CN1247990C - 电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶,其制法以及使用该凝胶的电泳法 - Google Patents

Abstract

本发明的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，含有Tris和甘氨酸，或Tris、甘氨酸和一种以上的两性电解质以及一元酸，还含有调整至特定pH范围的凝胶缓冲液。上述凝胶，即使冷藏保存6个月以上，在用通用的莱姆理缓冲液进行蛋白质电泳的场合，或者在DNA电泳时采用含通用的Tris、以及螯合剂，和醋酸、磷酸、硼酸中的任何一种酸的电泳用缓冲液，使DNA进行电泳时，可以得到与制造后不久同样的分离能力和鲜明的电泳像。

Description

电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，其制法以及 使用该凝胶的电泳法

本发明涉及电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，其制法以及使用该凝胶的电泳法。

电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，是蛋白质、糖质、脂质等构成生物体的重要物质的检测和定量分析试剂，在生物学、医学、水产学、兽医学等多个领域中作为基础研究手段而广泛使用。特别是，聚丙烯酰胺凝胶，由于是人工合成的物质，通过改变配方，容易制成分离特性不同的凝胶。因此，使用大量生产的预制凝胶，使预先具有各种分离特性，可以大大省略分析的时间，均匀而再现性良好，所以，在该领域，对生产及质量管理的贡献程度大。大量生产的预制凝胶，在供给它时，可以期待保存稳定性良好。

早先，电泳用的聚丙烯酰胺凝胶，按照噢隆斯达尹〔L.Ornstein，Ann.N.Y.Acad.Sci.121，321～349(1964)〕和戴维斯〔B.J.Davis，Ann.N.Y.Acad.Sci，121，404～427(1964)〕提出的方法，以及，按照莱姆理〔U.K.Laemmli，Nature，227，680(1970)〕提出的方法，广泛用于蛋白质的生物化学医药分析，使用者制造凝胶加以使用。特别是莱姆理的方法，通过往凝胶和电泳用缓冲液中添加十二烷基硫酸钠(下面称作SDS)，可简便地推定蛋白质的分子量，得到广泛普及。莱姆理的方法，作为凝胶缓冲液，使用三羟甲基氨基甲烷(下面称作Tris)的盐酸部分中和物，作为电泳缓冲液，使用Tris及甘氨酸盐(莱姆理的电泳缓冲液)。在该法中，凝胶缓冲液，用盐酸部分中和Tris的约10～20％(摩尔)溶液，使pH达到8.8(莱姆理的凝酸缓冲液)。然而，在莱姆理的凝胶缓冲液的pH，酰胺基经受随时间而变的水解反应。凝胶的水解反应，因为即使在低温条件下也能进行，所以，聚丙烯酰胺凝胶部分具有阴离子基团。结果是，蛋白质的电泳距离变短，同时，分离像变得不鲜明，凝胶不可能长期保存。

其次，粗略看一下核酸的电泳。随着分子生物学的进展，必须进行DNA、RNA的分析制备，然而，在这种核酸分析中，经常采用琼脂糖电泳法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳法。核酸在中性缓冲液中显示带强阴电，其移动度，由于作为支持体的凝胶分子筛的效果，根据作为对象的核酸的大小，经常采用0.3～2％左右的琼脂糖凝胶或3.5％～20％左右的聚丙烯酰胺凝胶。

琼脂糖凝胶，因为具有较大的孔径，可在高分子的核酸作为分离分析对象的场合使用。琼脂糖凝胶，因其电渗透的强弱、凝胶强度、熔点等的不同而有许多种类。另外，琼脂糖是天然产物，即使同一公司同一种产品，根据载荷，可以见到各种各样性状的差异。另外，在琼脂糖电泳法用于制备，精制DNA的场合，各种杂质混入琼脂糖中，限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等酶活性受到阻碍，所以，要附加苯酚萃取等精制法。

一方面，聚丙烯酰胺凝胶具有较小的孔径，可用于中分子～低分子核酸作为分离分析对象的场合。聚丙烯酰胺凝胶是合成的物质，具有化学高纯度，所以，未发现琼脂糖凝胶存在问题。另外，聚丙烯酰胺凝胶，通过改变配方，可容易地制出分离特性不同的凝胶。因此，采用大量生产的预制凝胶，使其预先具有各种分离能力，可大大省略分析时间，均匀而再现性良好，所以，在该领域对生产及质量管理的贡献程度大。大量生产的聚丙烯酰胺凝胶，在供给它时，可以期待保存稳定性良好。在用于DNA电泳的场合，琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶的缓冲液，主要是含有pH7.8～8.3的乙二胺四醋酸(下面称作EDTA)或乙二胺四醋酸二钠(下面称作ETA)的三-醋酸缓冲液(下面称作TAE)、三-硼酸缓冲液(下面称作TBE)、三-磷酸缓冲液(下面称作TPE)，凝胶缓冲液是与电泳用缓冲液的组成相同的连续缓冲液体系。

如上所述，大量生产的预制凝胶，在供给它时，可以期待保存稳定性良好。保存稳定性良好的凝胶的制造方法，是含有由Tris、两性电解质及酸构成的凝胶缓冲液，长期保存稳定性优良的，并且，可能测定的分子量范围显著扩大的聚丙烯酰胺凝胶的制造方法，已在特开平4-184163号公报中公开。采用该制造方法制造的聚丙烯酰胺电泳凝胶，可用于莱姆理电泳用缓冲液的分析，它是其中含有两性电解质pH4.0～7.5的凝胶缓冲液的凝胶，在其实施例中，举出pH6.9～7.4凝胶的制造，经过冷藏保存4个月，蛋白质的移动度未发生变化，是稳定的。

凝胶缓冲液，目的是用于抑制聚丙烯酰胺凝胶的水解，将Tris的中和率设定在高值，另外，电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分在边界附近的电位坡度变化，由于两性电解质的添加而变缓，和使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围。

然而，含有pH6.9～7.4范围的凝胶缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶，当经过冷藏保存5个月以上时，蛋白质的移动度出现变化。另外，在板状凝胶的情况下，聚丙烯酰胺凝胶其凝胶形状发生变化，玻璃极板易发生滑动。结果是，电泳分析时的操作困难，由于玻璃极板的滑动，还产生凝胶的剥离等问题。当凝胶缓冲胶的pH在6.8以下时，可以推测其保存稳定性更加提高。然而会出现电泳时间变长，分离能力恶化的问题，与使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围的聚丙烯酰胺凝胶无法得到。

