KR100718191B1

KR100718191B1 - 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔, 그 제조방법및 그 겔을 사용한 전기영동법

Info

Publication number: KR100718191B1
Application number: KR1020017006718A
Authority: KR
Inventors: 스즈키미카
Original assignee: 하이모 가부시키가이샤
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2007-05-15
Also published as: WO2001040789A1; US6726821B1; EP1167962A4; CN1247990C; KR20010101094A; AU1649601A; CN1327537A; AU769771B2; EP1167962A1; EP1167962B1

Abstract

본 발명의 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 트리스와 글리신 또는 트리스, 글리신과 1종 이상의 양성전해질 및 1가의 산을 함유하고, 특정의 pH 범위로 조정된 겔완충액을 내포한다. 상기 겔은 냉장보존에서 6개월 이상으로 하여도, 범용되고 있는 래믈리의 완충액을 사용하여 단백질의 전기영동을 하는 경우, 또는 DNA의 전기영동시에 범용되고 있는 트리스 및 킬레이트제와, 아세트산, 인산, 붕산중 어느 하나의 산을 함유하는 영동용 완충액을 사용하여 DNA의 전기영동을 하는 경우, 제조직후와 동일한 분리능과 선명한 영동상이 얻어진다. 상기 겔은 냉장보존에서 4개월 이상으로 하여도 단백질의 전기영동시에 범용되고 있는 래믈리의 완충액 또는 오른스타인 데이비스의 완충액을 사용하여 DNA의 전기영동을 하는 경우, 제조직후와 동일한 분리능과 선명한 영동상이 얻어진다.

Description

전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔, 그 제조방법 및 그 겔을 사용한 전기영동법{PRECAST POLYACRYLAMIDE ELECTROPHORESIS GEL, PRODUCTION METHOD THEREOF AND ELECTROPHORESIS USING THE GEL}

본 발명은 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔, 그 제조방법 및 그 겔을 사용한 전기영동법에 관한 것이다.

전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 단백질, 당질, 지질 등의 생체를 구성하는 중요한 물질의 검출 및 정량분석을 목적으로 하여, 생물학, 의학, 스산학, 수의학 등의 많은 분야에서 기초적 연구수단으로서 널리 사용되고 있다. 특히, 폴리아크릴아미드겔은 인공적으로 합성된 물질이므로, 처리방법을 변경하므로써 분리특성이 다른 겔을 용이하게 제조할 수 있다. 그 때문에, 미리 여러가지의 분리특성을 갖도록 양산된 프리캐스트겔을 사용하는 것은 분석의 시간을 대폭 줄이고, 균일하게 재현성이 양호하므로 당해 분야에 있어서 생산 및 품질관리에 공헌하는 바가 크다. 양산된 프리캐스트겔은 그것을 공급할 때에 보존안정성이 양호하다는 것이 기대된다.

종래, 전기영동용 폴리아크릴아미드겔은 단백질의 생화학의약 분석용으로 오른스타인[L.Ornstein, Ann. N.Y. Acad. Sci. 121, 321~349(1964)]과 데이비스[B.J.Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci. 121, 404~427(1964)]에 의해 제안된 방법이나, 래믈리[U.K.Laemmli, Nature, 227, 680(1970)]에 의해 제안된 방법이 널리 사용되어, 사용자가 겔을 제조하여 사용할 수 있었다. 특히, 래믈리의 방법은 도데실황산나트륨(이하, SDS라 한다)을 겔이나 영동용 완충액에 첨가하므로써 손쉽게 단백질의 분자량이 추정될 수 있어, 널리 보급되어 있다. 래믈리의 방법은 겔 완충액으로서 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(이하, 트리스라 한다)의 염산에 의한 부분중화물을 사용하고, 영동용 완충액으로서 트리스 및 글리신염을 사용하고 있다(래믈리의 영동완충액). 이 방법으로 겔완충액은 pH가 8.8로 되도록, 트리스의 약 10∼20몰%를 염산에 의해 부분중화한다(래믈리의 겔완충액). 그러나, 래믈리의 겔완충액의 pH에서는 아미드기는 시간이 경과함에 따라 가수분해반응을 한다. 겔의 가수분해반응은 저온조건에서도 진행하기 때문에 폴리아크릴아미드겔은 부분적으로 음이온기를 갖게 된다. 이 결과, 단백질의 영동거리가 짧게 됨과 동시에, 분리상은 선명하지 않게 되므로, 겔을 오랜 기간 보존할 수 없다.

다음에, 핵산의 전기영동에 관해서 개관하여 본다. 분자생물학이 진전함에 따라서 DNA, RNA의 분석조제가 필요하게 되었지만, 이 핵산의 분석에는 아가로스 전기영동법 및 폴리아크릴아미드겔 전기영동법이 많이 사용되고 있다. 핵산은 중성완충액중에서는 강한 음성하전을 나타내고, 그 이동도는 지지체로서의 겔의 분자사(分子篩)효과에 의하므로, 대상으로 하는 핵산의 크기에 따라 0.3%∼2% 정도의 아가로스겔 또는 3.5%∼20% 정도의 폴리아크릴아미드겔이 많이 사용되고 있다.

아가로스겔은 비교적 큰 지름의 구멍을 갖고 있으므로, 고분자 핵산의 분리 분석을 대상으로 하는 경우에 사용되고 있다. 아가로스에는 전기침투의 강약, 겔강도, 융점 등이 다른 많은 종류가 있다. 또한, 아가로스는 천연물이므로, 동일회사의 동일제품이어도 배치에 의해 자주 성상에 차이가 나타난다. 또한, 아가로스겔 전기영동법을 조제에 사용하여 DNA를 정제하는 경우에 자주 아가로스중의 불순물이 혼입하여, 제한효소, DNA폴리머라아제, DNA리가아제 등의 산소활성을 저해하기 때문에, 페놀유출 등에 의한 정제법을 가미할 필요가 있다.

한편, 폴리아크릴아미드겔은 비교적 작은 지름의 구멍을 갖고 있으므로, 중분자∼저분자 핵산의 분리분석을 대상으로 하는 경우에 사용되고 있다. 폴리아크릴아미드겔은 합성품이므로, 화학적으로 고순도이고, 아가로스겔에서 나타나는 문제점은 없다. 또한, 폴리아크릴아미드겔은 처리방법을 변화시키므로써 분리특성이 다른 겔을 용이하게 제조할 수 있다. 그 때문에, 미리 여러가지의 분리능을 갖도록 양상된 프리캐스트겔을 사용하는 것은 분석의 시간을 대폭 줄이고, 균일하게 재현성이 양호하기 때문에, 당해 분야에 있어서 생산 및 품질관리에 공헌하는 바가 크다. 양산된 폴리아크릴아미드겔은 그것을 공급할 때에 보존안정성이 양호한 것이 기대된다. DNA의 전기영동에 사용하는 경우에 아가로스겔 및 폴리아크릴아미드겔의 완충액은 주로 pH 7.8∼8.3의 에틸렌디아민사아세트산(이하, EDTA라 한다) 또는 에틸렌디아민사아세트산이나트륨(이하, ETA라 한다)을 포함하는 트리스-아세트산완충액(이하, TAE라 한다), 트리스-붕산완충액(이하, TBE라 한다), 트리스-인산완충액(이하, TPE라 한다)으로서, 겔완충액과 영동용 완충액의 조성이 동등한 연속완충액계이다.

전술한 바와 같이, 양산된 프리캐스트겔은 그것을 공급할 때에, 보존안정성이 양호한 것이 기대된다. 보존안정성이 양호한 겔을 제조하는 방법으로는, 트리스, 양성전해질 및 산으로 이루어지는 겔완충액을 내포하고, 장기보존안정성이 우수하고, 또한 측정가능한 분자량 범위를 현저하게 확대한 폴리아크릴아미드겔의 제조방법이 특개평 제 4-184163호 공보에 개시되어 있다. 이 제조방법에 의한 폴리아크릴아미드 전기영동겔은 래믈리의 영동용 완충액을 사용하여 분석가능하고, 양성전해질을 함유하는 pH 4.0∼7.5의 겔완충액을 내포하는 것이고, 그 실시예에 있어서, pH 6.9∼7.4의 겔의 제조가 예시어 있고, 냉장보존으로 4개월 동안은 단백질의 이동도에 변화 없이 안정한 것으로 되어 있다.

