CN101474346A - 薤白提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种薤白提取物及其制备方法与应用。本发明所提供的薤白提取物是按照包括以下步骤的方法制备的：将小根蒜或薤的鳞茎用体积百分含量45－55％的乙醇水溶液浸泡、回流提取，收集提取液，得到薤白提取物。该薤白提取物可以液体、浸膏或干粉的形式存在。药效学试验证明，本发明的薤白提取物具有改善骨骼肌的能量代谢，加强胰岛素敏感性，减少腹部脂肪，降低血糖，促进脂代谢等作用，可用于目前日益增加的代谢综合征的防治或2型糖尿病的早期预防。

Description

薤白提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种薤白提取物及其制备方法与应用。

背景技术

代谢综合征表现为中心性肥胖、胰岛素抵抗、糖耐量异常、血脂紊乱、高血压等症状[Roche HM，Phillips C，Gibney MJ.The metabolic syndrome：the crossroads ofdiet and genetics.Proc Nutr Soc.2005 Aug；64(3)：371-7.]。代谢综合征诊断标准分别被美国NCEP ATPIII，世界卫生组织(WHO)及国际糖尿病联盟(IDF)所定义。尽管诊断标准存在些须争议，但存在一个事实，近几年代谢综合征的发病率正以高速度增长。在美国，20岁以上成年人代谢综合征的患病率为25％，60岁以上为40％。在中国，亚洲洲际合作组织(The InterASIA Collaborative Group)调查研究表明，按美国国家胆固醇教育计划(NCEP)的标准，35-74岁的中国人中男性约9.8％，女性约17.8％具有代谢综合征[Gu D，Reynolds K，Wu X，et al；InterASIA CollaborativeGroup.Prevalence of the metabolic syndrome and overweight among adults in China.Lancet.2005 Apr 16-22；365(9468)：1398-405]。流行病学调查研究还显示高营养食物长期摄取可促进代谢综合征的发生。代谢综合征可增加2型糖尿病和心血管疾病的危险数倍。代谢综合征的防治已经成为全球研究的热点，尽管在代谢综合征发病机制上进展不小，也出现了不少防治代谢综合征的药物，然而目前防治代谢综合征的理想药物的研制仍没有取得成功[

 G，Pérez-Torres I，El Hafidi M.Medicinal agentsin the metabolic syndrome.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem.2008Oct；6(4)：237-52.]。由于代谢综合征有多种症状如糖耐量异常、肥胖、血脂紊乱、高血压等，都是独立的心血管危险因子，所以目前的治疗策略只能是多种药物联合使用加以干预。然而，不同作用的药物的联合使用不仅加重了患者的毒副作用，而且增加了患者的经济负担。因此，市场急需安全无毒副作用，价格低廉，具有多种调节功效的药物来用于代谢综合征的防治。

腺苷酸激酶(AMPK)在调节能量代谢方面发挥了重要的作用，是一个新的作用靶点[Viollet B，Mounier R，Leclerc J，et al.Targeting AMP-activated protein kinaseas a novel therapeutic approach for the treatment of metabolic disorders.Diabetes Metab.2007 Dec；33(6)：395-402.]。新近研究表明，双胍类药物可激活AMPK的活性，改善机体能量代谢，对AMPK的调控作用可用于代谢综合征疾病的治疗。Sirt1蛋白新近发现在能量代谢方面具有重要的作用，激活该蛋白也许能发挥防治代谢综合征的作用[Pfluger PT，Herranz D，Velasco-Miguel S，et al.Sirtl protects against high-fatdiet-induced metabolic damage.Proc Natl Acad Sci U S A.2008 Jul15；105(28)：9793-8.]。内脏脂肪素(Visfatin)是新近发现的由脂肪细胞分泌的因子，能与胰岛素受体非竞争性结合发挥拟胰岛素样作用，从而发挥降血糖的作用[SethiJK，Vidal-Puig A.Visfatin：the missing link between intra-abdominal obesity anddiabetes？Trends Mol Med 2005；11：344-7]。视黄醇结合蛋白4(RBP4)也是新近发现的脂肪细胞因子，可促进胰岛素抵抗和影响糖代谢[Yang Q，Graham TE，Mody N，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type2 diabetes.Nature.2005 Jul 21；436(7049)：356-62]。脂肪组织总脂酶的活性也许在脂肪溶解中起非常重要的作用。药物对以上靶点在体内直接或间接的调控也许能揭示其作用机理。特别是对AMPK和Sirt1的调控，也许可解释药物用于代谢综合征防治的作用机制。