另外，在特表平9-512907号公报中，公开一种用于中性pH长寿命的预制电泳凝胶的体系。该体系的凝胶缓冲液含有pH在中性附近的一价有机胺或取代胺，用盐酸滴定至pH在约6～7之间。上述体系的电泳用缓冲液含有选自MOPS、MES、ACES、MOPSO、TES、HEPES及TAPSO所组成的族群中的两性离子，用氢氧化钠或有机碱滴定至pH约7。凝胶缓冲液、电泳用缓冲液是同时设定在中性，抑制聚丙烯酰胺凝胶的水解，同时，在蛋白质完全还原的状态下进行分离的缓冲液体系。上述电泳用体系，可以稳定12个月。

然而，用特表平9-512907号公报中表示的体系，必须采用专用的分子量标记器。另外，特表平9-512907号公报表示的聚丙烯酰胺凝胶，当使用已知的电泳用缓冲液(例如，含有通用的甘氨酸的莱姆理电泳用缓冲液)时，电泳速度变得极慢，不可能在蛋白质的分离分析中使用。

聚丙烯酰胺凝胶，如果pH设定在中性～酸性领域，可以把聚丙烯酰胺凝胶的水解抑制到某种程度，变成保存稳定性良好的电泳凝胶。因此，把pH设定在中性～酸性领域的聚丙烯酰胺凝胶，可把保管的有效期限设定长，作为预制凝胶，可以大量生产使预先具有各种分离特性。也就是说，电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，与作为蛋白质电泳法使用的电泳用缓冲液加以组合，进行DNA的分离分析，或者，与作为核酸电泳法通用的电泳用缓冲液加以组合，进行DNA的分离分析，如果都可能的话，使用者可以经济而有效地进行分析。

为了解决上述课题，本发明的第一目的是提供一种冷藏保存6个月以上的蛋白质的分离能力以及凝胶形状同时稳定，并且与使用莱姆理凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围的聚丙烯酰胺预制凝胶。

为了解决上述课题，本发明的第二目的是提供一种使用冷藏保存6个月以上稳定的电泳用的聚丙烯酰胺凝胶和核酸分离分析通用的电泳用缓冲液，进行DNA鲜明的分离分析的电泳法。

为了解决上述课题，本发明的第三目的是提供一种使用冷藏保存4个月以上稳定的可作为蛋白质分析用的电泳用的聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质分析用的电泳用缓冲液，进行DNA鲜明的分离分析的电泳法。

本发明涉及一种电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，其特征是，在用于电泳用缓冲液的组成为含有三羟甲基氨基甲烷及两性电解质的水溶液的电泳法的聚丙烯酰胺预制凝胶中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.07mol/l～0.2mol/l的范围，上述两性电解质是由甘氨酸和1种以上的共存两性电解质构成的，上述共存两性电解质的碱基解离常数的范围为8.3＜pKb＜9.6，上述共存两性电解质的添加量，为上述甘氨酸的0.1～30％摩尔百分比，上述共存两性电解质和上述甘氨酸的总浓度为0.1～0.3mol/l的范围，另外，采用pH6.0～6.8范围的缓冲液。

该聚丙烯酰胺预制凝胶，冷藏保存6个月以上，蛋白质的分离能力及凝胶的形状均稳定，并且，与使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围。

上述共存两性电解质是分子内具有相同数目阴离子性基团和阳离子性基团的氨基酸。

上述共存两性电解质至少是丝氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、消旋蛋氨酸以及苯丙氨酸中的任何一种。

另外，本发明涉及的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶的制造方法，该法是把由丙烯酰胺、多官能交联剂、水，以及下述(1)及(2)组成的缓冲液所构成的混合物，在pH6.0～6.8的条件下，在聚合引发剂存在下聚合成的。

(1)三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.07mol/l～0.2mol/l，

(2)两性电解质是由甘氨酸和1种以上的共存两性电解质所构成，

(a)上述共存两性电解质的碱解离常数为8.3＜pKb＜9.6，

(b)上述共存两性电解质的添加量，相对于上述甘氨酸为0.1～30％(摩尔)

(c)上述共存两性电解质和上述甘氨酸的总浓度为0.1～0.3mol/l。

采用该电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶的制造方法，可有效地制造出保存6个月以上，分离能力及形状稳定性良好的电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶。

另外，本发明涉及的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶的使用方法，该法是采用含有十二烷基硫酸盐存在下的三羟甲基氨基甲烷及甘氨酸的电泳用缓冲液，进行蛋白质的分离分析。

按照该方法，使用在蛋白质分离分析中通用的莱姆理电泳用缓冲液，与使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围是可能的。

另外，本发明涉及一种DNA的电泳方法，该法是采用具有下述(1)及(2)特征的聚丙烯酰胺预制凝胶和含有三羟甲基氨基甲烷的电泳用缓冲液所构成。

(1)含在上述聚丙烯酰胺预制凝胶中的凝胶缓冲液，其中含有上述三羟甲基氨基甲烷、以甘氨酸作为必须的一种以上的两性电解质以及一元酸，pH调节至6.0～7.5。

(2)含在上述凝胶缓冲液中的上述两性电解质，是其碱基解离常数为8.3＜pKb＜9.6、分子内具有相同数目的阳离子性基团和阴离子性基团的氨基酸。

上述凝胶缓冲液，其中至少含有一种作为上述一元酸的盐酸及醋酸，以长期保存稳定性为目的，把pH调至6.0～6.5。

另外，上述凝胶缓冲液，其中至少含有一种作为上述一元酸的盐酸及醋酸，以长期保存稳定性为目的，把pH调至6.5～7.5。

上述电泳用缓冲液，除三羟甲基氨基甲烷外，还含有(1)及(2)，pH调节至7.8～8.3。

(1)醋酸、磷酸及硼酸中的任何一种，以及

(2)作为螯合剂的乙二胺四醋酸二钠。

上述电泳用缓冲液，含有作为上述一元酸的硼酸。

上述电泳用缓冲液，除三羟甲基氨基甲烷以外，还含有两性电解质，pH调节至7.8～8.3的范围。

含在上述电泳用缓冲液中的上述两性电解质为甘氨酸。

另外，含在上述电泳用缓冲液中的上述两性电解质为甘氨酸，上述电泳用的缓冲液还含有十二烷基硫酸盐。

本发明的具有长期保存稳定性的进行蛋白质分离分析的凝胶，该凝胶中所含的缓冲液的组成是由Tris、甘氨酸以及一种以上的共存两性电解质构成的，凝胶中Tris的浓度为0.07mol/l～0.2mol/l，理想的为0.08mol/l～0.1mol/l。为了与用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的电泳时间，该范围是，所必须的凝胶中含有的前导离子量的范围。凝胶中Tris的浓度低于0.07mol/l时，整个电泳缘不鲜明，难以用于蛋白质的分离分析。凝胶中Tris的浓度大于0.2mol/l时，凝胶中的前导离子浓度变高，电泳时间延长，分析作业效率变坏。