겔완충액은 폴리아크릴아미드겔의 가수분해를 억제할 목적으로 트리스의 중화율이 높게 설정되고, 또한 영동겔중의 트리스 강산부분과 트리스 약산부분의 경계부근에서의 전위구배(電位勾配)의 변화를 양성전해질의 첨가에 의해 완만하게 하고, 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 분별(fractionated)분자량 범위를 유지하는 것을 의도하고 있다.

그러나, pH 6.9∼7.4의 범위의 겔완충액을 내포한 폴리아크릴아미드겔은 냉장보존으로 5개월 이상 경과하면, 단백질의 이동도에 변화가 현저하다. 또한, 슬래브겔의 경우, 폴리아크릴아미드겔은 겔의 형상이 변화하고, 유리플레이트가 어긋나기 쉽게 된다. 그 결과, 영동분석상의 처리가 악화되고, 유리의 어긋남에 의한 겔의 박리 등의 문제도 생긴다. 겔완충액의 pH를 6.8 이하로 하면, 보존안정성 또한 향상한다는 것이 추측된다. 그러나, 영동시간이 길게 되고, 분리능이 악화하는 문 제가 있고, 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 유지한 폴리아크릴아미드겔을 얻을 수 없다.

또한, 특표평 제 9-512907호 공보에는 중성 pH의 장수명 프리캐스트 전기영동겔을 위한 시스템이 표시되어 있다. 상기 시스템의 겔완충액은 pH가 중성부근인 1가 유기아민 또는 치환아민을 함유하고, 약 6∼7 사이의 pH로 염산으로 적정되어 있다. 상기 시스템의 영동용 완충액은 MOPS, MES, ACES, MOPSO, TES, HEPES 및 TAPSO로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양성이온을 포함하고, 수산화나트륨 또는 유기염기로 약 7의 pH로 적정되어 있다. 겔완충액, 영동용 완충액을 함께 중성으로 설정하므로써, 폴리아크릴아미드겔의 가수분해를 억제함과 동시에, 단백질이 완전히 환원된 상태 그대로 분리되는 완충액 시스템이다. 상기 전기영동용 시스템은 12개월 동안 안정한 것으로 되어 있다.

그러나, 특표평 제 9-512907호 공보에 표시되어 있는 시스템에서는 전용의 분자량 마커를 사용하지 않으면 안된다. 또한, 특표평 제 9-512907호 공보에 표시되어 있는 폴리아크릴아미드겔은 공지의 영동용 완충액(예컨대, 범용으로 이용되고 있는 글리신을 함유하는 래믈리의 영동용 완충액)을 사용하면, 영동속도가 매우 느리게 되어, 단백질의 분리분석에 사용하는 것이 불가능하다.

폴리아크릴아미드겔은 pH를 중성∼산성 영역으로 설정하면, 폴리아크릴아미드겔의 가수분해를 어느 정도 억제하는 것이 가능하고, 보존안정성이 양호한 전기영동겔로 된다. 따라서, pH를 중성∼산성 영역으로 설정한 폴리아크릴아미드겔은 보관유효기한을 길게 설정하는 것이 가능하고, 프리캐스트겔로서 미리 여러가지의 분리특성을 갖도록 양산할 수 있다. 즉, 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 단백질의 전기영동법으로서 사용되고 있는 영동용 완충액과 조합하여 DNA의 분리분석을 행하는 것, 또는 핵산의 전기영동법으로서 범용되고 있는 영동용 완충액과 조합하여 DNA의 분리분석을 행하는 것이 가능하다면, 사용자가 경제적이고 또한 효율적으로 분석을 수행할 수 있다.

본 발명의 제 1의 목적은, 상기 과제를 해결하기 위하여 냉장보존으로 6개월 이상 단백질의 분리능 및 겔의 형상이 모두 안정하고, 또한 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조된 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 유지시킨 폴리아크릴아미드프리캐스트겔을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 2의 목적은, 상기 과제를 해결하기 위하여 냉장보존으로 6개월 이상 안정한 전기영동용 폴리아크릴아미드겔과, 핵산의 분리분석에 범용되고 있는 영동용 완충액을 사용하여 DNA의 선명한 분리분석을 행하는 전기영동법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 3의 목적은, 상기 과제를 해결하기 위하여 냉장보존으로 4개월 이상 안정한 단백질 분석용으로서 사용가능한 전기영동용 폴리아크릴아미드겔과, 단백질 분석용의 영동용 완충액을 사용하여 DNA의 선명한 분리분석을 행하는 전기영동법을 제공하는 것이다.

본 발명은 영동용 완충액의 조성이 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 양성전해질을 함유하는 수용액인 전기영동법에 사용되는 폴리아크릴아미드프리캐스트겔 에 있어서, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 농도가 0.07mol/ℓ∼0.2mol/ℓ의 범위이고, 상기 양성전해질이 글리신과 1종 이상의 공존 양성전해질로 이루어지고, 상기 공존 양성전해질의 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6의 범위에 있고, 상기 공존 양성전해질의 첨가량이 상기 글리신에 대해서 0.1∼30mol%의 범위에 있고, 상기 공존 양성전해질과 상기 글리신의 농도의 합계가 0.1∼0.3mol%의 범위에 있고, 또한 pH가 6.0∼6.8의 범위에 있는 완충액을 사용하여 조제되어 있는 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔에 관한 것이다.

이 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 냉장보존으로 6개월 이상 단백질의 분리능 및 겔의 형상이 모두 안정하고, 또한 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조된 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 유지하는 것이다.

상기 공존 양성전해질은 분자내에 음이온성기와 양이온성기를 동수 갖는 아미노산이다.

상기 공존 양성전해질은 세린, 글루타민, 트립토판, 메티오닌 및 페닐알라닌의 적어도 어느 하나이다.

또한, 본 발명은 아크릴아미드, 다관능가교제, 물 및 하기 (1) 및 (2)의 조성의 완충액으로 이루어지는 혼합물을 pH가 6.0∼6.8의 범위에 있는 조건으로 중합개시제의 존재하에 중합하는 것으로 이루어지는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 제조방법에 관한 것이다.

(1) 트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 농도가 0.07mol/ℓ∼0.2mol/ℓ의 범위에 있는 것,

(2) 양성 전해질이 글리신과 1종 이상의 공존 양성전해질로 이루어지고,

a) 상기 공존 양성전해질의 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6의 범위에 있고,

b) 상기 공존 양성전해질의 첨가량이 상기 글리신에 대해서 0.1∼30mol%의 범위에 있고,

c) 상기 공존 양성전해질과 상기 글리신의 농도의 합계가 0.1∼0.3mol/ℓ의 범위에 있는 것.

이 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 제조방법에 의해 6개월 이상 분리능 및 형상안정성이 양호한 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔을 효율적으로 제조하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명은 도데실황산염이 존재하는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 글리신을 함유하는 영동용 완충액을 사용하여, 단백질의 분리분석을 행하는 것으로 이루어지는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 사용방법에 관한 것이다.

이 방법에 의해 단백질의 분리분석에 범용되고 있는 래믈리의 영동용 완충액을 사용하여, 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조된 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 갖게 하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명은 하기 (1) 및 (2)의 특징을 갖는 폴리아크릴아미드프리캐스트겔과 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 함유하는 영동용 완충액을 사용하는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법에 관한 것이다.

(1) 상기 폴리아크릴아미드프리캐스트겔에 함유되는 겔완충액은 상기 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 글리신을 필두로 한 1종 이상의 양성전해질 및 1가의 산을 함유하고, pH가 6.0∼7.5의 범위로 조정되어 있는 것,

(2) 상기 겔완충액에 함유되는 상기 양성전해질은 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6이고, 분자내에 양이온성기와 음이온성기를 동수 갖는 아미노산을 함유하고 있는 것.

