CN103724444B - 一种红毛五加多糖的超声波提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种红毛五加多糖的超声波提取方法，属于中药制药领域。依次包括：红毛五加70～80℃烘干，粉碎机粉碎；按照红毛五加与水重量比为1∶20～22加水浸泡，并以超声波辅助提取红毛五加多糖，过滤后得提取液；将提取液减压浓缩至原体积1/10～1/12，加入三氯醋酸充分溶解后静置10～12h，过滤收集滤液；滤液中加入乙醇充分搅拌、静置，收集沉淀；用水复溶后冷冻干燥，既得红毛五加多糖。传统方法多采用沸水浸提法，能耗高，提取效率低，容易破坏多糖结构，影响其生物学功能。本发明可显著提高多糖提取率，缩短提取时间、能耗低，所得红毛五加多糖对化疗药物导致的免疫力低下，有明显的改善作用。

Description

一种红毛五加多糖的超声波提取方法

技术领域

本发明涉及中药制药领域，特别是指一种红毛五加多糖的超声波提取方法。

背景技术

红毛五加(Acanthopanax giraldii Harms)为五加科五加属植物，其茎皮入药，性温，味辛，入肝肾经，具有祛风湿，通关节、强筋骨功效，主治痿痹、拘挛疼痛、风寒湿痹、足膝无力、皮肤风湿及阴痿囊湿等。近年来药理学研究表明多糖是其主要药物活性成分之一。吕晓英等(实用癌症杂志.2000.16(1)：6-8)研究发现，红毛五加多糖能够抑制胃癌细胞集落形成、诱导人胃癌细胞凋亡。张莅峡等(中药材.1994.17(5)：36-38)研究表明，红毛五加多糖参与机体的体液免疫，可激发T、B淋巴细胞的生物学功能，对小鼠T、B淋巴细胞增殖反应有增强效应。Wang J.z.等(Cancer Let t.1992.65(1)：79-84)研究表明红毛五加多糖促进辐射损伤小鼠骨髓造血功能的恢复，提高抗体的抗辐射能力。另外，还有研究表明红毛五加多糖具有抗病毒、保肝等药理作用。

虽然红毛五加多糖药理作用研究取得较大进展，但是关于红毛五加多糖提取工艺的研究较少，大多停留于传统的沸水浸提法。专利“红毛五加复合多糖、制备工艺、用途及该复合多糖组合物”和文章《红毛五加多糖分离精制实验研究》、《红毛五加多糖含量测定及急性毒性实验研究》公开了各自提取红毛五加多糖的方法，均为高温沸水浸提法，提取效率相对较低，其中《红毛五加多糖分离精制实验研究》中的提取效率为0.39％；《红毛五加多糖含量测定及急性毒性实验研究》中提到在累计提取时间达到3.5h后提取率仅为为2.5％。因而寻找一简便、快速、高效且不破坏其生理活性成分的提取方法是首要解决的问题之一。

发明内容

本发明提出一种红毛五加多糖的超声波提取方法，该方法能够高效、快捷的提取红毛五加多糖，且保持其生物活性，并最大限度的提高红毛五加多糖的提取率。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种红毛五加多糖的超声波提取方法，依次包括如下步骤：

(1)粉碎：红毛五加70～80℃烘干，粉碎机粉碎；

(2)提取：按照红毛五加与水重量比为1：20～22加水浸泡，并以超声波法提取红毛五加多糖，过滤后得提取液；

(3)去除蛋白：将提取液减压浓缩至原体积1/10～1/12，加入三氯醋酸充分溶解后静置10～12h，过滤收集滤液；

(4)醇沉：滤液中加入乙醇充分搅拌、静置，收集沉淀；

(5)冷冻干燥：用水复溶后冷冻干燥，即得红毛五加多糖。

上述技术方案中，步骤(1)中，粉碎机粉碎具体为：将红毛五加粉碎至130～150目。

上述技术方案中，步骤(2)中，以超声波法提取具体为：药材加水浸泡3～5h，超声波频率为30～50KHz，功率为400～600W，提取温度为65～75℃，提取时间为40～50min；并且其优选为：药材浸泡3h～5h，超声波频率为40KHz，功率为400W，提取时间为40～50min，提取温度为65～75℃。

上述技术方案中，步骤(3)中减压浓缩具体为：真空度为-0.09～-0.11MPa，浓缩温度为60～70℃，浓缩至原体积1/10～1/12。

上述技术方案中，步骤(3)中加入三氯醋酸具体为：加入三氯醋酸至终浓度为50mg/mL、55mg/mL或60mg/mL。

上述技术方案中，步骤(4)醇沉步骤具体为：将过滤液中糖浓度加水稀释调整为4～6mg/mL，加入糖溶液3～4倍体积的无水乙醇，0～4℃静置12～24h，离心收集沉淀。