上述两性电解质，是由甘氨酸和一种以上的共存两性电解质构成的，上述共存两性电解质的碱解离常数范围为8.3＜pKb＜9.6，理想的是9.0＜pKb＜9.6。单独用甘氨酸时，在凝胶缓冲液的pH小于7的场合，与使用的莱姆理凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象不可能具有同等的分级分子量范围。另外，共存两性电解质的pKb＜8.3时，由于pKb比Tris的低，使凝胶缓冲液的pH改变，可以大幅增大分级分子量范围。在共存两性电解质的pKb＞9.6的场合，由于碱基解离常数比甘氨酸的高，无助于使凝胶内的电位坡度变化产生减缓作用。在共存两性电解质中，当使用9.0＜pKb＜9.6的丝氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸等时，依次从pKb低的向阳极一侧移动，凝胶内的电位坡度变化变缓。因此，本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶，与采用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围。

本发明的共存两性电解质的添加量，相对于甘氨酸为0.1～30％摩尔百分比，理想的为1～20％摩尔百分比。上述共存两性电解质的添加量低于0.1％摩尔百分比时，与使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围的效果不出现，反之，添加量大于30％摩尔百分比时，由于凝胶上的电泳像不鲜明，所以，变得不耐用。

本发明的共存两性电解质和甘氨酸的总浓度为0.1～0.3mol/l，理想的为0.1～0.2mol/l。两性电解质浓度低于0.1mol/l，大于0.3mol/l时，凝胶上的电泳像不鲜明，变得不耐用。

本发明所用的两性电解质，分子内最好具有同等数目的阴离子基团和阳离子基团。在本发明的凝胶缓冲液中，两性电解质的全部阴离子性基团和全部阳离子性基团发生解离，变成电中性，在pH高于pKb时，只有阴离子性基团解离，阳离子性基团的解离受到抑制，带负电。因此，上述两性电解质实际上显示的是一元弱酸的行为。

本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶、其使用方法以及在其制造方法中使用的凝胶缓冲液的pH为6.0～6.8，理想的为6.3。当缓冲液的pH大于6.8时，聚丙烯酰胺凝胶的水解容易进行，保管有效期限不能很长。当凝胶缓冲液的pH低于6.0时，聚丙烯酰胺凝胺的稳定性良好，但蛋白质的电泳像不鲜明，变得不耐用。凝胶缓冲液的pH，在pH6.8时，冷藏保存6个月仍可使用，而在pH6.3时，由于接近丙烯酰胺本身的pH，所以水解速度较pH6.8时显著减少。结果是，保持1年的长时间，凝胶的形状及电泳像均未见变化，是稳定的。

本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶使用方法，是使用含Tris及两性电解质的电泳用缓冲液进行蛋白质分离分析的方法，特别是希望使用组成为Tris0.025mol/l、甘氨酸0.192mol/l、SDS 0.1％(重量)的电泳用缓冲液。该电泳用缓冲液其组成是按照莱姆理所提出的凝胶缓冲液，由于作为蛋白质分离分析方法的广泛普及，使用者可经济、有效地进行分析。甘氨酸以外的两性电解质，例如，即使使用含有MOPS的电泳用缓冲液也可以进行蛋白质的分离分析，然而，凝胶的分级分子量范围比使用广泛普及的莱姆理凝胶缓冲液制成的分级分子量范围广。

本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶的制造方法，除了调节凝胶缓冲液的pH以及添加两性电解质以外，可以按照早先已知的电泳用的聚丙烯酰胺凝胶的制造方法进行制造。例如，作为与丙烯酰胺共存用于交联目的的水溶性二乙烯化合物，采用最多的是N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(下面简称BIS)，另外，N，N’一二烯丙基酒石酸酰胺等一般的二乙烯化合物也可以使用。

在本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶制法的单体水溶液中，为了使其对凝胶具有弹力性，提高凝胶强度，可以含有琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、聚甲基乙烯醚等水溶性聚合物，还可以与其他的单体共聚。

在本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶的制法中，单体的聚合是通过聚合引发剂、紫外线照射以及电离性射线的照射所生成的自由基进行的。作为聚合引发剂，可以采用过硫酸铵(下面称作APS)等过氧化物以及，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(下面称作TEMED)等还原剂并用的氧化还原型聚合引发剂，然而，对此未作特别的限定。上述过氧化物及还原剂，相对于全部单体使用0.05～5％(重量/体积)。聚合温度，只要是能使引发剂发挥作用的温度即可，未作特别限定，然而，通常15～50℃是理想的.

下面，使用在核酸的分离分析中通用的电泳用缓冲液，采用保存稳定性良好的本发明聚丙烯酰胺预制凝胶，对DNA的电泳法加以说明.

凝胶缓冲液含有包括Tris、及甘氨酸在内的一种或二种以上的两性电解质及一元酸，理想的是Tris、甘氨酸、碱基解离常数为8.3＜pKb＜9.6的分子内具有同样数目的阳离子性基团和阴离子性基团的氨基酸、盐酸及醋酸。如果其中不含包括甘氨酸在内的一种或二种以上的两性电解质，通过把凝胶缓冲液的pH设定在酸性一侧，Tris的中和率提高，电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分边界附近的电位坡度变化变得非常大。因此，在边界附近，分离对象易于收缩，凝胶的分级分子量范围变得非常窄。另外，由于电泳时间非常长，从作业效率看，是不理想的。

甘氨酸，即使在凝胶缓冲液pH下降的场合，在电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分的边界附近，电位坡度的变化缓慢，与使用TBE以及噢隆斯特尹·戴维斯的凝胶缓冲液的凝胶具有同样的分级分子量范围是必要的。然而，凝胶缓冲液的pH愈接近酸性侧时，单独用甘氨酸，电位坡度变化的调节力愈不充分。这样，在凝胶缓冲液中，由于甘氨酸和碱基解离常数为8.3＜pKb＜9.6的分子内具有相同数目的阳离子性基团和阴离子性基团的氨基酸共存，则电泳凝胶中的电位坡度可能变得更加平缓。

与甘氨酸共存的氨基酸的pKb为8.3＜pKb＜9.6，理想的为9.0＜pKb＜9.6。当与甘氨酸共存的氨基酸pKb＜8.3时，由于pKb比Tris的低，从而使凝胶缓冲液的pH改变，另外，凝胶的分级分子量范围大幅度增大。当与甘氨酸共存的氨基酸pKb＞9.6时，由于pKb比Tris的高，所以，无助于凝胶内电位坡度变化变缓的作用。当在凝胶缓冲液中使用9.0＜pKb＜9.6的氨基酸时，则从pKb低的，依次向阳极侧移动，电泳凝胶内的电位坡度变平缓。9.0＜pKb＜9.6的氨基酸包括丝氨酸，色氨酸和苯丙氨酸等，然而，理想的是丝氨酸。