西药作用机制明确，靶点比较单一，而中药具有多效性的特点，这在一定程度上给予中药在代谢综合征治疗方面的想象空间。我国中药资源丰富，价格相对低廉，长期以来中药在疾病预防与治疗过程中，起了非常重要的作用。但中药大多物质基础和作用机理不清晰，不易被国际市场接受。人参、黄连、苦瓜等具有抗代谢综合征的作用，尽管具有大量动物和人的数据，但还没有多中心关于其疗效和安全性的数据[Yin J，Zhang H，Ye J.Traditional chinese medicine in treatment of metabolicsyndrome.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets.2008 Jun；8(2)：99-111.]。作为一种代谢综合征的防治产品，应该适合长期服用的特点，而人参长期服用，容易上火，黄连久服易导致胃寒，苦瓜具有一些低血糖毒性，因此市场仍然缺乏抗代谢综合征的药物。薤白是一味传统的中药，始载于《神农本草经》，为百合科植物小根蒜Alliummacrostemon Bge或薤Allium chinense G.Don的干燥鳞茎。薤白中医可用于治疗胸痹胀痛、心痛彻背等症，即西医临床所述心绞痛的治疗。化学研究显示其含有挥发油、皂苷、含氮化合物、前列腺素等成分。薤白皂苷是主要的活性组分之一，其中发现的薤白皂苷类新化合物有19个，具有抑制血小板聚集，抗肿瘤等活性[Peng JP，Wu Y，Yao XS，Okuyama T，Narui T.[Two new steroidal saponins from Allium macrostemon]Yao Xue Xue Bao.1992；27(12)：918-22.Article in Chinese.]。薤白还含有黄酮类物质[刘丽娟，刘银燕，杨晓虹。葱属植物甾体化合物及黄酮化合物的研究进展。中国药学杂志，2000，35(6)：72-13，173]，黄酮类物质具有广泛的生物活性，不同植物品种的黄酮可能具有特殊的生理调节作用。薤白是否可用于代谢综合征的防治，特别是改善胰岛素敏感性，降低血糖及减肥等方面目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种薤白提取物及其制备方法。

本发明所提供的薤白提取物是按照包括下述步骤1)的方法制备的：将小根蒜或薤的鳞茎用体积百分含量为45％-55％的乙醇水溶液浸泡、提取，收集提取液，得到薤白提取物。

所述方法还可包括将收集得到的提取液浓缩至原提取液体积的1/2-1/5倍的步骤，得浓缩提取物。所述浓缩具体可为真空浓缩。

本发明所述方法还可包括以下纯化的步骤：将所述浓缩提取物上大孔吸附树脂柱，先用所述浓缩提取物2-6倍体积的去离子水洗柱，再用所述浓缩提取物2-6倍体积的体积百分含量为45％-55％的乙醇水溶液洗柱，收集乙醇水溶液洗柱的洗脱液，得到纯化的薤白提取物。

将纯化的薤白提取物进一步浓缩可得到纯化的薤白提取物的浸膏。对浸膏进行(真空)干燥即可得到纯化的薤白提取物粉末。

纯化步骤中，所述大孔吸附树脂柱具体可为D101型大孔吸附树脂柱。

上述步骤1)中所述体积百分含量为45-55％的乙醇水溶液与所述小根蒜或薤的鳞茎的配比为5ml：1g-15ml：1g。

步骤1)中所述提取可为回流提取，所述回流提取的温度可为55-85℃；所述回流提取中，至少提取两次，每次提取的时间为1-3小时。

对本发明的薤白提取物的成分进行了初步的分析，其主要活性成分为薤白皂苷和黄酮类物质。其中以敷甾皂苷1计总敷甾皂苷含量为35％，以斛皮素计总黄酮类为40％。

本发明的另一个目的是提供薤白提取物的用途。

本发明所提供的薤白提取物的用途是薤白提取物在制备预防和/或治疗代谢综合征药物中的应用或在制备预防2型糖尿病药物中的应用。

以本发明所提供的薤白提取物为活性成分制备的预防和/或治疗代谢综合症的药物，也属于本发明的保护范围。

以本发明所提供的薤白提取物为活性成分制备的预防2型糖尿病药物同样属于本发明的保护范围。

本发明所提供的预防和/或治疗代谢综合症的药物以及预防2型糖尿病药物均可通过注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

