

1) COX-2 효소활성 검색

세포배양에 필요한 시약은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였으며, COX-2 효소활성 검색은 다음과 같은 방법에 의해 수행하였다.

J774A.1 세포주(ATCC TIB 67)를 5 % 우 태아 혈청(fetal bovine serum), 100x 항생-항진균 용액(antibiotic- antimycotic solution)을 함유한 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5 % CO₂의 조건으로 3-4일 배양한 후 2×10⁵ 세포/ml의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간동안 아스피린(0.4 ㎍/㎖)을 전처리하고, COX-2 유도를 위해 LPS (2.5 ㎍/㎖)와 봉독 분획(0 - 20 ㎍/㎖)을 첨가한 다음 18시간 동안 동일한 조건으로 배양하였다. 그 후 배양액을 버리고 PBS로 2회 세척한 후 PBS를 180 ㎕씩 분주하고 칼슘 이오노포어(ionophore) A23187 (1 ㎛)과 〔1-¹⁴C〕아라키돈산(0.125 μCi/㎖)를 첨가하여 흔들어 준 후 37℃ 배양기에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1 M 시트르산을 10 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시킨 후 반응액 200 ㎕를 미량원심분리 튜브(microcentrifuge tube)로 옮겨 에틸아세테이트 500 ㎕를 첨가하여 10분간 진탕추출하였다.

그 후 추출 상등액 450 ㎕를 취하여 진공건조기를 이용하여 건조시킨 후 에틸 아세테이트 10 ㎕로 재용해시켰다. 용해된 각 시료는 0-4℃를 유지시켜 주면서 실리카 겔 60W TLC 알루미늄 시이트(Merck사)에 에이코사노이드 표준물질(authentic eicosanoid standard, NEN사)과 함께 스팟팅(spotting)하고 CHCl₃/MeOH/아세트산/H₂O (90/10/1/1)의 전개 용매 조건에서 전개시켰다. 전개가 끝난 TLC 플레이트는 이미지 플레이트(imaging plate)에 24시간 감광시킨 후 방사능을 바이오-이미지 분석기(Bio-imaging analyzer (Fuji Film사, BAS-1500))를 통하여 측정하여 대사물들의 변화를 에이코사노이드 표준물질로 확인하여 분석하고 효소의 억제 효과는 봉독 분획 대신 DMSO를 사용한 경우를 대조구(100 %)로 하여 나타내었다.

도 2는 LPS로 유도된 J774A.1 세포주에서 봉독의 헥산층(H), 에틸 아세테이트층(E) 및 수용층(A)의 COX-2 효소 활성 억제 효과를 나타낸 것으로, 세 분획 중에서 수용층이 가장 우수한 활성억제 효과를 보여주었다(IC₅₀ = 13.1 ㎍/㎖).

2) 사이토카인(TNF-α와 IL-1β) 생성 검색

ATCC사로부터 구입한 U937 세포주(ATCC CRL-1714)를 5 % 우 태아 혈청이 포함된 RPMI1640 배지에서 37℃, 5 % CO₂의 조건으로 배양하였다. 배양된 U937 세포를 3.5 x 10⁴ 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후 PMA(Sigma사)를 최종농도 200 nM로 6시간동안 처리하였다. 그 후 LPS (최종농도 1 ㎍/㎖)와 봉독 분획(0 - 4 ㎍/㎖)을 처리하고 18시간동안 배양한 후 생성된 TNF-α와 IL-1β의 양을 비교하기 위해 배양액을 이용하여 ELISA 방법으로 확인하였다. 즉, 배양 상층액을 96-웰 플레이트에서 4℃, 24 시간동안 처리하여 고정시킨 후 상층액을 버리고 3% BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 4℃에서 6시간 처리하여 블로킹하였다. 1차 항체 (IL-1β의 경우 항-인간 IL-1β, Sigma사; TNF-α의 경우 항-인간 TNF-α, Sigma사)는 0.05% Tween-20, 3% BSA를 포함하는 PBS에 희석하여 4℃에서 처리하였으며 희석배수는 1:5000이었다. 24시간 후 0.05% Tween-20, 3% BSA를 포함하는 PBS로 10분간 3회 세척하고 동일한 완충액에 희석한 2차 항체 (alkaline phosphatase가 접합된 항-토끼 IgG, Sigma사)를 상온에서 2 시간동안 처리하였다. 0.05% Tween-20, 3% BSA를 포함하는 PBS로 15분씩 3회 세척한 후 pNPP (Sigma사)를 처리한 후 405 nm에서 OD값을 측정하여 발현양을 비교하였다. 생성 억제 효과는 봉독 분획 대신 DMSO를 사용한 경우를 대조구(100 %)로 하여 나타내었다.

