CN109528917A

CN109528917A - 一种治疗类风湿性关节炎的朝医方组合物及其乳膏剂的制备方法

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Publication number: CN109528917A
Application number: CN201710844729.0A
Authority: CN
Inventors: 郭建鹏; 许灵善; 杜秉权
Original assignee: Yanbian Shanbao Technology Development Co Ltd
Current assignee: Du Bingjing; YANBIAN SHANBAO TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd.
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2037-09-21
Also published as: CN109528917B

Abstract

本发明提供一种治疗类风湿性关节炎的朝医方组合物及其乳膏剂的制备方法。组合物原料药味：黄芩7～9份，黄芪5～7份，雷公藤2～4份，细辛1～3份，穿地龙3～5份，千年健3～5份，防风3～5份，乳香2～4份，没药2～4份，桂枝3～5份，白术3～5份，透骨草3～5份，甘草3～5份，辣椒3～5份。乳膏剂制剂处方：组合物制备的浓缩药液15～25份，白凡士林7～11份，羊毛脂0.5～1.5份，液体石蜡6～10份，单硬脂酸甘油酯3～7份，硬脂酸5.5～7.5份，甘油10～20份，吐温80 2～6份，月桂氮卓酮0.5～1.5份，尼泊金乙酯0.03～0.07份，水加至100份。制备方法：组合物提取，浓缩，浓缩药液和基质混合，乳化，制膏，充填，包装，即得。实验表明，本发明产品具有治疗类风湿性关节炎的药效作用。

Description

一种治疗类风湿性关节炎的朝医方组合物及其乳膏剂的制备方法

技术领域

本发明属于民族药领域，具体涉及一种用于类风湿性关节炎的朝医方组合物，及其外用乳膏剂的制备方法和用途。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病，具有慢性、对称性、侵袭性的特点。早期时症状主要表现为关节疼痛，局部红肿、灼热，功能障碍，晚期时则会表现出现不同程度的关节变形和功能严重受损，痛不可及，同时可造成心、肺、肾等多器官、多系统受损，严重危害患者的生命健康。因此，RA的防治具有重要的理论与社会意义。

目前，尚未有特效药物可以根治RA。西医治疗RA是建立在人体解剖学和生理学的基础上，注重局部和微观研究，主要通过杀菌抑制病毒，镇痛，抗过敏，增强免疫力来控制炎症。常用的药物主要包括非甾体抗炎药、改善病情药、糖皮质激素等。非甾体抗炎药是治疗初期的首选药物，但该类药只能消炎止痛，改善病情药物起效较慢，有较大的副作用，不能有效阻止疾病的持续进程，长期可引起肝肾损害、肺纤维化等并发症；糖皮质激素虽然有很强的药效，但是却不能阻止关节进一步被破坏，不能根治RA，同时其副作用也较大，难以达到长期的疗效。近些年，生物制剂(如：抗TNF-α)在临床上得到广泛应用，然而由于口服生物制剂在体内的被清除速度较快，需要反复注射，且它们无法从根本上完成治疗，并伴有明显的副作用，甚至使机体免疫失调，进而导致功能障碍。同时，生物制剂的价格都不菲，使大部分病人望而生畏。由于应用西药治疗RA往往不能改善患者长期的症状，并且有较强的毒副作用，采用中药治疗风湿、类风湿成为我国医药学领域亟待发展的一个方向。

传统医学中RA归属于“痹证”范畴，但它有别与其它痹病，是一种具有特定病机、相对独立症候分布规律的疾病，禀赋不足、外感六淫而引起脏腑功能失调，经络气血运行不畅，耗损肝肾，伤骨损筋，是其显著的本质特点。传统医学的优势在于注重机体的平衡和整体调节，治本，从人体根本上解决病症，且中药制剂性和力缓，毒副作用低，适于RA等慢性疾病的治疗。

本发明一种用于防治RA的朝医方组合物的处方来源于朝鲜族民间传承验方，原方为外用酊剂。处方主要包含黄芩、大黄、防风、细辛、雷公藤等药味，具有活血化瘀、止痛、改善微循环之功效，适用由痹证引起的疼痛、肿胀、僵直拘挛。由于原剂型酊剂中含有大量的乙醇，存在着运输携带不方便，气味大，患者顺应性差，产品易挥发稳定性下降等缺点。

本发明基于原方酊剂的功效及应用，为增加制剂的稳定性，提高患者顺应性，保证其临床疗效，研制了上述朝医方组合物乳膏剂。拟通过局部涂抹乳膏剂，实现在病患处透皮给药，直达病所，迅速发挥抗炎镇痛和组织修复的目的。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于防治RA的朝医方组合物。一种用于防治RA的朝医方组合物主要药味及重量配比为：黄芩7～9份，黄芪5～7份，雷公藤2～4份，细辛1～3份，穿地龙3～5份，千年健3～5份，防风3～5份，乳香2～4份，没药2～4份，桂枝3～5份，白术3～5份，透骨草3～5份，甘草3～5份，辣椒3～5份。

本发明的另一个目的在于提供一种上述朝医方组合物乳膏剂的制备方法，具体如下：

所述的防治RA的乳膏剂的制备方法，其特征在于，所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比为：

所述朝医方组合物制备的浓缩药液15～25份，白凡士林7～11份，羊毛脂0.5～1.5份，液体石蜡6～10份，单硬脂酸甘油酯3～7份，硬脂酸5.5～7.5份，甘油10～20份，吐温802～6份，月桂氮卓酮0.5～1.5份，尼泊金乙酯0.03～0.07份，水加至100份。

所述制备方法包括如下步骤：

(1)按照所述乳膏剂的原料药组成及配比重量份准备各原料药，各原料质量均应符合《中华人民共和国药典》2015版(一部)的规定；

(2)取上述原料药，采用60％～80％乙醇为溶剂，室温浸渍提取15～45天，得提取液；

(3)将提取液进行低温浓缩，浓缩至料液比3:1～5:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液；

(4)按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相基质与水相基质成分放置于不同的容器中，油相加热至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后，将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速150r·min^-1～350r·min^-1搅拌，边加边搅，60℃～80℃乳化5min～20min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得。

所述步骤(1)中，原料药的单位处方组成优选为：黄芩8g，黄芪6g，雷公藤3g，细辛2g，穿地龙4g，千年健4g，防风4g，乳香3g，没药3g，桂枝4g，白术4g，透骨草4g，甘草4g，辣椒4g。

所述步骤(2)中，原料药用60％～80％乙醇为溶剂浸渍提取，优选的，乙醇浓度为70％；

优选的，所述步骤(2)中，提取溶剂用量为药材重量的8～12倍，提取时间为15～45天；优选的，溶剂用量为药材重量的10倍，提取时间为30天；

所述步骤(2)优选的技术方案为：

取上述原料药，采用70％乙醇为溶剂浸渍提取，溶剂用量为药材重量的10倍，提取30 天，滤过，得提取液。

所述步骤(3)中，将提取液进行低温浓缩，优选的，浓缩温度为60℃；

优选的，所述步骤(3)中，提取液浓缩至料液比3:1～5:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液；优选的，提取液浓缩至料液比4:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液；

所述步骤(3)优选的技术方案为：

将提取液在60℃进行浓缩，提取液浓缩至料液比4:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液。

所述步骤(4)中，软膏剂单位制剂处方中基质组成优选为：

油相：白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g；

水相：浓缩药液20g、甘油15g、吐温80 4g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g、水30g。

所述步骤(4)中，按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相与水相成分放置于不同的容器中，油相加热至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速150r·min^-1～350r·min^-1搅拌，边加边搅，优选的，搅拌转速为250r·min^-1；

优选的，所述步骤(4)中，在60℃～80℃乳化；优选的，乳化温度为70℃；

优选的，所述步骤(4)中，乳化5min～20min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得；优选的，乳化时间为10min；

所述步骤(4)优选的技术方案为：

按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相(白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g)，水相(浓缩药液20g、甘油15g、吐温804g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g、水30g)放置于不同的容器中，油相加热至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速250r·min^-1搅拌，边加边搅，在70℃乳化10min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得。

