CN111729076B

CN111729076B - 重组人溶菌酶的应用

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Publication number: CN111729076B
Application number: CN202010669063.1A
Authority: CN
Inventors: 张华�; 熊进; 李亚男; 李脉; 陈达凯; 李月俏; 陈禹兴; 杨创钦; 陈聪伟; 邓远倪; 连培荣; 龙志东; 黄金锐; 黄嘉麒; 郭秋霞; 梁玲娜; 柏松; 李福生; 吕秋军; 梁佳潮
Original assignee: Guangzhou Qilong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Qilong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2040-07-13
Also published as: CN111729076A

Abstract

本申请属于医疗技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的应用。本申请提供了重组人溶菌酶在制备治疗或预防胃疾病的药物中的应用。本申请发现了重组人溶菌酶在制备治疗或预防由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡或由幽门螺旋杆菌感染引起的胃癌的药物中的应用；本申请提供了重组人溶菌酶在制备修复胃疾病的创面的药物中的应用。本申请发现了重组人溶菌酶在制备修复由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎创面、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡创面或手术引起的胃部创面的药物中的应用。本申请公开了重组人溶菌酶能不引起耐药性地治疗胃疾病，能有效解决现有抗生素治疗幽门螺旋杆菌引起胃疾病过程中容易引起抗生素耐药性的技术缺陷。

Description

重组人溶菌酶的应用

技术领域

本申请属于医疗技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，下文简称Hp)于1983年由澳大利亚病理学家从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜中首次分离。胃液pH值为1.3.～1.5的酸性液体，饭后胃液被稀释，其pH值可上升至3.5，绝大部分细菌都无法生存，而幽门螺旋杆菌是目前所知能够在人类胃里生存的唯一微生物种类。据调查，Hp在全世界范围感染率超过50％，我国平均的感染率为55％。目前大量研究已证实Hp与慢性胃炎、胃溃疡、胃癌的发生、发展有密切关系，是极其重要的始动因素1994年世界卫生组织国际癌症研究机构正式将其列为I类致癌物。在我们国家，每年大约有16万人死于胃癌，并有逐年增加的趋势。胃癌也是全球最常见的恶性肿瘤之一，在癌症死亡原因中位列第二。

因此，及早诊断并根除Hp就显得十分重要。目前临床上以两种抗生素加质子泵抑制剂为治疗Hp感染的首选药物，但是其首治根除率只有约70％，补救疗法的失败率也有9％～10％，这一方面是因为患者对药物的依从性不好，药物副作用比较大，最担心的方面是因为Hp越来越严重的抗生素耐药性，大量的抗生素临床无效。因此，研究新的抗Hp药物已成为一项重要的研究课题。

综上所述，研究开发出不耐药、无毒无副作用，治疗幽门螺旋杆菌引起胃疾病的新药品是是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本申请公开了重组人溶菌酶的新应用，公开了重组人溶菌酶能不引起耐药性地治疗胃疾病，能有效解决现有抗生素治疗幽门螺旋杆菌引起胃疾病过程中容易引起抗生素耐药性的技术缺陷。

本申请第一方面提供了重组人溶菌酶在制备治疗或预防胃疾病的药物中的应用。

作为优选，所述胃疾病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡或由幽门螺旋杆菌感染引起的胃癌。

其中，由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎为幽门螺旋杆菌相关性胃炎，由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡为幽门螺旋杆菌相关性胃溃疡，由幽门螺旋杆菌感染引起的胃癌为幽门螺旋杆菌相关性胃癌。

作为优选，本申请重组人溶菌酶在制备在pH值在1.2～2环境中治疗或预防胃疾病的药物中的应用。

作为优选，所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3。

作为优选，所述胃疾病包括胃炎、胃溃疡或胃癌。

作为优选，所述重组人溶菌酶的使用量为10000～～30000U/ml/d。

其中，所述重组人溶菌酶在pH值在1.2～2环境中具有治疗幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡或由幽门螺旋杆菌感染引起的胃癌的活性。