상기 겔완충액은 상기 1가의 산으로서 염산 및 아세트산의 적어도 하나를 함유하고, 장기 보존안정성을 목적으로 하여 pH가 6.0∼6.5의 범위로 조정되어 있는 것으로 이루어진다.

또한, 상기 겔완충액은 상기 1가의 산으로서 염산 및 아세트산의 적어도 하나를 함유하고, 장기 보존안정성을 목적으로 pH가 6.5∼7.5의 범위로 조정되어 있는 것으로 이루어진다.

상기 영동용 완충액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 이외에, 하기 (1) 및 (2)를 함유하고, pH가 7.8∼8.3의 범위로 조정되어 있다.

(1) 아세트산, 인산 및 붕산중 어느 하나 및

(2) 킬레이트제로서 에틸렌디아민사아세트산이나트륨.

상기 영동용 완충액은 상기 1가의 산으로서 붕산을 함유한다.

상기 영동용 완충액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 이외에 양성전해질을 함유하고, pH가 7.8∼8.3의 범위로 조정되어 있다.

상기 영동용 완충액에 함유되는 상기 양성전해질은 글리신이다.

또한, 상기 영동용 완충액에 함유되는 상기 양성전해질은 글리신이고, 상기 영동용 완충액은 도데실황산염을 더 함유한다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 따른 장기보존 안정성을 갖는 단백질의 분리분석을 행하기 위한 겔은 겔중에 함유되는 완충액의 조성이 트리스, 글리신 및 1종 이상의 공존 양성전해질로 이루어지고, 겔중의 트리스 농도는 0.07mol/ℓ∼0.2mol/ℓ, 바람직하게는 0.08mol/ℓ∼0.1mol/ℓ의 범위이다. 이 범위는 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 영동시간을 갖기 위하여 필요한 겔중의 리딩 이온(leading ion)의 양을 함유시킬 수 있는 범위이다. 겔중의 트리스 농도가 0.07mol/ℓ보다도 낮은 경우, 영동상 전체가 선명하지 않게 되어, 단백질의 분리분석에 사용하기 어렵게 된다. 겔중의 트리스 농도가 0.2mol/ℓ보다 높은 경우, 겔중의 리딩 이온 농도가 높게 되고, 영동시간이 연장되어, 분석의 작업효율이 악화된다.

상기 양성전해질은 글리신과 1종 이상의 공존 양성전해질로 이루어지고, 상기 공존 양성전해질의 염기해리정수의 범위는 8.3<pKb<9.6, 바람직하게는 9.0<pKb<9.6이다. 글리신 단독으로는 겔완충액의 pH를 7 이하로 한 경우, 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 유지하는 것이 불가능하다. 또한, 공존 양성전해질이 pKb<8.3인 경우에는 트리스보다도 pKb가 낮게 되기 때문에, 겔완충액의 pH를 변화시키고, 또한 분별분자량 범위가 대폭 넓어지게 된다. 공존 양성전해질이 pKb>9.6인 경우에는 글리신보다도 염기해리정수 가 높게 되기 때문에, 겔내의 전위구배의 변화를 완만하게 하는 작용에 기여하지 않는다. 공존 양성전해질에 9.0<pKb<9.6인 세린, 트립토판, 페닐알라닌 등을 사용하면, pKb가 낮은 것부터 차례로 양극측으로 이동하여, 겔내의 전위구배의 변화는 완만하게 된다. 따라서, 본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 가질 수 있다.

본 발명의 공존 양성전해질의 첨가량은 글리신에 대해서 0.1∼30mol%, 바람직하게는 1∼20mol%이다. 상기 공존 양성전해질의 첨가량이 0.1mol%보다 낮은 경우, 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 갖는 효과가 나타나지 않고, 역으로 30mol%보다도 많이 첨가한 경우는 겔상의 영동상이 선명하지 않아서 실용적으로 견딜수 없는 것으로 된다.

본 발명의 공존 양성전해질과 글리신의 농도의 합계는 0.1∼0.3mol/ℓ이고, 바람직하게는 0.1∼0.2mol/ℓ이다. 전체 양성전해질 농도가 0.1mol/ℓ보다도 적고, 0.3mol/ℓ보다도 많게 되면, 겔상의 영동상이 선명하지 않아서 실용적으로 견딜 수 없는 것으로 된다.

본 발명에 사용되는 양성전해질은 분자내에 음이온기와 양이온기를 동수 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 겔완충액중에서는, 양성전해질은 전체의 음이온성기와 전체의 양이온성기가 해리하여 전기적으로 중성으로 되고, pKb값보다도 높은 pH에서는 음이온성기만이 분리되고, 양이온성기의 해리가 억제되므로 마이너스로 대전된다. 이 때문에, 상기 양성전해질은 실질적으로 1가의 약산으로서의 거동을 나타낸다.

본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔, 그 사용법 및 그 제조방법에 사용되는 겔완충액의 pH는 6.0∼6.8이고, 바람직하게는 6.3이다. 완충액의 pH가 6.8보다도 높은 경우, 폴리아크릴아미드겔의 가수분해가 진행하기 쉽게 되어, 보관유효기한을 길게 가질 수 없다. 겔완충액의 pH가 6.0보다도 낮은 경우, 폴리아크릴아미드겔은 안정성은 양호하지만, 단백질의 영동상이 선명하지 않아서 실용적으로 견딜 수 없는 것으로 된다. 겔완충액의 pH는 pH 6.8에서는 냉장보존으로 6개월 정도, 또한 pH 6.3에서는 아크릴아미드 자체의 pH에 가깝기 때문에, pH 6.8에 비하여 가수분해 속도가 현저하게 감소한다. 그 결과 1년의 장기간 동안 겔의 형상 및 영동상은 모두 변화가 발견되지 않고 안정하다.

본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 사용법은 트리스 및 양성전해질을 함유하는 영동용 완충액을 사용하여 단백질을 분리분석하는 방법이고, 특히 트리스 0.025mol/ℓ, 글리신 0.192mol/ℓ, SDS 0.1중량%인 조성의 영동용 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 이 영동용 완충액은 조성이 래믈리에 의해 제안된 겔완충액이고, 단백질의 분리분석방법으로서 널리 보급되어 있으므로, 사용자가 경제적이고 또한 효율적으로 분석을 수행할 수 있다. 글리신 이외의 양성전해질, 예컨대 MOPS를 함유한 영동용 완충액을 사용하여도 단백질의 분리분석을 행할 수 있지만, 널리 보급되어 있는 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 것 보다도 겔의 분별분자량 범위가 넓어진다.

본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 제법은 겔완충액의 pH조정과 양성전해질의 첨가 이외에는 종래 공지의 전기영동 폴리아크릴아미드겔의 제조방법에 따라서 제조할 수 있다. 예컨대, 아크릴아미드와 공존하는 가교를 목적으로 한 수용성 디비닐화합물로서는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(이하, BIS라 한다)가 가장 많이 사용되고 있지만, 그 밖에 N,N'-디아릴주석산아미드 등의 일반적인 디비닐화합물을 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 제법에 있어서 모노머 수용액에는 겔에 탄력성을 갖게 하고, 겔강도를 향상시키기 위해서 아가로오스, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리메틸비닐에테르 등의 수용성 폴리머를 함유시킬 수 있고, 그 밖의 모노머를 공중합시킬 수도 있다.

본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 제법에 있어서 모노머의 중합은 중합개시제, 자외선조사 및 전리성(電離性) 방사선의 조사에 의해 발생하는 라디칼에 의해 행해진다. 중합개시제로서는 과황산암모늄(이하, APS라 한다) 등의 과산화물과, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(이하, TEMED라 한다) 등의 환원제를 병용하는 레독스형의 중합개시제가 상용되지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 과산화물 및 환원제는 전체 모노머에 대해서 0.05∼5%(중량/용량)가 사용된다. 중합온도는 개시제가 기능하는 온도이면, 특별히 한정되지 않지만, 통상 15∼50℃의 범위가 바람직하다.

다음에, 핵산의 분리분석에 범용되고 있는 영동용 완충액을 사용하고, 보존안정성이 양호한 본 발명의 폴리아크릴아미드프리캐스트겔을 사용한, DNA의 전기영동법에 관해서 설명한다.