如上制备的预防和/或治疗代谢综合症的药物以及预防2型糖尿病的药物均可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述预防和/或治疗代谢综合症的药物的用量一般为100-200mg薤白提取物/kg体重/天，疗程为30至60天，也可长期服用；预防2型糖尿病的药物的用量一般为100-200mg薤白提取物/kg体重/天，疗程为30至60天，也可长期服用。

本发明所提供的药物可单独或与其它药物联合使用来预防和/或治疗代谢综合征或预防2型糖尿病。

药效学试验证明，薤白提取物具有改善骨骼肌的能量代谢，加强胰岛素敏感性，减少腹部脂肪，降低血糖，促进脂代谢等作用，可用于目前日益增加的代谢综合征的防治或2型糖尿病的早期预防。

附图说明

图1为实施例1制备的薤白提取物在DU-8OO仪器上全波长扫描图谱(200-800nm)。

图2为实施例1制备的薤白提取物的HPLC图谱。

图3为实施例2中正常对照组、HFD组、45％乙醇提取物组、55％乙醇提取物组、60％乙醇提取物组、65％乙醇提取物组、75％乙醇提取物组腹腔胰岛素耐量实验中血糖浓度-时间曲线图(n＝8)。

图4为实施例2中各组血糖下降的速率柱形图。

图5为实施例2中正常对照组、HFD组、45％乙醇提取物组、55％乙醇提取物组、60％乙醇提取物组、65％乙醇提取物组、75％乙醇提取物组骨骼肌脂质过氧化MDA数值图(n＝8)。

图6为实施例3小鼠糖耐量实验中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组血糖浓度-时间曲线图(n＝10)。

图7为实施例3小鼠糖耐量实验中各组小鼠血糖浓度-时间曲线下面积(AUC)的柱形图(n＝10)。

图8为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠腹部脂肪组织总脂酶活性的柱状图(n＝10)。

图9为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠腹部脂肪中Visfatin蛋白和RBP4蛋白的表达。

图10为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠腹部脂肪中Visfatin蛋白和RBP4蛋白分别与内参actin的灰度比值。

图11为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠骨骼肌中pAMPK(磷酸化蛋白)和AMPKα 1(非磷酸化蛋白)蛋白表达。

图12为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠骨骼肌中pAMPK(磷酸化蛋白)和AMPKα 1(非磷酸化蛋白)的灰度比值。

图13为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠骨骼肌中Sirt1蛋白的表达。

图14为实施例3中正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组小鼠骨骼肌中Sirt1蛋白与内参actin的灰度比值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1、制备薤白提取物

取中药薤白(深圳本草药业有限公司，批号070427)，粉碎成粗粉状。然后将200g粉碎的薤白干燥鳞茎用1000ml体积百分含量为55％的乙醇水溶液浸泡过夜，过滤收集浸取液1和滤渣1。

再将滤渣1以1∶5(滤渣1∶55％乙醇)的质量份数比与55％乙醇(乙醇∶水＝55∶45，体积比)混合，在85℃条件下回流提取2h，抽滤，收集第一次回流提取液2和滤渣2；将得到的所有滤渣2与55％乙醇混合，55％乙醇的量与第一次相同，在85℃条件下再提取2h，收集第二次回流提取液3和滤渣3，并将浸取液1、提取液2与提取液3合并，在真空度为0.1MPa，温度为85℃的条件下对合并液进行减压浓缩去除乙醇，得到浓缩为原体积1/3倍的浓缩液。

