CN111888414B - 预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物及包含其的药物制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药技术领域，具体提供了一种预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物及包含其的药物制剂与应用，所述中药组合物的原料组成包括鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加和玄参，本发明中药组合物中，鸡血藤补血行血，通经活络，解郁止痛为君药；凌霄花破瘀通经，凉血祛风；千年健祛风湿，强筋骨，止痹痛；鹿衔草祛风湿，强筋骨，止血，辅君药止痹痛，为臣药；刺五加和玄参均具有营养神经作用为佐使药；诸药合用，共奏通络止痛、养血祛风的功效。

Description

预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物 及包含其的药物制剂与应用

技术领域

本发明涉及中药制剂领域，具体涉及一种预防和/或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物及包含其的药物制剂与应用。

背景技术

基于分子遗传学特征定制个体化分子靶向药物治疗策略为IV期非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌及血液肿瘤的治疗原则。其中替尼类受体酪酸激酶抑制剂为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因或间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)基因敏感突变IV期非小细胞型肺癌(NSCLC)患者的一线治疗药物，且可作用于表皮生长因子受体VEGFR等多靶点。肿瘤分子靶向药物提高抗肿瘤疗效的同时也出现了许多新的不良反应，成为肿瘤临床难治的并发症，严重影响患者生活质量，导致剂量减少和治疗中断，从而降低抗肿瘤疗效。肿瘤分子靶向药物不良反应的主要临床症状为神经毒性反应或者皮肤毒性反应，表现为手足麻木疼痛、感觉异常、皮肤脱屑皲裂、色素沉着或缺失，不但影响患者的生活质量，而且可能导致治疗无法正常进行，严重影响肿瘤的治疗效果。目前西医常用甲钴胺、尿素软膏等非特异性营养治疗，效果不甚明显。

中国专利文献CN109966413A公开了一种治疗化疗药物所致的周围神经病变的中药外用制剂，主以熟附子、桂枝、黄芪、当归、鸡血藤、红花、川芎、杜仲、桑寄生、川续断、淫羊藿、天麻、钩藤、白僵蚕、透骨草和伸筋草为原料药，按药剂学的常规工艺和辅料制备而成的外用制剂。然而，分子靶向药物导致的神经病变是由于蛋白酶体或受体酪酸激酶受到抑制产生的，发病机制与化疗药物导致周围神经病变不同，上述组合物用于靶向药物治疗所致周围神经病变时并没有表现出治疗效果，从而限制了其应用。

因此，研究新型的治疗效果好、毒副作用小、成本较低的具有预防或治疗靶向药物治疗所致神经毒性反应或皮肤毒性反应的药物具有重要意义。

发明内容

因此，本发明提供一种治疗效果好、毒副作用小、成本较低的具有预防或治疗靶向药物治疗所致神经和/或皮肤毒性反应的中药组合物，进而提供包含其的药物制剂。

本发明提供了一种预防和/或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，所述中药组合物的原料药组成包括鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加和玄参。

进一步地，按照重量份数计，所述中药组合物的原料药组成包括：鸡血藤25-35份、凌霄花22-32份、千年健20-30份、鹿衔草20-35份、刺五加10-20份和玄参10-20份。

进一步地，所述中药组合物为各原料药经粉粹得到组合物；或各原料药混合后按常规提取方法或分别按常规提取方法提取得到的提取物；或提取物经过精制纯化工艺得到的有效部分。

进一步地，所述常规提取方法包括浸渍提取、煎煮提取、回流提取、渗漉提取、超声提取和水蒸气蒸馏中的一种或几种；提取溶剂包括水或20-95vt％乙醇溶液；所述精制纯化工艺包括水提醇沉、萃取、硅胶色谱柱分离和大孔树脂柱分离中的一种或几种。

所述中药组合物的制备方法，包括如下步骤：按照选定的重量份数取鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加和玄参，加水加热回流提取1～10次，以鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加和玄参的总重量为基准，每次加入1～20重量倍量的水提取1～10小时，合并提取液，过滤，即得。

本发明还提供了一种药物制剂，采用上述任一所述的中药组合物为活性成分加入常规辅料按照常规工艺制备得到。

进一步地，所述常规辅料选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种；

所述药物制剂为水煎剂、浸膏剂、软膏剂、贴剂、搽剂、洗剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、糖浆剂、湿敷剂、栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂。