그 결과 봉독의 헥산층(H), 에틸 아세테이트층(E) 및 수용층(A)이 모두 TNF-α와 IL-1β의 생성억제 효과를 보였으며, 수용층의 활성이 가장 우수하였다(도 3a 및 3b).

실시예 3: 봉독 분획의 관절염 치료 효과

실시예 2의 시험관내 실험 결과 소염활성이 우수한 것으로 확인된 봉독 수용층 및 이로부터 분획된 분획 1 내지 3을 사용하여 다음과 같이 관절염유발 동물모델에서 소염진통 효과를 확인하였다. 봉독 수용성 분획 2의 경우에는 소염진통효과를 나타내지 않았다.

1) 실험 동물

서울대학교 실험 동물 사육장에서 분양받은 체중 130-150 g의 수컷 스프라그-다우리(Sprague-Dawley)종 백서를 실험에 사용하였다. 사료는 깔집 위에 충분히 공급하여 관절염 유발에 따른 통증으로 인한 사료섭취의 어려움을 최소화시켰으며, 실험에 따른 모든 측정 방법은 서울대학교 실험동물 규정과 NIH 가이드라인(NIH publication No. 86-23, revised 1985)에 따라 수행하였고, 모든 통증 관련실험은 국제통증학회(IASP)의 규정을 준수하였다(Zimmermann M., Pain, 16:109-110(1983)).

2) 백서에서의 관절염 유발 및 봉독 성분의 투여

백서를 3 % 이소플루란(isoflurane)과 N₂O/O₂ 혼합가스로 흡입마취시킨 후 미네랄 오일에 20 ㎎/㎖ 농도로 부유한 가열 살균된 마이코박테리움 부티리슘(Mycobacterium butyricium)(Difco Laboratory사, Detroit, MI, USA) 혼탁액을 오른쪽 발바닥에 피하로 50 ㎕ 주입하여 관절염을 유발시켰다.

실험군은 관절염 유발 대조군 (Sham, n=10), 봉독의 수용층 희석시에 사용되는 생리식염수만을 투여하는 약물 대조군 (RA-Sal, n=10) 및 봉독의 수용층을 생리식염수로 희석한 희석액을 봉독 수용층 0.9 ㎎/㎏ 용량으로 투여하는 치료군 (RA-BVA, n=10)으로 나누었다. 봉독 분획 실험에서는 봉독 수용성분 중 분획 1(RA-BVAF1, n=20)과 분획 3(RA-BVAF3, n=20)을 각각 0.4 ㎎/㎏과 1 ㎎/㎏ 용량으로 위의 방법과 동일하게 투여하였다. 모든 약물 및 희석액의 주입은 족삼리(ST 36)에 양측성으로 관절염 유발 후 3주 동안 피하 주입하였으며 통증 및 염증 테스트는 관절염이 유발되기 시작하는 시점인 9일 후부터 왼쪽 발에서 실시하였다.

2) 관절염 유발 백서에서 소염효과의 검증

(1) 발목부종의 측정

일측성으로 오른쪽 발에 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)를 피하로 주입하였을 경우 반대쪽 발에서 주입 후 12일경부터 발목부종이 관찰되기 시작하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 발목의 부종변화는 관절염에 대한 소염효능을 검증할 수 있는 우수한 지표로 이용되어 왔다(Eiseman et al., 상기 문헌 참조; Philippe et al., 상기 문헌 참조). 따라서 본 실시예에서는 이러한 관절염의 유발에 따른 발목부종의 변화 및 봉독의 수용성분이 발목부종 변화에 미치는 영향에 대해 분석하였다.

