CN1289678C - 高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产方法及其新用途。提供了利用提取纯化的基因工程技术表达的人溶菌酶的溶菌活性，用于临床上细菌和真菌的感染，特别是耐药性细菌感染的治疗方法，以及革兰阴性菌感染治疗后内毒素引发的后遗症的治疗方法。提供了用于各种治疗用途的抗生素和人溶菌酶的药用组合物。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基因重组人溶菌酶的方法及用途，特别是涉及一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途，属于生物工程技术领域。
背景技术：
溶菌酶是由Fleming在1922年发现的(Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.1922)。它是一种有效的抗菌剂，全称为：1，4-β-N-溶菌酶或者称：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。溶菌酶广泛存在于自然界动物、植物和微生物中。目前，人们主要从鸡蛋清来制取溶菌酶。然而，鸡溶菌酶作为异种蛋白可引起变态反应而无法用于人类，天然人溶菌酶的价格过于昂贵也无法用于临床。我们利用酵母系统表达人溶菌酶，该方法已申请专利(专利申请号：00110463.2)，同时具有天然人溶菌酶的杀菌活性。1928年，弗莱明发明了第一个抗生素--青霉素，开创了人类医学史上的一个重大的里程碑。抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。但21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。如耐青霉素的肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎“刀枪不入”。肺炎克雷伯氏菌对西力欣、复达欣等16种高档抗生素的耐药性高达51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)除万古霉素外已经无药可治。从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的产生速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。
溶菌酶除可以直接裂解细菌，还可以作为免疫调节剂调节中性粒细胞的作用，保护炎症部位的正常组织，在调节炎症反应中起负反馈作用(Leo IG，etal.J.Clin.Invist.1979；64：222)。它可能通过与多形核粒细胞膜表面的多糖部分结合，抑制多形核粒细胞向炎症部位移动，并可衰减炎症部位由多形核粒细胞所产生的超氧化物的作用，保护机体在炎症反应时由于免疫应答过度而发生的组织损伤。也有报道说在单核细胞的培养液中加入高浓度溶菌酶，可提高单核细胞吞噬结核杆菌的能力(Kokoshis PL，et al.S cience.1978：199：1340)。溶菌酶还可与其他生物活性蛋白共同作用，充分发挥抗菌作用，如补体、乳转铁蛋白等。梁爱华等研究溶菌酶对头孢他啶诱导的细菌内毒素(LPS)释放抑制作用时，发现溶菌酶能抑制头孢他啶诱导的细菌内毒素释放。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途。利用现已公知的溶菌酶的直接裂解细菌作用、保护炎症部位的正常组织作用、提高单核细胞吞噬结核杆菌的能力、抑制细菌内毒素释放作用并发现了杀灭真菌的活性用于人类医用药物的生产，将基因工程表达的人溶菌酶用于人类的细菌、真菌感染，特别是耐药菌、结核杆菌的感染以及细菌感染以后引起的后遗症的治疗。在此基础上，建立新的提取纯化的方法，产物纯度高达99.8％以上，且成本低，生产量大，可实现工业化生产。
本发明的技术方案是：其生产高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的材料：基因工程人溶菌酶的表达系统特征是采用甲醇营养型酵母菌作为宿主菌“毕赤酵母菌属的菌株”。在甲醇利用的表型上既采用甲醇利用快速型(mut+)，也使用甲醇利用慢速型(muts或must-)。主要采用毕赤酵母的smd1165(his4.prb1)，smdll63(his.pep4.prb1)，Gs115、km71菌株。本发明基因工程人溶菌酶的质粒主要是以pPIC9k系列的质粒整合上述菌株染色体上。
步骤；1、摇瓶种子制备：以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸镁)1-5克，K2SO4(硫酸钾)2-6克，KOH(氢氧化钾)1-3克，CaSO42H2O(硫酸钙)1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。2、种子罐培养：以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)25-19毫升，MgSO4(硫酸镁)13-17克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.4-0.8克，K2SO4(硫酸钾)16-20克，KOH(氢氧化钾)2.12-6.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0-8.0；溶解氧浓度为10-60％，当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。3、生产罐培养：以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)93-97毫升，MgSO4(硫酸镁)51-55克，CaSO42H2O(硫酸钙)19-23克，K25O4(硫酸钾)61-65克，KOH(氢氧化钾)13-17克加蒸馏水至7升，高压灭菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。