本发明还提供了上述任一项所述的预防和/或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，或者所述的药物制剂在制备预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的药物中的应用。

进一步地，所述神经毒性反应和/或皮肤毒性反应为由靶向药物治疗所导致。

进一步地，所述神经毒性反应或皮肤毒性反应包括感觉迟钝、肌腱反射减弱、震颤、周围感觉神经病变、周围运动神经病变、掌跖感觉丧失性红斑综合征、指甲或趾甲改变、指甲或趾甲变色、指甲或趾甲脱落、多形性红斑、皮肤干燥、角化过度、皮肤或毛发色素沉着或缺失、毛发改变中的至少一种；

所述感觉迟钝是表现为感觉减弱或缺失的感觉迟钝，所述感觉包括痛觉、温度觉、触觉、震动觉、位置觉、运动觉中的至少一种；

所述周围感觉神经病变是表现为手足麻木疼痛、手足感觉异常、手足感觉减弱或手足感觉缺失的感觉神经病变；

所述周围运动神经病变是表现为持物困难、行走困难或拧瓶盖扣纽扣困难的运动神经病变；

所述掌跖感觉丧失性红斑综合征是为表现为手足部麻木疼痛、感觉异常、持物困难、行走困难、拧瓶盖扣纽扣困难、红斑、皮肤脱屑皲裂、水肿、水泡、血泡或溃疡的掌跖感觉丧失性红斑综合征。

进一步地，所述靶向药物为酪酸激酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂。

进一步地，所述酪酸激酶抑制剂为索拉非尼、舒尼替尼、瑞格菲尼、安罗替尼、阿帕替尼、克唑替尼、达克替尼、奥希替尼、色瑞替尼、安罗替尼、伊马替尼、吉非替尼、厄罗替尼和埃克替尼中的至少一种；所述蛋白酶体抑制剂为硼替佐米和/或伊沙佐米。

本发明技术方案，具有如下优点：1、本发明的中药组合物中，鸡血藤补血行血，通经活络，解郁止痛为君药；凌霄花破瘀通经，凉血祛风；千年健祛风湿，强筋骨，止痹痛；鹿衔草祛风湿，强筋骨，止血，辅君药止痹痛，为臣药；刺五加和玄参均具有营养神经作用为佐使药；诸药合用，发挥协同作用，共奏通络止痛、养血祛风的功效。

2、本发明的中药组合物对硼替佐米致大鼠周围神经毒性的动物模型能够明显改善机械性痛觉超敏状态和冷痛觉过敏状态，显著降低脊髓和血浆中的P物质及CGRP的含量，表明本发明的中药组合物对硼替佐米致大鼠周围神经毒性具有良好的治疗作用；本发明的中药组合物能够明显改善舒尼替尼致小鼠皮肤毒性反应，改善手足皮肤状态，降低手足皮肤反应评分，明显改善机械性痛觉超敏状态和冷痛觉过敏状态，降低Fas蛋白表达水平和FasL蛋白表达水平；本发明的中药组合物能够明显改善索拉非尼致大鼠神经毒性反应，提高缩足反应阈值，提高中枢神经递质谷氨酰胺、葡萄糖及乳酸的水平，从而说明本发明的中药组合物对神经毒性反应和皮肤毒性反应具有良好的治疗作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1中HE染色图；其中图1-A为空白对照组，图1-B为模型组，图1-C为中药组；

图2是本发明实验例1中免疫组化图；其中图2-A为空白对照组，图2-B为模型组，图2-C为中药组；

图3是本发明实验例2中HE染色图，其中图3-A为空白对照组，图3-B为模型组，图3-C为中药组；

图4是本发明实验例2中免疫组化Fas染色图，其中图4-A为空白对照组，图4-B为模型组，图4-C为中药组；

图5是本发明实验例2中免疫组化FasL染色图，其中图5-A为空白对照组，图5-B为模型组，图5-C为中药组。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1中药组合物

配方：鸡血藤30g，凌霄花30g，千年健25g，鹿衔草26g，刺五加16g，玄参12g；

制法：按照选定重量取鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加、玄参，加水煎煮2次，第一次加6倍药材重量的水，煎煮2小时，过滤，取滤渣加6倍药材重量的水，煎煮2小时，滤过，合并两次滤液，静置过夜，取上清液浓缩至60℃相对密度为1.23的浸膏，即得。