接着将浓缩液过夜室温静置，1000rpm离心，取上清液上D101大孔吸附树脂柱，上样体积与柱床体积比为1：1，先用5倍上样体积的去离子水洗柱，再用5倍上样体积的体积百分含量为55％的乙醇水溶液洗柱，收集55％乙醇水溶液洗柱的洗脱液。将收集的洗脱液在真空度为0.1MPa，温度为85℃的条件下进行减压蒸发，真空干燥(去除乙醇和水)至恒重，得到2.1g薤白提取物干粉，为棕黄色的膏状物。将薤白提取物干粉溶解于体积百分含量为50％甲醇溶液，溶液为金黄色，进行全波长扫描及HPLC分析。

全波长扫描在Beckman Coulter公司核酸蛋白分析仪DU-800仪器上进行，扫描波长为200-800nm，扫描结果在220nm及280nm处有最大吸收(见图1)。

然后对薤白提取物用HPLC进行分析，色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Hypersil ODS(C18)柱((4.0mm×125mm，5μm))，检测仪器为Agilent公司的液相设备(1200series)

检测波长为220nm；流速，1.0ml/min，

流动相为乙腈和水的混合液进行梯度洗脱(0—5min，体积百分含量5％-25％乙腈水溶液；5-10min，体积百分含量25％-50％乙腈水溶液；10-15min，50％乙腈水溶液；

液相主要考察不同批次的提取物指纹图谱是否一致，以考察工艺的稳定性，结果表明各批次提取物色谱图波形特征较为吻合，工艺相对比较稳定，各指纹图谱组分有待进一步鉴定(见图2)。参照文献方法分别检测薤白总敷甾皂苷的含量[刘岱琳，马杰，曲戈霞，等。薤白中呋甾皂苷的含量测定。中国中药杂志，2000，25(6)：753-953]和总黄酮的含量[马陶陶，张群林，李俊等。三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨。时珍国医国药，2008，19(1)：45-65]，总敷甾皂苷的含量以敷甾皂苷I计含量为35％，总黄酮含量以斛皮素计为40％。

实施例2、45％乙醇、55％乙醇、60％乙醇、65％乙醇、75％乙醇作提取剂提取得到的薤白提取物的药效比较

胰岛素抵抗是代谢综合症的关键环节。高脂食物很容易导致动物体内胰岛素抵抗，出现糖耐量异常。胰岛素耐量实验，简单易于操作，可以反应体内胰岛素敏感性。另外高脂诱导的代谢综合征患者早期体内骨骼肌线粒体脂质氧化增加，产生过多氧自由基，引起线粒体膜损伤，脂质过氧化增加，线粒体功能下降和数量减少，是导致代谢综合征的体内能量代谢障碍和胰岛素抵抗的重要原因之一，因此富含具有抗过氧化损伤的测试物也许具有防治代谢综合征的作用。此处用胰岛素耐量实验和体内脂质过氧化实验来粗步筛选各提取物防治代谢综合征的效应。综合其药效决定提取物所选用的乙醇体积百分比。

实验材料

血糖试剂盒(北京北控中生生物工程公司)，过氧化脂质丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程公司)。

试验动物：C57BL/6雄性小鼠(20g±2g)购自广州中医药大学实验动物中心(SPF级，许可证号：粤监证字2005A009，SCXK(粤)2003-0001)

试验用食物：高脂食物(购自中国医学科学院实验动物研究所)

高脂食物的配方(以各成分的质量百分含量计)为猪油12％，蛋黄10％，雀巢全脂奶粉10％，普通基础饲料68％

普通基础饲料含20％蛋白，65％碳水化合物，4％脂肪，其余11％组分为水，无机盐等

45％乙醇的薤白提取物、60％乙醇的薤白提取物、65％乙醇的薤白提取物和75％乙醇的薤白提取物的制备方法同实施例1。

实验方法

C57BL/6小鼠代谢综合征模型参考文献制作[Weidong Xie，Yaou Zhang，NailiWang，et al.Novel effects of Macrostemonoside A，a compound from Alliummacrostemon Bung，on hyperglycemia，hyperlipidemia，and visceral obesity in high-fatdiet-fed C57BL/6mice.European Journal of Pharmacology.2008 Oct 9.Epub ahead ofprint]，具体制备方法如下：使用高脂食物对60只C57BL/6小鼠进行诱导2周，根据生长速率挑选40只肥胖易感的小鼠进行下一步活性评价实验，该小鼠表现为腹部肥胖，高血糖，高血脂以及胰岛素抵抗，基本符合代谢综合征的特征。

