CN105315382A - 由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用，由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1001，其特它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1002，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，活性多糖的提取纯化工艺，它包括以下工艺步骤：材料预处理、离子交换柱层析、Sephadex？G-200凝胶柱层析，本发明取纯化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002具有良好的生物活性，本发明的加工工艺简单。
Description
技术领域
本发明涉及由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用。
背景技术
双孢蘑菇性平、味甘，能补脾益气，润燥化痰，有滋补作用，消食，清神，平肝阳，主治消化不良，高血压,双孢蘑菇肉质肥厚,味道鲜美,而且热能低,具有很高的医疗保健作用，被联合国粮农组织誉为21世纪的健康食品，双孢蘑菇子实体中含有丰富的氨基酸、矿质元素、多糖、核甘酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分及其超氧化物歧化酶(SOD)。
双孢蘑菇具有降低血液中的总胆固醇、超低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白胆固醇；双孢蘑菇能够促进CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合体、IL-12的表达、T细胞增殖、增高胸腺指数、脾脏指数等免疫活性；抑制乳癌细胞MCF-7aro等癌细胞的生长具有抗肿瘤活性；能显著地抑制大肠杆菌390、大肠杆菌739、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等细菌的生长；具有除去大蒜所产生口腔恶臭的治疗口臭功效；可显著抑制正常小鼠的胃排空、对新斯的明负荷小鼠引起的胃排空亢进有显著的拮抗作用，具有改善胃肠道功能等活性，双孢蘑菇有这么多的功效，源于其含有丰富的营养成分和活性物质，具有相当大的开发潜力
双孢蘑菇作为世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，其贸易以罐头为主，在双孢蘑菇罐头加工过程中清洗、预煮、灌装、注液等工艺产生大量工业废水，这些废水中往往含有大量的双孢蘑菇子实体中可溶性物质，然而诸多罐头工厂着眼于眼前利益，对双孢蘑菇罐藏预煮液没有做任何处理，直接排入环境，这不仅给环境、生态、经济协调发展造成很大的压力，而且浪费了这些废水中隐藏的有益成分，因此，有必要设计出一种能够将双孢蘑菇罐头加工过程中产生的废水中有益物质提取出来，将这些有益物质利用起来，防止资源的浪费，造福人类。
发明内容
本发明的目的在于提供具有良好生物活性的由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1001，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩尔比为39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1002，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩尔比为0.13:0.56:1.57:87.1。
一种活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35～55％，得到蘑菇预煮浓缩液；量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在65-75℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解(因为折光率高于35％就会出现晶体析出，所以需要在65-75℃水浴条件下将晶体溶解)，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，离心之后取上清液，上清液用90-150KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3.5-1:2.5的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用50～100ml去离子水溶解，并于65-75℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，即得到不小于100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量(测Abcp的多糖含量，是为了解粗多糖Abcp含量的多少，方便进行下一步实验)，3.5-5℃保存备用；
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理；
b.经柱层析得Abnp100；
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
b.经柱层析得活性多糖。
步骤(2)中DEAE-52预处理的具体过程为：在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性；用0.45-0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性；用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
步骤(2)的b工艺具体为：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为10-20min,脱气之后冷却装柱，用0.015-0.025mol/L、pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，定时为5～20min/管，用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用4.5-5.5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100。
步骤(3)中所述的SephadexG-200预处理的具体工艺为：将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀45-50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
步骤(3)的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰C的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用4.5-5.5KDa超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001。
步骤(3)的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰D的洗脱液，合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用4.5-5.5KDa超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002。
步骤(2)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2/5-3/5，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为8-11cm，Abcp的上样量为5-10毫升。