발목부종은 혈관내 혈량계(plethysmometer (UGO BASIL, Italy))를 사용하여 왼쪽발에서 유발직후부터 3일 간격으로 3주간 측정하였다. 각각의 실험동물에서 관절염 유발 전 발목부피(day 0)를 기준으로 하여 각각의 측정 시점에서 부종에 따른 부피변화를 계산하였다. 모든 실험은 블라인드 테스트(blind test)로 실시하였으며 발목의 부피는 3회 측정한 후 평균값을 사용하였다.

그 결과, 프로인트 보조제를 주입한 후 12일째부터 보조제를 주입한 반대쪽 발인 왼쪽 발에서 관절염이 전이되기 시작하여 발목부종이 관찰되었으며, 왼쪽발의 부종정도를 측정함으로써 봉독 수용성분의 소염효과를 검증하였다. 봉독의 수용성분을 족삼리에 투여한 군은(RA-BVA)은 생리식염수를 투입한 대조군(RA-Sal)에 비하여 유발 12일째부터 유발되는 발목부종이 현저히 억제되는 것으로 관찰되어 뚜렷한 소염효과를 나타내었다(도 4, P<0.01).

한편, 도 5에서 보듯이, 관절염이 발생함에 따라 대조군(RA-Sal, n=13)에서는 현저한 발목부종이 관찰되고 있으나, 봉독 수용성분 중 분획 1과 3을 침자리에 투여한 군(RA-BVAF1, RA-BVAF3)에서는 대조군(RA-Sal)과 비교하였을 때 통계적으로 유의한 수준에서 관절염으로 인해 유발된 발목부종을 현저히 억제하는 것으로 관찰되었다(P<0.01). 그러나 봉독 수용성분 중 분획 2을 침자리에 투여한 군(RA-BVAF2)은 대조군(RA-Sal)과 비교하였을 때 유의한 차이를 나타내지 않았다.

(2) 방사선학적인 검증

방사선학적인 검증의 객관적인 분석을 위해 컴퓨터와 연계된 영상분석기기를 사용하고 다양한 관절의 방사선학적 병리소견에 대한 지표를 사용하여 변화를 분석하였다. 이러한 영상분석법은 조직학적인 분석결과와도 밀접한 상관관계를 가지며 주관적인 분석에 비해 정량적이고 객관적인 결과를 얻을 수 있는 장점이 있는 것으로 보고되어 있다(Esser et al., 상기 문헌 참조).

실험 (1)의 종료 후 쥐를 안락사시키고 왼쪽 뒷다리를 적출하여 외내측상(lateromedial view)으로 방사선 촬영을 실시하였다. 웨스팅하우스 리베라(Westinghous Rivera)사의 촬영기기를 사용하였으며 코닥 엑타스캔 M(Kodak Ektascan M) 필름을 사용하여 12.5 mA/s, 40 kV 조건으로 촬영하였다. 방사선 필름은 휴렛-팩카드(Hewlett-Packard) 스캐너로 200 % 확대된 디지털 영상을 얻었다. 방사선 영상의 분석은 유니버셜 이미징(Universal Imaging)사의 메타모르프(Metamorph) 프로그램을 이용하여 실시하였으며 에써의 방법(Esser R. E., Arthritis Rheum., 38:129-138(1995))을 참고로 하여 병리변화를 정량 분석하였다. 발목관절 아래부분을 중심으로 뼈의 증생과 연부 조직 부종을 중심으로 측정하였다. 뼈의 증생은 정상 동물군에서 종골(calcaneus)의 평균면적을 계산한 다음 이 값을 측정동물의 뼈면적에서 제외시키는 방법으로 계산하였다. 연부 조직에서의 부종 측정시에는 약물투여군에서의 연부조직면적(전체발부피-뼈의 부피)에서 정상동물의 연부조직면적(전체발부피-뼈의 부피)을 제하여 산출하였다.