겔완충액은 트리스, 글리신을 포함한 1종 또는 2종 이상의 양성전해질 및 1가의 산을 함유하고, 바람직하게는 트리스, 글리신, 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6인 분자내에 양이온성기와 음이온성기를 동수 갖는 아미노산, 염산 및 아세트산이다. 글리신을 포함하는 1종 또는 2종 이상의 양성전해질을 함유하지 않으면, 겔완충액의 pH를 산성측으로 설정할 경우 트리스의 중화율이 높아져서, 영동겔중의 트리스 강산부분과 트리스 약산부분의 경계부근에서의 전위구배의 변화가 상당히 크게 된다. 이 때문에, 경계부근에 분리대상이 모이기 쉽게 되어, 겔의 분별분자량 범위가 상당히 좁게 된다. 또한, 영동시간이 상당히 길게 되므로, 작업효율상 바람직하지 않다.

글리신은 겔완충액의 pH를 낮춘 경우에도, 영동겔중의 트리스 강산부분과 트리스 약산부분의 경계부근에 있어서의 전위구배의 변화를 완만하게 하면서, TBE나 오른스타인 데이비스의 겔완충액을 사용한 겔과 동일한 분별분자량 범위를 갖게 하기 때문에 필요하다. 그러나, 겔완충액의 pH가 산성측으로 되는 한, 글리신 단독으로는 전위구배의 변화를 조절하는 힘이 충분하지 않게 된다. 따라서, 겔완충액중에 글리신과 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6인 분자내에 양이온성기와 음이온성기를 동수 갖는 아미노산을 공존시키므로써 영동겔중의 전위구배를 보다 완만하게 하는 것이 가능하게 된다.

글리신과 공존시키는 아미노산의 pKb는 8.3<pKb<9.6이고, 바람직하게는 9.0<pKb<9.6이다. 글리신과 공존시키는 아미노산은 pKb<8.3의 경우, 트리스보다도 pKb가 낮게 되므로, 겔완충액의 pH를 변화시키고, 또한 겔의 분별분자량 범위를 대 폭 넓게 한다. 글리신과 공존시키는 아미노산은 pKb>9.6의 경우, 글리신보다도 pKb가 높게 되기 때문에, 겔내의 전위구배의 변화를 완만하게 하는 작용에 기여하지 않는다. 9.0<pKb<9.6인 아미노산을 겔완충액에 사용하면, pKb가 낮은 것부터 차례로 양극측으로 이동하여, 영동겔 내의 전위구배는 완만하게 된다. 9.0<pKb<9.6인 아미노산에는 세린, 트립토판, 페닐알라닌 등이 있지만, 바람직하게는 세린이다.

또한, 글리신과 공존시키는 아미노산은 분자내에 음이온성기와 양이온성기를 동수 갖는 것이 바람직하다. 아미노산은 pKb보다도 약간 낮은 pH에서는 전체의 음이온성 기와 전체의 양이온성기가 해리하여 전기적으로 중성으로 되고, pKb보다도 높은 pH에서는 음이온성기만이 해리하여 양이온성기의 해리가 억제되므로 마이너스로 대전한다. 이 때문에, 상기 아미노산은 실질적으로 1가의 약산으로서의 거동을 나타내게 되고, 의사(疑似)약산으로서 사용하는 것이 가능하다. 미리 겔완충액중에 의사약산을 첨가하여 두는 것은 영동겔중의 트리스 약산부분의 전기저항치를 저하시키고, 또한 강산 라디칼의 존재하에서는 pH가 낮기 때문에, 아미노산이 전기적으로 중성으로 되어, 전기전도에 기여하지 않는다.

또한, 겔완충액의 pH는 6.0∼7.5, 바람직하게는 6.0∼6.5이다. pH가 7.5보다 높은 경우, 폴리아크릴아미드겔은 경시적으로 가수분해를 일으켜서, 프리캐스트겔의 보관유효기한을 길게 할 수 없다. pH가 6.0보다 낮은 경우, 폴리아크릴아미드겔로서의 안정성은 양호하게 되지만, 트리스의 중화율이 너무 올라가서 완충액으로서의 기능이 손상된다. 겔완충액의 pH는 폴리아크릴아미드프리캐스트겔에 장기보존 안정성을 갖게 하기 위하여, 아크릴아미드 자체의 pH에 가까운 것이 바람직하다.

또한, 영동용 완충액은 트리스 및 킬레이트제와 아세트산, 인산 및 붕산의 어느 하나의 산을 함유하고, 바람직하게는 붕산이다. 겔완충액의 pH를 6.0∼6.5로 설정한 경우, 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용하면, 영동상이 선명하지 않게 되어, DNA의 분리분석을 행할 수 없다. 본 발명에서 사용하는 TBE의 조성은 0.0892mol/ℓ(트리스), 0.0890mol/ℓ(붕산) 및 0.0025mol/ℓ(ETA)이고, pH가 8.3인 것이 바람직하다. 상기 조성의 완충액은 핵산의 분리분석에 있어서 널리 사용되고 있는 TBE이므로, 사용자가 효율 좋게 분석을 행할 수 있다. 또한, 단시간에 영동이 완료되고, 상당히 선명한 영동상을 얻는 것이 가능하다. TAE 또는 TPE를 사용하여도 DNA의 분리분석은 가능하지만, 영동시간이 걸리고, TBE에 비하여 분석효율이 악화된다.

다음에, 본 발명에 의해 단백질의 전기영동법에서 범용되고 있는 영동용 완충액과, 본 발명에서 사용하는 보존안정성이 양호한 폴리아크릴아미드프리캐스트겔을 사용한 DNA의 전기영동법에 관해서 설명한다.

겔완충액은 트리스와 글리신 또는 트리스와 글리신을 포함하는 1종 또는 2종 이상의 양성전해질 및 1가의 산을 함유하고, 바람직하게는 트리스, 글리신, 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6인 분자내에 양이온성기와 음이온성기를 동수 갖는 아미노산, 염산 및 아세트산이다. 겔완충액에 글리신을 포함하는 1종 또는 2종 이상의 양성전해질을 함유하지 않으면, 겔완충액의 pH를 산성측으로 설정할 경우 트리스의 중화율이 높아지고, 영동겔중의 트리스 강산부분과 트리스 약산부분의 경계부근에서 전위구배의 변화가 상당히 크게 된다. 이 때문에 경계부근에 분리대상이 모 이기 쉽게 되어, 분별분자량 범위가 상당히 좁게 된다. 또한, 영동시간이 상당히 길게 되므로, 작업효율상 바람직하지 않다.

글리신은, 겔완충액의 pH를 낮추어도 영동겔중의 트리스강산부분과 트리스약산부분의 경계부근에 있어서의 전위구배의 변화를 완만하게 하고, TBE나 오른스타인 데이비스의 겔완충액을 사용한 겔과 동일한 분별분자량 범위를 갖게 하기 때문에, 겔완충액중에 필요하다. 그러나, 겔완충액의 pH가 산성측으로 되는 한, 글리신 단독으로는 전위구배의 변화를 조절하는 힘이 충분하지 않게 된다. 따라서, 겔완충액중에 글리신과 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6인 분자내에 양이온성기와 음이온성기를 동수 갖는 아미노산을 공존시키므로써 영동겔중의 전위구배를 보다 완만하게 하는 것이 가능하게 된다.

글리신과 공존시키는 아미노산의 pKb는 8.3<pKb<9.6이고, 바람직하게는 9.0<pKb<9.6이다. 아미노산의 pKb가 pKb<8.3인 경우, 트리스보다도 pKb가 낮게 되기 때문에, 겔완충액의 pH를 변화시키고, 또한 분별분자량 범위를 대폭 넓게 한다. 아미노산의 pKb가 pKb>9.6인 경우, 글리신보다도 pKb가 높게 되기 때문에, 겔내의 전위구배의 변화를 완만하게 하는 작용에 기여하지 않는다. 9.0<pKb<9.6인 아미노산을 사용하면, pKb가 낮은 것부터 차례로 양극측으로 이동하여, 영동겔내의 전위구배는 완만하게 된다. 9.0<pKb<9.6인 아미노산에는 세린, 트립토판, 페닐알라닌 등이 있지만, 세린이 바람직하다.