步骤(3)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为35-45cm，Abnp100的上样量分别为为5-10毫升。
以上所述的NaCl溶液为以NaCl作溶质，0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液作溶剂配得的溶液。
所述的活性多糖Abnp1001的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
所述的活性多糖Abnp1002的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：1)本发明提取纯化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002对急性肝损伤具有良好的保护活性可以作为潜在的急性肝损伤治疗药物或者可以用于制备治疗急性肝损伤的药物；2)本发明提取纯化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002具有良好的抗肿瘤活性，它们可以作为潜在的抗肿瘤药物或者可以用于制备抗肿瘤药物；3)本发明将废弃的双孢蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水作为原料，提取纯化出能够为人们所用的活性多糖，这不仅将废水变废为宝，减少了废水的排放量，降低了对环境的污染程度，而且为人们带来了具有良好生物活性的活性多糖；4)本发明的提取纯化工艺简单易实施，且得到高纯度的活性多糖。
附图说明
图1是本发明多糖Abnp1001的单糖组分分析图。
图2是本发明多糖Abnp1002的单糖组分分析图。
图3是本发明多糖Abap1001的单糖组分分析图。
图4是本发明多糖Abap1002的单糖组分分析图。
图5是本发明实施例1粗多糖Abcp的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图6是本发明实施例1中性粗多糖Abnp100的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图7是本发明实施例1粗多糖Abap100的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图8是本发明实施例2粗多糖Abcp的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图9是本发明实施例2中性粗多糖Abnp100的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图10是本发明实施例2粗多糖Abap100的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图11是本发明实施例3粗多糖Abcp的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图12是本发明实施例3中性粗多糖Abnp100的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图13是本发明实施例3粗多糖Abap100的洗脱曲线及多糖含量分布图。
图14是本发明多糖Abnp1001、多糖Abap1001作用于急性肝损伤小鼠模型后其血清中ALT、AST变化图。
图15是本发明多糖Abnp1001、多糖Abap1001保护CCl4诱导急性肝损伤的肝脏的组织学特点和病理分析图。
图16是本发明多糖Abnp1002、多糖Abap1002作用于急性肝损伤小鼠模型后其血清中ALT、AST变化图。
图17是本发明多糖Abnp1002、多糖Abap1002保护CCl4诱导急性肝损伤的肝脏的组织学特点和病理分析图。
标号说明：1主峰A、2主峰B、3主峰C、4主峰D、5主峰E、6主峰F。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
如图1所示：一种双孢蘑菇罐头加工废水中的活性多糖Abnp1001，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩尔比为39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
如图2所示：一种双孢蘑菇罐头加工废水中的活性多糖Abnp1002，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩尔比为0.13:0.56:1.57:87.1。
如图3所示：一种双孢蘑菇罐头加工废水中的活性多糖Abap1001，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩尔比为0.4:0.02:0.4:73.6。
如图4所示：一种双孢蘑菇罐头加工废水中的活性多糖Abap1002，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖的摩尔比为1.3:0.14:0.2:76.73。
实施例1：
一种活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002、Abap1001、Abap1002的提取纯化工艺，它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％，得到蘑菇预煮浓缩液；量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在75℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在11500rpm之间，离心温度为25℃，离心时间为10min，离心之后取上清液，上清液用150KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3.5的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用100ml去离子水溶解，并于65℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在12500rpm，离心温度为15℃，离心时间为20min，收集上清液，即得到100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量，5℃保存备用；
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理；
在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.45mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性；用0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性；用0.45mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