作为优选，所述药物选自胃溶片剂、胃溶胶囊和口服液中的一种或多种。

作为优选，所述胃溶片剂包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料。

具体的，所述胃溶片剂中药学上可接受的辅料选自酵母粉、微晶纤维素、预胶化淀粉(或ST1500)、羧甲淀粉钠、硬脂酸镁和色素中一种或多种。

作为优选，所述胃溶胶囊包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料。

具体的，所述胃溶胶囊中药学上可接受的辅料选自酵母粉、微晶纤维素、预胶化淀粉(或ST1500)和羧甲淀粉钠中一种或多种。

作为优选，所述口服液包括重组人溶菌酶、水和药学上可接受的辅料。

具体的，所述口服液中药学上可接受的辅料选自甘油、聚乙二醇和吐温80中一种或多种。

本申请第二方面提供了重组人溶菌酶在制备修复胃疾病的创面的药物中的应用。

作为优选，所述胃疾病的创面包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎创面、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡创面或手术引起的胃部创面。

需要说明的是，本申请人溶菌酶可以为从人体中提取的人溶菌酶，也可以为重组人溶菌酶，从人体中提取的人溶菌酶和重组人溶菌酶为含有130个氨基酸，分子量约为14700Da，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.1：

KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；

本申请重组人溶菌酶也可以为多四个氨基酸的重组人溶菌酶，多四个氨基酸的重组人溶菌酶有134氨基酸，分子量约为15,100Da，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.2：

EAEAKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；

本申请重组人溶菌酶也可以为多六个氨基酸的重组人溶菌酶，多六个氨基酸的重组人溶菌酶有136氨基酸，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.3：

EAEAEAKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV。

其中，上述多四个氨基酸的重组人溶菌酶与多六个氨基酸的重组人溶菌酶的效果与重组人溶菌酶的效果相当，多四个氨基酸的重组人溶菌酶与多六个氨基酸的重组人溶菌酶的纯度和活性比重组人溶菌酶更高。

需要说明的是，经军事医学科学院采用小鼠、猕猴为实验动物模型进行毒性、药代动力学试验研究表明，本申请的重组人溶菌酶药品无毒、安全，无副作用。重组人溶菌酶没有过敏反应，无毒副作用，重复使用也不会产生耐药性。重组人溶菌酶是人源性蛋白质药物，优于原有的抗生素。本申请的重组人溶菌酶填补抗耐药菌药品领域空白，是抗生素领域药品的一场革命。

重组人溶菌酶(Recombinant human lysozyme)是采用基因重组，生物工程发酵方法生产出来的药品。重组人溶菌酶是本公司自行研制，独立开发，具有自主知识产权的产品。经过实验重组人溶菌酶具有杀菌(包括耐药菌)、抗炎症、抗病毒和镇痛作用。重组人溶菌酶是人源性蛋白，对人没有过敏反应，无毒副作用，可以大剂量使用，重复使用也不会产生耐药性。开发药品的三大要素，安全、有效和质量可控，安全尤为重要。重组人溶菌酶是人源性蛋白，无毒无副作用，安全有效，是治疗由幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠疾病的新选择。

重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20－35℃，在恒温箱上培养36－48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将重组人溶菌酶发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行蛋白含量、纯度、活性检测保存。将合格的重组人溶菌酶制得10000U/ml，30000U/ml，50000U/ml备用。

本申请公开的胃溶片剂，包括酵母粉5重量份、微晶纤维素4重量份、预胶化淀粉(或ST1500)0.5重量份、羧甲淀粉钠0.4重量份、硬脂酸镁0.1重量份，色素适量，加入每片含人溶菌酶5000U～3万U/mL直接压片。

本申请公开的胃溶胶囊剂，包括酵母粉5重量份、微晶纤维素4重量份、预胶化淀粉(或ST1500)1重量份，加入每粒含人溶菌酶5000U～3万U/mL制作成胶囊。

本申请公开的口服液，包括甘油1重量份、聚乙二醇0.5重量份、吐温80用0.02重量份，水9重量份，加入每毫升含人溶菌酶1000U～3万U/mL制作成口服液。

本申请公开了重组人溶菌酶的新应用，第一方面，本申请发现重组人溶菌酶能在低pH环境(胃液环境)有效预防或治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡或胃癌疾病；第二方面，本申请发现重组人溶菌酶能在低pH环境有效预防或治疗其他原因引起的胃炎、胃溃疡或胃癌疾病；第三方面，本申请发现重组人溶菌酶能在低pH环境对由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎创面、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡创面或手术引起的胃部创面，或其他原因导致的胃炎创面、胃溃疡创面具有良好的修复作用，同时，重组人溶菌酶是人源性蛋白，对人没有过敏反应，无毒副作用，可以大剂量使用，重复使用也不会产生耐药性，安全有效，是治疗和预防由幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠疾病的新选择。