作为本发明的一个优选实施方式，所述制备方法的具体操作步骤如下：

(1)按照所述乳膏剂的原料药组成及配比重量份准备各原料药如下：黄芩8g，黄芪6g，雷公藤3g，细辛2g，穿地龙4g，千年健4g，防风4g，乳香3g，没药3g，桂枝4g，白术4g，透骨草4g，甘草4g，辣椒4g；

(2)取上述原料药，采用药材重量10倍量的70％乙醇为溶剂，室温浸渍提取30天，得提取液；

(3)将提取液浓缩，60℃真空浓缩至料液比4:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液；

(4)按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相(白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g)，水相(浓缩药液20g、甘油15g、吐温80 4g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g、水30g)放置于不同的容器中，油相加热至 70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速250r·min^-1搅拌，边加边搅，在70℃乳化10min 后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得。

本发明的有益技术效果在于：

(1)提供了一种防治RA的朝医方组合物，该组合物主要由特定的药味按特定的配比构成，并呈现出最佳药理活性。经主要药效学实验证明，本发明组合物所制备的乳膏剂能抑制小鼠对二甲苯所致的急性炎症和对小鼠琼脂性肉芽组织的增生，能抑制对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增强作用，能抑制小鼠对热刺激法和对醋酸致小鼠扭体产生疼痛反应，尤其是高剂量组效果显著；还能够改善AA大鼠的体重及关节炎评分，抑制其关节肿胀；能降低大鼠血清中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6的含量，增加抗炎因子IL-10的含量。

(2)提供了一种朝医方组合物乳膏剂的制备方法，以乳膏剂物理稳定性、保湿性、粒径及乳膏的外观性状等指标为评价标准，优选了制剂处方和制备工艺参数，制得的乳膏呈棕黄色半固体状，外观性状、稳定性及保湿性良好，粒度分布均匀，乳膏剂各项检查指标均符合药典规定，所建立的质量标准重复性好、准确度高。

具体实施方式

以下结合实验例和实施例对本发明进行更为详细的说明。

实验例1提取工艺研究

1.1原料药成分分析

处方中主要的药味有黄芩、大黄、防风、细辛、雷公藤等。研究表明，黄芩在抗炎抗菌方面具有较强的活性，主要包括黄酮类化合物，其中黄芩苷可通过调节TLR4信号通路，从而抑制OGD诱导的小胶质细胞炎性因子的产生。大黄中黄酮类成分可使血液黏度下降，从而增强微循环，具有活血的功效；防风具有解表散风、祛风止痛的功效，其中含有的色原酮类成分是其发挥药效作用的主要物质，例如升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷等，细辛中的木质素类成分具有解热镇痛、抗炎的作用，其中细辛脂素可以有效的防止自由基对关节腔的损害和细胞膜的脂质过氧化作用，对治疗关节炎有积极的作用；雷公藤中萜类成分有促进肾上腺合成皮质激素的作用，有减轻炎性关节水肿的作用。

综上所述，本研究选用总黄酮为含量测定指标。

1.2总黄酮的含量测定

采取紫外分光光度法，测定复方提取液中总黄酮的含量。

1.2.1溶液配制

对照品溶液：精密称量芦丁对照品适量，用甲醇溶解，配成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取待测品1mL，用提取溶液稀释10倍，摇匀，即得供试品溶液。

1.2.2检测波长的确定精密量取芦丁对照品溶液2mL，置于25mL容量瓶中，加水至6mL，加入1.0mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min，加入1.0mL 10％硝酸铝溶液，摇匀放置6min，继续加入10mL 5％氢氧化钠试液，摇匀，加水定容，混匀后放置15min，以0.0 mL对照品溶液为空白，于紫外可见分光光度计200-800nm处，测吸光度值。

测定结果表示在510nm处对照品溶液有最大吸收,故选择510nm作为测定波长。

1.2.3线性关系考察精密量取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL 量瓶中，按1.2.2项下方法测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标(A)，对照品浓度为横坐标 (μg/mL)，绘制标准曲线。得线性回归方程为：y＝11.85x+0.0192，r＝0.9995。结果表明，总黄酮浓度在0.008～0.048mg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

1.2.4精密度考察精密量取芦丁对照品溶液2mL，按1.2.2项下方法重复5次测定吸光度，考察仪器的精密性。结果平均吸光度值为0.211，RSD值为0.226％。表明仪器精密性良好。

1.2.5稳定性考察精密量取样品溶液2mL，按1.2.2项下方法操作，在0，2，4，8，10，12h测定吸光度。结果平均吸光度值为0.371，RSD值为1.367％。表明待测样品液在一定时间内稳定。

1.2.6重复性考察分别精密量取样品溶液2mL 5份，按1.2.2项下的方法测量吸光度值，验证方法的重复性。结果RSD值为1.078％。表明该法重复性良好。

1.2.7加样回收率考察量取已知含量样品溶液6份，分别精密加入适量芦丁对照品，制备不同含量的供试品溶液，计算回收率，结果总黄酮平均回收率为99.78％，RSD＝0.69％，表明本实验法具有较好的准确度及可行性。

1.3浸渍提取工艺优化

1.3.1提取方法按照上述朝医方组合物药味及重量配比称取药味，按设计条件置浸渍罐中浸渍，浸渍提取液用旋转蒸发仪浓缩定容至料液比1:1左右。按1.2.2项下操作测定总黄酮含量。

1.3.2影响因素考察乙醇浓度，乙醇用量(药材量的倍数)，浸渍时间3个因素。选用L9(3⁴)正交设计进行实验。每个因素设计3个水平。因素水平见表1。

表1因素水平表

1.3.3正交试验及结果以各实验组总黄酮的含量为结果进行分析，正交试验安排

及结果见表2，经SPSS15统计软件进行统计分析，结果见表3。表3结果表明，A、B、 C三因素对总黄酮提取量均有显著性影响，进一步分析见表4～表6。

表2正交实验安排及结果

表4结果表明，A1、A2、A3均有显著性差异，且A2>A3>A1。故应选择A2，即乙醇浓度为70％。表5结果表明，B1与B2、B3间有显著性差异，B2与B3间无显著性差异，且B1>B2>B3故应选择B1，即乙醇用量为药材量的10倍。表6结果表明，C1与C2、C3间均无显著性差异，C2与C3间有显著性差异，且C2>C1>C3,故应选择C2，即浸渍提取时间 30天。故最佳提取工艺为A₂B₁C₂，即采用70％乙醇浸渍提取，乙醇为药材量的10倍，浸渍提取时间30天。

表3统计分析结果

表4对因素A进一步统计分析结果

表5对因素B进一步统计分析结果

表6对因素C进一步统计分析结果

1.3.4验证实验取上述朝医方组合物药味，按照上述优化提取工艺进行提取。重复进行3次平行试验，总黄酮平均含量为0.7350％±0.0170％。与正交实验最大值0.7308％接近，结果表明优选的最佳提取工艺相对稳定，具有可行性。

1.4小结

提取工艺参数为：以70％乙醇为溶剂，浸渍提取，溶剂用量为药材量的10倍，提取时间为30天，即得提取液。

实验例2制剂处方研究

乳膏剂系指药物溶解或分散在乳状液型基质中形成的均匀的半固体制剂。乳膏剂既能克服油脂性基质不易吸收水分、药物释放度差及不易清洗的缺点，又能改善水溶性基质对皮肤保护润滑的作用。乳膏剂稠度适宜、易于涂抹且不易融化、易于清洗，对皮肤正常生理活性影响较小，生产工艺不复杂，生产成本低，对生产条件没有特殊要求。本品药物有效成分含有水溶性和脂溶性两大类，且用于治疗风湿痹证，因此不适宜选用具有闭合性且渗透性较差的油脂性基质，也不宜选用易失水的水溶性基质，适宜选用乳剂型基质制成乳膏剂。