그 결과, 대조군(RA-SAL)에서는 관절염유발에 의해 뼈의 증생과 연부조직부종이 정상동물군(SHAM)과 비교하였을 때 현저하게 증가하는 것으로 관찰되었다(도 6a). 봉독의 수용층을 침자리에 투여한 실험군(RA-BVA)에서는 대조군에서 관찰되었던 관절염에 의한 병리학적인 변화가 현저하게 억제되어 뼈의 증생 및 연부조직부종이 억제되었다(도 6a). 또한, 도 7a 에서와 같이, 봉독의 수용층을 침자리에 투여한 실험군(RA-BVA)에서는 관절염 유발 대조군(RA-Sal)에서 관찰되었던 관절염에 의한 병리학적인 변화가 현저하게 억제되어(p<0.01:RA-SAL군과의 차이) 뼈의 증생 및 연부조직 부종이 억제됨을 정량적으로 확인하였다. 따라서, 봉독의 수용성분은 관절염의 유발을 현저히 억제시킴을 확인할 수 있었다.

봉독의 수용성분 분획물에 의한 방사선학적인 소견에서는 도 6b에서 보는 바와 같이 대조군(RA-SAL)에 비해서 수용성 분획 1(RA-BVAF1) 과 분획 3(RA-BVAF3)은 관절염에 의한 병리증상을 억제하였다. 이러한 소견을 영상분석을 통하여 정량적으로 확인한 결과 도 7b에서와 같이 뼈의 증생이 현저하게 억제되었다(p<0.01:RA-SAL군과의 차이).

(3) 혈중 인터루킨-6(IL-6) 농도 측정

혈중 염증 물질중의 하나인 IL-6는 관절의 생성장애를 일으키며, 관절내 대사과정을 파괴시키는 것으로 알려져 있어 관절염 치료 경과의 좋은 지표로 이용되고있다(Breennan, Clin. Exp. Immunol., 97: 1-3(1994)). 일반적으로 IL-6의 농도는 관절염 유발후 급성염증으로 일시적으로 증가를 나타내었다가 12일경부터 지속적으로 증가된다고 보고되어 있다(Philippe et al., 상기 문헌 참조). 이러한 양상은 발목부종의 변화와도 일치한다.

실험 (1) 종료 후 심장채혈을 통해 혈액을 얻은 후 원심분리하여 혈청을 얻었다. 얻어진 혈청은 측정시까지 -60℃에서 보관하였다. 인터루킨-6의 농도는 바이오소스 인터내셔널(Biosource international)사로부터 구입한 ELISA 키트로 측정하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 관절염을 유발시키지 않은 정상 실험동물 대조군(SHAM)에서 정상적인 IL-6의 농도는 53.5 ± 7.9 pg/ml로 측정되었다. 관절염 유발 3주 후 관절염 대조군(RA-Sal)의 경우 혈중 인터루킨-6의 농도가 현저히 증가하여 161.4±15.3 pg/ml이었으나, 봉독의 수용성분을 침자리로 투여한 실험군(RA-BVA)에서는 혈중 인터루킨-6의 농도가 정상동물과 유사한 61.1±9.1 pg/ml으로 측정되어 염증에 의해 증가하는 혈중 인터루킨-6의 농도를 정상수준으로 감소시키는 것으로 관찰되었다.

상기 실험들에 의해, 봉독의 수용성분 투여가 염증의 여러 가지 지표인 발목부종, 방사선학적인 변화 및 혈중 IL-6의 농도를 현저히 감소시켜 탁월한 소염효과를 가짐을 검증할 수 있었다.

5) 관절염 유발 백서에서 진통효과의 검증

(1) 열 통각과민 시험 (Hargreaves's Method)

쥐를 유리판 위에 올려진 측정용 플라스틱 방(plastic chamber)에서 5분간 적응시킨 후 유리판 아래에서 빛을 쥐의 발바닥에 조사하여 열에 대한 민감도를 측정하였다. 쥐가 발을 회피하는 반응은 광 센서를 사용하여 0.1초까지 자동으로 측정하였다. 조사하는 빛의 세기는 정상동물에서 9-10초에서 회피반응을 보이는 세기로 조정하였다. 측정은 5분의 시간차를 두고 왼발에서 2회 반복 측정하였다.