또한, 글리신과 공존시키는 아미노산은 분자내에 음이온성기와 양이온성기를 동수 갖는 것이 바람직하다. 글리신과 공존시키는 아미노산은 pKb보다 약간 낮은 pH에서는 전체의 음이온성기와 전체의 양이온성기가 해리하여, 전기적으로 중성으로 되며, pKb보다 높은 pH에서는 음이온성기만이 해리하고, 양이온성기의 해리가 억제되므로 마이너스로 대전한다. 이 때문에, 상기 아미노산은 실질적으로 1가의 약산으로서의 거동을 나타내게 되고, 의사약산으로서 사용하는 것이 가능하다. 미리 겔완충액중에 의사약산을 첨가하여 두는 것은 영동겔중의 트리스 약산부분의 전기저항치를 저하시키고, 더욱이 강산 라디칼의 존재하에서는 pH가 낮기 때문에, 아미노산이 전기적으로 중성으로 되어 전기전도에 기여하지 않는다.

겔완충액의 pH는 6.5∼7.5, 바람직하게는 6.5∼7.0이다. 겔완충액의 pH가 7.5보다 높은 경우, 폴리아크릴아미드겔은 경시적으로 가수분해를 하여, 프리캐스트겔의 보관유효기한을 길게 할 수 없다. 겔완충액의 pH가 6.5보다도 낮은 경우, 폴리아크릴아미드겔의 안정성은 양호하게 되지만, 영동상이 선명하지 않아서 사용에 견딜 수 없게 된다.

본 발명에서 사용하는 영동용 완충액은 트리스 및 글리신을 함유한 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액이다. 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액 조성은 0.025mol/ℓ트리스, 0.192mol/ℓ글리신이고, pH가 8.3이다. 상기 조성의 완충액은 단백질의 분리분석에 있어서 널리 사용되고 있는 영동용 완충액이므로, 작업자가 효율 좋게 분석을 행할 수 있고, 또한 상당히 선명한 영동상을 얻는 것이 가능하다.

또한, 영동용 완충액의 조성이 0.025mol/ℓ트리스, 0.192mol/ℓ글리신, 0.1%(w/v)SDS인 단백질 분석법으로서 범용되고 있는 래믈리의 영동용 완충액도 사 용가능하다. DNA의 분리분석과 단백질의 분리분석에서 동일한 영동용 완충액이 사용가능한 것은 작업효율의 향상, 비용 삭감에 기여한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

가로폭 12cm, 세로 10cm의 장방형의 유리판과, 상부에 오목상의 노치부가 들어간 같은 치수의 유리판의 사이에, 두께 1mm의 스페이서와 모노머액이 흘러 넘치지 않도록, 실리콘의 실(seal)을 끼워서, 유리플레이트를 조립한다. 아크릴아미드 농도 10%(%T ; 액중의 단량체 농도의 합계. 이하, 동일.), BIS 농도 5%(%C ; BIS의 농도. 이하, 동일.) 및 표 1에 기재하는 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머용액에 대해서, APS 0.0025mol/ℓ 및 TEMED 0.0075mol/ℓ로 되도록, 각각을 첨가혼합후, 그 용액을 플레이트 내에 주입하고, 25℃하에서 중합시켜 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 얻었다.

상기에서 얻어진 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 시판되는 단백질 분자량 마커를 전기영동하고, 이동거리를 측정하였다. 단백질 분자량 마커는 2-메르캅토에탄올, SDS를 사용하여 처리하고, 더욱이 7중량% 글리세린 및 0.05중량% 브로모페놀블루(이하, BPB라 한다)를 가하여 시험에 제공하였다. 영동용 완충액의 조성은 트리스 0.025mol/ℓ, 글리신 0.192mol/ℓ, SDS 0.1중량%의 래믈리 처방이다. 전기영동은 20mA 정전류에서 행하고, BPB의 영동말단이 아래로부터 5mm의 위치에 도달했을때 통전을 중지하였다. 염색은 0.25용량% 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)(이하, CBB라 한다) G-250, 10용량% 아세트산, 30용량% 메탄올 용액중에서 진탕기를 사용하여 45분간 행하고, 탈색은 7용량% 아세트산, 3용량% 메탄올 용액중에서, 진탕기를 사용하여 90분간 행하였다. 표 2는 제조직후의 이동도이고, 또한 표 3은 5℃에서 6개월간 보존 후의 이동도이다. 이동도는 단백질의 이동거리를 퍼센트로 표시한 것이다.

(이동도%) = (웰(well) 하단으로부터 각 밴드의 위치까지의 거리) /

(웰 하단으로부터 BPB의 영동말단까지의 거리)×100

표 1 [영동겔 완충액 조성]

	시료-1	시료-2	비교시료-1	비교시료-2	비교시료-3
트리스 (mol/ℓ)	0.082	0.080	0.375	0.075	0.082
글리신 (mol/ℓ)	0.167	0.162	-	0.192	0.182
세린 (mol/ℓ)	0.025	0.03	-	-	-
트리신 (mol/ℓ)	-	-	-	-	0.01
pH	6.8	6.3	8.8	6.8	6.8

표 2 [제조직후의 이동도(%)]

	시료-1	시료-2	비교시료-1	비교시료-2	비교시료-3
단백질 분자량 94,000	23.81	22.49	23.07	26.78	24.49
단백질 분자량 43,000	50.79	50.24	50.48	53.55	48.47
단백질 분자량 20,100	91.53	94.26	92.91	-	77.04
영동상의 선명도	선명	선명	선명	선명	선명

표 3 [5℃, 6개월간 보존후의 이동도(%)]

	시료-1	시료-2	비교시료-1	비교시료-2	비교시료-3
단백질 분자량 94,000	26.67	28.43	17.10	25.51	24.02
단백질 분자량 43,000	52.31	55.39	42.20	54.08	47.98
단백질 분자량 20,100	94.36	96.08	88.99	-	76.40
영동상의 선명도	선명	선명	불선명	선명	선명

겔완충액의 산에 의한 중화율이 낮은 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔은 높은 pH 때문에, 장기보존에 의한 이동도가 저하하고, 분리능이 악화한다. 트리스의 중화율을 높이고, 겔완충액중에 양성전해질로서 글리신만을 첨가한 경우, 장기보존에 의한 이동도 저하는 나타나지 않지만, 저분자 영역이 검출되지 않는다. 또한, 겔완충액의 pH를 6.8로 하고, 글리신과 공존 양성전해질로서 트리신(8.3>pKb)을 첨가한 경우, 분별분자량 범위가 대폭 넓어진다.

이에 대해서, 글리신과 공존 양성전해질로서 9.0<pKb<9.6인 세린을 사용하면, pKb가 낮은 것부터 차례로 양극측으로 이동하여, 겔내의 전위구배의 변화는 완만하게 된다. 따라서, 트리스의 중화율을 높이고, 완충액 pH를 6.8 또는 6.3으로 하여도, 래믈리의 겔완충액을 사용하여 제조한 겔의 측정대상과 동등한 분별분자량 범위를 가질 수 있고, 또한 겔의 장기보존에 의한 이동도 저하는 나타나지 않는다.

<실시예 2>

실시예 1과 동일한 유리플레이트를 사용하고, 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS농도 5%(%C) 및 표 4에 기재하는 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용 액 완충액 조성에 따라서 10% 폴리아크릴아미드겔을 제조하고, 제조된 겔을 5℃하에서 12개월간 보존하였다. 보존후, 텐시론만능시험기(주식회사 오리엔틱, 형식U-2129)로 유리플레이트를 상하로 잡아 당겨, 그 인장강도를 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.