制备乳膏剂时，选择合理的乳膏类型、基质的种类、基质与主药的配比以及附加剂的筛选，都是至关重要的，可以直接影响乳膏剂的质量和药物的释放与吸收。

2.1处方前研究

2.1.1W/O型乳膏剂与O/W型乳膏剂

乳膏剂根据基质不同，可分为油包水型(W/O)乳膏剂与水包油型(O/W)乳膏剂。W/O型乳膏剂的优点：润滑、无刺激性，能在皮肤上形成一层封闭性的油脂膜，促进皮肤的水合作用，对皮肤有保护软化的作用，可以促进创伤面肉芽组织的生长，且作用持久，因此在皲裂、干燥性及慢性皮损等皮肤病的治疗中广泛应用。W/O型乳膏剂的缺点：释药性较差，油腻感强，不易洗涂，其稳定性受温度的影响变化较大。吸水性较差，与分泌物不易混合等。 O/W型乳膏剂易于涂展、清洗，使药物更好地与皮肤接触，发挥作用，由于基质中水分的存在，使其增强了润滑性，与W/O型乳膏剂相比，在药物释放速度和皮肤穿透性以及稳定性等方面较强。故本实验确定制备O/W型乳膏剂。

2.1.2O/W型乳膏基质

制备O/W型基质，通常要求处方中水相的量大于油相，主要乳化剂为O/W型乳化剂。基质应尽量满足以下要求：1.物理性质稳定，不与主药和附加剂发生配伍变化，长时间贮存不变质；2.具有良好的安全性、不引起皮肤的刺激性，无过敏反应，不阻碍皮肤正常生理；3.具有适当的黏稠度，润滑，易于涂布且不易融化；4.具有吸湿性，能软化伤口；5.对药物有良好的释放性；6.易清洗，不污染衣服。除考虑基质的质量外，还要根据药物的理化性质选用合适的乳膏基质进行配制。

2.1.3水相

在水相中加入增加黏度的物质，如阿拉伯胶、海藻酸钠等利于O/W型体系的形成。为了能够提高体系的低温稳定性，通常在水相中加入2％以上的多元醇，降低水相的凝固点，如甘油、丙二醇、山梨醇和丁二醇等。常用水相基质：聚乙二醇类高分子化合物、甘油、明胶、淀粉甘油、纤维素衍生物类(如MC、CMC-Na)等。

2.1.4油相

常用油相基质有硬脂酸、羊毛脂、凡士林、高级脂肪醇等。它的缺点是比较油腻，会影响药物的穿透吸收，故处方中加入的量应适宜。

2.1.5乳化剂

一般油溶性乳化剂偏向形成W/O型基质，水溶性乳化剂偏向形成O/W型基质。在实际应用中，往往使用复合乳化剂，将HLB值较低的和值较高的乳化剂混合使用，对处方中的HLB值起调节作用，一般复合乳化剂的质量和稳定性优于单一的乳化剂。但使用复合乳化剂时，必须符合油相对HLB值的要求。常用乳化剂有十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、吐温80、司盘80。

2.1.6附加剂

为了能够使膏体具有适宜的黏度和稠度，增加乳化膜的强度，通常在油相中加入适量的增稠剂。可以有效的防止出现乳滴合并现象，从而提高乳膏剂的稳定性。常用增稠剂有单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、十八醇等。

O/W型乳膏基质外相为水相，易挥发失去水份导致乳膏变干，且对滋润皮肤、软化皮肤较差，需加保湿剂。常用保湿剂有甘油、丙二醇和山梨醇等。

为避免O/W型乳膏中的各组分受到外界环境因素的影响发生腐败或霉变，需加入适量的防腐剂，防止微生物滋生，要求加入防腐剂对体系的稳定性不会产生显著影响。常用防腐剂有尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸等。

为了提高药效，往往在乳膏中加入皮肤促渗透剂。在使用促渗剂时，其浓度的选择至关重要。如果太高会使乳膏难以成型或者刺激皮肤，如果太低则达不到效果。一般用量控制在处方量的0.5％～5％。常用透皮促进剂主要有氮酮、油酸、冰片、薄荷醇、二甲基亚砜等。

通过查阅相关文献及资料，初步确定防腐剂的用量范围为0.05％～0.1％，透皮促进剂用量范围为1.0％～3.0％。

2.2制剂处方初步筛选

2.2.1基质与主药的配比

本品主药为复方朝药的70％乙醇提取液，相对密度为1.04(22℃测)，如果将其直接加入基质中不易与油相混合，且易发生分层的现象。通过预实验发现，将主药提取液浓缩至相对密度为1.15-1.16(22℃测)时，与基质比较容易混合。乳膏剂当中通常含有大量的基质，为了能够提高药物的药效，所以要尽可能的增加乳膏剂的载药量，采用相同工艺制备了3种的乳膏剂，其中含主药浓缩液分别为10％、20％、30％，对比3种乳膏剂的质量。结果表明，在主药浓缩液含量为20％时，乳膏剂的性状最好，30％时载药量过大，制备的乳膏容易发生油水分层的现象。故初步确定主药浓缩液的相对密度为1.15-1.16(22℃测)，基质与主药浓缩液的配比为4:1。

2.2.2基质组成

通过查阅相关文献和预试验研究，初步选出4组较为常用的O/W型乳剂基质，见表7。

表7乳膏基质组成及配比

2.2.3制备方法

将原药液进行减压浓缩，浓缩相对密度至1.15-1.16(22℃测)，按表7各处方配比分别称量油相与水相成分放置于不同的烧杯中，水浴加热油相至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，并按顺时针方向不断手工搅拌，边加边搅，先快后慢，乳化(75℃的水浴保温)20min 后停止加热，继续搅拌冷却至室温。

2.3考察指标及评分标准

本试验采用综合评分法为指标对处方进行筛选，以乳膏剂的外观性状、物理稳定性、乳滴粒径、保湿度为考察指标，依据对乳膏剂质量的影响因素的大小来制定评分标准。评分方法及标准：综合评分满分为100分，其中外观性状为30分，稳定性为30分，乳滴粒径为20 分，保湿度为20分。

2.3.1外观性状考察

分别取4组乳膏剂样品适量，依次观察其光泽度、均一度、细腻度，并在手背部均匀的涂抹适当的乳膏剂，感受其黏度与涂布性。具体评分如下：满分30分，以光泽度、均一度、细腻度、黏度及涂布性为5个指标，评价方法：光泽度，5人以上用肉眼观察乳膏是否有光泽；均一度，5人以上用肉眼观察乳膏颜色是否一致；细腻度，5人以上用肉眼观察乳膏是否细腻无粗颗粒；黏度，5人以上取适量感觉油腻感是否明显；涂布性，5人以上取适量乳膏涂抹于手背部，感觉是否能快速涂匀；按照乳膏剂的各个指标的质量的好坏，分值从0→6，依次提高，按1分1级升级评分，再将分数进行叠加，即是外观性状考察指标的总分。评分结果见表8。

表8外观性状考察结果

2.3.2物理稳定性考察

以离心实验、耐热、耐低温实验为考察指标。叠加各项指标分数即为物理稳定性评分的总分。

离心试验：取4组乳膏各10g，分别标记好放于带有刻度离心管中，密封后离心操作(3000r·min^-1)25min，观察各组离心管内乳膏剂的性状，是否有油水分层现象的出现。具体评分如下：若无油水相分层为满分10分，若分层体积超过1mL为0分，按照分层的体积的多少进行评价，分值由0→10，分层体积越大分值越低。评分结果见表9。

耐热性实验：取4组乳膏剂各15g，置于封闭的容器内，用保鲜膜密封好，放置于恒温烘箱内，保持55℃，6小时后拿出，待冷却至室温后观察各组性状有无变化。具体评分如下：满分10分，设定变硬、变稀、变粗超、起泡、油水分层5个指标，各指标2分，按照其变化的程度逐级打分，无变化为2分，变化大为0分，按1分1级降级评分。将分数进行叠加即是该指标评分总分。结果见表9。

耐低温实验：取4组乳膏剂各15g置于封闭容器内，先放入冰箱冷藏室(4℃)预冻2h，再迅速放置到-20℃冷冻室，24h后取出，待恢复至常温后观察各组膏体有无变化。具体评分如下：满分10分，设定裂开、发硬、变稀、变粗糙、油水分层分为5个指标，各指标2分，按照其变化的程度逐级打分，无变化为2分，变化大为0分，按1分1级降级评分。评分结果见表9。