도 9는 열 자극에 의한 발의 회피시간의 변화를 나타낸 것으로, 결과는 왼쪽발에서의 결과이며 비관절염 유발군(Sham group)의 평균값에 대한 %변화로 나타내었다. 관절염 유발대조군(RA-Sal, n=10)에 비해 봉독의 수용성분(RA-BVA, n=10)의 투여가 관절염에 의한 열 통각과민의 유발을 억제하였다(**p<0.01: RA-Sal 군과 유의한 차이를 나타냄).

한편, 봉독의 수용성분 분획 중 분획 1을 투여한 군(RA-BVAF1, n=20)에서는 관절염을 유발한 지 12일째부터 대조군(RA-Sal, n=13)과 통계적으로 유의한 수준에서 열자극에 대한 역치가 높게 관찰되었다(도 10). 그리고 분획 3을 투여한 군(RA-BVAF3, n=20)에서는 18일째부터 이러한 효과를 관찰할 수 있었다. 그러나 분획 2를 투여한 군에서는 유의한 차이를 관찰할수 없었다. **p<0.01: RA-Sal 군과 유의한 차이를 나타냄. *p<0.05: RA-Sal군과의 유의한 차이를 나타냄. ++p<0.01: RA-Sal군과 RA-BVAF3군과의 유의한 차이를 나타냄.

(2) 기계적 통각과민 시험

통각 측정기(Analgesy meter (LETICA, LE7356))를 사용하여 쥐의 발등에 기계적으로 압력(g)을 가한 후 쥐가 회피하거나 울음소리를 내는 시점의 압력을 정량화하였다. 측정은 5분의 시간차를 두고 왼발에서 2회 반복 측정하였다. 정상동물에서 평균치는 160 - 180 g이었다.

도 11은 기계적 자극에 의한 발의 회피시간의 변화를 나타낸 것으로, 결과는 왼쪽발에서의 결과로 비관절염 유발군(Sham group)의 평균값에 대한 %변화로 나타내었다(**p<0.01: RA-Sal 군과 유의한 차이를 나타냄). 도 11로부터, 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=10)에 비해 봉독의 수용성분 투여군(RA-BVA, n=10)에서 관절염에 의한 기계적 통각과민의 유발이 억제됨을 확인할 수 있었다.

한편, 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 관절염 유발대조군(RA-Sal, n=10)에 비해 봉독의 수용성분 분획 1(RA-BVAF1, n=20)과 분획 3(RA-BVAF3, n=20)의 투여가 관절염에 의한 기계적 통각과민의 유발을 억제하였다. 그러나 분획 2(RA-BVAF2, n=20)의 투여는 통각과민의 유발에 영향을 미치지않았다. 결과는 왼쪽발에서의 결과로 정상동물값에 대한 %변화로 나타내었다(*p<0.05: RA-Sal군과의 유의한 차이를 나타냄. **p<0.01: RA-Sal 군과 유의한 차이를 나타냄).

(3) 척수에서 Fos 발현 단백질의 측정

관절염에 의한 만성통증으로 척수내 신경세포 내에서 발현되는 Fos 단백질은 통증의 정도와 일치하여 유용한 통증지표로 이용되어 왔으며, 이러한 발현은 다양한 진통제의 투여에 의해 감소하는 것으로 보고되어 있어 새로이 개발된 약물의 진통효능 검증에 널리 사용되어 왔다(Abbadie and Besson, Neuroscience, 48: 985-993(1992); Kwon et al., 상기 문헌 참조).