具体实施方式

本申请提供了重组人溶菌酶的新应用，用于解决现有抗生素治疗幽门螺旋杆菌引起胃疾病过程中容易引起抗生素耐药性的技术缺陷。

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。

本申请实施例1的重组人溶菌酶：批号20190616，蛋白纯度98.6％，活性单位为10万单位/ml，由广州奇龙生物科技有限公司提供；重组人溶菌酶含有130个氨基酸，分子量约为14700Da，氨基酸序列为：

本申请实施例1的重组人溶菌酶可以通过发酵工程获得，方法为：以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20－35℃，在恒温箱上培养36－48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将重组人溶菌酶发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行蛋白含量、纯度、活性检测保存。

本申请实施例1的幽门螺旋杆菌(H.pylori，下文简称Hp，SS1)的菌株由广东省微生物检测中心馈送。

本申请实施例1的丽珠维三联组，购自丽珠集团丽珠制药厂。脲酶试剂，购自上海信裕生物科技有限公司。Giemsa染液，购于厦门鹭隆生物科技发展有限公司；血琼脂平板购自郑州安图生物工程有限公司。比浊仪和氧化酶试剂购自法国梅里埃生物公司；Hp抗原检测试剂(胶体金法)购自上海凯创生物技术有限公司。脲酶试剂购自上海信裕生物科技有限公司。Hp培养采用美国生产的Gene Science Anaero Mark厌氧/低氧/二氧化碳多组分培养系统及培养罐；超低温保存箱(德国贝尔)。

本申请实施例1的H.pylori菌液制备方法为：H.pylori(SS1)菌株接种在含7.5％～10％无菌脱纤羊血、0.2％葡萄糖和1％抗菌素液(含甲氧苄啶50mg，万古霉素100mg，多粘霉素B 3.8g)的脑心浸培养基上，37℃、微需氧条件下(5％O₂、10％CO₂、85％N₂)培养72h；取菌液涂片，经革兰染色，在油镜下观察菌体形态。留取菌体弯曲明显的菌液，采用含10％蔗糖和50％小牛血清的保存液，将细菌浓度调整至2.5×10⁹菌落形成单(CFU)/ml后，置-70℃贮存备用，制得H.pylori(SS1)菌株菌液。

本申请实施例1的由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎的动物模型制备方法为：雄性昆明小鼠90只，6～8周龄，体重18～20g。购自广东省实验动物中心。在本科技园实验动物室清洁级饲养，室温(23±2)℃，相对湿度为(55±5)％，每天光照黑暗交替各12h。自由进食、饮水。然后，小鼠适应性饲养1d，禁食禁水12h后经口灌胃给予乙醇0.2ml，2h后恢复饮食饮水。将预处理过的小鼠禁食12h，经口灌胃给予上述H.pylori(SS1)菌株菌液0.5ml/只(浓度为1×10¹²CFU/L)，每间隔12h重复一次，共3次。距末次灌胃2h后恢复饮食饮水。6周后随机处死5只小鼠，取胃窦部组织进行尿素酶、细菌学涂片检查和组织学检查以确定是否成功感染Hp。

本申请实施例1的动物模型的Hp鉴定：

菌落观察：81.18％的Hp培养至第3天可观察到有针尖样大小细菌生长，少部分于第3天后才开始生长，6.93％的Hp于第7天才开始生长。Hp在血琼脂平板、巧克力平板、哥伦比亚血琼脂平板上生长良好，初期为针尖样大小菌落，继续培养，可见无色或灰色、光滑，半透明细小菌落生长，大部分Hp培养至第4天或第5天，继续培养，菌落大小不再明显变化，继续培养至第9～10天，大部分标本可出现β溶血环；