表9物理稳定性考察结果

2.3.3乳滴大小及均匀度考察

取4组乳膏剂适量，均匀涂抹铺盖在载玻片上，保持厚度均一，再用盖玻片盖住，置100 倍的显微镜下观察各组乳膏的乳滴大小及分布，具体评分如下：满分20分，设定乳滴粒径和粒度分布2个指标，各分好(8～10)，中(4～7)，差(0～3)3个等级评分，粒径小、粒度分布均匀得分高，结果见表10。

表10显微观察乳滴粒径和粒度分布评分结果

2.3.4保湿性考察

在载玻片(2cm*7cm)均匀涂上2g乳膏(每组处方各做3份)，精密称重后，置于37℃恒温箱内保持8h，再取出精密称量，求出各乳膏失水率的平均值。保湿性评分方法：得分＝20-失水率×20，分值越少，保湿性越差。结果见表11。

表11保湿性考察结果

2.4综合评分结果

将4组处方各考察指标的评分进行叠加，得到的最终综合评分为：

A处方(74.3分)、B处方(64.4分)、C处方(64.2分)、D处方(77.0分)。综合评分表明，处方D可作为通过初选的处方。

2.5制剂处方优化

乳膏剂制剂处方影响因素较多，故采用正交设计可以较为简便且全面地进行优化，筛选出最佳水平，使该乳膏剂在外观及物理性质上达到最优。

2.5.1正交实验设计

以初选处方为基础，结合文献报导，本实验将A(吐温80的用量)、B(液体石蜡的用量) 及C(单硬脂酸甘油酯的用量)作为考察因素，每个因素各取3个水平，正交实验因素水平设计见表12，考察指标及评分标准同处方筛选，选用L₉(3⁴)正交表进行试验，正交实验顺序及结果见表13。

表12正交试验设计

表13正交试验结果表

2.5.2正交实验结果分析

以各实验组中综合评分值进行结果分析，正交实验方差分析结果见表14；进一步分析多水平均值检验，结果见表15。

分析结果表明，吐温80与液体石蜡的用量对实验结果无显著性影响，单硬脂酸甘油酯的用量对乳膏的综合评分有显著性影响。

进一步分析多水平均值检验结果表明，A影响综合评分的影响A₃>A₂>A₁，A₃与A₁间无显著性差异，考虑到在制备乳膏时基质的含量应尽量减少，不影响药效且节约成本，故综合考虑选择A₁，即吐温80的用量的为4g；B因素对综合评分的影响B₁>B₃>B₂，但B₁与 B₂间没有显著性差异，综合考虑选择B₂，即液体石蜡的用量为8g；C因素对乳膏剂的综合评分影响为C₂>C₁>C₃，选择C₂，即单硬脂酸甘油酯的用量为5g。最佳处方为A₁B₂C₂，吐温80用量为4g，的液体石蜡的用量8g，单硬脂酸甘油酯的用量为5g。

表14方差分析结果

表15进一步分析多水平均值检验

2.6小结

通过综合评分法和正交实验设计筛选得到的最佳乳膏剂处方为：浓缩药液20g、白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g、甘油15g、吐温80 4g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g，水加至100g。

实验例3制备工艺研究

乳膏的质量与制备工艺密切相关，很多乳膏常因制备工艺中的某个参数选择的不合理，而严重影响了乳膏剂的质量和稳定性。根据文献研究和预试验，发现搅拌速度、乳化温度、乳化时间、乳化剂加入方法4个因素对乳膏剂的质量影响较大，故对这4个因素进行单因素考察。

3.1搅拌速度的考察

本实验考察了不同搅拌速度(150r·min^-1、250r·min^-1、350r·min^-1、450r·min^-1)对乳膏质量的影响。按“2.2.3”项下的方法制备乳膏，按“2.3”项下的标准进行综合评分。考察结果见表16。结果表明，当转速为250r·min^-1时制备的乳膏的综合评分最高，外观性状、物理稳定性及保湿性最好，粒度均匀。

表16搅拌速度对乳膏质量的影响

3.2乳化温度的考察

本实验考察了不同乳化温度(60℃、70℃、80℃、90℃)对乳膏质量的影响。按“2.2.3”项下的方法制备乳膏，按“2.3”项下的标准进行综合评分。考察结果见表17。结果表明，当温度控制在70～80℃时制备的乳膏的综合评分最高，外观性状、稳定性及保湿性最优良，粒度均匀。但考虑到温度太高会导致挥发油损失及增加能耗，最后确定的最佳乳化温度为70℃。

表17乳化温度对乳膏质量的影响

3.3乳化时间的考察

考察了不同乳化时间(5min、10min、15min、20min)对乳膏剂质量的影响。结果见表18。结果表明，当乳化时间为20min时制备的乳膏的综合评分最高，外观性状、稳定性及保湿性相对最好，粒度均匀。但是考虑到方法越简化越有利于实验的进行，可以适当的简短时间以防止水分的流失和浪费，最后选定乳化时间为10min。

表18乳化时间对乳膏质量的影响

3.4乳化方法的考察

一般制备O/W乳膏剂时，采用转相法效果较好，即将水相加入油相。乳化剂有多种加入方式，方法的不同也会对乳膏的稳定性产生影响。本实验考察不同的乳化剂加入方式对乳膏剂质量的影响。乳化剂加入方式主要有以下三种：(1)水中加入法，是将乳化剂都溶解在水相中，在搅拌下将水相加入油相制得乳膏；(2)油中加入法，是将乳化剂都溶解于油相中，再将水相加入油相而制得；(3)油水分别法，将单硬脂酸甘油酯加入油相，吐温80加入水相，再将水相加入油相制成乳膏。结果见表19。结果表明，采用油水分别法制备的乳膏的综合评分最高，质量最好，外观细腻光滑，稳定性、保湿性最佳，镜下检查乳滴粒度分布均匀。

表19乳化剂加入方法对乳膏质量的影响

3.5验证性实验

按优选的制剂处方在选定的最佳制备工艺条件下制备3个批次的乳膏，按“2.3”项下方法对其质量进行考察，结果综合评分分别为93.2分、93.1分、93.4分，RSD<2％，说明优选的制备工艺稳定可行。

3.6小结

通过单因素考察得到的最佳制备工艺为：搅拌速度250r·min^-1、乳化温度70℃、搅拌时间10min，采用油水分别加入法制备。

实验例4乳膏剂的质量标准研究

乳膏剂的质量与其物理性质、物理稳定性、刺激性及主药的含量息息相关，为了控制循环通络乳膏剂的产品质量，本实验对其质量标准进行了初步研究。

本发明处方中主要的药味有黄芩、大黄、防风、细辛、雷公藤等。研究表明，黄芩在抗炎抗菌方面具有较强的活性，主要包括黄酮类化合物，其中黄芩苷可通过调节TLR4信号通路，从而抑制OGD诱导的小胶质细胞炎性因子的产生。大黄中黄酮类成分可使血液黏度下降，从而增强微循环，具有活血的功效；防风具有解表散风、祛风止痛的功效，其中含有的色原酮类成分是其发挥药效作用的主要物质，例如升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷等，细辛中的木质素类成分具有解热镇痛、抗炎的作用，其中细辛脂素可以有效的防止自由基对关节腔的损害和细胞膜的脂质过氧化作用，对治疗关节炎有积极的作用；雷公藤中萜类成分有促进肾上腺合成皮质激素的作用，有减轻炎性关节水肿的作用。

综上所述，本实验采用紫外分光光度测定总黄酮含量、利用HLCP测定防风中升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷及细辛中细辛脂素的含量。通过以上方法,更好的控制循环通络乳膏剂的质量,从而保证临床疗效的稳定。

4.1检查

4.1.1性状本品为棕黄色半流体状软膏，有光泽、质地均匀、细腻，涂在手上无粗粒感。

4.1.2乳膏类型的鉴别利用染色法，染料亚甲蓝亲水性强，而苏丹红亲水性强，取三份不同批次的乳膏适量，在每份中同时加入两者，来判断乳剂类型。如果红色染料比蓝色染料扩散的快，则表明是w/o型乳膏，反之则为o/w型。结果表明，三份都是o/w型乳膏。