봉독의 수용성 분획 및 분획 1 및 3의 진통 효능을 확인하기 위하여, 아무런 통증실험을 시행하지 않고 약물투여 후 3주가 경과한 별도의 실험군에서 Fos 단백질의 수적 변동을 관찰하였다. 동물을 흡입 마취한 다음 무칼슘 티로드 용액(calcium-free Tyrode's solution; 시그마사)으로 관류하여 혈액을 제거한 후 고정액(0.1 M 인산염 완충액(pH 6.9) 중 4 % 파라포름알데하이드 및 0.2 % 피크린산 용액)으로 관류시켰다. 동일 고정액으로 4시간 동안 후고정한 후 20 %와 30 % 슈크로즈 용액으로 조직을 탈수시켰다. L3-L5 척수 부위를 40 ㎛ 두께로 동결절편을 제작하여 염색에 이용하였다. 사용한 일차항체는 다클론성 토끼 항-Fos 항체(Calbiochem)이며 희석배수는 1:10,000로 하였다. 0.2 % 염화 니켈을 포함한 3,3-디아미노-벤지딘 반응으로 발색하였다.

척수내의 Fos 단백질을 정량화하기 위해 광학현미경으로 가장 많은 수의 Fos 단백질이 분포하는 각 동물당 5장씩 선별하였다. 각각의 조직은 냉각된 CCD 카메라(Micromax Kodak 1317, Princeton Instruments, Tucson, AZ, USA)을 4096 그레이 레벨(gray levels)로 영상을 얻었으며 영상분석은 메타모르프(Metamorph) 프로그램을 사용하였다(Kwon et al., 상기 문헌 참조). 척수는 1) 얕은 등쪽뿔 (superficial dorsal horn:SDH, laminae I and II), 2) 고유핵 (nucleus proprius :NP, laminae III and IV), 3) 척수목(NECK, laminae V and VI), 및 4) 배쪽뿔(the ventral horn VENT, laminae VII-IX)의 4부분으로 나누어서 Fos의 숫자를 분석하였다.

도 13a는 정상동물(Sham, n=5), 관절염 대조군(RA-Sal, n=5) 및 봉독의 수용성분 투여군(RA-BVA, n=5)에서 관절염 유발 3주후에 면역염색을 실시하여 척수에서의 Fos 발현 단백질의 숫적인 변동을 나타낸 것으로, 관절염 유발 21일 후에 요척수(L3-L5)내 신경세포에서 관찰되는 Fos 단백질의 발현은 관절염 대조군(RA-SAL)에서 척수의 전부분(SDH, NP, NECK 및 VENT 부분)에 걸쳐서 정상동물에 비하여 현저히 증가되었다. 봉독의 수용성분을 침자리에 투여한 실험군(RA-BVA)의 경우 척수의 SDH와 NP 부위에서 관절염에 의해 신경세포의 활성이 증가함으로써 나타났던 Fos 단백질의 발현이 현저히 감소되었다 (**: p<0.01, RA-SAL과의 차이).

도 13b은 관절염 대조군(RA-Sal, n=5) 및 봉독 수용성분 분획 1, 2 및 3 (RA-BVAF1,RA-BVAF2, RA-BVAF1, 각각 n=5)에서 관절염 유발 3주후에 면역염색을 실시한 것으로, 봉독의 수용성분 분획 1 및 3을 투여한 군의 경우 척수의 SDH와 NP 부위에서 관절염에 의해 신경세포의 활성이 증가함으로써 나타났던 Fos 단백질의 발현이 현저히 감소되었다(**: p<0.01, RA-SAL과의 차이).

봉독의 수용성 추출성분 중 10KDa 이하의 분획물로 부작용을 감소시킨 것을 특징으로 하며 이들을 주사제나 패취제로 적용함으로써 효능을 극대화할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 봉독 수용성분과 수용성분 분획의 15 % SDS-PAGE 결과로서, 레인 1은 표준 분자량 크기 표지, 레인 2는 봉독의 수용층, 레인 3은 수용성 분획 1 (20 KDa 이상인 분획), 레인 4는 수용성 분획 2(10 KDa 이상, 20 KDa 이하인 분획), 그리고 레인 5는 분획 3(10 KDa 이하인 분획)을 각각 나타낸다.

도 2는 LPS로 유도된 J774A.1 세포주에서 봉독의 헥산층(H), 에틸아세테이트 층(E) 및 수용층(A) 분획의 COX-2 효소 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 3a 및 3b는 U937 세포주에서 봉독의 헥산층(H), 에틸아세테이트 층(E) 및 수용층(A) 분획의 A형 TNF-α와 IL-1β의 생성 억제 효과를 각각 나타낸 것이다.