试验中发现，当糖浓度为4～6mg/mL时，多糖的沉淀效果最好，及得率最高。

上述技术方案中，步骤(5)冷冻干燥：用水复溶后冷冻干燥的温度为-25～-15℃，并且优选为-20℃，即得红毛五加活性多糖。

本发明方法的原理是：通过将红毛五加粉碎至130～150目，增加了红毛五加的比表面积，提高了多糖的溶出率；然后，利用超声波的空化作用加速多糖的溶出，另外超声波的次级效应如机械振动、乳化、扩散、化学效应等也能加速多糖的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于提取。

以下为表明红毛五加多糖对小鼠免疫功能的影响的实验数据

1实验材料：

昆明种小鼠，购自山东中医药大学实验动物中心。红毛五加多糖由本发明的技术方案制备；香菇多糖、环磷酰胺购自潍坊金通大药房。

2实验方法

2.1实验分组：昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只。A组为对照组，腹腔注射和灌胃与其它组相同体积的生理盐水。B组为免疫抑制模型组，腹腔注80mg/kg环磷酰胺，连续3d，同时灌胃与治疗组等体积生理盐水；C、D、E治疗组分别腹腔注射80mg/kg环磷酰胺连续3d，同时灌胃50，100和200mg/kg红毛五加多糖生理盐水溶液每日1次，连续给药7d，于第8d处死动物。

2.2胸腺指数、脾指数检测

无菌摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干后，称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，再乘以10，得到胸腺指数和脾脏指数。

胸腺指数＝(胸腺重量/小鼠体重)×10

脾脏指数＝(脾脏重量/小鼠体重)×10

2.3巨噬细胞功能测定

实验前30min每只小鼠腹腔注射5％CRBC悬液0.5mL，30min后处死小鼠，消毒腹部，注射0.5mL D-Hanks液，轻揉小鼠腹部，取腹腔液涂片，孵育10min，弃生理盐水，瑞氏染色4min，生理盐水轻轻冲去染液，晾干镜检：计数，并计算阳性细胞的百分率。

吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞/100×100％

吞噬指数＝100个吞噬细胞中吞噬的鸡红细胞总数/100

2.4淋巴细胞转化实验

2.4.1脾细胞悬液制备：取脾脏放入盛有5mL D-Hanks液培养皿中，用注射器针芯轻轻研磨脾脏，制成单细胞悬液，150目筛网过滤，D-Hanks液洗3次，每次离心1500rpm，5min，取100μL，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，完全培养基调整细胞浓度为3×10⁶/mL。

2.4.2淋巴细胞增殖反应：将5×105/mL脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，其中3个孔加5μg/mL_ConA_10μL，另3个孔不加ConA作为对照，置C02培养箱37℃培养48h；在培养结束前4h，于培养板各孔内加入5mg/mL MTT液，10μL/孔，37℃继续培养4h；弃上清，各孔内加入150μL DMSO，溶解10min，30min内用酶标仪于570nm处测定OD值。

3实验结果

表1红毛五加多糖对免疫抑制小鼠免疫器官的影响(n＝10，±s)

从表1可以看出，红毛五加多糖对免疫抑小鼠的胸腺指数和脾指数有明显的提高作用，100mg/kg治疗组基本可以使小鼠的胸腺指数恢复到正常水平，而脾指数明显高于正常组，说明红毛五加多糖具有细胞免疫增强作用。

表2红毛五加多糖对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(n＝10，±s)

从表2可以看出，红毛五加多糖对免疫抑小鼠的吞噬率和吞噬指数有显著提高，具有非特异性免疫增强作用。

表3红毛五加多糖对免疫抑制小鼠溶血素水平的影响(n＝10，±s)

溶血素是反映体液免疫功能状况的一种方法，如果用药后溶血素生成增多，则出现红细胞溶血时的吸光值增高，表明用药后机体的体液免疫作用增强。结果表明，不同剂量的红毛五加多糖可显著增加环磷酰胺造成免疫抑制小鼠血清溶血素水平，具有显著的特异性体液免疫增强作用。

表4红毛五加多糖对免疫抑制小鼠淋巴细胞转化能力的影响(n＝10，±s)

表4结果表明与模型组相比，红毛五加多糖不同剂量组均可明显增加小鼠脾淋巴细胞转化率，具有明显的特异性细胞免疫增强作用。

本发明的有益效果：本发明采用微粉粉碎、超声波辅助提取技术，极大的提高提取率、缩短提取时间；同时，提取温度较低，减少了色素的生成，有利于进一步精制提纯等优点。将提取液浓缩至原体积1/10～1/12，提高溶液中蛋白的初始浓度，显著改善了除蛋白效果。该方法所提出的工艺科学、合理，具有快速、简便、成本低、收率高的优点，即节能又保持了红毛五加多糖的活性。运用该方法红毛五加活性多糖的得率可达3.17％，同时保留了红毛五加多糖药理活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种红毛五加多糖的超声波提取方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：按以下方法步骤提取红毛五加多糖