实施例2中药组合物

配方：鸡血藤25g，凌霄花32g，千年健20g，鹿衔草35g，刺五加15g，玄参10g；

制法：按照选定的重量取凌霄花、鹿衔草和刺五加，加水在40℃下加热回流提取2次，以凌霄花、鹿衔草和刺五加的总重量为基准，每次加入3倍药材重量的水提取5小时，合并提取液，过滤，得滤液A；按照选定的重量份数称取鸡血藤、千年健、玄参加入体积百分数为85％乙醇水溶液，在30℃下加热回流提取4次，以鸡血藤、千年健、玄参的总重量为基准，每次加入2倍药材重量的的体积百分数为50％乙醇水溶液提取30min，合并提取液，过滤，得滤液B；将滤液A与滤液B均匀，浓缩至60℃相对密度为1.21，即得。

实施例3中药组合物

配方：鸡血藤35g，凌霄花22g，千年健30g，鹿衔草26g，刺五加10g，玄参20g；

制法：按照选定的重量称取鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加、玄参加入体积百分数为85％乙醇水溶液，在30℃下超声提取4次，以鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加、玄参的总重量为基准，每次加入2重量倍量的体积百分数为50％乙醇水溶液提取30min，合并提取液，过滤，即得。

实施例4片剂

配方：鸡血藤35g，凌霄花22g，千年健30g，鹿衔草26g，刺五加10g，玄参20g；

制法：按照选定的重量称取鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加、玄参加入体积百分数为85％乙醇水溶液，在30℃下加热回流提取10次，以鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加、玄参的总重量为基准，每次加入2重量倍量的体积百分数为50％乙醇水溶液提取30min，合并提取液，过滤、浓缩、冻干，得药粉，按照药粉与乳糖、微晶纤维素的质量比为1:5:10，将药粉与乳糖、微晶纤维素混合均匀，粉末直接压片，得到片剂。

实施例5水煎液

配方：鸡血藤30g，凌霄花30g，千年健25g，鹿衔草26g，刺五加16g，玄参12g；

制法：按照选定重量取鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加、玄参，加水煎煮2次，第一次加10倍药材重量的水，煎煮2小时，第二次加20倍药材重量的水，煎煮2小时，滤过，合并滤液，即得。

实验例1本发明的中药组合物对硼替佐米致大鼠周围神经毒性反应的影响

1、实验动物、动物模型建立与分组给药

雄性SD大鼠，体重180～220g，适应性饲养5～7天后，随机分为空白对照组、模型组和中药组，每组12只。参照文献(Shota Yamamoto,Takehiro Kawashiri,Hitomi Higuchi,et al.Behavioral and pharmacological characteristics of bortezomib-inducedperipheral neuropathy in rats.J Pharmacol Sci.2015,129(1):43-50.)记载的方法建立硼替佐米致周围神经病变或者周围神经毒性大鼠模型。具体为：取注射用硼替佐米一支(规格：含硼替佐米3.5mg/支)加入浓度为0.9％的氯化钠水溶液配制成含硼替佐米0.1mg/ml的溶液，模型组和中药组大鼠分别注射含硼替佐米0.1mg/ml的溶液。以硼替佐米的质量计，每次注射硼替佐米0.2mg/kg体重大鼠，在第1天、第3天、第5天、第7天分别注射一次，建立硼替佐米致周围神经病变大鼠模型，空白对照组平行注射相同体积的生理盐水。

动物模型建立后，对于中药组大鼠，采用实施例1制得的浸膏灌胃给药，以浸膏的质量计，给药量为500mg/kg大鼠体重，从动物模型建立后的第1天开始，每天给药一次，连续给药21天，对于模型组和空白对照组，分别灌胃给予相同体积的去离子水。

2、实验方法

(1)痛觉行为测试

机械性痛觉超敏实验：造模后第21天，参照文献(Shota Yamamoto,TakehiroKawashiri,Hitomi Higuchi,et al.Behavioral and pharmacological characteristicsof bortezomib-induced peripheral neuropathy in rats.J Pharmacol Sci.2015,129(1):43-50.)记载的方法采用von-fery纤维丝观测硼替佐米致周围神经病变大鼠痛行为的改变，具体地，取各组6只大鼠分别置于金属网上，盖上透明有机玻璃罩，采用4g和15gVon-Frey纤维丝分别刺激大鼠后肢足底，每侧足底刺激5次，2次刺激需间隔6s以上，记录大鼠后肢抬足次数。