另外，与甘氨酸共存的氨基酸，其分子内最好具有相同数目的阴离子性基团和阳离子性基团。氨基酸，在pH较pKb稍低时，全部的阴离子性基团和全部的阳离子性基团发生解离，变成电中性，在pH较pKb高时，只有阴离子性基团解离，而阳离子性基团的解离受到抑制，带负电。因此，上述氨基酸，显示的实际上是一元弱酸的行为，可作为假弱酸使用。预先在缓冲液中添加假弱酸，可以使电泳凝胶中Tris的弱酸部分电阻值降低，而且，在强酸根存在下，由于pH降低，变成电中性，无助于电导。

另外，凝胶缓冲液的pH为6.0～7.5，理想的为6.0～6.5。在pH大于7.5的场合，聚丙烯酰胺凝胶经受随时间变化的水解，则预制凝胶的保管有效期限不可能长。在pH低于6.0的场合，聚丙烯酰胺凝胶的稳定性变好，然而，当Tris的中和率过高时，损害了作为缓冲液的功能。凝胶缓冲液的pH，为了使在聚丙烯酰胺预制凝胶中具有长期保存稳定性，希望接近丙烯酰胺本身的pH值。

另外，电泳用缓冲液，含有Tris及螯合剂和醋酸、磷酸及硼酸的任何一种酸，理想的是硼酸。凝胶缓冲液的pH设定在6.0～6.5时，当使用噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液时，电泳像不鲜明，不能进行DNA的分离分析。本发明中使用的TBE的组成为0.0892mol/l(Tris)、0.0890mol/l(硼酸)以及0.0025mol/l(ETA)，pH希望在8.3。上述组成的缓冲液，由于在核酸的分离分析中广泛使用TBE，使用者可以有效地进行分析。另外，可在短时间完成电泳，得到非常鲜明的电泳像。即使使用TAE或TPE，也可以进行DNA的分离分析，然而，要花费电泳时间，与TBE相比，分析效率变差。

下面，采用本发明的在蛋白质电泳法中通用的电泳用缓冲液和本发明使用的保存稳定性良好的聚丙烯酰胺预制凝胶，对NDA的电泳法进行说明。

凝胶缓冲液含有Tris和甘氨酸，或者，含有Tris和包括甘氨酸在内的一种或二种以上的两性电解质及一元酸，理想的是Tris、甘氨酸、碱基解离常数范围为8.3＜pKb＜9.6的分子内具有相同数目阳离子性基团和阴离子性基团的氨基酸、盐酸及醋酸。在凝胶缓冲液中，如不含有包括甘氨酸在内的一种或二种以上的两性电解质，通过把凝胶缓冲液的pH设定在酸性一侧，则Tris的中和率提高，在电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分的边界附近，电位坡度的变化非常大。因此，在边界附近，分离对象易收缩，分级分子量范围变得非常窄。另外，由于电泳时间变得非常长，从作业效率考虑，是不理想的。

即使凝胶缓冲液的pH下降，在电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分的边界附近，电位坡度的变化变缓，为了与采用TBE及噢隆斯特尹·戴维斯的凝胶缓冲液的凝胶，具有同样的分级分子量范围，甘氨酸必须在凝胶缓冲液中。然而，凝胶缓冲液的pH愈达到酸性一侧，单独用甘氨酸，调节电位坡度变化的力愈不充分。这样，在凝胶缓冲液中，通过使甘氨酸和碱基解离常数的范围为8.3＜pKb＜9.6的分子内具有相同数目的阳离子性基团和阴离子性基团的氨基酸共存，可能使电泳凝胶中的电位坡度更加变缓.

与甘氨酸共存的氨基酸的pKb为8.3＜pKb＜9.6，理想的为9.0＜pKb＜9.6。当氨基酸的pKb为pKb＜8.3的场合，由于pKb比Tris的低，使凝胶缓冲液的pH改变，另外，分级分子量范围大大变宽。当氨基酸的pKb为pKb＞9.6的场合，因为pKb比甘氨酸高，无助于凝胶内电位坡度的变化变缓。当使用9.0＜pKb＜9.6的氨基酸时，从pKb低的依次往阳极一侧移动，则电泳凝胶内的电位坡度变缓。在9.0＜pKb＜9.6的氨基酸中有丝氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，理想的是丝氨酸。

另外，与甘氨酸共存的氨基酸，希望其分子内具有相同数目的阴离子性基团和阳离子性基团。与甘氨酸共存的氨基酸，在pH较pKb稍低时，全部阴离子性基团和全部阳离子性基团解离，变成电中性，在pH较pKb高时，只有阴离子性基团解离，由于阳离子基团受到抑制，从而带负电。因此，上述氨基酸显示出实际上是作为一元弱酸的行为，可作为假弱酸使用。在凝胶缓冲液中预先添加假弱酸，可使电泳凝胶中Tris的弱酸部分的电阻值降低，并且，在强酸根存在下，由于pH降低，达到电中性，无助于电导。

凝胶缓冲液的pH为6.5～7.5，理想的为6.5～7.0。当凝胶缓冲液的pH高于7.5时，聚丙烯酰胺凝胶发生随时间变化的水解，预制凝胶的保管有效期限不可能长。当凝胶缓冲液的pH低于6.5时，聚丙烯酰胺凝胶的稳定性变好，然而，电泳像不鲜明，不耐用。

本发明所用的电泳用缓冲液，是含有Tris及甘氨酸的噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液。噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液的组成为0.025mol/l的Tris、0.192mol/l的甘氨酸，pH为8.3。上述组成的缓冲液，是蛋白质的分离分析中广泛使用的电泳用缓冲液，作业者可以有效地进行分析，另外，可以得到非常鲜明的电泳像。

另外，也可以使用电泳用的缓冲液组成为0.025mol/l的Tris、0.192mol/l的甘氨酸、0.1％(w/v)SDS的作为蛋白质分析法所通用的莱姆理电泳用缓冲液。在DNA的分离分析和蛋白质的分离分析中可使用同样的电泳用缓冲液，使作业效率提高、成本降低。

下面通过实施例说明本发明，然而，本发明又不受这些实施例所局限。

【实施例1】

在横向宽12cm、纵向宽10cm的长方形玻璃板和上部具有凹状切口的同尺寸的玻璃板之间，插入厚度1mm的隔板和用来防止单体液体漏失的硅密封垫，组成玻璃极板。往丙烯酰胺的浓度10％(％T；液中的单体浓度总和。下同)、BIS浓度5％(％C；BIS浓度。下同)，以及表1中记载浓度的缓冲液的组成所构成的单体溶液中，分别添加APS以及TEMED并混合后，使APS达到0.0025mol/l以及使TEMED达到0.0075mol/l，把该溶液注入极板内，于25℃使其聚合，得到电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。