将筛选的代谢综合征模型小鼠随机分成5组，每组8只，同时设置正常对照组(n＝8)。高脂小鼠连续1周分别经口给予45％乙醇的薤白提取物、55％乙醇的薤白提取物、60％乙醇的薤白提取物、65％乙醇的薤白提取物、75％乙醇的薤白提取物200mg/kg体重，体积为10ml/kg，HFD模型对照组和正常对照组给予等体积溶解薤白提取物的蒸馏水，然后进行胰岛素耐量测定。

测定前禁食不禁水6h后，腹腔给予0.2U的胰岛素/kg体重，于时间点0，15，30，45分钟时尾静脉取血于血糖计上检测血糖，描绘血糖—时间曲线，计算血糖下降速率，将其值×-100，用ANOVA的方法进行统计学比较(^aP<0.05，^aaP<0.01，实验各组与正常对照组进行统计学分析；^bP<0.05，^bbP<0.01，实验各组与模型对照组(HFD)进行统计学分析)，数值越大，改善胰岛素敏感性效果越好。实验结束时，动物麻醉致死，取后肢肌肉，按硫代巴比妥酸的方法用MDA检测试剂盒检测各给药组体内骨骼肌抗氧化损伤的大小，MDA值越小，抗过氧化损伤能力越大，数据统计同上。

实验结果

胰岛素耐量结果表明，各给药组与正常对照组比较无显著性差异，HFD模型组与正常对照组比较有非常显著性差异(^aaP<0.01)；各给药组与HFD模型对照组比较，55％乙醇的提取物组与HFD模型组比较有显著性差异(^bP<0.05)，说明55％乙醇的薤白提取物可显著改善胰岛素的敏感性，其次是45％乙醇的提取物也可显著改善胰岛素的敏感性，其它如60％、65％和75％乙醇的提取物没有明显的效应(见图3、4)。抗氧化体内结果发现45％乙醇提取物抗骨骼肌脂质过氧化作用最强，其次是55％的乙醇提取物，到60％、65％和75％乙醇提取物则依次递减(见图5)。综合上述两个实验结果不难发现45％—55％的乙醇提取物可能具有较好活性，并且要优于60％、65％和75％乙醇提取物，因此选取45％—55％的乙醇提取物更适合用于代谢综合征的防治。以下动物实验选取55％乙醇的薤白提取物进行进一步的实验评价。

实施例3、薤白提取物对代谢综合征模型小鼠的药理作用

本实施例中数据均表示为Mean±SD，数据统计采用单因素方差分析的方(ANOVA)。P值<0.05将视为具有显著统计学意义。

实验材料

C57BL/6小鼠代谢综合征模型制作同实施例2。

将筛选的代谢综合征模型小鼠随机分成四组，每组10只；其中，组1为实施例1的薤白提取物剂量100mg/kg体重的给药组(XB-100)，组2为实施例1的薤白提取物剂量200mg/kg体重的给药组(XB-200)，组3为阳性药二甲双胍(天津太平洋医药科技集团，生产批号071101)200mg/kg体重的对照组(Met-200)，组4为HFD模型生理盐水对照组(HFD)。另设一组没用高脂食物饲喂的正常的C57BL/6小鼠生理盐水对照组(Normal)。

给药方式为灌胃，每天灌胃1次，连续灌胃给予4周。临给药前将薤白提取物及二甲双胍用双蒸馏水配成所需浓度的混悬液，每只小鼠每次灌胃量为10ml/kg体重。给药期间，给药组喂养高脂饲料(同实施例1)，HFD模型小鼠对照组喂养高脂饲料(同实施例1)，正常小鼠对照组喂养普通饲料。各组饲养的环境一致，温度为25℃，相对湿度为60％，12h/12h交替光照。并每周二次监测体重和食物摄取量，给药2周后进行糖耐量实验。

开始给药前，尾静脉取小鼠禁食6h后血清测定血糖和血脂用作基值。末次给药后继续喂养一天，将小鼠禁食6h后，10％乌拉坦麻醉(0.1ml/10g体重)，眼眶取血，1000rpm离心10min取血清，放置在—80℃冰箱备用，主要用于血生化检测。血生化主要检测血糖、胰岛素、血甘油三酯、血总胆固醇、血低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。血液收集完毕，立即将动物脱颈椎处死，取腹部脂肪、肝脏、脾脏称重；并取部分脂肪、肝脏、后腿骨骼肌液氮瞬时冷冻后放置—80℃冰箱备用，用于糖脂代谢及相关酶及蛋白的表达。