冷痛觉过敏实验：参照文献(Shota Yamamoto,Takehiro Kawashiri,HitomiHiguchi,et al.Behavioral and pharmacological characteristics of bortezomib-induced peripheral neuropathy in rats.J Pharmacol Sci.2015,129(1):43-50.)记载的方法造模后第21天，取各组机械性痛觉超敏实验之外的6只大鼠分别置于金属网上，盖上透明有机玻璃罩，每只大鼠采用50μl丙酮喷洒在大鼠足底，记录大鼠30秒内缩足次数，每只大鼠连续测定3次，取平均值。

(2)神经递质表达

造模后第21天，将各组大鼠用过量麻醉处死，其中6只心尖采集血液样本，离心，取上清，制得待测血浆样本；然后剥离脊髓组织，制得待测脊髓样本。采用大鼠P物质检测试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)和大鼠CGRP检测试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)分别按照试剂盒说明书中的方法，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定大鼠血浆及脊髓样本中的神经肽P物质和降钙素基因相关肽(CGRP)的表达。具体为，按照试剂盒说明书的方法得到不同浓度的标准品，在试剂盒反应板不同的孔中分别加入标准品或待测样本，混匀，封板，37℃孵育2小时。洗板后加入生物素标记抗体，混匀，封板，37℃孵育1小时，洗板加入试剂盒中的酶联物，混匀，封板，温育37℃孵育1小时，洗板，加入试剂盒中的显色液，37℃避光孵育15min，加入终止液，混匀。使用酶标仪在450nm处读取OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据待测样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

(3)HE染色：取各组ELISA检测外的另6只大鼠的各腰椎4-5的背根神经节，4％甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片，制得石蜡切片。取石蜡切片用二甲苯脱蜡、梯度酒精入水，再用苏木精(Hematoxylin，H)和伊红(Eosin，E)染色2-5min，用无水乙醇分色与脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片，1000×镜下拍照镜检。

(4)免疫组化：取各组ELISA检测外的另6只大鼠的各脊髓腰膨大，根据实验方法(3)制得石蜡切片，采用免疫组化(SABC)法对神经细胞进行脊髓背角胶质细胞酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色，观测GFAP染色阳性的星型胶质细胞。具体为将石蜡切片用二甲苯脱蜡、梯度酒精入水，GFAP抗原(购自沈阳万类生物科技有限公司)修复10min，3％H₂O₂室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性，山羊血清封闭。GFAP抗体(购自沈阳万类生物科技有限公司)稀释浓度为(1：200)湿盒内4℃过夜。HRP标记山羊抗兔二抗湿盒内37℃孵育60min，DAB(二氨基联苯胺)显色10分钟，苏木素复染细胞核3min。用无水乙醇分色与脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片，1000×镜下拍照镜检。

3、实验结果

(1)痛行为学观测结果

结果见表1所示，造模后第21天，相比于空白对照组，模型组大鼠对4g及15g vonFery纤维刺激的缩足次数明显增高(P<0.01)，分别呈现机械性痛觉超敏及机械性痛觉过敏状态。相对于模型组，中药组机械性痛觉超敏及痛觉过敏明显缓解，缩足次数明显下降(P<0.01)。相比于空白对照组，模型组大鼠对丙酮刺激的缩足次数明显增高(P<0.01)，呈现冷痛觉过敏状态。相对于模型组，中药组冷痛觉过敏状态明显缓解，缩足次数明显下降(P<0.01)。

表1机械性痛觉超敏实验和冷痛觉过敏实验结果表

**表示与模型组相比p<0.01。

(2)神经递质表达结果

结果见表2和3所示，相对比空白对照组，模型组P物质及CGRP的含量明显增高(P<0.01)，相比于模型组，中药组脊髓和血浆中的P物质及CGRP含量明显降低(P<0.01)。

表2各组动物脊髓和血浆中CGRP的含量(单位：pg/ml)

	脊髓	血浆
			空白对照组	199.14±29.49	50.37±3.91
模型组	474.73±103.42	136.10±32.45
			中药组	226.72±60.81**	57.66±4.00**