采用上述得到的电泳用的聚丙烯酰胺凝胶，用从市场购得的蛋白质分子量标记器进行电泳，测定移动距离。蛋白质分子量标记器，用2-巯基乙醇、SDS进行处理，再添加7％(重量)的甘氨酸以及0.05％(重量)的溴酚蓝(下面称作BPB)供作试验。电泳用的缓冲液的组成为Tris0.025mol/l、甘氨酸0.192mol/l、SDS为0.1％(重量)的莱姆理配方。电泳，用20mA的恒电流进行，BPB的电泳末端在离下部5mm的地方停上通电。染色，在0.25％(体积)的科麦西亮蓝(クマシ-ブリリァントブル-、下面称作CBB)G-250、10％(体积)的醋酸、30％(体积)的甲醇溶液中，用振荡机进行45分钟振荡；脱色，在7％(体积)的醋酸、3％(体积)的甲醇溶液中，用振荡机进行90分钟振荡。表2为制造后不久的移动度，而表3为于5℃保存6个月后的移动度。所谓移动度，即用参数表示的蛋白质移动距离。

(移动度％)＝(从池的下端至各带位置的距离)/

             (从池的下端至BPB电泳末端的距离)×100

表1  电泳凝胶缓冲液的组成

	试样-1	试样-2	比较试样-1	比较试样-2	比较试样-3
						Tris(mol/l)	0.082	0.080	0.375	0.075	0.082
甘氨酸(mol/l)	0.167	0.162	-	0.192	0.182
						丝氨酸(mol/l)	0.025	0.03	-	-	-
联甲苯胺(mol/l)	-	-	-	-	0.01
						pH	6.8	6.3	8.8	6.8	6.8

表2  制造后不久的移动度(％)

	试样-1	试样-2	比较试样-1	比较试样-2	比较试样-3
						蛋白质分子量94,000	23.81	22.49	23.07	26.78	24.49
蛋白质分子量43,000	50.79	50.24	50.48	53.55	48.47
						蛋白质分子量20,100	91.53	94.26	92.91	-	77.04
电泳像的鲜明度	鲜明	鲜明	鲜明	鲜明	鲜明

表3  5℃保存6个月后的移动度(％)

	试样-1	试样-2	比较试样-1	比较试样-2	比较试样-3
						蛋白质分子量94,000	26.67	28.43	17.10	25.51	24.02
蛋白质分子量43,000	52.31	55.39	42.20	54.08	47.98
						蛋白质分子量20,100	94.36	96.08	88.99	-	76.40
电泳像的鲜明度	鲜明	鲜明	不鲜明	鲜明	鲜明

使用凝胶缓冲液的酸中和率低的莱姆理凝胶缓冲液制成的凝胶，由于pH高，在长期保存时移动度降低，分离能力恶化。Tris的中和率升高，在凝胶缓冲液中只添加作为两性电解质的甘氨酸时，长期保存时未发现移动度降低，然而，低分子区域未被检出。另外，凝胶缓冲液的pH达到6.8时，添加联甲苯胺(8.3＞pKb)作为甘氨酸和共存两性电解质时，分级分子量范围大幅度增大。

反之，作为甘氨酸和共存两性电解质，当使用9.0＜pKb＜9.6的丝氨酸时，从pKb低的一侧依次向阳极一侧移动，凝胶内的电位坡度变化平缓。因此，Tris的中和率上升，即使缓冲液的pH达到6.8或6.3，仍与采用莱姆理凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围，另外，凝胶的长期保存，未见移动度降低。

【实施例2】

采用与实施例1同样的玻璃极板，使用丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表4中记载的浓度的缓冲液组成构成的单体溶液缓冲液组成，制造10％聚丙烯酰胺凝胶，把制成的凝胶于5℃下保存12个月。保存后，用腾西隆(テンシロン)万能试验机(株式会社ォリェンテック，型式U-2129)把玻璃极板上下拉伸，测定其拉伸强度。结果示于表5。

表4  电泳凝胶缓冲液的组成

	试样-3	试样-4	比较试样-4
				Tris(mol/l)	0.082	0.080	0.09375
甘氨酸(mol/l)	0.167	0.162	0.192
				丝氨酸(mol/l)	0.025	0.03	-
联甲苯胺(mol/l)	-	-	-
				pH	6.3	6.8	7.5

表5  玻璃极板的拉伸强度(kgf)

	制造后不久	5℃2个月后	5℃4个月后	5℃6个月后	5℃8个月后	5℃10个月后	5℃12个月后
								试样-3	1.85	1.83	1.88	1.83	1.85	1.85	1.83
试样-4	1.83	1.80	1.78	1.73	0.85	0.388	-
								比较试样-4	1.80	0.65	0.52	-	-	-	-

通过降低凝胶缓冲液的pH，不仅蛋白质的移动度，而且，预制凝胶的形状也保持稳定。聚丙烯酰胺凝胶，当水解时，易发生膨润，预制凝胶的玻璃极板易于滑动。在pH7.5时，凝胶的水解易于进行，错开玻璃极板所必须的力(拉伸强度)，于5℃保存2个月后变成约1/3。反之，在凝胶缓冲液的pH6.8时，玻璃极板的拉伸强度，于5℃保存6个月时，与制造后不久保持相同的程度，另外，凝胶缓冲液的pH在6.3时，由于接近丙烯酰胺自身的pH，与pH6.8相比，凝胶的水解速度显著减少。结果是，保存1年的长时间，未见凝胶形状发生变化，是稳定的。

【实施例3】

在横向宽12cm、纵向宽10cm的长方形玻璃板和上部具有凹状切口的同尺寸的玻璃板之间，插入厚1mm的隔板，组成玻璃极板。往丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表6记载的浓度的缓冲液组成所构成的单体溶液中，添加APS400ppm以及四甲基乙二胺(下面称作TEMED)400ppm，混合后，把该溶液注入极板内，用常规方法使其聚合，得到电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。

采用上述聚丙烯酰胺凝胶，使分子量已知的市场购得的标记DNA进行电泳，确认移动距离和带的鲜明度。标记DNA是，30％(w/v)的蔗糖、含着色BPB的10m mol/l的Tris、以及1m mol/l的ETA、以及20m mol/l的氯化钠溶液，用经盐酸把pH调至7.9的缓冲液稀释100倍，用于试验。电泳用的缓冲液的组成是0.0892mol/l的Tris、0.0890mol/l的硼酸、2.5m mol/l的ETA。于200V的恒电压进行电泳，把经BPB着色的电极液放入上部电极槽。BPB的电泳末端达到隔板下端时，通电中止。采用银染色法进行染色。电泳后的凝胶，在50％(v/v)甲醇、5％(w/v)三氯醋酸、3.5％(w/v)磺基水扬酸水溶液中，浸透20分钟，固定DNA，然后，用纯净水进行水洗15分钟，进行2次。然后，把凝胶在8％碳酸钠水溶液和1％(w/v)硅钨酸、0.02％(w/v)硝酸银、0.02％(w/v)硝酸铵、0.28％(v/v)甲醛水溶液以1∶1的比例加以混合的溶液中浸透，进行染色。7分钟后，凝胶上出现带，弃去染色液，于1％(v/v)醋酸中浸15分钟，停止染色。结果是，可以检出鲜明的DNA带。各种DNA断片的电泳距离对BPB电泳距离的相对位置作为移动度，记入表7中。