测定内容及结果：

1、正常小鼠和代谢综合征模型小鼠分别给药四周后总卡路里摄取、体重以及脏器系数的变化

小鼠总卡路里摄取、体重以及脏器系数的变化情况见表1。由表1可知，各组之间总卡路里摄取、给药前及给药后体重以及肝重均无显著性差异；HFD组的内脏指肪相对重量与正常对照组相比具有非常显著的差异，XB-200组和Met-200组的内脏脂肪相对重量与HFD组相比具有非常显著的差异，说明剂量为200mg/kg体重的薤白提取物和二甲双胍能显著减少具有代谢综合征模型小鼠腹部脂肪的堆积。

表1、正常小鼠和代谢综合征模型小鼠分别给药四周后总卡路里摄取、体重以及脏器系数的变化(n＝10)

注：数据均表示为MEAN±SD，统计采用单因素分析的方法(ANOVA)，P<0.05视为具有显著统计学意义。模型对照(HFD)与正常对照组比较，^aP<0.05，^aaP<0.01；各给药组间与模型对照(HFD)比较，^bP<0.05，^bbP<0.01。HFD组为高脂喂养(代谢综合征模型)对照组，xB-200组为薤白提取物剂量100mg/kg体重的给药组，xB-100组为薤白提取物剂量100mg/kg体重的给药组，Met-200组为阳性药二甲双胍剂量200mg/kg体重的对照组。

2、正常小鼠和代谢综合征模型小鼠分别给药四周后血生化指标的变化

血糖、血甘油三酯、血总胆固醇、血低密度脂蛋白、高密度脂蛋白检测购自北京北控中生生物工程公司的试剂盒进行检测，主要使用酶反应显色的方法(具体操作按照试剂盒说明书进行)于酶标仪(GENios，瑞士TECAN)上检测。胰岛素检测主要采用双抗体夹心ABC-ELISA的方法于酶标仪上进行检测。

小鼠给药四周后血生化指标的变化见表2。由表2可知，给药前，各给药组与模型对照血糖血脂没有明显的区别，但均显著高于正常对照(血清甘油三酯除外)。给药后，HFD模型对照组空腹血糖显著高于正常对照组的，而XB-200组、XB-100组、Met-200组的空腹血糖均显著低于HFD组，说明薤白提取物和二甲双胍均有降低代谢综合征模型小鼠血糖的作用，且两者的降糖作用无明显差别。给药前，各组的血清甘油三脂无显著性差异，给药后，XB-200组、XB-100组、Met-200组的血清甘油三脂显著性低于HFD组，说明薤白提取物和二甲双胍均有降低代谢综合征模型小鼠甘油三脂的作用。给药后，HFD模型对照组的总胆固醇显著高于正常对照组，而XB-200组、XB-100组的总胆固醇均显著低于HFD组，Met-200组的总胆固醇与HFD组无显著性差异，说明薤白提取物有明显的降低代谢综合征模型小鼠胆固醇的作用，而二甲双胍降胆固醇的作用并不显著。给药后，正常对照组的血清胰岛素含量显著低于HFD组，而XB-200组、XB-100组、Met-200组的血清胰岛素含量均显著低于HFD组，说明薤白提取物和二甲双胍均有降低代谢综合征模型小鼠血清胰岛素的作用，但薤白提取物降血清胰岛素的作用优于二甲双胍。综上所述，剂量200mg/kg薤白提取物具有显著减少腹部脂肪的堆积，降低血糖，降低血脂，改善胰岛素敏感性的作用。与阳性药二甲双胍比较，降糖作用没有明显差别，但降脂作用明显优于二甲双胍。

表2、正常小鼠和代谢综合征模型小鼠分别给药四周后血生化指标的变化(n＝10)