显微镜下观察：选取培养至第4天的可疑菌落培养皿，在生物安全柜中挑取少量细菌涂于载玻片上,并在火焰上固定，水洗，革兰染色观察；

生化试验：脲酶试验：强阳性；氧化酶试验：阳性；过氧化氢酶试验：阳性；

抗原检测：取疑似Hp的菌落用生理盐水制备细菌悬液，吸取150uL悬液加入Hp抗原检测(胶体金法)的测试板中，按试剂说明书放置15min后观察结果。当细菌悬液浊度大于0.1麦氏标准单位，即可为阳性。

本申请实施例2-3的重组人溶菌酶：批号20190319，纯度99.50％，活性单位30000U/ml，由广州奇龙生物科技有限公司提供；甲氰咪胍胶囊(重庆科瑞制药有限责任公司，批号：20180608)；无水乙醇，500ml/瓶，国药集团化学试剂有限公司生产(批号：KJ20180509)。

本申请实施例2-3的采用的动物为昆明种小鼠、Wistar系大鼠一级动物，由广东省动物实验研究中心提供。

本申请实施例2-3的采用的仪器为生物解剖镜(重庆光学仪器厂)；pH测定仪(上海雷磁仪器厂)。

本申请实施例4的重组人溶菌酶：批号20190319，纯度99.50％，活性单位30000U/ml，由广州奇龙生物科技有限公司提供；多四个氨基酸的重组人溶菌酶，批号20180517，纯度99.30％，活性单位30000U/ml，由广州奇龙生物科技有限公司提供；蛋清溶菌酶，上海易恩化学技术有限公司，纯度98.50％，活性30000U/mg，批号201809-88-3。

本申请实施例5的重组人溶菌酶：批号20190616，纯度98.6％，活性单位100000U/ml，由广州奇龙生物科技有限公司提供。

实施例1

本申请实施例提供了重组人溶菌酶对体内幽门螺旋杆菌的药效试验，具体步骤如下：

1、动物分组及药物治疗：

将造模后动物(即上述由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎的动物模型)随机分为4组，每组20只：重组人溶菌酶组(A组)、丽珠维三联组(标准对照)(B组)、模型对照组(空白对照，C组)和正常对照组(空白对照，D组)。重组人溶菌酶原液稀释10倍，重组人溶菌酶组灌胃2ml/只/d(2ml中含重组人溶菌酶2万单位)，分早、晚两次灌入。丽珠维三联组灌胃0.4ml/只/d，每ml灌胃液中含枸橼酸铋钾7.8mg、替硝唑6.5mg及克拉霉素3.25mg分早、晚两次灌入。正常对照组灌等体积蒸馏水。模型对照组灌等体积生理盐水。共进行两周。最后1次灌药后第4周处死动物，取胃窦部组织进行尿素酶、细菌学涂片检查和组织学检查以确定Hp是否存在。

2、实验动物解剖：

1、实验动物胃部Hp感染检查在无菌条件下，取出鼠胃，沿胃大弯剪开，用无菌生理盐水冲洗净残留物后沿纵轴截取胃窦部分，后将胃窦切为3部分，一部分用于涂片镜检：将小鼠胃窦部黏膜面贴于载玻片上进行涂片，革兰染色后镜检；一部分用于组织学检查：胃组织块用4％甲醛固定，组织切片分别作HE染色和Giemsa染色；另一部分用于尿素酶试验(操作及结果判断按说明书进行，显色10min)。3种检测方法中只要有2种为阳性即认定小鼠胃黏膜有Hp感染，只有一种阳性为可疑感染，但不计算在内，3项阴性者诊断为无Hp感染。

2、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎的动物模型的胃组织炎症鉴定方法观察高倍镜下10个视野固有层慢性炎症细胞(淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞)和中性粒细胞浸润情况，并对慢性炎症和炎症活动程度进行计分(慢性炎症：0＝偶见淋巴细胞；1＝固有层有散在的淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞；2＝固有层有较多的淋巴细胞、浆细胞；3＝固有层有大量的淋巴细胞、浆细胞；活动性炎症：0＝固有层偶见中性粒细胞，1＝固有层有散在的中性粒细胞；2固有层有较多的中性粒细胞；3＝固有层有大量的中性粒细胞)。

