CN102532340A

CN102532340A - 海参多糖的分离纯化方法及双水相萃取方法在其中的应用

Info

Publication number: CN102532340A
Application number: CN2012100320621A
Authority: CN
Inventors: 常耀光; 宿玮; 薛长湖; 续晓琪; 于龙; 李兆杰; 薛勇; 徐杰; 王玉明; 王静凤
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-02-14
Also published as: CN102532340B

Abstract

本发明提供了一种海参多糖的分离纯化方法，其包括：第一步，分离步骤，对海参多糖进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相；第二步，后处理步骤，将第一步获得的萃取上相脱盐、干燥获得海参岩藻聚糖硫酸酯，将第一步获得的萃取下相脱盐、干燥获得海参硫酸软骨素，从而实现海参多糖的分离纯化。本方法将双水相萃取技术这一新型的分离技术应用于海参多糖的分离纯化，具有条件温和、操作简便、设备要求低、成本低廉、易于放大、产物纯度高的优点，克服了现有海参多糖分离纯化方法的缺陷。

Description

海参多糖的分离纯化方法及双水相萃取方法在其中的应用

技术领域

本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种海参多糖的分离纯化方法。

背景技术

海参多糖是海参体壁的重要组成部分，其占海参体壁干重的5％～10％。海参多糖在海参体壁中与蛋白相连，通过蛋白酶酶解、乙醇沉淀等步骤可从海参体壁中提取得到海参多糖。海参多糖为混合物，其中主要包括海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯两种组分，这两种物质分别具有不同的化学结构及生理活性。海参硫酸软骨素的化学结构类似于硫酸软骨素，其已被证实具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂及抗病毒等功效。海参岩藻聚糖硫酸酯主要由岩藻糖及硫酸根组成，属于岩藻聚糖硫酸酯类化合物，具有保护神经干细胞、预防胃溃疡等功效。海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯在功能性食品及药物开发等方面已展现出良好的应用前景。

为了获得海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯，需对海参多糖进行分离纯化。因此，海参多糖快速有效的分离纯化是海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯得以充分研究与利用的前提条件。目前，海参多糖的分离纯化方法有乙醇分级分离、盐分级分离、离子交换层析及凝胶过滤层析等。乙醇分级分离及盐分级分离分别采用不同浓度的乙醇及盐溶液对海参多糖进行沉淀，可将海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯粗略分开，其成本低廉，易于操作，但得到的产物纯度较低。离子交换层析及凝胶过滤层析分别采用离子交换树脂与凝胶过滤树脂对海参多糖进行分离，纯化效果好，获得的海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯纯度高，但是层析树脂价格昂贵，操作繁琐，处理规模有限。现有方法均存在不足，这在一定程度上制约了海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯的研究与利用。

把两种聚合物或一种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起，由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性而形成两相，这种互不相溶的两相体系称为双水相体系(aqueous two-phase system，ATPS)。利用双水相体系并配合萃取操作对物质进行分离纯化的技术称为双水相萃取，又称为双水相分配。双水相萃取与传统的水-有机溶剂萃取都是利用物质在两相间的分配系数不同来实现分离的。双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，具有条件温和、操作简便、易于放大、分离能力强等一系列优点，目前已成功应用于蛋白质、核酸和病毒等生物大分子的分离纯化。但目前尚未见将双水相萃取技术用于海参多糖分离纯化的研究报道或专利。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是在于将双水相萃取这一新型的分离技术应用于海参多糖的分离纯化，充分发挥其条件温和、操作简便、易于放大、分离能力强的优点，从而高效纯化出海参岩藻聚糖硫酸酯与海参硫酸软骨素，克服现有海参多糖分离纯化方法的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种海参多糖的分离纯化方法，其包括：

第一步，分离步骤，对海参多糖进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相；

第二步，后处理步骤，将第一步获得的萃取上相脱盐、干燥获得海参岩藻聚糖硫酸酯，将第一步获得的萃取下相脱盐、干燥获得海参硫酸软骨素，从而实现海参多糖的分离纯化。

其中，所述第一步中，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、硫酸铵和水构成，所述聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为5％～25％，所述硫酸铵在所述双水相体系中的质量百分比为10％～30％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为600～10000。