**表示与模型组相比p<0.01。

表3各组动物脊髓和血浆中P物质的表达(单位：pg/ml)

	脊髓	血浆
			空白对照组	169.78±14.13	94.74±10.96
模型组	367.24±29.62	140.12±13.12
			中药组	212.47±26.53**	103.10±1.62**

**表示与模型组相比p<0.01。

(3)HE染色

如图1所示，通过HE染色观测背根神经节核型，结果表明模型组可见神经元胞核固缩、可见多核仁核。中药组病变明显缓解，提示本发明的中药组合物能够逆转靶向药物对背根神经节神经元的损伤。

(4)免疫组化分析

如图2所示，采用免疫组化法对GFAP阳性的星形胶质细胞进行染色，模型组GFAP染色阳性的星形胶质细胞明显增生肥大、数量增多，呈过度激活状态，中药组明显缓解，提示本发明中药组合物能够抑制星形胶质细胞激活及疼痛在脊髓水平的扩大。

实验例2本发明的中药组合物对舒尼替尼致皮肤毒性反应的影响

1、实验动物、动物模型建立与分组给药

雌性C3H小鼠48只，体重180～220g，适应性饲养5～7天后，随机分为空白对照组、模型组及中药组，每组12只。参照文献(Yeh CN,Chung WH,Su SC,et al.Fas/Fas ligandmediates keratinocyte death in sunitinib-induced hand-foot skin reaction.JInvest Dermatol.2014,134(11):2768-75.)中记载的方法，采用舒尼替尼水溶液灌胃，以舒尼替尼的质量计，每次灌胃40mg/kg小鼠体重，每日一次，连续给药25天，建立舒尼替尼致HFSR小鼠模型。对于中药组大鼠模型，采用实施例1制得的浸膏灌胃给药，以浸膏的质量计，给药量为500mg/kg小鼠体重，从造模第1天开始，每天给药一次，连续给药25天，对于模型组和空白对照组，分别灌胃给予相同体积的去离子水。

2、实验方法

(1)手足皮肤反应(HFSR)分级评分测试

造模后第25天，参照文献(Vail DM,Chun R,Thamm DH,et al.Efficacy ofpyridoxine to ameliorate the cutaneous toxicity associated with doxorubicincontaining pegylated(Stealth)liposomes:a randomized,double-blind clinicaltrial using a canine model.Clin Cancer Res.1998,4(6):1567-71.)中记载的方法，分别观察每只小鼠的脚部、背部皮肤是否完整，是否有红斑/色素沉着或缺失、脱皮/结痂、脱毛/溃疡、水肿等临床体征，并按照表4的评分标准进行评分。

表4手足皮肤反应分级评分标准

(2)痛觉行为测试

机械性痛觉超敏实验：HFSR分级评分测试完毕后，参照文献(Meyer L,Patte-Mensah C,Taleb O,et al.Allopregnanolone prevents and suppresses oxaliplatin-evoked painful neuropathy:multi-parametric assessment and directevidence.Pain.2011,152(1):170-81.)中的方法采用von-fery纤维丝观测舒尼替尼致周围神经毒性疼痛小鼠痛行为学改变，具体地，随机取各组6只小鼠分别置于金属网上，盖上透明有机玻璃罩，采用4gVon-Frey纤维丝刺激小鼠后肢足底，每侧足底刺激5次，2次刺激需间隔6s以上，记录小鼠后肢缩足次数，取平均值。

冷痛觉过敏实验：HFSR分级评分测试完毕后，参照文献(Meyer L,Patte-MensahC,Taleb O,et al.Allopregnanolone prevents and suppresses oxaliplatin-evokedpainful neuropathy:multi-parametric assessment and direct evidence.Pain.2011,152(1):170-81.)中的方法采用冷板仪，将温度设定为4℃，待温度恒定后，将机械性痛觉超敏实验剩余的6只小鼠分别置于冷板仪上，盖上透明有机玻璃罩，开始记录小鼠抬足或舔足发生时间，每只小鼠连续测定3次，取平均值。