도 4는 대조군(RA-Sal, n=10)과 봉독 수용층 투여군(RA-BVA, n=10)에서 관절염 유발에 따른 발목부종의 변화를 나타낸 것이다.

도 5는 대조군(RA-Sal, n=10), 봉독 수용성분 중 분획 1 투여군(RA-BVAF1, n=20) 및 분획 3 투여군(RA-BVAF3, n=20)에서 관절염 유발에 따른 발목부종의 변화를 나타낸 것이다.

도 6은 관절염 유발 3주 후 실험 동물에서 왼쪽발의 방사선 사진으로, 도 6a는 정상동물(SHAM), 관절염 대조군(RA-SAL), 봉독의 수용성 분획 투여군(RA-BVA) 및 비효과 봉독분획인 에틸 아세테이트 추출분획 투여군(RA-BVE)의 결과이며, 도 6b는 관절염 유발대조군 (RA-Sal), 봉독의 수용성 분획중 분획 1 투여군 (RA-BVAF1), 분획 2 투여군 (RA-BVAF2) 및 분획 3 투여군 (RA-BVAF3)의 결과이다.

도 7은 관절염 유발조직의 방사선학적인 사진의 영상분석을 통해서 뼈의 증생 및 연부조직의 부종을 조사한 것으로, 도 7a 는 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=5)과 봉독 수용성 분획 투여군(RA-BVA, n=5)에 대한 결과이며, 도 7b는 관절염 유발대조군 (RA-Sal), 봉독의 수용성 분획중 분획 1 투여군 (RA-BVAF1), 분획 2 투여군 (RA-BVAF2) 및 분획 3 투여군 (RA-BVAF3)의 결과이다.

도 8은 정상동물(SHAM, n=5), 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=5) 및 봉독 수용성 분획 투여군(RA-BVA, n=5)에서 관절염 유발 3주 후에 혈중 인터루킨-6(IL-6)의 변화를 조사한 것이다.

도 9는 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=10) 및 봉독의 수용성 분획 투여군(RA-BVA, n=10)에서 열 자극에 의한 발의 회피시간의 변화를 조사한 것이다.

도 10은 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=13), 봉독의 수용성 분획 1(RA-BVAF1, n=20), 분획 2(RA-BVAF2, n=20) 및 분획 3(RA-BVAF3, n=20)에서 열 자극에 의한 발의 회피시간의 변화를 조사한 것이다.

도 11은 관절염 유발대조군(RA-Sal, n=10) 및 봉독의 수용성 분획 투여군(RA-BVA, n=10)에서 기계적 자극에 의한 발의 회피시간의 변화를 조사한 것이다.

도 12는 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=13), 봉독의 수용성 분획 1(RA-BVAF1, n=20), 분획 2(RA-BVAF2, n=20) 및 분획 3(RA-BVAF3, n=20)에서 기계적 자극에 의한 발의 회피시간의 변화를 조사한 것이다.

도 13은 관절염 유발 3주 후에 척수에서의 Fos 발현 단백질의 수적인 변동을 조사한 것으로, 도 13a는 정상동물군(Sham, n=5), 관절염 유발 대조군(RA-Sal, n=5) 및 봉독의 수용성 분획 투여군(RA-BVA, n=5)의 결과이고, 도 13b는 봉독의 수용성 분획중 분획 1 투여군(RA-BVAF1, n=5), 분획 2 투여군(RA-BVAF2, n=5) 및 분획 3 투여군(RA-BVAF3, n=5)의 결과이다.

Claims (8)

1. 봉독을 헥산 추출하여 헥산 가용물을 제거한 후, 이를 다시 에틸 아세테이트로 추출하여 에틸 아세테이트 가용물을 제거한 수용성분획으로부터 얻어진 분자량 10 KDa 이하의 물질로 구성된 소염, 진통 효과를 갖는 봉독 분획.
2. 제1항의 분획을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 염증질환 및 통증질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
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