其中，所述第二步中的脱盐方法可以采用超滤法或透析法，超滤法采用截留分子量为1000～100000的超滤膜脱盐，透析法采用截留分子量为1000～100000的透析袋脱盐。

其中，所述第二步中的干燥方法可以采用喷雾干燥或冷冻干燥。

为了解决上述技术问题，本发明提供了双水相萃取方法在海参多糖分离纯化中的应用，所述双水相萃取方法中的双水相体系由聚乙二醇、硫酸铵和水构成，所述聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为5％～25％，所述硫酸铵在所述双水相体系中的质量百分比为10％～30％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为600～10000。

本发明的有益效果：

本发明将双水相萃取技术这一新型的分离技术应用于海参多糖的分离纯化，具有条件温和、操作简便、设备要求低、成本低廉、易于放大、产物纯度高的优点，克服了现有海参多糖分离纯化方法的缺陷。

具体实施方式

本发明提供了一种海参多糖的分离纯化方法，其包括：

所述第一步中，通过双水相萃取将海参多糖的两个组分-海参岩藻聚糖硫酸酯与海参硫酸软骨素分别分配于双水相体系的两相，从而实现海参多糖的分离。海参岩藻聚糖硫酸酯与海参硫酸软骨素在双水相萃取中的分配行为与双水相体系的条件密切相关。

所述第一步中，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、硫酸铵和水构成，所述聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为5％～25％，所述硫酸铵在所述双水相体系中的质量百分比为10％～30％，余量为水。聚乙二醇或硫酸铵的质量百分比在上述范围以外，将导致无法形成双水相或分配效果不理想。

所述聚乙二醇的重均分子量为600～10000。使用重均分子量小于600的聚乙二醇，形成双水相时所需聚乙二醇的量过大，不利于成本的控制；重均分子量大于10000的聚乙二醇形成的双水相体系粘度高，不利于后续操作的进行。

利用所述双水相体系对海参多糖进行萃取后，海参岩藻聚糖硫酸酯集中于上相，海参硫酸软骨素集中于下相。

所述第二步中，由于第一步中使用的双水相体系包括聚乙二醇和硫酸铵，获得的萃取上相和萃取下相中均含有一定量的聚乙二醇和硫酸铵，因此需要通过脱盐步骤将所述聚乙二醇和所述硫酸铵脱除。

所述第二步中的脱盐方法可以采用超滤法或透析法，超滤法采用截留分子量为1000～100000的超滤膜脱盐，透析法采用截留分子量为1000～100000的透析袋脱盐，收集超滤截留液或者透析截留液得到海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯的水溶液。海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯的水溶液通过喷雾干燥或冷冻干燥等方法进行干燥处理，获得海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯的干制品。

利用本发明的海参多糖分离纯化方法纯化得到的海参岩藻聚糖硫酸酯及海参硫酸软骨素，其纯度均大于95％。

海参岩藻聚糖硫酸酯及海参硫酸软骨素的纯度的测定方式如下：采用高效凝胶排阻色谱进行测定，色谱柱为Tosoh TSK gel 4000 PWxl，流动相为0.2mol/L NaCl，柱温为40℃，检测器为示差检测器，纯度计算方法为：海参硫酸软骨素的纯度＝海参硫酸软骨素物质峰的峰面积/(海参硫酸软骨素物质峰的峰面积+海参岩藻聚糖硫酸酯物质峰的峰面积)；海参岩藻聚糖硫酸酯的纯度＝海参岩藻聚糖硫酸酯物质峰的峰面积/(海参硫酸软骨素物质峰的峰面积+海参岩藻聚糖硫酸酯物质峰的峰面积)。

本发明中的海参多糖分离纯化方法所处理的海参多糖，究其本质是海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯的混合物。因此，本方法除了对天然提取的海参多糖，对混有海参岩藻聚糖硫酸酯的海参硫酸软骨素粗制品、混有海参硫酸软骨素的海参岩藻聚糖硫酸酯粗制品、以及海参硫酸软骨素与海参岩藻聚糖硫酸酯的人工混合物均可实现相同的分离纯化效果。