3、口服糖耐量实验

糖耐量测定具体操作如下：小鼠给药两周后，为防止药液抗氧化物质对血糖测定的干扰，测定前12h内不要给药。小鼠空腹6h，用10％乌拉坦麻醉，口服2.5g/kg体重的葡萄糖，开始计时，于时间点0，0.5，1，2h于尾静脉取血检测血糖，血糖用试剂盒(北京北控中生生物工程公司)检测。将得到的血糖值与时间点描绘动态变化曲线(见图6)，计算曲线下面积(见图7)。将各组的曲线下面积进行数据统计处理(^aP<0.05，^aaP<0.01，实验各组与正常对照组进行统计学分析；^bP<0.05，^bbP<0.01，实验各组与HFD模型对照组进行统计学分析)。

由图5可知，高脂食物饲喂的小鼠与正常对照比较出现显著的糖耐量异常，XB给予2周后显著抑制模型对照组的血糖升高。由图7可知，HFD组与正常对照组相比具有非常显著的差异(^aaP<0.01)；XB-200组、Met-200组与HFD组相比具有非常显著的差异(^bbP<0.01)，XB-100组与HFD组相比具有非常显著的差异(^bP<0.05)。XB给予2周后，能显著降低血糖曲线下面积，表明给予XB后可改善糖耐量异常。

4、脂肪总脂酶活性测定：

用经液氮瞬时冷冻后放置—80℃冰箱备用的小鼠腹部脂肪进行总脂酶活性的测定。用浊度比色的方法按脂肪总脂酶试剂盒(南京建成生物工程有限公司)说明书进行操作。取50mg左右的脂肪，用2ml左右的生理盐水匀浆，低温离心，3000rpm×10min。于24孔板上，加入匀浆液上清10μl，加入试剂四10μl，加入1ml的预温的底物缓冲液，迅速置多功能酶标仪上震摇5秒钟，静止5秒钟，于420nm处比色，记录吸光度值A1，37℃温孵10分钟，再次记录吸光度值A2。记录标准管浓度(454μmol/l)的吸光度值。取10μl上清用BCA试剂测试蛋白浓度。组织脂肪酶单位定义为：在37℃条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1分钟，每消耗1μmol/l底物为一个酶活力单位。

图8为各组小鼠腹部脂肪组织总脂酶活性的柱状图(n＝10)。将各组的组织总脂酶活性进行统计学处理(^aP<0.05，^aaP<0.01，实验各组与正常对照组进行统计学分析；^bP<0.05，^bbP<0.01，实验各组与模型对照组(HFD)进行统计学分析)，可知，HFD组与正常对照组相比具有显著的差异(^aP<0.05)；XB-200组、Met-200组与HFD组相比具有显著的差异(^bP<0.05)。说明HFD模型对照组显著降低了总脂酶的活性，而给XB后，可明显增加总脂酶活性。

5、腹部RBP4，Visfatin和骨骼肌Sirt1，pAMPK，AMPKα1蛋白表达：

分别取正常对照组、HFD组、XB-200组、XB-100组和Met-200组的腹部脂肪组织和骨骼肌组织，每种组织各称取100mg，分别用1ml的PBS缓冲液进行组织匀浆，匀浆后于10000rpm离心30秒，取中间上清液(避免吸入上层脂肪层)，得到腹部脂肪组织总蛋白和骨骼肌组织总蛋白。然后用BCA法进行蛋白定量(BCA试剂购自PIERCE公司(Rockford，Illinois，USA))。蛋白定量在1mg/ml左右，取50ul上样进行10％SDS-PAGE电泳。采用Western Blot法检测Visfatin、RBP4蛋白的表达和Sirt1，pAMPK，AMPKα 1蛋白的表达。Western Blot按照常规方法进行，检测Visfatin蛋白的表达时，一抗使用Visfatin一抗(兔抗鼠来源，Phoenix Biotech，USA)，以β-actin(兔抗鼠肌动蛋白，武汉博士德生物工程有限公司)作为内参；检测RBP4蛋白的表达时，一抗使用RBP4一抗(兔抗鼠来源，武汉三鹰生物技术有限公司)，以β-actin(兔抗鼠肌动蛋白，武汉博士德生物工程有限公司)作为内参；检测Sirt1蛋白的表达时，一抗使用Sirt1抗体(兔抗鼠来源，碧云天生物技术研究所，产品编号AS391)，以β-actin(兔抗鼠肌动蛋白，武汉博士德生物工程有限公司)作为内参；检测p-AMPK蛋白的表达时，一抗使用p-AMPK抗体(兔抗鼠来源，Cell Signaling Technology)；检测AMPKα1蛋白的表达时，一抗使用AMPKα1抗体(兔抗鼠来源，Cell Signaling Technology)；上述二抗均使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