표 4 [영동겔 완충액 조성]

	시료-3	시료-4	비교시료-4
트리스(mol/L)	0.082	0.080	0.09375
글리신(mol/L)	0.167	0.162	0.192
세린(mol/L)	0.025	0.03	-
트리신(mol/L)	-	-	-
pH	6.3	6.8	7.5

표 5 [유리플레이트의 인장강도(kgf)]

	제조직후	5℃ 2개월 후	5℃ 4개월 후	5℃ 6개월 후	5℃ 8개월 후	5℃ 10개월 후	5℃ 12개월 후
시료-3	1.85	1.83	1.88	1.83	1.85	1.85	1.83
시료-4	1.83	1.80	1.78	1.73	0.85	0.388	-
비교시료 -4	1.80	0.65	0.52	-	-	-	-

겔완충액의 pH를 낮추므로써 단백질의 이동도 뿐만 아니라 프리캐스트겔의 형상도 안정하게 유지될 수 있다. 폴리아크릴아미드겔은 가수분해하면 팽윤하기 쉽게 되고, 프리캐스트겔의 유리플레이트가 어긋나기 쉽게 된다. pH 7.5에서는 겔의 가수분해는 진행하기 쉽고, 유리플레이트를 어긋나게 하는데 필요한 힘(인장강도)은 5℃ 보존, 2개월 후에는 약 1/3로 된다. 그에 비하여 겔완충액의 pH 6.8에서는 유리플레이트의 인장강도는 5℃보존 6개월까지 제조직후와 동일한 정도를 유지하게 되고, 또한 겔완충액의 pH 6.3에서는 아크릴아미드 자체의 pH에 가깝기 때문에 pH 6.8에 비하여 겔의 가수분해 속도가 현저하게 감소한다. 그 결과, 1년 정도의 장기 간 동안 겔의 형상에 변화는 나타나지 않고 안정하다.

<실시예 3>

가로폭 12cm, 세로 10cm의 장방형의 유리판과 상부에 오목상의 노치부가 들어간 같은 치수의 유리판의 사이에 두께 1mm의 스페이서를 끼워서 유리플레이트를 조립한다. 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 표 6에 기재하는 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액에 APS 400ppm 및 테트라메틸에틸렌디아민(이하, TEMED라 한다) 400ppm을 첨가하여 혼합한 후, 그 용액을 플레이트 내에 주입하고, 통상의 방법으로 중합시켜 전기영동용 폴리아크릴아미드를 얻었다.

상기 폴리아크릴아미드겔을 사용하여, 분자량이 이미 알려진 시판 마커 DNA를 전기영동하고, 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 마커 DNA는 30%(w/v)설탕, 착색하는 정도의 BPB를 포함하는 10mmol/ℓ트리스 및 1mmol/ℓETA 및 20mmol/ℓ염화나트륨용액을 염산으로 pH 7.9로 조정한 완충액으로 100배로 희석하여 시험에 사용하였다. 영동용 완충액의 조성은 0.0892mol/ℓ트리스, 0.0890mol/ℓ붕산, 2.5mmol/ℓETA이다. 전기영동은 200V 정전압에서 행하고, 상부 전극조에 BPB로 착색한 전극액을 넣었다. BPB의 영동말단이 스페이서의 하단에 도달한 시점에서 통전을 중지하였다. 염색은 은염색법을 사용하였다. 영동후의 겔은 50%(v/v)메탄올, 5%(w/v)트리클로로아세트산, 3.5%(w/v)술포살리틸산 수용액 중에서 20분간 침투시켜 DNA를 고정하고, 그 후 정제수로 15분간의 수세를 2회 행하였다. 그 후, 겔을 8% 탄산나트륨 수용액과 1%(w/v)옥텅스텐산, 0.02%(w/v)질산은, 0.02%(w/v)질산암모늄, 0.28%(v/v)포름알데히드 수용액을 1:1의 비율로 혼합시킨 액에 침투시켜 염 색하였다. 7분 후에 겔에 바인더가 출현하였기 때문에 염색액을 제거하고, 1%(v/v)아세트산에 15분간 담구어 염색을 정지시켰다. 그 결과, 선명한 DNA의 밴드가 검출되었다. BPB영동거리에 대한 각 DNA 단편의 영동거리의 상대위치를 이동도로서 표 7에 기재한다.

(이동도%) = (웰 하단으로부터 각 밴드의 위치까지의 거리)/

(웰 하단으로부터 BPB의 영동말단까지의 거리)×100

또한, 각 겔의 영동시간을 표 8에 기재한다.

표 6 [영동겔 완충액 조성]

	시료-5	시료-6	시료-7
트리스(mol/ℓ)	0.094	0.082	0.080
글리신(mol/ℓ)	0.192	0.167	0.167
세린(mol/ℓ)	-	0.025	0.025
염산(mol/ℓ)	0.080	0.0695	0.068
pH	7.5	아세트산으로 6.8로 조정	아세트산으로 6.3으로 조정

표 7 [DNA 단편의 이동도(제조직후)]

	시료-5	시료-6	시료-7
단편 사이즈 495bp	25.91%	31.82%	31.78%
단편 사이즈 210bp	45.30%	53.79%	50.93%
단편 사이즈 162bp	53.79%	63.33%	59.35%
단편 사이즈 79bp	81.06%	89.39%	88.32%
영동상	선명	선명	선명

표 8 [영동시간 200V 정전압]

시료-5	시료-6	시료-7
49분	52분	50분

표 6, 표 7 및 표 8에 나타난 바와 같이, DNA 단편을 겔완충액 pH가 6.3, 6.8 및 7.5인 각 폴리아크릴아미드겔에서 TBE를 사용하여 영동한 경우, 모두 선명한 영동상이 얻어지고, DNA 단편의 이동도나 영동시간도 거의 동일하였다.

<비교예 1>

실시예 3과 동일한 유리플레이트를 사용하고, 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 표 9에 기재하는 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액으로, 실시예 3과 동일하게 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 제조하였다. 분자량이 이미 알려진 시판 마커 DNA를 이 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 전기영동하고, 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 영동용 완충액으로 조성이 0.025mol/ℓ트리스 및 0.192mol/ℓ글리신인 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용하였다. BPB영동거리에 대한 각 DNA 단편의 영동거리의 비를 이동도로서 표 10에 나타낸다. 또한, 영동시간을 표 11에 나타낸다.

표 9 [영동겔 완충액 조성]

	시료-5
트리스(mol/ℓ)	0.080
글리신(mol/ℓ)	0.172
세린(mol/ℓ)	0.030
염산(mol/ℓ)	0.068
pH	아세트산으로 6.3으로 조정

표 10 [DNA 단편의 이동도(제조직후)]

	비교시료-5
단편 사이즈 495bp	불선명
단편 사이즈 210bp	불선명
단편 사이즈 162bp	불선명
단편 사이즈 79bp	불선명
영동상	불선명

표 11 [영동시간 20mA 정전류]

비교시료-5

80분

표 9, 표 10 및 표 11에 나타난 바와 같이, DNA 단편을 겔완충액의 pH가 6.3인 폴리아크릴아미드겔에서, 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용하여 영동을 행하면, DNA의 밴드가 선명하지 않아서 검출불가능하였다.

<실시예 4>

실시예 3과 동일한 유리플레이트를 사용하고, 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 표 12에 기재하는 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액으로, 실시예 3과 동일하게 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 제조하였다. 상기 폴리아크릴아미드겔을 5℃하에서 보관하고, 일정기간마다 꺼내어 실시예 3과 동일하게 TBE를 사용하여 DNA 단편의 전기영동을 행하였다. 전기영동은 200V 정전압에서 행하고, 50분 경과한 시점에서 영동을 정지하여, 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 그 결과를 표 13, 표 14 및 표 15에 나타낸다.