(3)病理组织学分级测试：造模后第25天，将各组小鼠过量麻醉致死，随机取各组6只小鼠，分别取小鼠的足底、背部皮肤，进行HE染色。染色步骤如下：分别取空白对照组、模型组、中药组的小鼠足底和背部皮肤，4％甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片，制得石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度酒精入水，再用苏木精(Hematoxylin，H)和伊红(Eosin，E)染色3min，用无水乙醇分色与脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片，1000×镜下拍照镜检。

镜下观察上皮层厚度，颗粒层厚度，基底层和棘层间细胞数量及排列等。对表面角化过度、毛囊角化过度、毛囊萎缩、毛囊坏死、毛囊周纤维化、色素失禁、汗腺扩张、汗腺上皮空泡样变或坏死、皮脂腺萎缩和炎症10项病理改变进行评分，评分标准如下：

0分：无病理改变；1分：微小病理改变；2分：轻度病理改变；3分：中度病理改变：4分：重度病理改变。

(4)HFSR相关因子表达：采用免疫组化及ELISA法观测小鼠足底、背部表皮组织Fas蛋白(凋亡相关因子蛋白)及FasL蛋白(凋亡相关因子配体蛋白)表达。取实验方法(3)制得的石蜡切片，采用免疫组化(SABC)法观测各组爪组织Fas及FasL蛋白表达，具体为取石蜡切片二甲苯脱蜡、梯度酒精入水，抗原修复(操作步骤为：将抗原修复液装入一耐热容器中，微波炉加热至沸腾。切片架放入抗原修复液中，低火持续加热10min。停止加热，自然冷却至室温。取出切片架放入PBS中浸泡5min，重复3次。)，3％H₂O₂室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性，山羊血清封闭。Fas及FasL抗体(购自沈阳万类生物科技有限公司)稀释浓度为(1：100)，湿盒内4℃过夜。HRP标记山羊抗兔二抗湿盒内37℃孵育60min，DAB显色10分钟，苏木素复染细胞核3min。用无水乙醇分色与脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片，1000×镜下拍照镜检。

取各组病理检测外的另6只小鼠的血浆样本和足底及背部皮肤样本，采用小鼠Fas检测试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)和小鼠FasL检测试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)分别按照试剂盒说明书中的方法，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定小鼠血浆及皮肤组织中的Fas和FasL的表达水平(或浓度)。按照试剂盒说明书的方法得到标准品，在试剂盒反应板不同的孔中分别加入标准品或待测样本，混匀，封板，37℃孵育2小时。洗板后加入生物素标记抗体、混匀、封板，37℃孵育1小时，洗板加入酶联物、混匀、封板，温育37孵育1小时，洗板，加入显色液37避光孵育15min，加入终止液，混匀。使用酶标仪在450nm处读取OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

4、实验结果

(1)手足皮肤反应(HFSR)分级评分测试：结果显示，空白对照组小鼠后爪底表皮完整、光滑润泽，皮毛浓密有光泽、未见脱皮脱毛，分级评分为0分。模型小鼠从第3周给药开始，出现HFSR皮损、背部皮肤干燥，脱毛，皮毛色素缺失，评分为2-3分。造模后第25天，可见明显HFSR皮损，爪底、背部皮肤干燥、脱毛、脱皮，皮毛色素缺失，耳廓缺损，分级评分达9-11分。相对于模型组，造模后第25天，中药组皮损明显缓解，分级评分为4-7分，手足综合征评分明显下降(P<0.01)。

(2)痛觉行为测试：

表5机械性痛觉超敏实验和冷痛觉过敏实验结果表

从上表可以看出，造模后第25天，空白对照组小鼠未见明显机械性痛觉超敏。相对于空白对照组，模型组小鼠对4g纤维刺激的缩足次数明显增高(P<0.01)，呈现机械性痛觉超敏及机械性痛觉过敏状态。相对于模型组，中药组机械性痛觉超敏及痛觉过敏明显缓解，缩足次数明显下降(P<0.05)。相对于空白对照组，模型组小鼠对冷刺激的缩足反射潜伏期明显缩短，呈现冷痛觉过敏状态(P<0.01)。相对于模型组，中药组冷痛觉过敏明显缓解，缩足反射潜伏期明显上升(P<0.01)。

(3)如图3所示，相对于空白对照组，模型组小鼠爪组织表皮呈现明显角化不全，基底层和棘层间细胞数量增加，细胞排列紊乱，厚度明显增加，空白对照组评分为1.17±1.17，模型对照组评分为10.67±1.63(P<0.01)。相对于模型组，中药组足底表皮层厚度明显下降，细胞层数下降，评分为3.50±2.17(P<0.01)。