3、统计学处理：采用SPSS 15.0软件，计数资料行χ²检验，计量资料的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

从造模第2周开始实验鼠均有食欲不振、反应迟钝、皮毛蓬乱等现象，体重下降，从第4周开始精神状态有所好转。实验过程中未见小鼠死亡。建模处死的10只小鼠，尿素酶试验均为阳性；组织学检查Giemsa染色可见所有小鼠的胃窦胃腺腔内均有杆状幽门螺杆菌存在，呈多杆状；细菌学涂片检查有六例阳性，两例阴性。根据前面所述标准，建模方法是成功的，建模感染成功率为100％。

4、药物治疗效果：各组治疗效果见表1。与C组比较，A组和B组均有较好的治疗作用，对Hp的清除率较高(P<0.01)。A组的效果虽然比B组稍差，但二者比较无统计学意义(P﹥0.05)。而C组炎性细胞浸润明显，与A组、B组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1药物治疗后Hp感染情况及胃部炎症分级

注：“-”表示不存在，A与C组比较，差异有统计学意义，P<0.05。

同时，对各组的小鼠进行生物解剖，结果发现，重组人溶菌酶对由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎创面、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡创面具有良好的修复作用。

综上，重组人溶菌酶药品既能调节免疫系统，增强胃粘膜抵御Hp的能力；又具有直接杀灭Hp的能力，还能清除Hp引发的一些致病因素，具有较好的抗Hp能力。另外，重组人溶菌酶药品有很好的抗炎症、镇痛作用，还能改善胃粘膜病损，与C组比较已有很大改善。重组人溶菌酶药品总体抗Hp疗效已接近西医常用的三联疗法，加之其为重组人溶菌酶药品，不存在耐药性、没有副作用及致肠道菌群失调等问题故其应用前景较好，本申请实施例公开重组人溶菌酶填补抗耐药菌药品在治疗由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎领域空白。

实施例2

本申请实施例提供了重组人溶菌酶对应激性胃炎、胃溃疡小鼠的治疗试验，具体步骤如下：

1、选用体重为20g～25g小鼠50只，雌雄各半，随机均分为5组，即阳性对照组(灌服甲氰咪胍胶囊0.1g/kg)、阴性对照组(灌服等体积的蒸馏水)和重组人溶菌酶高、中、低剂量组(分别对应灌服5ml，3万单位/5ml/只；5ml，2万单位/5ml/只；5ml，1万单位/5ml/只)。各组给药1次/d，连续3d。小鼠于末次给药后，禁食但不禁水18h，将小鼠直立固定于23℃的水中，使其剑突与水面齐平。

以造模前一天为第0日，造模当天为第1日。除正常对照组外，其余5组于第0日中午12：00同时开始禁食不禁水至第1日中午12：00，达20h。第1日中午12：00开始，按时间安排依次通过水浸应激开始造模，至下午2：00全部造模结束，期间各组造模前仍禁食不禁水。具体如下：

1)空白(正常)阴性对照组：正常饮水、摄食。

2)禁食对照组：正常饮水，继续禁食至第二天早晨8：00。

3)水浸拘束组：中午12：00开始，将各小鼠置于小鼠固定器中，限制活动，头朝上立于23℃左右的恒温水浴内，水面齐剑突，至第二天早晨8：00。水浸应激20h后，每个试验组处死小鼠5只，打开腹腔，结扎幽门和贲门，取出胃，由腺胃部注入10％甲醛液1ml，再置于10％甲醛液中固定，10min后,沿胃大弯剪开，用生物解剖镜观察胃炎、胃溃疡指数，并根据以下标准评判。

胃炎指数评分标准：1分指胃炎面积为1mm～12mm；2分指胃炎面积为13mm～25mm；3分指胃炎面积为26mm～40mm；4分指胃炎面积为41mm～50mm；5分指胃炎面积≥50mm或穿孔。