图9为各组测定的小鼠腹部脂肪中Visfatin蛋白和RBP4蛋白表达。图10为与内参灰度值较正的比较。由图可知，HFD模型对照组显著增加Visfatin的表达RBP4。而给予XB后显著促进Visfatin蛋白的表达，但显著抑制RBP4的表达。这些蛋白是新近发现的与糖代谢和胰岛素敏感性有关的蛋白，提示XB改善血糖和胰岛素敏感性也许与此有关。

图11、13分别为各组测定的小鼠腹部脂肪中AMPK蛋白和Sirt1蛋白表达。磷酸化AMPK(p-AMPK)为AMPK的一种活化形式，AMPKα1为AMPK一亚型，p-AMPK占AMPK比例越高，活性越强。图12、14结果表明，XB组可显著增加p-AMPK和Sirt1蛋白的表达。p-AMPK和Sirt1蛋白为骨骼肌能量代谢的关键蛋白，提示可能与增加骨骼肌能量代谢有关。

综合上述实验结果，高脂饲喂的C57BL/6小鼠出现了腹部脂肪增加、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症，基本符合代谢综和征的特征。剂量200mg/kg薤白提取物能显著减少腹部脂肪的堆积，降低血糖，降低血脂，改善胰岛素敏感性的作用。与阳性药二甲双胍比较，降糖作用没有明显差别，但降脂作用明显优于二甲双胍。结果还显示薤白提取物可促进AMPK活化蛋白和Sirt1蛋白的表达，推测可加强骨骼肌的能量代谢，促进脂质氧化，从而发挥降脂和改善胰岛素敏感性的作用。该实验结果还表明可通过腹部脂肪细胞促进visfatin的表达和抑制RBP4的表达发挥降糖和改善胰岛素的效应。同时还可促进腹部脂肪总脂酶的活性，促进脂肪溶解，减少脂肪堆积。因此薤白提取物在预防高营养食物所诱导的代谢综合征方面具有多效性的特点，其作用中心环节推测可能主要与其能促进骨骼肌能量代谢有关。薤白是一味常用中药，安全性较高，预实验显示薤白提取物LD50>5.0g/kg，因此推测较为安全，适合长期服用。薤白提取物质量可控，安全有效，提示其具有较为广阔的临床应用开发前景。

Claims (10)

1、一种薤白提取物的制备方法，包括步骤1)：将小根蒜或薤的鳞茎用体积百分含量为45-55％的乙醇水溶液浸泡、提取，收集提取液，得到薤白提取物。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述体积百分含量为45-55％的乙醇水溶液与所述小根蒜或薤的鳞茎的配比为5ml：1g-15ml：1g。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述提取为回流提取，所述回流提取的温度为55-85℃；所述回流提取中，至少提取两次，每次提取的时间为1-3小时。

4、根据权利要求1-3中所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤2)：将收集得到的提取液浓缩至原提取液体积的1/2-1/5倍，得到浓缩液。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括以下纯化的步骤3)：将所述浓缩液上大孔吸附树脂柱，先用2-6倍浓缩液体积的去离子水洗柱，再用2-6倍浓缩液体积的体积百分含量为45-55％的乙醇水溶液洗柱，收集乙醇水溶液洗柱的洗脱液，得到纯化的薤白提取物。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将得到的纯化的薤白提取物进行浓缩并干燥的步骤。

7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂柱为D101型大孔吸附树脂柱。

8、按照权利要求1-7中任一所述方法制备的薤白提取物。

9、权利要求8所述的薤白提取物在制备下述药物中的应用：

1)预防和/或治疗代谢综合征的药物；

2)预防2型糖尿病的药物。

10、一种预防和/或治疗下述疾病的药物，其活性成分为权利要求7所述的薤白提取物；所述疾病为代谢综合症或2型糖尿病。

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