b.柱层析：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为10min,脱气之后冷却装柱，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的3/5，用0.015mol/L、pH为7.3的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为8cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，定时为20min/管，用0.015mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，Abcp的上样量为10毫升，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.015mol/L，pH为7.3的Tris-HCl缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用5.5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在11500rpm，离心温度为25℃，离心时间为10min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100，如图5所示；
层析柱继续用0.1～0.5mol/L连续梯度溶度的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为0.25mL/min，进行部分收集，每5min收集1管，每管的量是2mL，采用苯酚-硫酸法测偶数管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，再根据多糖含量分布图与洗脱谱图收集主峰B的洗脱液，合并主峰B的洗脱液，主峰B的洗脱液经4.5KDa超滤膜超滤脱盐，超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在12500rpm，离心温度为15℃，离心时间为20min，收集上清液，即得酸性粗多糖Abap100，如图5所示；
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀45h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
b.柱层析：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为35cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，Abnp100的上样量为10毫升，待样品完全进入填料界面时用0.015mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.250mL/min，分部收集，每5min收集1管，每管的量是2mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，分别收集主峰C以及主峰D的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用4.5KDa超滤膜进行超滤到11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001；合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用4.5KDa超滤膜进行超滤到11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002，如图6所示；
(4)Abap100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀45h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
b.柱层析：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为35cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abap100，Abap100的上样量为10毫升，待样品完全进入填料界面时用0.015mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.250mL/min，分部收集，每5min收集1管，每管的量是2mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，分别收集主峰E以及主峰F的洗脱液，合并主峰E的洗脱液，对主峰E的洗脱液用4.5KDa超滤膜进行超滤到11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1001；合并主峰F的洗脱液，对主峰F的洗脱液用4.5KDa超滤膜进行超滤到11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1002，如图7所示；
以上所述的NaCl溶液为以NaCl作溶质，0.015mol/L、pH为7.3的Tris-HCl缓冲液作溶剂配得的溶液；
实施例2：
一种活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002、Abap1001、Abap1002的提取纯化工艺，它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到40％，得到蘑菇预煮浓缩液；量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在70℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在12000rpm，离心温度为20℃，离心时间为15min，离心之后取上清液，上清液用100KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用80ml去离子水溶解，并于70℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在12000rpm，离心温度为20℃，离心时间为15min，收集上清液，即得到120KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量，4℃保存备用；
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理；
在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.5mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性；用0.5mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性；用0.5mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
b.柱层析：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为15min,脱气之后冷却装柱，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2.5/5，用0.02mol/L、pH为7.2的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为10cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，定时为15min/管，用0.02mol/LpH7.2Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，Abcp的上样量为8毫升，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.02mol/L，pH为7.2的Tris-HCl缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在12000rpm，离心温度为20℃，离心时间为15min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100，如图8所示；