胃溃疡指数评分标准：1分指胃溃疡面积为1mm～12mm；2分指胃溃疡面积为13mm～25mm；3分指胃溃疡面积为26mm～40mm；4分指胃溃疡面积为41mm～50mm；5分指胃溃疡面积≥50mm或穿孔性胃溃疡。

每个组剩余的5只小鼠，即阳性对照组(灌服甲氰咪胍胶囊0.1g/kg)、阴性对照组(灌服等体积的蒸馏水)和重组人溶菌酶高、中、低剂量组(分别对应灌服5ml，3万单位/5ml/只；5ml，2万单位/5ml/只；5ml，1万单位/5ml/只)。各组给药1次/d，连续3d。每个试验组小鼠5只全部处死，打开腹腔，结扎幽门和贲门，取出胃，由腺胃部注入10％甲醛液1ml，再置于10％甲醛液中固定，10min后，沿胃大弯剪开，用生物解剖镜观察胃炎、胃溃疡治疗指数，并根据以上标准评判。

表2生物解剖镜观察结果见

注：“-”表示不存在。

表3模型预留动物治疗结果

注：“-”表示不存在。

表2结果表明，重组人溶菌酶高、中、低剂量组对小鼠应激性胃炎、胃溃疡具有显著的治疗作用，并呈剂量依赖关系。重组人溶菌酶低剂量组的治疗效果也高于阳性对照组。同时，生物解剖发现，重组人溶菌酶对胃炎和胃溃疡造成的创面具有良好的修复作用。

实施例3

本申请实施例提供了重组人溶菌酶对乙醇所致大鼠胃炎、胃溃疡的治疗试验，具体步骤如下：；

1、选用体重为180g～240g大鼠50只，雌雄各半，随机均分为5组,即阳性对照组(灌服甲氰咪胍胶囊0.1g/kg)、阴性对照组灌服等体积的生理盐水(1ml/100g体重)和重组人溶菌酶高、中、低剂量组(分别对应灌服5ml，3万单位/5ml/只；5ml，2万单位/5ml/只；5ml，1万单位/5ml/只)。各组给药1次/d，连续3d。以造模前一天为第0日，造模当天为第1日。除正常对照组外，其余5组于第1日早晨7：00同时开始，按时间安排依次开始造模，至上午8：00全部造模结束，具体如下：

1)空白(正常)阴性对照组：正常饮水、摄食。

2)禁食对照组：正常饮水，继续禁食至早晨8：00。

3)乙醇组：每只大鼠灌服无水乙醇1ml，1h后处死大鼠，取胃，并结扎幽门和喷门，向胃内注入生理盐水10ml，然后置于10％甲醛溶液中浸泡10min,沿胃大弯剪开，平铺在玻板上，用生物解剖镜观察胃炎、胃溃疡程度，按上述评分标准评定胃炎、胃溃疡指数，并根据以下标准评分。

胃溃疡指数评分标准:1分指胃溃疡面积为1mm～12mm；2分指胃溃疡面积为13mm～25mm；3分指胃溃疡面积为26mm～40mm；4分指胃溃疡面积为41mm～50mm；5分指胃溃疡面积≥50mm或穿孔性胃溃疡。

每个组剩余的5只小鼠，即阳性对照组(灌服甲氰咪胍胶囊0.1g/kg)、阴性对照组(灌服等体积的蒸馏水)和重组人溶菌酶高、中、低剂量组(分别对应灌服5ml，3万单位/5ml/只；5ml，2万单位/5ml/只；5ml，1万单位/5ml/只)。各组给药1次/d，连续3d。每个试验组小鼠5只全部处死，取胃，并结扎幽门和喷门，向胃内注入生理盐水10ml，然后置于10％甲醛溶液中浸泡10min，沿胃大弯剪开，平铺在玻板上，用生物解剖镜观察胃炎、胃溃疡程度，按上述评分标准评定胃炎、胃溃疡治疗指数，并根据以下标准评判。

表4生物解剖镜观察结果

注：“-”表示不存在。

表5模型预留动物治疗结果

注：“-”表示不存在。

表5结果表明，重组人溶菌酶高、中剂量组对大鼠乙醇性胃炎、胃溃疡具有显著的治疗作用，并呈剂量依赖关系。

实验结果表明，重组人溶菌酶对应激性胃炎、胃溃疡和无水乙醇所致胃炎、胃溃疡具有明显治疗和胃粘膜保护作用，效果是非常显著性的。同时，生物解剖发现，重组人溶菌酶对胃炎和胃溃疡造成的创面具有良好的修复作用。