(移动度％)＝(从池的下端至各带位置的距离)/

(从池的下端至BPB电泳末端的距离)×100

另外，各种凝胶的电泳时间记入表8中。

表6  电泳凝胶缓冲液的组成

	试样-5	试样-6	试样-7
				Tris(mol/l)	0.094	0.082	0.080
甘氨酸(mol/l)	0.192	0.167	0.167
				丝氨酸(mol/l)	-	0.025	0.025
盐酸(mol/l)	0.080	0..0695	0.068
				pH	7.5	用醋酸调节至6.8	用醋酸调节至6.3

表7  DNA断片的移动度(制造后不久)

	试样-5	试样-6	试样-7
				断片尺寸  495bp	25.91％	31.82％	31.78％
断片尺寸  210bp	45.30％	53.79％	50.93％
				断片尺寸  162bp	53.79％	63.33％	59.35％
断片尺寸  79bp	81.06％	89.39％	88.32％
				电泳像	鲜明	鲜明	鲜明

表8  电泳时间  200V恒电压

试样-5	试样-6	试样-7
			49分	52分	50分

如表6、表7及表8所示，用凝胶缓冲液pH为6.3、6.8及7.5的各种聚丙烯酰胺凝胶，使用TBE对DNA断片电泳的场合，任何一种均可得到鲜明的电泳像，DNA断片的移动度以及电泳时间也几乎相同。

【比较例1】

采用与实施例3同样的玻璃极板，使用由丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表9中记载的浓度的缓冲液组成构成的单体溶液，与实施例3同样，制造电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。用该聚丙烯酰胺凝胶，把分子量已知的市场购得的标记DNA进行电泳，确认移动距离和带的鲜明度。电泳用缓冲液是使用了组成为0.025mol/l的Tris以及0.192mol/l的甘氨酸的噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液。各DNA断片的电泳距离对BPB电泳距离之比作为移动度，示于表10。另外电泳时间示于表11。

表9  电泳凝胶缓冲液的组成

	试样-5
		Tris(mol/l)	0.080
甘氨酸(mol/l)	0.172
		丝氨酸(mol/l)	0.030
盐酸(mol/l)	0.068
		pH	用醋酸调节至6.3

表10  DNA断片的移动度(制造后不久)

	比较试样-5
		断片尺寸  495bp	不鲜明
断片尺寸  210bp	不鲜明
		断片尺寸  162bp	不鲜明
断片尺寸  79bp	不鲜明
		电泳像	不鲜明

表11  电泳时间  20mA恒电流

比较试样-5
	80分

如表9、表10及表11所示，采用凝胶缓冲液的pH为6.3的聚丙烯酰胺凝胶，使用噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液，进行DNA断片电泳，DNA带不鲜明，不可能检出。

【实施例4】

采用与实施例3同样的玻璃极板，使用由丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表12中记载的浓度的缓冲液组成所构成的单体溶液，与实施例3同样，制造电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。把上述聚丙烯酰胺凝胶保管在5℃下，隔一定时间取出，使用与实施例3同样的TBE，进行DNA断片的电泳。电泳在200V的恒电压下进行，在经过50分钟时停止电泳，确认移动距离和带的鲜明度。其结果示于表13、表14及表15。

表12  电泳凝胶缓冲液的组成

	试样-8	试样-9	试样-10
				Tris(mol/l)	0.094	0.082	0.080
甘氨酸(mol/l)	0.192	0.167	0.167
				丝氨酸(mol/l)	-	0.025	0.025
盐酸(mol/l)	0.080	0.070	0.068
				pH	7.5	用醋酸调节至6.8	用醋酸调节至6.3

表13  5℃下长期保存时，DNA断片的移动度变化(试样-8)

	制造后不久	2个月后	4个月后	6个月后
					断片尺寸495bp	30.80％	26.22％	17.72％	18.75％
断片尺寸210bp	52.85％	44.44％	35.04％	32.03％
					断片尺寸162bp	62.36％	52.89％	42.91％	39.05％
断片尺寸79bp	90.87％	79.56％	70.47％	不鲜明
					电泳像	鲜明	鲜明	鲜明	不鲜明

表14  5℃下长期保存时，DNA断片的移动度变化(试样-9)

	制造后不久	2个月后	4个月后	6个月后
					断片尺寸495bp	26.20％	22.91％	23.25％	18.50％
断片尺寸210bp	47.16％	41.41％	41.67％	34.80％
					断片尺寸162bp	55.90％	49.34％	50.00％	42.29％
断片尺寸79bp	85.59％	77.97％	78.51％	68.72％
					电泳像	鲜明	鲜明	鲜明	鲜明

表15  5℃下长期保存时，DNA断片的移动度变化(试样-10)

	制造后不久	3个月后	5个月后	7个月后
					断片尺寸495bp	31.78％	31.05％	31.05％	30.52％
断片尺寸210bp	50.93％	49.61％	50.23％	50.23％
					断片尺寸162bp	59.35％	57.99％	58.45％	59.15％
断片尺寸79bp	88.32％	87.21％	86.76％	87.79％
					电泳像	鲜明	鲜明	鲜明	鲜明

如表13所示，凝胶缓冲液的pH为7.5的聚丙烯酰胺凝胶，即使在5℃下也要发生随时间变化的水解，由于产生阴离子基团，DNA的移动速度也变慢。当经过6个月时，低分子断片不可能检出。如表14所示，凝胶缓冲液的pH为6.8的聚丙烯酰胺凝胶，与pH7.5时相比，水解速度降低，然而，还是在5℃下，也是经过6个月，发现DNA的移动速度有大的变化。