표 12 [영동겔 완충액 조성]

	시료-8	시료-9	시료-10
트리스(mol/ℓ)	0.094	0.082	0.080
글리신(mol/ℓ)	0.192	0.167	0.167
세린(mol/ℓ)	-	0.025	0.025
염산(mol/ℓ)	0.080	0.070	0.068
pH	7.5	아세트산으로 6.8로 조정	아세트산으로 6.3으로 조정

표 13 [5℃하 장기보존에 의한 DNA 단편의 이동도 변화(시료-8)]

	제조직후	2개월 후	4개월 후	6개월 후
단편 사이즈 495bp	30.80%	26.22%	17.72%	18.75%
단편 사이즈 210bp	52.85%	44.44%	35.04%	32.03%
단편 사이즈 162bp	62.36%	52.89%	42.91%	39.06%
단편 사이즈 79bp	90.87%	79.56%	70.47%	불선명
영동상	선명	선명	선명	불선명

표 14 [5℃하 장기보존에 의한 DNA 단편의 이동도 변화(시료-9)]

	제조직후	2개월 후	4개월 후	6개월 후
단편 사이즈 495bp	26.20%	22.91%	23.25%	18.50%
단편 사이즈 210bp	47.16%	41.41%	41.67%	34.80%
단편 사이즈 162bp	55.90%	49.34%	50.00%	42.29%
단편 사이즈 79bp	85.59%	77.97%	78.51%	68.72%
영동상	선명	선명	선명	선명

표 15 [5℃하 장기보존에 의한 DNA 단편의 이동도 변화(시료-10)]

	제조직후	3개월 후	5개월 후	7개월 후
단편 사이즈 495bp	31.78%	31.05%	31.05%	30.52%
단편 사이즈 210bp	50.93%	49.61%	50.23%	50.23%
단편 사이즈 162bp	59.35%	57.99%	58.45%	59.15%
단편 사이즈 79bp	88.32%	87.21%	86.76%	87.79%
영동상	선명	선명	선명	선명

표 13에 나타난 바와 같이 겔완충액의 pH가 7.5인 폴리아크릴아미드겔은 5℃하에서도 경시적으로 가수분해를 일으키고, 발생하는 음이온기에 의해 DNA의 이동속도도 빠르게 된다. 6개월 경과하면 저분자의 단편은 검출불가능하게 되었다. 또한 표 14에 나타난 바와 같이, 겔완충액의 pH가 6.8인 폴리아크릴아미드겔은 pH가 7.5일 때에 비하여 가수분해 속도는 저하하지만, 역시 5℃하에서 6개월 경과하면, DNA의 이동속도에 큰 변화가 나타난다.

그에 비하여 표 15에 나타난 바와 같이, 겔완충액의 pH가 6.3인 폴리아크릴아미드겔은 5℃하, 7개월 경과하여도 DNA의 이동도, 영동상에 변화가 발견되지 않고 안정하였다.

<실시예 5>

가로폭 12cm, 세로 10cm의 장방형의 유리판과, 상부에 오목상의 노치부가 들어간 같은 치수의 유리판의 사이에, 두께 1mm의 스페이서를 끼워 유리플레이트를 조립한다. 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 표 16에 기재하는 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액에, APS 400ppm 및 TEMED 400ppm을 첨가혼합후, 이 용액을 플레이트내에 주입하고, 통상의 방법으로 중합시켜 전기영동 용 폴리아크릴아미드겔을 얻었다. 분자량이 이미 알려진 시판 마커 DNA를 상기 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 전기영동하고, 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 마커 DNA는 30%(w/v)설탕, 착색하는 정도의 BPB를 포함한 10mmol/ℓ트리스, 1mmol/ℓETA 및 20mmol/ℓ염화나트륨 용액을 염산으로 pH 7.9로 조정한 완충액으로 100배로 희석하여 시험에 사용하였다. 영동용 완충액에는 0.025mol/ℓ트리스 및 0.192mol/ℓ글리신인 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용하였다, 전기영동은 20mA 정전류에서 행하고, 상부 전극조에 BPB로 착색한 전극액을 넣었다. BPB의 영동 말단이 스페이서의 하단에 도달한 시점에서 통전을 중지하였다. 염색은 은염색법을 사용하였다. 영동후의 겔을 50%(v/v)메탄올, 5%(w/v)트리클로로아세트산, 3.5%(w/v)술포살리틸산 수용액중에서 20분간 침투시켜 DNA를 고정하고, 그 후 정제수로 15분간의 수세를 2회 행하였다. 그 후, 겔을 8% 탄산나트륨 수용액과 1%(w/v)옥텅스텐산, 0.02%(w/v)질산은, 0.02%(w/v)질산암모늄, 0.28%(v/v)포름알데히드 수용액을 1:1의 비율로 혼합시킨 액에 침투시켜 염색하였다. 7분 후에 밴드가 나타났기 때문에, 염색액을 제거하여 1%(v/v)아세트산에 15분 담구어 염색을 정지시켰다. 그 결과, 선명한 DNA의 밴드가 검출되었다. BPB영동거리에 대한 각 DNA 단편의 영동거리의 상대위치를 이동도로서 표 17에 기재한다.

(이동도%) = (웰 하단으로부터 각 밴드의 위치까지의 거리) /

(웰 하단으로부터 BPB의 영동 말단까지의 거리)×100

또한, 각 겔의 영동시간을 표 18에 기재한다.

표 16 [영동겔 완충액조성]

	시료-11	시료-12	시료-13
트리스(mol/ℓ)	0.5	0.094	0.082
글리신(mol/ℓ)	-	0.192	0.167
세린(mol/ℓ)	-	-	0.025
염산(mol/ℓ)	#	0.080	0.070
pH	# 염산으로 8.8로 조정	7.5	아세트산으로 6.8로 조정

표 17 [DNA 단편의 이동도(제조직후)]

	시료-11	시료-12	시료-13
단편 사이즈 495bp	33.03%	26.01%	26.03%
단편 사이즈 210bp	45.87%	45.98%	47.00%
단편 사이즈 162bp	52.29%	54.19%	55.46%
단편 사이즈 79bp	79.39%	81.55%	85.09%
영동상	선명	선명	선명

표 18 [영동시간 20mA 정전류]

시료-11	시료-12	시료-13
74분	80분	79분

표 16, 표 17 및 표 18에 나타난 바와 같이, DNA 단편을 겔완충액의 pH가 7.5 및 6.8인 각 폴리아크릴아미드겔에서, 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용하여 영동한 경우, 모두 선명한 영동상이 얻어지고, DNA 단편의 이동도나 영동시간도 pH 8.8의 오른스타인 데이비스의 겔완충액을 사용한 겔과 같은 정도였다.

또한, 시료-12 및 시료-13을 5℃에서 보존한 경우의 이동도의 변화를 표 19 및 20에 나타낸다.

표 19 [5℃하 장기보존에 의한 DNA 단편의 이동도 변화(시료-12)]

	제조직후	2개월 후	4개월 후	6개월 후
단편 사이즈 495bp	26.01%	22.48%	20.01%	14.69%
단편 사이즈 210bp	45.98%	38.35%	33.89%	26.48%
단편 사이즈 162bp	54.19%	45.45%	41.56%	34.25%
단편 사이즈 79bp	81.55%	67.12%	60.57%	불선명
영동상	선명	선명	선명	불선명

표 20 [5℃하 장기보존에 의한 DNA 단편의 이동도 변화(시료-13)]

	제조직후	2개월 후	4개월 후	6개월 후
단편 사이즈 495bp	26.03%	22.91%	20.84%	17.40%
단편 사이즈 210bp	47.00%	42.56%	40.50%	35.02%
단편 사이즈 162bp	55.46%	49.12%	47.56%	43.58%
단편 사이즈 79bp	85.09%	79.80%	76.12%	70.48%
영동상	선명	선명	선명	선명

<비교예 2>

실시예 5와 동일한 유리플레이트를 사용하고, 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 표 21에 기재한 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액으로, 실시예 5와 동일하게 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 제조하였다. 상기 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 분자량이 이미 알려진 시판 마커 DNA를 전기영동하여 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 영동용 완충액에는 조성이 0.025mol/ℓ트리스 및 0.192mol/ℓ글리신인 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용하였다. 표 22에 BPB영동거리에 대한 각 DNA 단편의 영동거리의 비를 이동도로 나타내고, 표 23에 영동시간을 나타낸다.