可见，重组人溶菌酶具有预防和治疗胃炎、胃溃疡的作用；而且，重组人溶菌酶是人源性蛋白，对人没有过敏反应，无毒副作用，可以大剂量使用，重复使用也不会产生耐药性，促进胃细胞生长，促进胃粘膜修复，是治疗胃炎、胃溃疡的新选择。

实施例4

本申请实施例提供了重组人溶菌酶、多四个氨基酸重组人溶菌酶、蛋清溶菌酶至不同pH值下对幽门螺旋杆菌作用的活性试验，具体步骤如下：

1、本申请实施例的H.pylori菌液制备方法为：H.pylori(SS1)菌株接种在含7.5％～10％无菌脱纤羊血、0.2％葡萄糖和1％抗菌素液(含甲氧苄啶50mg，万古霉素100mg，多粘霉素B 3.8g)的脑心浸培养基上，37℃、微需氧条件下(5％O₂、10％CO₂、85％N₂)培养72h；取菌液涂片，经革兰染色，在油镜下观察菌体形态。留取菌体弯曲明显的菌液，采用含10％蔗糖和50％小牛血清的保存液，将细菌浓度调整至2.5×10⁹菌落形成单(CFU)/ml后，置-70℃贮存备用，制得H.pylori(SS1)菌株菌液。

2、检测不同处理组的重组人溶菌酶(重组人溶菌酶、多四个氨基酸的重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶)在不同pH环境对幽门螺旋杆菌的酶活性，方法为：准确量重组人溶菌酶、多四个氨基酸的重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶样品，于适量磷酸盐缓冲液中，配制pH值为1.2，1.3，1.5，2.0的三个不同溶菌酶30000u/ml溶液，各配制5ml备用，然后，于(25±1)℃的室温或恒温水浴锅中，于反应管中加入上述制得的2.5ml H.pylori(SS1)菌株菌液，

设30min、60min、120min、240min四个取样时间点进行取样，每时间点取20ul进行活性检测，每次每个样品重复检测三次重组人溶菌酶的试样与H.pylori(SS1)菌株菌液反应0min时记录450nm处的读数A₁，反应30min时记录450nm处的读数A₂，通过公式换算得出对应的重组人溶菌酶的酶活性，每个重组人溶菌酶样品做两个平行。

结果计算公式为：

其中，I为酶活性；

∣A₁-A₂∣为450nm处每30min的吸光度的变化；

Ew为0.5ml检测用样品中含有原始样品的体积(ml)；

0.001为以每分钟使450nm处吸光度值下降0.001为一个活性单位。

表6重组人溶菌酶、多四个氨基酸重组人溶菌酶、蛋清溶菌酶不同pH值活性

通过本次试验表明，重组人溶菌酶与多四个氨基酸的重组人溶菌酶活性相当，120分钟下降不到1％，四个小时活性降低不超过5％，变化很小。蛋清溶菌酶活性下降很快，在120分钟就下降近30％，240分钟下降近50％。相互比较重组人溶菌酶与蛋清溶菌酶活性差别很大，这可能是两种蛋白结构不同的原因。试验证明作为人源性蛋白重组人溶菌酶优于蛋清溶菌酶，重组人溶菌酶完全适合用于幽门螺旋杆菌疾病的治疗和预防。

实施例5

本申请实施例提供了重组人溶菌酶治疗幽门螺旋杆菌相关性胃溃疡的试验，具体如下：

选自某院胃溃疡合并幽门螺旋杆菌检测阳性患者36例(男18例，女18例)，全部患者年龄为45±10岁。所有患者均经胃镜室电子胃镜检测证实胃炎、胃溃疡，在胃镜检测时于距幽门2～3cm处取位粘膜1块，进检测为幽门螺旋杆菌阳性，近15天未服用抗溃疡和抗生素。所有患者均无胃癌、合并穿孔、出血、幽门梗阻，心肝肾和造血系统重大疾病，所有患者均无胃泌素引起溃疡以及妊娠及哺乳患者。随机分为A组和B组，每组18例，两组的一般资料比较差异具有均衡性。