(4)如图4和5和下表所示，相对于空白对照组，模型组小鼠足底、背部表皮组织可见Fas及FasL染色阳性棕黄色细胞，蛋白表达水平明显增高(P<0.01)；相对于模型组，中药组染色阳性细胞数量减少，蛋白表达水平明显下降(P<0.01或P<0.05)。

表6Fas蛋白表达水平(单位：ng/ml)

组别	爪组织	背部皮肤组织	血浆
				空白对照组	126.55±23.78	125.57±24.66	99.19±30.94
模型组	364.83±44.61<sup>ΔΔ</sup>	345.51±46.67<sup>ΔΔ</sup>	219.65±39.24<sup>ΔΔ</sup>
				中药组	203.83±42.35**	200.56±50.06**	152.78±40.70*

表7FasL蛋白表达水平(单位：pg/ml)

^ΔΔ表示与空白对照组相比，p<0.01，**表示与模型组相比，p<0.01.

实验例3本发明的中药组合物对索拉非尼致神经毒性反应的影响

1、实验动物、动物模型建立与给药方法

雄性SD大鼠30只，体重180～220g，适应性饲养5～7天后，随机分为空白对照组、模型1组、模型2组、中药1组及中药2组，每组6只。参照Di Cesare Mannelli L方法(参考文献：Lorenzo Di Cesare Mannelli,Mario Maresca,Carlo Farina,et al.A model ofneuropathic pain induced by sorafenib in the rat:Effect of dimiracetam.Neurotoxicology.2015,50:101-7.)，模型1组和中药1组分别灌胃浓度为32mg/ml的索拉非尼水溶液，给药剂量为拉非尼160mg/kg动物体重，连续给药14天，每天给药一次，建立索拉非尼致周围神经毒性大鼠模型。参照Changman Du方法(参考文献：Changman Du,Xue Shao,Ruiming Zhu,et al.NMR-Based Metabolic Profiling Reveals NeurochemicalAlterations in the Brain of Rats Treated with Sorafenib.2015,28(4):290-301.)，模型2组和中药2组分别灌胃浓度为24mg/ml索拉非替尼水溶液，给药剂量为索拉非尼120mg/kg动物体重，连续给药28天，每天给药一次，建立索拉非尼致中枢神经毒性大鼠模型。动物模型建立后，对于中药1组和中药2组，均采用实施例1制得的浸膏灌胃给药，以浸膏的质量计，给药量均为500mg/kg动物体重，从动物模型建立后的第1天开始，连续给药，每天给药一次，中药1组和中药2组分别药物治疗14天或21天，对于模型组和空白对照组，分别灌胃给予相同体积的去离子水。

2.实验方法

(1)机械性痛觉超敏实验

参照文献(Katherine Stockstill,Timothy M Doyle,Xisheng Yan,etal.Dysregulation of sphingolipid metabolism contributes to bortezomib-inducedneuropathic pain.J Exp Med.2018,215(5):1301-1313.)中记载的方法，采用up-and-down法观测各组大鼠对von Fery纤维刺激的缩足反应阈值，取各组6只大鼠分别置于金属网上，盖上透明有机玻璃罩，采用一系列von Fery纤维刺激大鼠足底，先从2g开始，当该力度的刺激不能引起大鼠缩足反应时，则给予相邻大一级力度的刺激，若出现缩足反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次取平均值。每次刺激间隔30s。

(2)中枢神经递质水平测试

对大鼠用过量麻醉处死，剥离海马组织，将海马组织加入0.5ml磷酸缓冲盐(PBS)溶液中，采用组织匀浆仪制成匀浆，制得待测样本。采用南京建成总蛋白定量测试盒测定待测样本中总蛋白浓度，按试剂盒说明配置比色法总蛋白定量工作液。采用双蒸水为空白对照，分别将标准品及待测样本加入标准管及测定管反应体系，漩涡混匀，37℃孵育30分钟。加入试剂盒中的终止剂应用液漩涡混匀，静置5分钟，562nm波长，0.5cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。总蛋白浓度＝(待测样本OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准品浓度×样本测定前稀释倍数。