(1)粉碎步骤：将红毛五加80℃烘干至恒重后，粉碎至140～150目。

(2)超声波提取步骤：取500g红毛五加微粉，加水11L浸泡5h，超声波频率为30KHz超声波功率500W，提取温度为65℃，提取50min，过滤，收集滤液。

(3)去除蛋白步骤：真空度为-0.09MPa，温度70℃，将提取液减压浓缩至1L，加入50g三氯醋酸，待充分溶解后静置10h沉淀，过滤并收集滤液。

(4)醇沉步骤：加水至6.16L，将溶液中糖浓度稀释至4mg/mL，然后加入无水乙醇18.5L，0℃静置24h，过滤收集沉淀。

(5)冷冻干燥步骤：将沉淀用少量水复溶，温度-25℃冷冻干燥后得棕色红毛五加多糖14.8g。

实施例2：按以下方法步骤提取红毛五加多糖

(1)粉碎步骤：将红毛五加70℃粉碎至135～145目。

(2)超声波提取步骤：取2000g红毛五加微粉，加水40L浸泡3h，超声波频率为50KHz超声波功率600W，提取温度为75℃提取40min，过滤，收集滤液。

(3)去除蛋白步骤：真空度为-0.11MPa，温度60℃，将提取液减压浓缩至3.4L，加入187g三氯醋酸，待充分溶解后静置12h沉淀，过滤并收集滤液。

(4)醇沉步骤：加水至18.5L，将溶液中糖浓度稀释至6mg/mL，然后加入无水乙醇75.5L，4℃静置12h，过滤收集沉淀。

(5)冷冻干燥步骤：将沉淀用少量水复溶，温度-15℃冷冻干燥后得棕色红毛五加多糖64.7。

实施例3：按以下方法步骤提取红毛五加多糖

(1)粉碎步骤：将红毛五加75℃粉碎至130～140目。

(2)超声波提取步骤：取1000g红毛五加微粉，加水21L浸泡4h，超声波频率为40KHz，超声波功率400W，提取温度为70℃，提取，45min，过滤，收集滤液。

(3)去除蛋白步骤：真空度为-0.10MPa，温度65℃，将提取液减压浓缩至2.1L，加入126g三氯醋酸，待充分溶解后静置11h沉淀，过滤并收集滤液。

(4)醇沉步骤：加水至11.2L，将溶液中糖浓度稀释至5mg/mL，然后加入无水乙醇39L，2℃静置18h，过滤收集沉淀。

(5)冷冻干燥步骤：将沉淀用少量水复溶，温度-20℃冷冻干燥后得棕色红毛五加多糖30.8g。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于，依次包括如下步骤：

(1)粉碎：红毛五加70～80℃烘干，粉碎机粉碎；

(2)提取：按照红毛五加与水重量比为1∶20～22加水浸泡3～5h，并以超声波辅助提取红毛五加多糖，过滤后得提取液，其使用超声波频率为30～50KHz，功率为400～600W，提取时间为40～50min，提取温度为65～75℃；

(3)去除蛋白：将提取液减压浓缩至原体积1/10～1/12，加入三氯醋酸充分溶解后静置10～12h，过滤收集滤液；

(4)醇沉：滤液中加入乙醇充分搅拌、静置，收集沉淀；

(5)冷冻干燥：用水复溶后冷冻干燥，即得红毛五加多糖。

2.根据权利要求1所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

步骤(1)中，粉碎机粉碎具体为：将红毛五加粉碎至130～150目。

3.根据权利要求2所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

步骤(2)中，以超声波法提取具体为：药材浸泡3h～5h，超声波频率为40KHz，功率为400W，提取时间为40～50min，提取温度为65～75℃。

4.根据权利要求1所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

步骤(3)中，减压浓缩具体为：真空度为-0.09～-0.11MPa，浓缩温度为60～70℃，浓缩至原体积1/10～1/12。

5.根据权利要求1所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

步骤(3)中，加入三氯醋酸具体为：加入三氯醋酸至终浓度为50mg/mL、55mg/mL或60mg/mL。

6.根据权利要求1所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

步骤(4)中，醇沉方法具体为：将过滤液中糖浓度加水稀释调整为4～6mg/mL，加入多糖溶液3～4倍体积的无水乙醇，0～4℃静置12～24h，过滤收集沉淀。

7.根据权利要求1所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

步骤(5)冷冻干燥：用水复溶后冷冻干燥的温度为-25～-15℃。

8.根据权利要求7所述的红毛五加多糖的超声波提取方法，其特征在于：

用水复溶后冷冻干燥的温度为-20℃。