纯化工艺：将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50万截流分子量膜超滤，收集滤液；用5000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过G-50柱除盐，冰冻干燥，测定蛋白量和溶菌酶活性。
本发明的积极效果在于提供一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及将基因工程表达的人溶菌酶用于人类的细菌、真菌感染，特别是耐药菌、结核杆菌的感染以及细菌感染以后引起的后遗症的治疗的新用途。其纯度可达到99.8％。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1：基因工程表达的人溶菌酶的生产方法；
材料：基因工程人溶菌酶的表达系统特征是采用甲醇营养型酵母菌作为宿主菌“毕赤酵母菌属的菌株”。在甲醇利用的表型上既采用甲醇利用快速型(mut+)，也使用甲醇利用慢速型(muts或mut-)。主要采用毕赤酵母的smd1165(his4.prb1)，smd1163(his.pep4.prb1)，Gs115、km71菌株。本发明基因工程人溶菌酶的质粒主要是以pPIC9k系列的质粒整合上述菌株染色体上。
步骤：1、摇瓶种子制备：以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)6毫升、MgSO4(硫酸镁)3克，K2SO4(硫酸钾)4克，KOH(氢氧化钾)1克，CaSO42H2O(硫酸钙)1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。2、种子罐培养：以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)27毫升，MgSO4(硫酸镁)15克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.6克，K2SO4(硫酸钾)18克KOH(氢氧化钾)4.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子。发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0-8.0。溶解氧浓度为10-60％。当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。3、生产罐培养：以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)95毫升，MgSO4(硫酸镁)53克，CaSO42H2O(硫酸钙)21克，K2SO4(硫酸钾)63克，KOH(氢氧化钾)15克加蒸馏水至7升，高压来菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数为温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％。当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。
纯化工艺：将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50万截流分子量膜超滤，收集滤液；用5000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过G-50柱除盐，冰冻干燥，测定蛋白量和溶菌酶活性。如图1、2、3最终纯化的纯度为99.51％。
实施例2：人溶菌酶溶菌活性的鉴定(试管法)
材料
1、缓冲液 pH7.210mMTris-Cl缓冲液
2、菌株 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌
3、10％SDS
4、LB培养基
方法：
实施例3：人溶菌酶对耐药性细菌的杀菌作用，如图6、7以鲍镘杆菌和金黄色葡萄球菌为例。
耐药菌株：30株不同耐药的细菌来自于西安西京医院检验科方法：
用pH7.210mM Tris-Cl缓冲液配制1％的琼脂糖
高压灭菌后，冷却至40℃，加入细菌至106倾倒平板
↓
用打孔器在平板上打孔
↓
在孔中加入不同浓度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)
↓
37℃孵箱孵育4-6小时
↓
LB营养琼脂高压灭菌后，冷却至40℃，覆盖于上述琼脂糖平板上
↓
将该平板至于紫外灯下照射20分钟
(LB营养琼脂覆盖于含菌的琼脂糖平板过程中，琼脂糖表面的游离细菌会混入营养琼脂中，其中冲到营养琼脂表面的细菌，由于氧气的作用，生长速度非常快，形成菌膜，影响琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况的观察，故用紫外灯照射杀死营养琼脂表面的细菌)
↓
37℃孵箱培养过夜
↓
观察琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况，测量不同浓度溶菌酶形成的抑菌圈的直径，加样孔直径4mm者为最低有效杀菌浓度。(对于有鞭毛，运动活跃的细菌，会影响抑菌圈的形成，可考虑加入0.01％石炭酸抑制其运动。)
实施例4：人溶菌酶对真菌的杀菌作用
材料：
1、菌株：临床分离株3株，分别为白色念珠菌2株和热带念珠菌1株。菌株来自于第四军医大学西京医院检验科。
2、缓冲液：PH7.2 10mMTrix-CL缓冲液。
3、10％SDS(缓冲液)
4、LB培养基。
方法：用pH7.210mM Tris-Cl缓冲液配制1％的琼脂糖