与其相比，如表15所示，凝胶缓冲液的pH为6.3的聚丙烯酰胺凝胶，于5℃下，即使经过7个月，DNA的移动度、电泳像也未发现变化，是稳定的。

【实施例5】

在横向宽12cm、纵向宽10cm的长方形玻璃板和上部具有凹状切口的同尺寸的玻璃板之间，插入厚度1mm的隔板，组成玻璃极板。往由丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表16中记载的浓度的缓冲液组成所构成的单体溶液中，添加APS 400ppm及TEMED 400PPm加以混合后，把该溶液注入极板内，用常规方法进行聚合，得到电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。把分子量已知的市场购得的标记DNA，用上述聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，确认移动距离和带的鲜明度。标记DNA是把含30％(w/v)的蔗糖、含着色BPB的10m mol/l的Tris、1mmol/l的ETA以及20m mol/l的氯化钠溶液，用经盐酸调至pH7.9的缓冲液稀释100倍，用于试验。电泳用缓冲液是使用了0.025mol/l的Tris以及0.192mol/l的甘氨酸的噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液。电泳在20mA的恒电流下进行，把经BPB着色的电极液放入上部电极槽内。BPB的电泳末端达到隔板的下端时中止通电。用银染色法染色。电泳后的凝胶，用50％(v/v)甲醇、5％(w/v)三氯醋酸、3.5％(w/v)磺基水扬酸水溶液浸透20分钟使DNA固定，然后，用纯净水洗涤15分钟，进行2次。然后，把凝胶浸透在8％碳酸钠水溶液和1％(w/v)硅钨酸、0.02％(w/v)硝酸银、0.02％(w/v)硝酸铵、0.28％(v/v)甲醛水溶液以1∶1的比例加以混合的溶液中，进行染色。7分钟后，带呈现，弃去染色液，在1％(v/v)醋酸中浸15分钟，使染色停止。结果是，可以检出鲜明的DNA带。各种DNA断片电泳距离对BPB电泳距离的相对位置作为移动度，记入表17中。

(移动度％)＝(从池的下端至各带位置的距离)/

(从池的下端至BPB电泳末端的距离)×100

另外，各种凝胶的电泳时间记入表18中。

表16  电泳凝胶缓冲液的组成

	试样-11	试样-12	试样-13
				Tris(mol/l)	0.5	0.094	0.082
甘氨酸(mol/l)	-	0.192	0.167
				丝氨酸(mol/l)	-	-	0.025
盐酸(mol/l)	#	0.080	0.070
				pH	#用盐酸调节至8.8	7.5	用醋酸调节至6.8

表17  DNA断片的移动度(制造后不久)

	试样-11	试样-12	试样-13
				断片尺寸  495bp	33.03％	26.01％	26.03％
断片尺寸  210bp	45.87％	45.98％	47.00％
				断片尺寸  162bp	52.29％	54.19％	55.46％
断片尺寸  79bp	73.39％	81.55％	85.09％
				电泳像	鲜明	鲜明	鲜明

表18  电泳时间  20mA恒电流

试样-11	试样-12	试样-13
			74分	80分	79分

如表16、表17及表18所示，用凝胶缓冲液的pH为7.5及6.8的各种聚丙烯酰胺凝胶，使用噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液对DNA断片进行电泳的场合，均可得到鲜明的电泳像，DNA断片的移动度及电泳时间，也与使用pH8.8的噢隆斯特尹·戴维斯的凝胶缓冲液的凝胶相同。

另外，试样-12及试样-13，于5℃保存时的移动度变化，示于表19及20。

表19  5℃下长期保存时，DNA断片的移动度变化(试样-12)

	制造后不久	2个月后	4个月后	6个月后
					断片尺寸495bp	26.01％	22.48％	20.01％	14.69％
断片尺寸210bp	45.98％	38.35％	33.89％	26.48％
					断片尺寸162bp	54.19％	45.45％	41.56％	34.25％
断片尺寸79bp	81.55％	67.12％	60.57％	不鲜明
					电泳像	鲜明	鲜明	鲜明	不鲜明

表20  5℃下长期保存时，DNA断片的移动度变化(试样-13)

	制造后不久	2个月后	4个月后	6个月后
					断片尺寸495bp	26.03％	22.91％	20.84％	17.40％
断片尺寸210bp	47.00％	42.56％	40.50％	35.02％
					断片尺寸162bp	55.46％	49.12％	47.56％	43.58％
断片尺寸79bp	85.09％	79.80％	76.12％	70.48％
					电泳像	鲜明	鲜明	鲜明	鲜明

【比较例2】

采用与实施例5同样的的玻璃极板，使用由丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表21中记载的浓度的缓冲液组成所构成的单体溶液，与实施例5同样，制造电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。使用上述聚丙烯酰胺凝胶，把分子量已知的市场购得的标记DNA进行电泳，确认移动距离与带的鲜明度。电泳用缓冲液是使用了组成为0.025mol/l的Tris、以及0.192mol/l的甘氨酸的噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液。各种DNA断片的电泳距离对BPB电泳距离之比作为移动度示于表22，电泳时间示于表23。

表21  电泳凝胶缓冲液的组成

	比较试样-6	比较试样-7
			Tris(mol/l)	0.5	0.5
甘氨酸(mol/l)	-	-
			丝氨酸(mol/l)	-	-
盐酸(mol/l)	#	#
			pH	用盐酸调节至8.8	用盐酸调节至7.5

表22  DNA断片的移动度(制造后不久)

	比较试样-6	比较试样-7
			断片尺寸495bp	33.03	49.32
断片尺寸210bp	45.87	74.43
			断片尺寸162bp	52.29	85.39
断片尺寸79bp	73.39	-
			电泳像	鲜明	鲜明

表23  电泳时间  20mA恒电流

比较试样-6	比较试样-7
		74分	216分

如表21、表22及表23所示，凝胶缓冲液，因其溶液中不含甘氨酸，在用Tris及盐酸调节pH至7.5的情况下，电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分的电位坡度上升，因分离对象在边界附近易于收缩，故分级分子量范围变得非常窄。另外，电泳时间也变得非常长，分析效率变差。

另外，比较试样-6于5℃保存时的移动度变化示于表24。

表24  5℃下长期保存时，DNA断片的移动变化(比较试样-6)

	制造后不久	2个月后	4个月后	6个月后
					断片尺寸495bp	33.03％	16.15％	-	-
断片尺寸210bp	45.87％	21.58％	-	-
					断片尺寸162bp	52.29％	32.41％	-	-
断片尺寸79bp	73.39％	不鲜明	-	-
					电泳像	鲜明	不鲜明	-	-

【实施例6】

用与实施例5同样的玻璃极板，采用由丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及实施例5的表16中记载的试样-12、试样-13浓度的缓冲液组成所构成的单体溶液，与实施例5同样，制造电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。采用电泳凝胶，把分子量已知的市场购得的标记DNA进行电泳，确认移动距离和带的鲜明度。电泳用缓冲液是使用了0.025mol/l的Tris、0.192mol/l的甘氨酸以及0.1％(w/v)SDS的莱姆理电泳用缓冲液，用20mA的恒电流进行电泳。各种DNA断片的电泳距离对BPB电泳距离之比作为移动度，记入表25。另外，电泳时间记入表26。

表25  DNA断片的移动度(制造后不久)

	试样-12	试样-13
			断片尺寸495bp	25.99％	26.00％
断片尺寸210bp	45.93％	48.89％
			断片尺寸162bp	54.10％	55.05％
断片尺寸79bp	81.00％	84.89％
			电泳像	鲜明	鲜明