4.1.3稠度在常温下，取适量乳膏装满样品杯，将重量为150g的锥尖与乳膏表面保持水平，迅速释放锥体，5秒后读出锥入深度，1个锥入度单位等于0.1mm，稠度以锥入度来表示。取 3批不同批次的乳膏同法测定，平均稠度为258。

4.1.4pH取3批不同批次的乳膏3份，各2.0g放入到烧杯内，加10mL蒸馏水，超声10min，振荡使之分散均匀后，用pH计进行测定，平均pH为7.33。

4.1.5粒度取3批不同批次的乳膏3份，将适量的乳膏分别涂于载玻片上，均匀的涂满薄薄一层，再覆以盖玻片，轻压使颗粒分布均匀，防止气泡混入影响结果，马上用显微镜观察全部视野中有无凝聚现象，是否含有大于180μm的粒子。观察结果发现无凝集现象，颗粒分布均匀，并未检查出大于180μm的粒子。符合2015版《药典》项下规定。

4.2物理稳定性考察

取三批次的乳膏按2.2.3项下方法分别进行离心实验、耐热耐低温，离心实验。离心实验中软膏剂油水两相没有分层，膏体没有变化。耐热耐低温实验中，软膏无分层现象，膏体没有变化。

4.3刺激性考察

选取6只Wistar大鼠，首先将小鼠背部用70％乙醇消毒，用脱毛膏脱毛，2cm×2cm大小，左右两侧各一处，再用温水擦干净脱毛处，检查皮肤是否完好，如果皮肤有损伤，则舍弃该鼠。24h以后进行造模，先对大鼠脱毛处进行消毒，再用砂纸打磨大鼠脱毛处，直到皮肤渗血为止。右侧作破损皮肤区，左侧作完整皮肤区。将2g乳膏剂涂在大鼠右侧脱毛区域，左侧为空白对照组。24h后用温水将皮肤轻轻洗干净，观察，然后再涂抹相同乳膏剂，连续涂抹3d。在第三天给药后的1、24、48、72h观察大鼠皮肤受刺激的程度。评分标准评分见表20，实验结果6只大鼠皮肤的刺激性分值均为0，说明该乳膏剂安全、无刺激性。

表20皮肤的刺激性实验标准评分

4.4总黄酮的含量测定

采取紫外分光光度法，测定乳膏剂中总黄酮的含量。

4.4.1溶液配制

对照品溶液：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10.0mg，以甲醇为溶剂定容至50ml，用保鲜膜密封，超声5min后放至30min，加甲醇补足至50ml，摇匀，即得。

供试品溶液：取乳膏1g，放入具塞锥形瓶内，加无水乙醇10ml，超声10min溶解，高速离心(2000r/min)10分钟后取上澄清液，再用10ml无水乙醇，超声10min后重复离心取上清液，合并两次上清液，放置冰浴中冷却1h，取出后高速离(2000r/min)10分钟，取上清液，放置冰浴中冷却0.5h后再离心10min，取上清液过滤，再进行浓缩滤液至10mL，摇匀，即得供试品溶液。

4.4.2线性关系考察精密量取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，每个对照溶液都放在25mL容量瓶内，用水补足至6.0mL，未加标准对照品的是空白对照组。将 5％亚硝酸钠溶液1mL加入六组容量瓶中，混匀后放置6min，再将10％的硝酸铝溶液1mL加入其中，混合放置6min，最后将5％氢氧化钠试液10mL加入每个容量瓶内，混匀加水补足至25mL，静置15min后以0.0mL对照品溶液为空白，于紫外可见分光光度计510nm处测定波长。以吸光度为纵坐标(A)，对照品浓度为横坐标(mg/mL)，绘制标准曲线，得线性回归方程为：y＝11.85x+0.0192，R＝0.9994。结果表明，总黄酮浓度在0.008～0.048mg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

4.4.3空白实验为了防止基质对检测的结果的干扰，进行了空白实验，按处方制备不加药液的空白制剂，按项下4.4.2方法操作，结果基本无吸收。

4.4.4精密度考察精密吸取芦丁对照品溶液2mL，按4.4.2项下方法重复5次，测定吸光度。结果平均吸光度值为0.211，RSD值为0.226％，表明仪器精密性良好。

4.4.5稳定性考察分别于0，30，60，90，120min，按4.4.2项下方法测定同一批供试品溶液的总黄酮含量，结果平均吸光度值为0.371，RSD值为1.367％，表明待测样品液在一定时间内稳定。

4.4.6重复性考察精密称取同一批提取液5份，按4.4.1的方法制备供试品，测定总黄酮含量。平均吸光度值为0.371，RSD值为1.078％，表明重现性良好。

4.4.7加样回收率考察取9份已知含量的供试品溶液，分别精密加入对照品适量，按4.4.1 方法制备供试品溶液，按4.4.2方法进行总黄酮的含量测定。结果见表21。总黄酮平均回收率为99.78％，RSD＝0.69％。

表21回收率考察结果

4.3.8样品含量测定按上述测定方法对3批样品进行测定，以外标法计算循环通络乳膏剂总黄酮的含量，平均含量为50.54mg/g。根据含量测定结果，规定本品每1g中总黄酮含量不少于45.486mg(50.54mg×90％)。

4.5升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、细辛脂素的含量测定

中药乳膏剂中成分复杂，经常会考虑在同一色谱条件下，将多组分同时测定，这样既可以提高实验效率，又可以简化实验过程。本实验利用HLCP同时测定升麻素苷、细辛脂素、 5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。

4.5.1色谱条件色谱柱为依特利Thermo ODS-HYPERSIL(4.6mm×250mm，5μm)，流动相: 甲醇(A)-水(B)，按表22进行梯度洗脱，流速1mL/min；检测波长0-30min，254nm；30-55min，287nm，柱温30℃。

表22梯度洗脱流程

4.5.2溶液的配制

对照品溶液：分别精密称取升麻素苷、细辛脂素、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品5mg，放于25mL容量瓶中，加入甲醇定容，用保鲜膜密封，超声5min后放至30min，加甲醇补足至25ml，摇匀，制成各含0.2mg/mL的对照品溶液；再分别精密称取各标准品2.5mg，放入同一25mL容量瓶中，加入甲醇定容，用保鲜膜密封，超声5min后放至30min，加甲醇补足至25ml，摇匀，制成各含0.1mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取乳膏1g，放入具塞锥形瓶内，加无水乙醇10ml，超声10min溶解，高速离心10分钟后，取上澄清液，再用10ml无水乙醇，超声10min后重复离心取上清液，合并两次上清液，放置冰浴中冷却1h，取出后高速离心10分钟，取上清液，放置冰浴中冷却0.5h后，再离心10min，取上清液过滤，再进行浓缩滤液至10mL，摇匀，再精密量取5mL浓缩液，放置于具25mL容量瓶中，加入甲醇定容，用保鲜膜密封后，用天平称重，超声45分钟后取出，放至30min后再次称重，加入甲醇补充重量，摇匀后再滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

4.5.3系统适应性实验取混合对照品溶液10μL、供试品溶液10μL，注入HPLC中，检测结果表明混合对照品色谱出现三个峰且分离度良好，供试品色谱图中升麻素苷、细辛脂素及5-O- 甲基维斯阿米醇苷与相邻峰分离度良好，表明该测定方法系统适应性好。

4.5.4线性关系考察精密量取各组单一对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0mL，每个对照溶液都分别置于在10ml的容量瓶中，加甲醇定容至10mL，摇匀后，各取10μl注入高效液相色谱仪进行测定，以峰面积(Y)对对照品浓度(X)进行线性回归，得到升麻素苷的回归方程为y＝5E+07x+538923，R2＝0.9992(n＝5)，结果表明，在0.01～0.05mg/mL范围内，本方中主药升麻素苷的对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系。细辛脂素的回归方程为y＝6E+07x +738923，R2＝0.9995(n＝5)，结果表明，在0.01～0.05mg/mL范围内，本方中细辛脂素的对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系。5-O-甲基维斯阿米醇苷的回归方程为y＝8E+07x+ 838923，R2＝0.9994(n＝5)，结果表明，在0.01～0.05mg/mL范围内，本方中5-O-甲基维斯阿米醇苷的对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系。