分别采用南京建成生化法检测试剂盒测定谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖及乳酸的含量，按试剂盒说明配置酶工作液、显色液、标准品贮备液、标准品应用液。采用双蒸水为空白对照，分别将标准品及待测样本加入标准管及测定管反应体系。混匀，37℃水浴准确反应10分钟。加入终止液，混匀。酶标仪采用空白对照调零，测定530nm、1cm光径下，各样本吸光度(OD)值。通过公式计算组织中神经递质水平。神经递质浓度(或水平)＝(待测样本OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准品浓度×样本测定前稀释倍数/待测样本总蛋白浓度。

3、实验结果

(1)机械性痛觉超敏

如下表所示，结果表明，空白对照组大鼠未见明显机械性痛觉超敏。相对于空白对照组，模型组大鼠对von Fery纤维刺激的缩足反应阈值明显下降(P<0.05)，呈现机械性痛觉超敏状态。相对于模型组，中药组机械性痛觉超敏状态明显缓解，对von Fery纤维刺激的缩足反应阈值明显上升(P<0.05)。

表8缩足反应阈值

组别	缩足反应阈值(g)
		空白对照组组	106.66±58.88
模型1组	46.83±20.69<sup>Δ</sup>
		中药1组	114.33±0.02*

^Δ表示与空白对照组相比，p<0.05，*表示与模型组相比，p<0.05.

(2)中枢神经递质水平

如下表所示，结果表明，相对于空白对照组，模型组谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖及乳酸含量明显下降(P<0.05)；中药2组谷氨酰胺、葡萄糖及乳酸含量明显回升(P<0.05)。

表9神经递质含量

组别	谷氨酸(μg/mL)	谷氨酰胺(mmol/L)	葡萄糖(mmol/L)	乳酸(mmol/L)
					空白对照组	356.83±35.54	4.21±0.53	6.89±0.17	5.68±0.46
模型2组	194.67±41.37<sup>ΔΔ</sup>	2.38±0.76<sup>ΔΔ</sup>	4.25±1.25<sup>ΔΔ</sup>	2.64±0.41<sup>ΔΔ</sup>
					中药2组	251.33±49.67	303±0.18**	4.94±0.63**	4.50±0.53**

^ΔΔ表示与空白对照组相比，p<0.01，**表示与模型组相比，p<0.01.

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，其特征在于，按照重量份数计，所述中药组合物由如下原料药制成：鸡血藤25-35份、凌霄花22-32份、千年健20-30份、鹿衔草20-35份、刺五加10-20份和玄参10-20份；所述神经毒性反应和/或皮肤毒性反应为由靶向药物治疗所导致；所述靶向药物为酪酸激酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂；所述酪酸激酶抑制剂为索拉非尼、舒尼替尼中的至少一种；所述蛋白酶体抑制剂为硼替佐米。

2.根据权利要求1所述的预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物为各原料药经粉粹得到的组合物。

3.根据权利要求1所述的预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物为各原料药混合后按常规提取方法得到的提取物；或分别按常规提取方法提取得到的提取物的混合物；

所述常规提取方法选自浸渍提取、煎煮提取、回流提取、渗漉提取和超声提取中的一种或几种；提取溶剂为水或20-95vt％乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的制备方法，包括如下步骤：按照选定的重量份数取鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加和玄参，加水加热回流提取1～10次，以鸡血藤、凌霄花、千年健、鹿衔草、刺五加和玄参的总重量为基准，每次加入1～20重量倍量的水提取1～10小时，合并提取液，过滤，即得。

5.根据权利要求1-4中任一所述的预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，其特征在于，所述神经毒性反应或皮肤毒性反应包括周围感觉神经病变、皮肤或毛发色素沉着或缺失、皮肤干燥中的至少一种。

6.一种药物制剂，其特征在于，采用权利要求1-5中任一所述的预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物为活性组分加入常规辅料按照常规工艺制备得到。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述常规辅料选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、渗透促进剂、pH值调节剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂和成膜材料中的至少一种；

所述药物制剂为水煎剂、浸膏剂、软膏剂、贴剂、搽剂、洗剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、糖浆剂、湿敷剂、栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂。

8.权利要求1-5中任一项所述的预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的中药组合物，或者权利要求6或7所述的药物制剂在制备预防或治疗神经毒性反应和/或皮肤毒性反应的药物中的应用。

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