层析柱继续用0.1～0.5mol/L连续梯度溶度的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为0.2mL/min，进行部分收集，每15min收集1管，每管的量是6mL，采用苯酚-硫酸法测偶数管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，再根据多糖含量分布图与洗脱谱图收集主峰B的洗脱液，合并主峰B的洗脱液，主峰B的洗脱液经5KDa超滤膜超滤脱盐，超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在12000rpm，离心温度为20℃，离心时间为15min，收集上清液，即得酸性粗多糖Abap100，如图8所示；
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀48h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
b.柱层析：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为40cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，Abnp100的上样量为8毫升，待样品完全进入填料界面时用0.02mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.20mL/min，分部收集，每6min收集1管，每管的量是8mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，分别收集主峰C以及主峰D的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用5KDa超滤膜进行超滤到10mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001；合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用5.0KDa超滤膜进行超滤到10mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002，如图9所示；
(4)Abap100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀48h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
b.柱层析：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为40cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abap100，Abap100的上样量为8毫升，待样品完全进入填料界面时用0.02mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.20mL/min，分部收集，每6min收集1管，每管的量是8mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，分别收集主峰E以及主峰F的洗脱液，合并主峰E的洗脱液，对主峰E的洗脱液用5.0KDa超滤膜进行超滤到10mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1001；合并主峰F的洗脱液，对主峰F的洗脱液用5.0KDa超滤膜进行超滤到10mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1002，如图10所示；
以上所述的NaCl溶液为以NaCl作溶质，0.02mol/L、pH为7.2的Tris-HCl缓冲液作溶剂配得的溶液。
实施例3：
一种活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002、Abap1001、Abap1002的提取纯化工艺，它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到55％，得到蘑菇预煮浓缩液；量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在65℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在12500rpm，离心温度为15℃，离心时间为20min，离心之后取上清液，上清液用90KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:2.5的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用50ml去离子水溶解，并于75℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，11500rpm，离心温度为25℃，离心时间为10min，收集上清液，即得到150KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量，3.5℃保存备用；
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理；
在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.55mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性；用0.45mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性；用0.55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
b.柱层析：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为20min,脱气之后冷却装柱，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2/5，用0.025mol/L、pH为7.1的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为11cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，定时为5min/管，用0.025mol/LpH7.1Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，Abcp的上样量为5毫升，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.025mol/L，pH为7.1的Tris-HCl缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用4.5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在12500rpm，离心温度为15℃，离心时间为20min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100，如图11所示；