4.5.5精密度考察精密量取混合对照品溶液，按4.5.4方法进行测定，连续测定5次。结果升麻素苷(A)RSD值为1.53％，细辛脂素(B)RSD值为1.31％，5-O-甲基维斯阿米醇苷(C)RSD 值为1.31％，说明仪器精密度良好。

4.5.6稳定性考察精密量取循环通络乳膏剂制备的供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h，每次进样10μL，测定，结果升麻素苷(A)RSD值为1.74％，细辛脂素(B)RSD值为1.66％，5-O- 甲基维斯阿米醇苷(C)RSD值为1.50％，结果表明供试品在12h小时内稳定性很好。

4.5.7重复性考察取精密称取同一批循环通络乳膏剂5份，按4.5.2的方法制备供试品，每次进样10μL，测定，结果升麻素苷(A)RSD值为1.81％，细辛脂素(B)RSD值为1.82％，5-O- 甲基维斯阿米醇苷(C)RSD值为1.11％，表明该实验方法重现性良好。

4.5.8加样回收率考察精密称取已知含量的样品溶液9份，分别精密加入对照品适量，制备不同含量的供试品溶液，每次进样量10μl，测定。升麻素苷(A)加样回收率为98.72％，RSD 值为1.21％；细辛脂素(B)加样回收率为99.12％，RSD值为1.63％；5-O-甲基维斯阿米醇苷(C) 加样回收率为100.72％，RSD值为1.34％。结果表明本实验方法可行。

4.5.9循环通络乳膏剂样品含量测定按上述测定方法对不同批次样品进行测定，以外标法计算升麻素苷、细辛脂素、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。测定结果表明循环通络乳膏剂中升麻素苷的平均含量为0.2885mg/g、细辛脂素的平均含量为0.3735mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为0.4593mg/g。

根据上述3批乳膏的含量测定结果，故暂定为本品每1g含升麻素苷不得少于0.2597mg (0.2885×90％)、细辛脂素不得少0.3362mg(0.3735×90％)、5-O-甲基维斯阿米醇苷不得少于0.4134mg(0.4593×90％)。

4.6小结

循环通络乳膏为棕黄色半流体状软膏，有光泽、质地均匀、细腻，为o/w型乳膏，稠度、 pH值、粒度均符合药典规定，稳定性良好，安全无刺激性，乳膏中总黄酮的平均含量为50.54 mg/g；高效液相色谱中，主要成分升麻素苷、细辛脂素及5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.01～0.05mg/mL区域内，进样浓度和峰面积之间分别有良好的线性关系，各方法学考察中各指标的RSD值均＜2％，测定3批乳膏样品，升麻素苷的平均含量为0.2885mg/g、细辛脂素的平均含量为0.3735mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为0.4593mg/g。

实施例1本发明朝医方组合物乳膏剂的制备

处方：

制法：

(1)取上述原料药，采用药材重量10倍量的70％乙醇为溶剂，室温浸渍提取30天，得提取液；

(2)将提取液在60℃真空浓缩至料液比4:1(相对密度1.15-1.16，22℃测)，得浓缩药液；

(3)分别称量白凡士林90g、羊毛脂10g、液体石蜡80g、单硬脂酸甘油酯50g、硬脂酸65g为油相；浓缩药液、甘油150g、吐温80 40g、月桂氮卓酮10g、尼泊金乙酯0.5g、水300g 为水相；将浓缩药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与其余水相组分混合；油相、水相分别放置于不同的容器中，油相加热至70℃-75℃，水相加热至80℃，各相搅匀后，将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速250r·min^-1搅拌，边加边搅，在70℃乳化10min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得。

实施例2本发明朝医方组合物乳膏剂对炎症、疼痛的小鼠模型和大鼠AA类风湿性关节炎模型的治疗作用

RA的临床主要特点为关节红肿胀、变形并伴随着疼痛。故在药效学实验中考察药物的抗炎镇痛、抗类风湿性关节炎的效果，具有重要的意义。本实施例以上述制备的朝医方组合物乳膏剂为供试品，建立几种炎症和疼痛的小鼠模型，考察其抗炎、镇痛的作用；建立大鼠AA 类风湿性关节炎模型，考察其抗类风湿性关节炎的作用。

1实验材料与试剂

1.1实验动物

选用清洁级昆明雄性小鼠120只，体重为20±2g，Wistar雄性大鼠50只，体重为180±20g，由延边大学实验动物中心提供(实验动物生产许可：SCXK(吉)2011-0007)。

1.2供试样品

按照2.2.3项下制备(批号：20161125)。

1.3动物实验室环境

实验环境为SPF级动物实验室，实验环境温度22±2℃，相对湿度57±2％，每2日清扫1 次以保持笼内清洁。

2抗炎作用研究

2.1实验分组

炎症和疼痛的小鼠模型中，每个实验各选取合格的昆明小鼠24只，随机分为4组，分别为对照组、乳膏剂高、中、低剂量组(分别相当于人用剂量5、10、20倍)，每组6只并进行标记。

2.2对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

实验主要原理是二甲苯可以致使小鼠内某些炎症介质溶解释放,使毛细血管通透性增加，导致局部血管扩张，从而使小鼠耳部发生急性水肿。实验用耳廓肿胀度来表示抗炎的效果。各组每天把不同剂量的乳膏剂均匀涂抹在小鼠的左耳两面，对照组给予同体积的乳膏剂基质。连续给药3天，每天2次。第3天给药后，建立炎症小鼠模型，将适量的二甲苯均匀的涂抹在每只小鼠的左耳两侧，用没有用药的右耳进行比较。20min后再次给药，半个小时后将小鼠处死，在小鼠两耳相同部位用打孔器打孔，再分别精密称量两耳圆片的重量，耳廓的肿胀度是两耳的片重之差，用来表示药物的抗炎效果，并按下面的公式求出抑制率，实验结果见表23。

实验发现，当各组小鼠左耳涂抹完二甲苯后，与右耳相比，有明显的肿胀。结果发现，三组治疗组与对照组比较，每组的两耳重量之差都有所减少，其中治疗中、高剂量组的耳胀度显著减小(p＜0.05)，中高两组之间无显著差异，而治疗低剂量组虽然在一定程度上可以抑制小鼠左耳的肿胀，但是与对照组相比，无显著差异(p>0.05)。提示乳膏中、高剂量组对二甲苯所致的急性炎症有较强抑制作用，尤其高剂量组的抑制作用显著。

抑制率＝{1-(左耳片重-右耳片重)÷左耳片重}×100％

表23各组小鼠耳肿胀度及抑制率(n＝6)

注：^#与对照组有显著性差异p＜0.05；^##有极显著性差异p＜0.01

2.3对小鼠琼脂性肉芽组织增生的影响

实验主要原理是在小鼠体内注射琼脂以后引发炎症,使结缔组织迅速生长，慢慢长成肉芽的肿块。通过比较肉芽肿重量之差来说明药物的抗炎效果。

首先将小鼠背部用70％乙醇消毒，用脱毛膏脱毛，1.5×1.5cm大小。在小鼠背部相同处标记好后，皮下注射2％琼脂，每只0.5mL。各组连续7天按照不同的剂量将乳膏涂抹在小鼠背部脱毛处，药物透过小鼠皮肤吸收，每天3次。对照组涂抹相同剂量的不含有药物的基质。 7天后处死，用剪刀剪开给药处的皮肤，找到肉芽肿块并迅速分离，精密称重。实验用对照组与治疗组分离出来的肉芽肿重量之差，来表示药物的抗炎效果，并按照下面的公式求出抑制率，实验结果见表24。

抑制率＝|对照组琼脂块重量-给药组琼脂块重量|÷对照组琼脂块重量×100％

实验结果发现，各治疗组的肉芽重量均低于对照组的重量。其中治疗高剂量组的抑制率为33.61％，治疗中剂量组的抑制率为30.03％，与对照组形成结缔组织肿块的重量有显著的减少，且具有极显著性差异(p＜0.01)。提示循环通络乳膏剂在一定程度上能减缓结缔组织的生长，有一定的抗炎效果。