治疗方案：A组为每人服用重组人溶菌酶每次30000U，一日3次，温水送服；B组为现有常规的抗酸药物奥美拉唑肠溶片一次20mg，一日2次。联合抗生素阿莫西林治疗，一次0.5g，每6小时1次，一日三次，温水送服。治疗程均为10天；治疗期间及治疗结束后，均给予相关的健康指导，进行相关的生活调理，包括饮食、休息、运动和情绪调整等。

疗效判定：显效—临床症状(如腹痛、腹胀、反酸、嗳气、恶心、呕吐、纳差等)以及溃疡面完全或基本消失，局部可有轻度充血，但无明显水肿；有效—临床症状有不同程度的改善，溃疡面缩小50％以上，仍有明显炎症。无效—临床症状无明显改善，溃疡面缩小不足50％。显效+有效＝总有效。停药4周后行¹⁴C呼气试验检测或者复查胃镜，统计幽门螺旋杆菌阳性率；停药6个月后统计胃溃疡复发率。结果如表7所示，A组的显效率和总有效高于B组，有效率和无效率低于B组。

表7

最后进行不良反应比较，A组和B组均未见明显的不良反应发生。

结论，经过对比试验观察，重组人溶菌酶对胃炎、胃溃疡及由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡治疗效果显著，优于抗酸、抗生素组。服用重组人溶菌酶起效时间更快，两组差异性显著；而且，仅服用重组人溶菌酶即可直接治疗胃炎、胃溃疡，无需饭后服用另外的抗酸药物，有效解决现有治疗胃溃疡需要在饭后服用抗酸药物、抗生素导致患者不便的缺陷，避免长时间服用抗生素产生耐药菌的问题。

本申请实施例说明了重组人溶菌酶在pH值为1.2～2的环境中具有由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡或由幽门螺旋杆菌感染引起的胃癌的活性，以及在pH值为1.2～2的环境中具有由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎创面、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡创面或手术引起的胃部创面的活性。因此，本申请实施例提供的重组人溶菌酶可以在pH值在1.3至1.5的胃酸环境下能直接治疗或预防胃疾病，无需服用抗胃酸药物，就可以达到治疗效果，也减少了副作用，解决了现有治疗胃疾病药物对pH值为1.2～2的环境敏感，需要饭后服用，还要服用抗胃酸药物，对人体带来不适的缺陷。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 广东工业大学

<120> 重组人溶菌酶的应用

<130> MP2009874

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly

1 5 10 15

Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala

20 25 30

Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp

50 55 60

Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala

85 90 95

Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp

100 105 110

Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys

115 120 125

Gly Val

130

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

Glu Ala Glu Ala Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu

1 5 10 15

Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp

20 25 30

Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn

35 40 45

Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn

50 55 60

Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala

65 70 75 80

Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala

85 90 95

Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala

100 105 110

Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr

115 120 125

Val Gln Gly Cys Gly Val

130

<210> 3

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 3

Glu Ala Glu Ala Glu Ala Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg

1 5 10 15

Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala

20 25 30

Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala

35 40 45

Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln

50 55 60

Ile Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val

65 70 75 80

Asn Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala

85 90 95

Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile

100 105 110

Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg

115 120 125

Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val

130 135

Claims

1.重组人溶菌酶在制备在pH值为1.2~2的环境中治疗或预防胃疾病的药物中的应用；所述胃疾病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡或由幽门螺旋杆菌感染引起的胃癌；所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3；所述重组人溶菌酶的使用量为10000~30000U/ml/d。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物选自胃溶片剂、胃溶胶囊和口服液中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃溶片剂包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃溶胶囊包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料；所述口服液包括重组人溶菌酶、水和药学上可接受的辅料。

5.重组人溶菌酶在制备在pH值为1.2~2的环境中修复胃疾病的创面的药物中的应用；所述胃疾病的创面包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎创面或由幽门螺旋杆菌感染引起的胃溃疡创面；所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3；所述重组人溶菌酶的使用量为10000~30000U/ml/d。