层析柱继续用0.1～0.5mol/L连续梯度溶度的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为0.15mL/min，进行部分收集，每20min收集1管，每管的量是10mL，采用苯酚-硫酸法测偶数管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，再根据多糖含量分布图与洗脱谱图收集主峰B的洗脱液，合并主峰B的洗脱液，主峰B的洗脱液经5.5KDa超滤膜超滤脱盐，超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在11500rpm，离心温度为25℃，离心时间为10min，收集上清液，即得酸性粗多糖Abap100，如图11所示；
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
b.柱层析：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为45cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，Abnp100的上样量为5毫升，待样品完全进入填料界面时用0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.150mL/min，分部收集，每20min收集1管，每管的量是10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，分别收集主峰C以及主峰D的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用5.5KDa超滤膜进行超滤到11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001；合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用5.5KDa超滤膜进行超滤到9mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002，如图12所示；
(4)Abap100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
b.柱层析：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为45cm，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，设定紫外检测仪的最大吸收波长为280nm，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abap100，Abap100的上样量为5毫升，待样品完全进入填料界面时用0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.150mL/min，分部收集，每20min收集1管，每管的量是10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，分别收集主峰E以及主峰F的洗脱液，合并主峰E的洗脱液，对主峰E的洗脱液用5.5KDa超滤膜进行超滤到9mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1001；合并主峰F的洗脱液，对主峰F的洗脱液用5.5KDa超滤膜进行超滤到9mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1002，如图13所示；
以上所述的NaCl溶液为以NaCl作溶质，0.025mol/L、pH为7.1的Tris-HCl缓冲液作溶剂配得的溶液。
实施例4：
Abnp1001、Abap1001对急性肝损伤的保护活性：取50只雄性KM小鼠，随机分为正常组、CCl4模型组、Abnp1001、Abap1001高、中、低剂量组。正常组、CCl4模型组按体重比(10mL/Kg)给药，采取尾静脉注射10％葡萄糖注射液，Abnp1001、Abap1001高、中、低剂量组(高、中、低剂量分别为：40mg/Kg·d、20mg/Kg·d、10mg/Kg·d)按体重比(10mL/Kg)、尾静脉注射给药，每天一次，连续给药7d。造模后12h，摘眼球取血，血液离心(3000rmp,4℃,5min)，取上清液即血清，测定ALT、AST活性，颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取肝脏，生理盐水漂洗肝脏上的血渍，取肝右小叶，置于10％福尔马林固定，用常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织的病理变化。如图14多糖Abnp1001、多糖Abap1001作用于急性肝损伤小鼠模型后其血清中ALT、AST变化图：Abnp1001、Abap1001均可使其升高的ALT,AST活性显著降低(与CCl4模型组比较)，并呈现剂量效应，降低急性肝损伤引起血清中转氨酶含量，起到保护作用。在图14中，A为正常组，B为CCl4模型组；C为Abnp1001低剂量组；D为Abnp1001中剂量组；E为Abnp1001高剂量组；F为Abap1001低剂量组；G为Abap1001中剂量组；H为Abap1001高剂量组；结果均为平均值±标准差(SD)，aP<0.05与正常组相比较,bP<0.05与CCl4模型组相比较。
如图15多糖Abnp1001、多糖Abap1001保护CCl4诱导急性肝损伤的肝脏的组织学特点和病理分析图：正常组：肝小叶结构完整,肝索呈辐射状排列,肝窦及汇管区无异常,无炎性细胞浸润,肝细胞形态正常。四氯化碳模型组：肝实质细胞排列混乱，可见明显的、大面积的灶状坏死,并伴有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润。Abap1001低剂量组：可见明显的灶状坏死,并伴有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，但实质细胞细胞质仍然饱满，表明肝细胞对四氯化碳所造成的损伤有修复和保护作用。Abap1001中剂量组：出现有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，病灶面积较小，肝实质细胞细胞质稀薄，没有正常组的充盈，但较模型组有明显改善。Abap1001高剂量组：肝实质细胞出现明显的气泡性样变，肝实质细胞受到非常严重的损伤。
在图15中，A为正常组，B为CCl4模型组；C为Abnp1001低剂量组；D为Abnp1001中剂量组；E为Abnp1001高剂量组；F为Abap1001低剂量组；G为Abap1001中剂量组；H为Abap1001高剂量组；
实施例5：
Abnp1002、Abap1002对急性肝损伤的保护活性：取50只雄性KM小鼠，随机分为正常组、CCl4模型组、Abnp1002、Abap1002高、中、低剂量组。正常组、CCl4模型组按体重比(10mL/Kg)给药，采取尾静脉注射10％葡萄糖注射液，Abnp1002、Abap1002高、中、低剂量组(高、中、低剂量分别为：40mg/Kg·d、20mg/Kg·d、10mg/Kg·d)按体重比(10mL/Kg)、尾静脉注射给药，每天一次，连续给药7d。造模后12h，摘眼球取血，血液离心(3000rmp,4℃,5min)，取上清液即血清，测定ALT、AST活性，颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取肝脏，生理盐水漂洗肝脏上的血渍，取肝右小叶，置于10％福尔马林固定，用常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织的病理变化。如图16多糖Abnp1002、多糖Abap1002作用于急性肝损伤小鼠模型后其血清中ALT、AST变化图：腹腔注射CCl4可引起小鼠急性肝损伤,表现在血清中ALT,AST活性明显升高,Abnp1002、Abap1002均可使其升高的ALT,AST活性显著降低(与CCl4模型组比较)，并呈现剂量效应，对CCl4引起的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用。在图16中，I为正常组，II为CCl4模型组；III为Abnp1002低剂量组；IV为Abnp1002中剂量组；V为Abnp1002高剂量组；VI为Abap1002低剂量组；VII为Abap1002中剂量组；VIII为Abap1002高剂量组；结果均为平均值±标准差(SD)，aP<0.05与正常组相比较,bP<0.05与CCl4模型组相比较。