表24各组小鼠肉芽肿重量及抑制率(n＝6)

2.4对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响

实验主要原理是醋酸可以导致小鼠局部血管扩张，毛细血管通透性增加,而伊文斯兰可与血浆蛋白稳固的结合，故在一定程度上,染料的吸光度值可反应出血浆蛋白的量，进而间接的反应出毛细血管的通透性。

小鼠腹部先用70％乙醇消毒，再用脱毛膏脱毛，1.5×1.5cm大小。连续3天各治疗组在脱毛处涂抹相同剂量的药物，对照组涂抹相同剂量的不含有药物的基质，3天后称量小鼠体重，尾静脉注射2％伊文斯兰，每只剂量0.005mL/g，10min后用新鲜配制的醋酸溶液进行腹腔注射，20min后断颈处死，剪开腹腔，用注射器吸取2mL生理盐水，注射到腹腔内，再抽出，这样反复3次。合并三次生理盐水，先高速离心5min，取上层溶液置于590nm波长处分光光度计中比色，测定吸光度(OD)值。以OD值来代表该药物的抗炎效果，并利用下面的公式求出抑制率，结果见表25。

抑制率＝|给药组OD值-对照组OD值|÷对照组OD值×100％

实验结果发现，各治疗组的OD值均低于对照组的OD值。其中治疗高剂量组的抑制率为 15.23％，与对照组测定的OD值相比，形成结缔组织肿块的重量有明显的减少，具有极显著性差异(p＜0.01))，但是治疗中、低剂量组的抑制率较低，无显著差异(p>0.05)。提示循环通络乳膏剂高剂量组在一定程度上能增加小鼠毛细血管的通透性，有一定的抗炎效果。

表25各组吸光度值与抑制率(n＝6)

3镇痛作用研究

3.1对小鼠热板法致痛的影响

实验前将电热板四周用隔离板围好，防止小鼠逃出。再加热电热板至55℃左右时开始保持恒温不变，将小鼠放置电热板上，开始用秒表计时，直到老鼠出现因热刺激而产生的舔后脚的动作，停止计时。将舔后脚这个动作作为热疼痛反应的标志，这个时间作为小鼠正常的热痛阈值。如果小鼠很活跃，时间不到5s，或对热刺激不敏感，时间超过30s，则放弃不进入下一步实验环节。各组连续3天按照不同的剂量将乳膏涂抹在小鼠的双足处，每天3次，对照组涂抹相同剂量的不含有药物的基质。在第3天涂抹完药物后的0.5、1、2h，再次测量出现热疼痛反应的时间。按照下面的公式求出痛阈提高百分率，结果见表26。

痛阈提高百分率＝(给药后痛阈值-基础痛阈值)÷基础痛阈值×100％

实验结果发现对照组的时间基本保持不变，而治疗组的时间有或多或少的增加。治疗低剂量组的时间几乎没有变化，无显著差异(p>0.05)。治疗中、高剂量组与对照组比较，小鼠出现热疼痛反应出现时间显著增加，具有显著性差异(p＜0.05)，特别是用药1小时后效果明显，但在用药2小时后，时间反而减少，可能是时间过长药物损失，影响了药效。提示说明循环通络乳膏剂中、高剂量对热刺激法引起的小鼠疼痛反应有明显的抑制作用。

表26各组小鼠的痛阈提高百分率(n＝6)

3.2对醋酸致小鼠扭体反应的影响

小鼠腹部先用70％乙醇消毒，再用脱毛膏脱毛，1.5×1.5cm大小。连续3天各治疗组在脱毛处涂抹相同剂量的药物，对照组涂抹相同剂量的不含有药物的基质，每天3次。第3天涂抹药物后1h后，在小鼠腹腔内注射新鲜配制的0.6％醋酸生理盐水溶液，每只0.01mL/g。此时仔细观察小鼠，如果小鼠出现腹腔处向里凹，后肢异动，把这个动作作为疼痛反应的标注，观察并记录20min内出现的次数，并按照下面的公式求出疼痛抑制率，结果见表27。

疼痛抑制率＝(对照扭体均数-药物组扭体均数)÷对照扭体均数×100％

各治疗组与对照组比较，乳膏剂中、高剂量组出现疼痛反应的次数显著减少，具有极显著差异(p＜0.01)，而低剂量则没有抑制作用。提示循环通络乳膏剂中、高剂量组对醋酸致小鼠产生疼痛反应有明显的抑制作用。

表27各组小鼠的扭体次数及疼痛抑制率(n＝6)

4抗类风湿性关节炎的作用研究

在药效学研究中，建立成模率高、症状与人体病理情况相似的动物模型是进行药物研究的关键。佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)模型是建立免疫性关节炎动物模型的经典方法。它的成模的周期较短，约14天，成功率较高，且评价的标准也比较准确，表现为大鼠四肢红肿发胀，体重明显减轻，其症状与人体的RA表现相似，即关节肿胀、骨豁变形等。因此，本实验选用AA模型。

4.1实验条件

实验前动物先适应环境1个星期，喂养标准颗粒鼠粮，自由摄食和充分饮水，随机分笼，自由活动，体征表现良好后才可以进行下一步实验。

4.2给药剂量

剂型为乳膏剂，推荐人体用量每次1g，每日2次。根据人体推荐剂量分别设计低、中、高三个剂量组。分别相当于人体推荐剂量的5、10、20倍量。成人体重按60kg计算，折算大鼠的给药剂量分别为190mg/kg、380mg/kg、768mg/kg。

4.3AA诱导剂的制备

将卡介苗冻干粉(BCG)及液体石蜡进行灭活处理，在超净台中用无菌注射器抽取10ml 液体石蜡倒入研钵中，稍稍研磨滋润研钵壁，然后倒入100mgBCG，顺时针方向研磨，研磨至乳化状态，即得到用于制备关节炎模型的完全弗式佐剂CFA，浓度为10mg/mL。

4.4AA模型的建立

将50只大鼠随机抽取8只为正常组，进行标记并关在同一鼠笼喂养。其它大鼠全部进行造模。先麻醉大鼠后，消毒大鼠的右足趾处，注射配置好的完全弗式佐剂，每只0.1mL。第7 日同法再注射一次CFA，加强诱导。实验第14天观察大鼠，若大鼠的左侧足趾出现明显肿胀，即造模成功。

4.5分组与给药

将大鼠分为5组，没有造模的为正常组，将造模成功的32只大鼠，随机分为4组，即AA对照组、循环通络乳膏剂高、中、低剂量组。将大鼠的背部先用70％乙醇消毒，再用脱毛膏脱毛，面积约为5×5cm大小。再用温水清洗干净，于实验第14日开始按照相应药物剂量给药，取乳膏剂均匀的涂抹于大鼠的背部，每天涂抹2次，正常组不给予药物治疗，AA对照组给予相同剂量的乳膏基质。连续给药18天后，心脏穿刺采血，分离血清后-80℃保存。

4.6AA模型的评价

4.6.1大鼠体重的增重率每隔3天称重大鼠的体重并记录，结果见表28，并按照下面的的公式求出增重率。增重率＝(第n天体重-第0天体重)÷第n天体重×100％

表28大鼠的体重(n＝8)

注：与正常组比较^*p＜0.01；与对照组比较，^#p＜0.05。

由表28可知，第一天时各组大鼠体重几乎无差别，但是在随后的32天里，正常组大鼠随着时间的延长，体重也逐渐在增加；对照组和治疗组大鼠的增重率显著低于正常组，具有极显著差异(p﹤0.01)，但治疗组的增重率显著高于对照组，并且随着时间的延长，治疗组大鼠体重在逐渐增长，但增长速度不及正常组大鼠。三组治疗组与对照组比较，每组的增重率都有所增加，其中治疗中、高剂量组的增重率显著增加(p﹤0.05)，而治疗低剂量组虽然在一定程度上可以增加大鼠体重，但是与对照组相比，无显著差异(p﹥0.05)。