本发明还提供了双水相萃取方法在海参多糖分离纯化中的应用，所述双水相萃取方法中的双水相体系由聚乙二醇、硫酸铵和水构成，所述聚乙二醇在所述双水相萃取体系中的质量百分比为5％～25％，所述硫酸铵在所述双水相萃取体系中的质量百分比为10％～30％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为600～10000。

以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1

将5g重均分子量为10000的聚乙二醇与17g(NH₄)₂SO₄溶于78g水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将0.2g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀后静置分层，取出上相及下相。

上相以截留分子量为50000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为96.0％。下相以截留分子量为14000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为97.1％。

实施例2

将25g重均分子量为10000的聚乙二醇与10g(NH₄)₂SO₄溶于65g水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将0.4g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀后静置分层，取出上相及下相。

上相以截留分子量为50000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为97.3％。下相以截留分子量为14000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为96.6％。

实施例3

将7.5kg重均分子量为10000的聚乙二醇与6.25kg(NH₄)₂SO₄溶于36.25kg水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将100g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀并静置分层后取出上相及下相。

上相以截留分子量为100000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经喷雾干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为98.6％。下相以截留分子量为50000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经喷雾干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为98.1％。

实施例4

将75g重均分子量为6000的聚乙二醇与75g(NH₄)₂SO₄溶于350g水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将4g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀并静置分层后取出上相及下相。

上相以截留分子量为50000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经冷冻干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为95.2％。下相以截留分子量为50000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经冷冻干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为97.1％。

实施例5

将100g重均分子量为4000的聚乙二醇与200g(NH₄)₂SO₄溶于700g水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将4g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀并静置分层后取出上相及下相。

上相以截留分子量为50000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经喷雾干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为97.6％。下相以截留分子量为20000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经喷雾干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为96.9％。

实施例6

将5g重均分子量为1000的聚乙二醇与5g(NH₄)₂SO₄溶于15g水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将0.25g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀并静置分层后取出上相及下相。

上相以截留分子量为10000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为95.2％。下相以截留分子量为5000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为95.8％。

实施例7

将0.8kg重均分子量为600的聚乙二醇与1.5kg(NH₄)₂SO₄溶于2.7kg水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将30g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀并静置分层后取出上相及下相。

上相以截留分子量为10000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经喷雾干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为96.7％。下相以截留分子量为1000的超滤膜进行超滤脱盐，超滤截留液经喷雾干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为98.3％。

实施例8

将16g重均分子量为600的聚乙二醇与30g(NH₄)₂SO₄溶于54g水，充分混匀后静置分层，形成双水相体系。将0.6g海参多糖溶于该双水相体系，充分溶解、混匀并静置分层后取出上相及下相。

上相以截留分子量为10000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参岩藻聚糖硫酸酯，纯度为96.2％。下相以截留分子量为1000的透析袋进行透析脱盐，透析截留液经冷冻干燥后得到海参硫酸软骨素，纯度为98.5％。

所有上述为这一知识产权的首要实施方法及其产品，并没有设定限制以其他形式实施这种新方法和/或新产品。本领域技术人员将利用这一重要信息，对上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有基于本发明的修改或改造新方法和/或新产品，属于保留的权利。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种海参多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的海参多糖的分离纯化方法，其特征在于：所述第一步中，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、硫酸铵和水构成，所述聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为5％～25％，所述硫酸铵在所述双水相体系中的质量百分比为10％～30％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为600～10000。

3.如权利要求1所述的海参多糖的分离纯化方法，其特征在于：所述第二步中的脱盐方法可以采用超滤法或透析法，超滤法采用截留分子量为1000～100000的超滤膜脱盐，透析法采用截留分子量为1000～100000的透析袋脱盐。

4.如权利要求1所述的海参多糖的分离纯化方法，其特征在于：所述第二步中的干燥方法可以采用喷雾干燥或冷冻干燥。

5.双水相萃取方法在海参多糖分离纯化中的应用，其特征在于：所述双水相萃取方法中的双水相体系由聚乙二醇、硫酸铵和水构成，所述聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为5％～25％，所述硫酸铵在所述双水相体系中的质量百分比为10％～30％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为600～10000。