如图17多糖Abnp1002、多糖Abap1002保护CCl4诱导急性肝损伤的肝脏的组织学特点和病理分析图：正常组：肝小叶结构完整,肝索呈辐射状排列,肝窦及汇管区无异常,无炎性细胞浸润,肝细胞形态正常。四氯化碳模型组：肝实质细胞排列混乱，可见明显的、大面积的灶状坏死,并伴有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润。Abnp1002低剂量组：肝实质细胞排列混乱，中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润的面积、病灶面积比模型组的大，表明肝脏受到严重的损坏。Abnp1002中剂量组：肝索排列混乱，肝实质细胞细胞质疏松，出现溶核现象，中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，病灶面积比低剂量组小，但肝小叶结构还是相对完整，表明中剂量组与低剂量相比，肝脏受到损坏时有一定程度的自我保护。Abnp1002高剂量组：肝小叶结构完整,肝索呈辐射状排列,肝实质细胞细胞质疏松，细胞核保持完整，出现少量中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，但病灶面积最小，较模型组有明显改善。Abap1002低剂量组：可见明显的灶状坏死,并伴有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，但实质细胞细胞质仍然饱满，表明肝细胞对四氯化碳所造成的损伤有修复和保护作用。Abap1002中剂量组：出现有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，病灶面积较小，肝实质细胞细胞质稀薄，没有正常组的充盈，但较模型组有明显改善。Abap1002高剂量组：肝实质细胞出现明显的气泡性样变，肝实质细胞受到非常严重的损伤。
在图17中，A为正常组，B为CCl4模型组；C为Abnp1002低剂量组；D为Abnp1002中剂量组；E为Abnp1002高剂量组；F为Abap1002低剂量；G为Abap1002中剂量；H为Abap1002高剂量；I的结果均为平均值±标准差(SD)，
aP<0.05与正常组相比较,bP<0.05与CCl4模型组相比较，cP<0.01与CCl4模型组相比较。
实施例6：Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002抑制肉瘤S-180生长的活性测试：
在无菌条件下，用生理盐水配制S-180瘤细胞悬液，调整细胞溶度为(1～2)×107个/mL，立即接种到昆明小鼠的右前肢腋下，接种量为2×106～4×106个肉瘤S-180细胞。接种完称重，随机分为荷瘤对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺20mg/Kg·d)、Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002高、中、低剂量组(40mg/Kg·d、20mg/Kg·d、10mg/Kg·d)，每组10只，接种后24h开始给药，按体重比(10mg/Kg)、尾静脉给药，连续10d，在末次给药后24h，称体重，颈椎脱臼处死小鼠，取肉瘤、脾脏、胸腺，剔除包膜和坏死部分，生理盐水漂洗去除血渍，用滤纸吸干，分析电子天平称重，计算瘤重抑制率、脾指数、胸腺指数， 实验结果如下表：
Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002对小鼠肉瘤S-180的抑制作用及对免疫器官重量的影响
环磷酰胺是临床常用的氮芥类的抗肿瘤药物,其抗癌谱广，该药在体外无活性,进入体内后在肝脏或血液中进行活化,生成烷基化的代谢产物,进而发挥抗肿瘤的作用，其主要的副作用是对免疫系统的抑制作用，环磷酰胺组中环磷酰胺极显著(P<0.01)地抑制了胸腺的生长；环磷酰胺组虽然S180肉瘤小鼠瘤重抑制率达22.6％，但脾脏指数和胸腺指数比荷瘤组下降23.18％、53.67％，严重影响脾脏和胸腺两个重要免疫器官的发育。
Abnp1001高剂量组对S180肉瘤小鼠瘤重抑制率达31.9％，比环磷酰胺组瘤重抑制率高；脾脏指数和胸腺指数比荷瘤组下降8.09％、14.41％，影响明显比环磷酰胺低；
Abnp1002高剂量组对S180肉瘤小鼠瘤重抑制率达32.1％，比环磷酰胺组瘤重抑制率高；脾脏指数和胸腺指数比荷瘤组下降3.43％、10.45％，影响明显比环磷酰胺低；
Abap1001高剂量组对S180肉瘤小鼠瘤重抑制率达32.3％，比环磷酰胺组瘤重抑制率高；脾脏指数和胸腺指数比荷瘤组下降9.87％、12.43％，影响明显比环磷酰胺低；
Abnp1002高剂量组对S180肉瘤小鼠瘤重抑制率达31.7％，比环磷酰胺组瘤重抑制率高；脾脏指数和胸腺指数比荷瘤组下降2.61％、7.63％，影响明显比环磷酰胺低；
实施例7：Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002对S180腹水瘤小鼠生存期的影响：
在无菌条件下，用生理盐水配制S180腹水瘤细胞悬液，调整细胞溶度为(1～2)×107个/mL，立即接种到昆明小鼠的腹腔，接种量为2×106～4×106个S-180细胞。
接种完称重，随机分为荷瘤对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺20mg/Kg·d)、多糖(Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002)处理组(40mg/Kg·d)以及联合处理组，每组10只，接种后24h就开始给药，按体重比(10mg/Kg)、腹腔给药，每日一次，其中联合处理组在腹腔先给药(按20mg/Kg·d环磷酰胺腹腔注射给药)后4h分别尾静脉注射4mg/mL多糖(Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002)，连续7d，观察30d，逐日记录小鼠的死亡情况，计算各组的平均生存时间(AST)、中位生存时间(MST)、生命延长率(ILS)＝(T/C-1)×100％,其中T为治疗组的平均生存时间、C为荷瘤对照组平均生存时间。实验结果如下表：
活性多糖对S180腹水瘤小鼠生存期的影响：
结论：环磷酰胺是常用的氮芥类的抗肿瘤药物,该药在体外无活性,进入体内后在肝脏或血液中进行活化,生成烷基化的代谢产物,进而发挥抗肿瘤的作用,从以上数据可知，阳性对照组(环磷酰胺20mg/Kg·d)与荷瘤对照组相比较，阳性对照组的S180腹水瘤小鼠生存时间延长了60.37％，这充分体现了环磷酰胺的抗肿瘤活性，多糖处理组与荷瘤对照组相比较，Abnp1001处理组、Abnp1002处理组、Abap1001处理组、Abap1002处理组的S180腹水瘤小鼠生存时间分别延长了16.04％、26.42％、30.19％、22.26％(p<0.01)。可见，本发明的到的活性多糖Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002，能够明显延长S180腹水瘤小鼠的生存时间；另外以上联合处理组与荷瘤对照组相比较，Abnp1001与环磷酰胺联合处理组、Abnp1002与环磷酰胺联合处理组、Abap1001与环磷酰胺联合处理组、Abap1002与环磷酰胺联合处理组的S180腹水瘤小鼠生存时间分别延长了54.71％、57.55％、61.32％、55.66％(p<0.01)，虽然这4组的生存延长时间不及阳性对照组(环磷酰胺20mg/Kg·d)，但是也可以充分说明Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002能够延长S180腹水瘤小鼠的生存时间，且从以上数据可知：Abnp1001、Abnp1002、Abap1001、Abap1002中的Abap1001相比其他3中活性多糖，Abap1001能更好的延长S180腹水瘤小鼠的生存时间。