4.6.2关节炎评分根据大鼠关节红肿程度和范围，通常采用关节炎五级评分法对大鼠的关节情况进行评分，每隔3天评分一次。评分标准见表29。每个关节炎表现最高为4分，总和累计最高为16分。结果见表30。

表29关节炎评分标准

表30关节炎评分结果(n＝8)

注：与对照组比较，^#p＜0.05；^##p＜0.01。

结果表明，大鼠造模后的第14天，各组大鼠的关节炎指数明显升高；第20天左右时，各组大鼠关节炎评分最高，说明此时关节肿胀严重。与对照组相比，各治疗组在第16天以后，关节炎分数开始逐渐降低，其中治疗高、中剂量组大鼠关节炎分数与对照组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)，低剂量组治疗作用不显著。提示该乳膏剂对关节炎症有一定的抑制作用。

4.6.3足趾肿胀率将每只大鼠的右后足关节处在相同的地方作好标记，每隔3天测量大鼠右足的体积，详细记录，结果见表31，并计算大鼠足趾的肿胀率。

表31大鼠右足体积(n＝8)

注：与正常组比较^*p＜0.05；^**p＜0.01；与对照组比较，^#p＜0.05；^##p＜0.01

结果表明，除正常组外，各组大鼠在第一次免疫后，足趾肿胀开始逐渐增长，直到第19 天左右达到峰值。乳膏剂低剂量组在给药初期抑制效果不明显，但是在给药后期逐渐随着时间，足趾肿胀程度有明显改善。乳膏剂高剂量组在第20日开始表现出明显的抑制作用，与对照组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。实验表明循环通络乳膏各剂量组均能明显抑制大鼠的关节局部的早期炎症，抑制其关节肿胀。

4.6.4ELISA法检测大鼠血清中TNF-α，IL-1β、IL-6及IL-10的含量实验第32日，每组大鼠心脏穿刺取全血，将血液放入低温离心机中高速离心20min，吸取上清液，分装好保存于-80℃冰箱中。

严格按照ELISA试剂盒说明书上操作，检测得各组大鼠血清中细胞炎症因子TNF-α， IL-1β，IL-6及抗炎因子IL-10的水平。记录数据。结果见表32。

表32各组血清中TNF-α，IL-1β，IL-6、IL-10含量(n＝8)

Elisa结果显示，在该组中所检测炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6及抗炎因子IL-10水平均处于正常水平；对照组大鼠血清中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平均有显著升高，且高于其余各组水平，而抗炎因子IL-10水平却比其余各组均降低；比较乳膏高剂量大鼠血清中各炎症因子水平发现，高剂量组可显著降低TNF-α，IL-1β，IL-6水平，升高抗炎因子IL-10水平，具有显著差异(p<0.05)；乳膏低剂量与对照组相比，大鼠血清中炎症因子TNF-α，IL-10 水平具有显著差异(p<0.05)，而IL-1β、IL-6水平虽然有所降低，但是无显著差异(p>0.05)，大鼠血清中IL-10水平诱导组有所升高，具有显著差异(p<0.05)；中剂量组与其他两用药组相比，可以降低TNF-α、IL-1β水平，没有高剂量组显著。

5结果分析

本实施例结果表明：

(1)本发明乳膏剂能抑制小鼠对二甲苯所致的急性炎症和对小鼠琼脂性肉芽组织的增生，能抑制对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增强作用，能抑制小鼠对热刺激法和对醋酸致小鼠扭体产生疼痛反应，尤其是高剂量组效果显著。

(2)本发明乳膏剂能够改善大鼠的体重及关节炎评分，抑制其关节肿胀，提示该乳膏剂能抑制大鼠关节局部的早期炎症。

(3)本发明乳膏剂能降低大鼠血清中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6的含量，可以增加抗炎因子IL-10的含量。提示其可以通过降低血清TNF-α，IL-1β，IL-6含量，升高IL-10 含量，对大鼠类风湿性关节炎产生保护作用。随着给药剂量的增加，治疗AA模型的药效依次增强，提示该乳膏剂治疗AA大鼠存在着量效关系。

本发明的保护范围不能认为只局限于上述具体实施方式及具体实例。对所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的基本前提下，还可以做出若干简单推演或等同替换，这些等同替换方案仍然将被视为在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种治疗类风湿性关节炎的朝医方组合物，其特征在于，主要药味及重量配比为：黄芩7～9份，黄芪5～7份，雷公藤2～4份，细辛1～3份，穿地龙3～5份，千年健3～5份，防风3～5份，乳香2～4份，没药2～4份，桂枝3～5份，白术3～5份，透骨草3～5份，甘草3～5份，辣椒3～5份。

2.根据权利要求1所述的朝医方组合物乳膏剂的制备方法，其特征在于，所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比为：所述朝医方组合物制备的浓缩药液15～25份，白凡士林7～11份，羊毛脂0.5～1.5份，液体石蜡6～10份，单硬脂酸甘油酯3～7份，硬脂酸5.5～7.5份，甘油10～20份，吐温80 2～6份，月桂氮卓酮0.5～1.5份，尼泊金乙酯0.03～0.07份，水加至100份。

3.根据权利要求1～2所述的用于类风湿性关节炎的朝医方组合物及其乳膏剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)按照所述重量份准备各原料药；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，原料药的单位处方组成优选为：黄芩8g，黄芪6g，雷公藤3g，细辛2g，穿地龙4g，千年健4g，防风4g，乳香3g，没药3g，桂枝4g，白术4g，透骨草4g，甘草4g，辣椒4g。

5.根据权利要求3～4所述的制备方法，所述步骤(2)中，原料药用60％～80％乙醇为溶剂浸渍提取，优选的，乙醇浓度为70％；优选的，所述步骤(2)中，提取溶剂用量为药材重量的8～12倍，提取时间为15～45天；优选的，溶剂用量为药材重量的10倍，提取时间为30天；所述步骤(2)优选的技术方案为：取上述原料药，采用70％乙醇为溶剂浸渍提取，溶剂用量为药材重量的10倍，提取30天，滤过，得提取液。

6.根据权利要求3～5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将提取液进行低温浓缩，优选的，浓缩温度为60℃；优选的，所述步骤(3)中，提取液浓缩至料液比3:1～5:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液；优选的，提取液浓缩至料液比4:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液；所述步骤(3)优选的技术方案为：将提取液在60℃进行浓缩，提取液浓缩至料液比4:1(相对密度1.15～1.16，22℃测)，得浓缩药液。

7.根据权利要求3～6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，软膏剂单位制剂处方中基质组成优选为：白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g为油相；浓缩药液20g、甘油15g、吐温80 4g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g、水30g为水相。

8.根据权利要求3～7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相与水相成分放置于不同的容器中，油相加热至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速150r·min^-1～350r·min^-1搅拌，边加边搅，优选的，搅拌转速为250r·min^-1；优选的，所述步骤(4)中，在60℃～80℃乳化；优选的，乳化温度为70℃；

优选的，所述步骤(4)中，乳化5min～20min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得；优选的，乳化时间为10min；所述步骤(4)优选的技术方案为：按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相(白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g)，水相(浓缩药液20g、甘油15g、吐温80 4g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g、水30g)放置于不同的容器中，油相加热至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速250r·min^-1搅拌，边加边搅，在70℃乳化10min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得。

9.根据权利要求1～8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作步骤如下：

(4)按照所述乳膏剂的制剂处方组成及重量配比，分别称量油相(白凡士林9g、羊毛脂1g、液体石蜡8g、单硬脂酸甘油酯5g、硬脂酸6.5g)，水相(浓缩药液20g、甘油15g、吐温804g、月桂氮卓酮1g、尼泊金乙酯0.05g、水30g)放置于不同的容器中，油相加热至70℃～75℃，水相至80℃；将浓缩的药液与甘油研磨成糊状物，混合均匀后再与水相混合；各相搅匀后将水相缓慢逐渐加入油相中，以转速250r·min^-1搅拌，边加边搅，在70℃乳化10min后停止加热，继续搅拌冷却至室温，充填，包装，即得。

10.根据权利要求1～9项所述的一种治疗类风湿性关节炎的朝医方组合物及其乳膏剂制备方法在制备治疗类风湿性关节炎的外用制剂中的应用。