高压灭菌后，冷却至40℃，加入细菌至106倾倒平板
↓
用打孔器在平板上打孔
↓
在孔中加入不同浓度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)
↓
37℃孵箱孵育4-6小时
↓
LB营养琼脂高压灭菌后，冷却至40℃，覆盖于上述琼脂糖平板上
↓
将该平板至于紫外灯下照射20分钟
(LB营养琼脂覆盖于含菌的琼脂糖平板过程中，琼脂糖表面的游离细菌会混入营养琼脂中，其中冲到营养琼脂表面的细菌，由于氧气的作用，生长速度非常快，形成菌膜，影响琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况的观察，故用紫外灯照射杀死营养琼脂表面的细菌)
↓
37℃孵箱培养过夜
↓
观察琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况，测量不同浓度溶菌酶形成的抑菌圈的直径，加样孔直径4mm者为最低有效杀菌浓度。(对于有鞭毛，运动活跃的细菌，会影响抑菌圈的形成，可考虑加入0.01％石炭酸抑制其运动。)
结果：
基因工程表达的人溶菌酶对本发明用的3例临床分离念珠菌均有明显抑菌效果。如图9中加入人溶菌酶对真菌的杀菌效果要比图8对照的图要明显。
实施例5：人溶菌酶对病毒的杀菌作用
材料：DHK细胞
方法： 培养DHK细胞
加入人溶菌酶
↓
加入病毒(疱疹病毒)
↓
观察DHK细胞病变
实施例6：人溶菌酶对细胞的保护作用(对结核病的治疗和肿瘤的放疗、化疗的治疗)
材料：DHK细胞
方法：培养DHK细胞
Claims (8)
1、一种基因重组人溶菌酶的生产方法，其特征在于：基因工程人溶菌酶的提取纯化工艺：将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50万截流分子量膜超滤，收集滤液；用5000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过G-50柱除盐，冰冻干燥，测定蛋白量和溶菌酶活性；生产步骤如下：1、摇床种子制备：以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)6毫升、MgSO4(硫酸镁)3克，K2SO4(硫酸钾)4克，KOH(氢氧化钾)1克，CaSO42H2O(硫酸钙)1.5克等成份，加蒸馏水至200毫升，高压来菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时；2、种子罐培养：以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)27毫升，MgSO4(硫酸镁)15克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.6克，K2SO4(硫酸钾)18克KOH(氢氧化钾)4.12克，加蒸馏水至500毫升，高压来菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0-8.0。溶解氧浓度为10-60％；当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束；3、生产罐培养：以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)95毫升，MgSO4(硫酸镁)53克，CaSO42H2O(硫酸钙)21克，K2SO4(硫酸钾)63克，KOH(氢氧化钾)15克加蒸馏水至7升，高压来菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数为温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。
2、根据权利要求1所述的生产方法生产的基因重组人溶菌酶，其特征在于所述的人溶菌酶用于制备杀死细菌、真菌、耐药菌的药物。
3、根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的人溶菌酶用于制备杀死细菌包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、厌氧菌和结核杆菌的药物。
4、根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的人溶菌酶用于临床上可以协同一种有效剂量的抗生素治疗细菌感染和细菌感染后由内毒素引起的后遗症的药用组合物。
5、根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药用组合物可以含有一种药用可接受的稀释剂、佐剂和载体。
6、根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药用组合物中的抗生素可选自青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类和头胞菌素类。
7、根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的人溶菌酶用于制备真菌感染的药用组合物。
8、根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的人溶菌酶用于制备耐药菌的药用组合物。
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| CN 02109840 CN1289678C (zh) | 2002-06-13 | 2002-06-13 | 高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途 |
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