Claims (12)
1.一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1001，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩尔比为39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
2.一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abnp1002，其特征在于：它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩尔比为0.13:0.56:1.57:87.1。
3.一种活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
(1)材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35～55％，得到蘑菇预煮浓缩液；量取单位体积的蘑菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在65-75℃水浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解，溶解之后离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，离心之后取上清液，上清液用90-150KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3.5-1:2.5的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用50～100ml去离子水溶解，并于65-75℃减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，即得到不小于100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量，3.5-5℃保存备用；
(2)离子交换柱层析：
a.DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理；
b.经柱层析得Abnp100；
(3)Abnp100的SephadexG-200凝胶柱层析：
a.SephadexG-200预处理；
b.经柱层析得活性多糖。
4.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(2)中DEAE-52预处理的具体过程为：在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性；用0.45-0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸馏水洗至中性；用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。
5.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(2)的b工艺具体为：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为10-20min,脱气之后冷却装柱，用0.015-0.025mol/L、pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入DEAE-Sephadex-A50，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，定时为5～20min/管，用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，待Abcp进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0.015-0.025mol/L，pH为7.1-7.3的Tris-HCl缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液，用4.5-5.5KDa超滤膜超滤主峰A的洗脱液，将超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min，收集上清液，此即为中性粗多糖Abnp100。
6.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3)中所述的SephadexG-200预处理的具体工艺为：将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅拌，放置于室温下膨胀45-50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干燥器除尽凝胶液中的空气。
7.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3)的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰C的洗脱液，合并主峰C的洗脱液，对主峰C的洗脱液用4.5-5.5KDa超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1001。
8.根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3)的b工艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品Abnp100，待样品完全进入填料界面时用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱谱图，收集主峰D的洗脱液，合并主峰D的洗脱液，对主峰D的洗脱液用4.5-5.5KDa超滤膜进行超滤到9-11mL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abnp1002。
9.根据权利要求3或5所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(2)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2/5-3/5，填入DEAE-Sephadex-A50的高度为8-11cm，Abcp的上样量为5-10毫升。
10.根据权利要求3或7或8所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤(3)的b步骤中：所选用的层析柱为2.6cm×50cm层析柱，SephadexG-200填入的高度为35-45cm，Abnp100的上样量分别为为5-10毫升。
11.根据权利要求1所述的活性多糖Abnp1001的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
12.根据权利要求1所述的活性多糖Abnp1002的应用，其特征在于：在制备治疗急性肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
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