表  26电泳时间  20mA恒电流

试样-12	试样-13
		81分	79分

如表25及表26所示，作为电泳用缓冲液，即使使用含SDS的蛋白质分析通用的莱姆理的电泳用缓冲液，也可以进行DNA断片鲜明的分离分析。

【比较例3】

用与实施例6同样的玻璃极板，使用由丙烯酰胺浓度10％(％T)、BIS浓度5％(％C)以及表27中记载的浓度的缓冲液组成所构成的单体溶液，与实施例6同样，制造电泳用的聚丙烯酰胺凝胶。用上述聚丙烯酰胺凝胶，把分子量已知的从市场购得的标记DNA进行电泳，确认移动距离和带的鲜明度。电泳用缓冲液是采用了组成为0.025mol/l的Tris、0.192mol/l的甘氨酸以及0.1％(重量/体积)SDS的莱姆理电泳用缓冲液。各种DNA断面的电泳距离对BPB电泳距离之比作为移动度，示于表28，另外，电泳时间示于表29。

表27  电泳凝胶缓冲液的组成

	比较试样-8
		Tris(mol/l)	0.5
甘氨酸(mol/l)	-
		丝氨酸(mol/l)	-
盐酸(mol/l)	#
		pH	用盐酸调节至7.5

表28  DNA断片的移动度(制造后不久)

	比较试样-8
		断片尺寸  495bp	50.00％
断片尺寸  210bp	75.43％
		断片尺寸  162bp	86.28％
断片尺寸  79bp	-
		电泳像	鲜明

表29  电泳时间  20mA恒电流

比较试样-8
	210分

如表27、表28及表29所示，凝胶缓冲液中不含甘氨酸，使用含Tris以及经盐酸调至pH7.5的电泳凝胶，采用莱姆理的电泳用缓冲液使DNA断片电泳的场合，与采用噢隆斯特尹·戴维斯的电泳用缓冲液的场合同样，分级分子量的范围变得非常窄。另外，电泳时间也变得非常长，分析效率变坏。

本发明的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，其凝胶缓冲液中含有三(羟甲基)氨基甲烷和两性电解质，由于把凝胶的pH设定在中性～酸性范围，所以，聚丙烯酰胺凝胶的水解可抑制到某种程度，是保存稳定性良好的电泳凝胶。

因此，本发明的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，其保管有限期限可设定长时间，作为预制凝胶可预先大量生产使具有各种分离特性。也就是说，与本发明的聚丙烯酰胺预制凝胶加以组合，可用作蛋白质的电泳法使用的电泳用缓冲液，进行蛋白质及DNA的分离分析，另外，采用核酸电泳法通用的电泳用缓冲液，使DNA的分离分析成为可能。

因此，本发明的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，使用者可经济而有效地进行分析，在工业上使用有很大的可能性。

Claims (13)

1、一种电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，在该用于电泳法的预制凝胶中，含有的电泳用缓冲液是其组成为含三羟甲基氨基甲烷及至少两种两性电解质的水溶液，其特征是，

(1)三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.07mol/l～0.2mol/l，

(2)两性电解质由甘氨酸和1种以上的共存两性电解质所构成，

(a)上述共存两性电解质的碱基解离常数范围为8.3＜pKb＜9.6

(b)上述共存两性电解质的添加量，相对于上述甘氨酸为0.1～30％摩尔百分比，

(c)上述共存两性电解质和上述甘氨酸的总浓度为0.1～0.3mol/l，以及，

(3)采用pH6.0～6.8范围的缓冲液进行配制。

2、如权利要求1所述的电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶，其特征是，上述共存两性电解质的分子内具有同样数目的阴离子性基团和阳离子性基团。

3、如权利要求1或2所述的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，其特征是，上述共存两性电解质为丝氨酸、谷氨酰胺、色氨酸，消旋蛋氨酸以及苯丙胺酸中的任何一种。

4、一种电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶使用方法，其特征是，采用权利要求1中记载的电泳用预制凝胶和含有三羟甲基氨基甲烷及甘氨酸的电泳缓冲液，进行蛋白质的分离分析。

5、一种电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶的制造方法，其把丙烯酰胺、多官能团交联剂、水以及下述(1)及(2)组成的缓冲液构成的混合物，在pH6.0～6.8的条件下，在聚合引发剂存在下进行聚合，

(1)三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.07mol/l～0.1mol/l，以及

(2)两性电解质是由甘氨酸和1种以上的共存两性电解质所构成，

(a)上述共存两性电解质的碱基解离常数为8.3＜pKb＜9.6，

(b)上述共存两性电解质的添加量，相对于上述甘氨酸为0.1～30％摩尔百分比，以及

(c)上述共存两性电解质和上述甘氨酸的总浓度为0.1～30％摩尔百分比。

6、一种DNA的电泳法，其中，采用含有三羟甲基氨基甲烷的电泳用缓冲液和具有下述(1)及下述(2)特征的聚丙烯酰胺预制凝胶，

(1)上述聚丙烯酰胺预制凝胶中所含的凝胶缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷、必须含有甘氨酸的一种以上的两性电解质以及一元酸，pH调至6.0～7.5，以及

(2)上述凝胶缓冲液中所含的上述两性电解质，是含有碱基解离常数为8.3＜pKb＜9.6的分子内具有同等数目的阳离子性基团和阴离子性基团的氨基酸。

7、如权利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述凝胶缓冲液，至少含有一种作为上述一元酸的盐酸以及醋酸，把作为长期保存稳定性目的的pH调节至6.0～6.5。

8、如权利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述凝胶缓冲液，至少含有一种作为上述一元酸的盐酸以及醋酸，把作为长期保存稳定性目的的pH调节至6.5-7.5。

9、如权利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述电泳用的缓冲液，除三羟甲基氨基甲烷以外，还含有下述(1)及下述(2)，pH调至7.8～8.3。

(1)醋酸、磷酸及硼酸中的任何一种，以及除三羟甲基氨基甲烷以外，还含有下述(1)及下述(2)，pH调至7.8～8.3。

(1)醋酸、磷酸及硼酸中的任何一种，以及

(2)作为螯合剂的乙二胺四醋酸二钠。

10、如利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述电泳用的缓冲液含有作为上述一元酸的硼酸。

11、如权利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述电泳用的缓冲液，除含有三羟甲基氨基甲烷以外，还含有两性电解质，pH调至7.8～8.3。

12、如权利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述电泳用的缓冲液中含有的上述两性电解法为甘氨酸。

13、如权利要求6所述的DNA电泳法，其中，上述电泳用缓冲液中含有的上述两性电解质是甘氨酸，而上述电泳用的缓冲液还含有十二烷基硫酸盐。