표 21 [영동겔 완충액 조성]

	비교시료-6	비교시료-7
트리스(mol/ℓ)	0.5	0.5
글리신(mol/ℓ)	-	-
세린(mol/ℓ)	-	-
염산(mol/ℓ)	#	#
pH	염산으로 8.8로 조정	염산으로 7.5로 조정

표 22 [DNA 단편의 이동도(제조직후)]

	비교시료-6	비교시료-7
단편 사이즈 495bp	33.03	49.32
단편 사이즈 210bp	45.87	74.43
단편 사이즈 162bp	52.29	85.39
단편 사이즈 79bp	73.39	-
영동상	선명	선명

표 23 [영동시간 20mA 정전류]

비교시료-6	비교시료-7
74분	216분

표 21, 표 22 및 표 23에 나타난 바와 같이, 겔완충액이 그 용액중에 글리신을 함유시키지 않고, 트리스 및 염산으로 pH 7.5로 조정되어 있는 경우, 영동겔중의 트리스 강산부분과 트리스 약산부분의 전위구배가 상승하고, 분리대상이 경계부근에 모이기 쉽게 되기 때문에, 분별분자량 범위가 상당히 좁게 되고 말았다. 또한, 영동시간도 상당히 길게 되어 분석효율이 악화되었다.

더욱이, 비교시료-6을 5℃에서 보존한 경우의 이동도의 변화를 표 24에 나타낸다.

표 24 [5℃하 장기보존에 의한 DNA 단편의 이동도 변화(비교시료-6)]

	제조직후	2개월 후	4개월 후	6개월 후
단편 사이즈 495bp	33.03%	16.15%	-	-
단편 사이즈 210bp	45.87%	21.58%	-	-
단편 사이즈 162bp	52.29%	32.41%	-	-
단편 사이즈 79bp	73.39%	불선명	-	-
영동상	선명	불선명	-	-

<실시예 6>

실시예 5와 동일한 유리플레이트를 사용하고, 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 실시예 5의 표 16에 기재한 시료-12, 시료-13의 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액으로, 실시예 5와 동일하게 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 제조하였다. 전기영동겔을 사용하여 분자량이 이미 알려진 시판 마커 DNA를 전기영동하고, 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 영동용 완충액에는 0.025mol/ℓ트리스, 0.192mol/ℓ글리신 및 0.1%(w/v)SDS인 래믈리의 영동용 완충액을 사용하고, 전기영동은 20mA 정전류에서 행하였다. 표 25에 BPB영동거리에 대한 각 DNA 단편의 영동거리의 비를 이동도로서 기재한다. 또한, 표 26에 영동시간을 기재한다.

표 25 [DNA 단편의 이동도(제조직후)]

	시료-12	시료-13
단편 사이즈 495bp	25.99%	26.00%
단편 사이즈 210bp	45.93%	48.89%
단편 사이즈 162bp	54.10%	55.05%
단편 사이즈 79bp	81.00%	84.89%
영동상	선명	선명

표 26 [영동시간 20mA 정전류]

시료-12	시료-13
81분	79분

표 25 및 표 26에 나타난 바와 같이, 영동용 완충액에 SDS를 함유하는 단백질 분석용으로 범용되고 있는 래믈리의 영동용 완충액을 사용하여도 DNA 단편의 선명한 분리분석을 행하는 것이 가능하다.

<비교예 3>

실시예 6과 동일한 유리플레이트를 사용하고, 아크릴아미드 농도 10%(%T), BIS 농도 5%(%C) 및 표 27에 기재한 농도의 완충액 조성으로 이루어지는 모노머 용액으로, 실시예 6과 동일하게 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 제조하였다. 상기 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 분자량이 이미 알려진 시판 마커 DNA를 전기영동하고, 이동거리와 밴드의 선명도를 확인하였다. 영동용 완충액에는 조성이 0.025mol/ℓ트리스, 0.192mol/ℓ글리신 및 0.1%(중량/용량)SDS인 래믈리의 영동용 완충액을 사용하였다. 표 28에 BPB 영동거리에 대한 각 DNA 단편의 영동거리의 비를 이동도로 나타내고, 또한 표 29에 영동시간을 나타낸다.

표 27 [영동겔 완충액 조성]

	비교시료-8
트리스(mol/ℓ)	0.5
글리신(mol/ℓ)	-
세린(mol/ℓ)	-
염산(mol/ℓ)	#
pH	염산으로 7.5로 조정

표 28 [DNA 단편의 이동도(제조직후)]

	비교시료-8
단편 사이즈 495bp	50.00%
단편 사이즈 210bp	75.43%
단편 사이즈 162bp	86.28%
단편 사이즈 79bp	-
영동상	선명

표 29 [영동시간 20mA 정전류]

비교시료-8

210분

표 27, 표 28 및 표 29에 나타난 바와 같이, 겔완충액에 글리신을 함유시키지 않고, 트리스 및 염산으로 pH 7.5로 조정되어 있는 영동겔을 사용하여, 래믈리의 영동용 완충액으로 DNA 단편을 영동한 경우, 오른스타인 데이비스의 영동용 완충액을 사용한 경우와 동일하게, 분별분자량 범위가 상당히 좁게 되었다. 또한, 영동시간도 상당히 길게 되어 분석효율이 악화되었다.

본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 겔완충액에 트리스(히드록시메틸)아미노메탄과 양성전해질을 함유하고, 겔 pH를 중성∼산성 영역으로 설정하고 있으므로, 폴리아크릴아미드겔의 가수분해를 어느 정도 억제하는 것이 가능하고, 보존안정성이 양호한 전기영동겔이다.

따라서, 본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 보관유효기한을 길게 설정하는 것이 가능하게 되고, 프리캐스트겔로서 미리 여러가지의 분리특성을 갖도록 양산할 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 폴리아크릴아미드프리캐스트겔과 조합시켜, 단백질의 전기영동법으로서 사용되고 있는 영동용 완충액을 사용하여, 단백질 및 DNA의 분리분석을 행하는 것이 가능하고, 또한 핵산의 전기영동법으로서 범용되고 있는 영동용 완충액을 사용하여 DNA의 분리분석이 가능하다.

따라서, 본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔은 사용자가 경제적으로 또한 효율적으로 분석을 수행할 수 있고, 산업상 이용에 큰 가능성을 갖는다.

Claims

영동용 완충액의 조성이 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 양성전해질을 함유하는 수용액인, 전기영동법에 사용되는 폴리아크릴아미드프리캐스트겔로서,

(1) 트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 농도가 0.07mol/ℓ∼0.2mol/ℓ의 범위이고,

(2) 양성전해질이 글리신과 1종 이상의 공존 양성전해질로 이루어지고,

a) 상기 공존 양성전해질의 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6의 범위에 있고,

b) 상기 공존 양성전해질의 첨가량이 상기 글리신에 대해서 0.1∼30mol%의 범위에 있고,

c) 상기 공존 양성전해질과 상기 글리신의 농도의 합계가 0.1∼0.3mol/ℓ의 범위에 있고,

(3) pH가 6.0∼6.8의 범위에 있는 완충액을 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔.
제 1항에 있어서, 상기 공존 양성전해질이 분자내에 음이온성기와 양이온성기를 동수 갖는 아미노산인 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔.
제 1항에 있어서, 상기 공존 양성전해질이 세린, 글루타민, 트립토판, 메티오닌 및 페닐알라닌의 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔.
제 1항의 전기영동용 프리캐스트겔과, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 글리신을 함유하는 영동용 완충액을 사용하여 단백질의 분리분석을 행하는 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 사용방법.
아크릴아미드, 다관능가교제, 물 및 하기 (1) 및 하기 (2)의 조성의 완충액으로 이루어지는 혼합물을, 혼합물의 pH가 6.0∼6.8의 범위에 있는 조건에서, 중합개시제의 존재하에 중합하는 것으로 이루어지는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 제조방법:

(1) 트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 농도가 0.07mol/ℓ∼0.1mol/ℓ의 범위에 있고,

(2) 양성전해질이 글리신과 1종 이상의 공존 양성전해질로 이루어지고,

a) 상기 공존 양성전해질의 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6의 범위에 있고,

b) 상기 공존 양성전해질의 첨가량이 상기 글리신에 대해서 0.1∼30mol%의 범위에 있고,

c) 상기 공존 양성전해질과 상기 글리신의 농도의 합계가 0.1∼0.3mol/ℓ의 범위에 있는 것.
도데실황산염이 존재하는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 글리신을 함유하는 영동용 완충액을 사용하여, 단백질의 분리분석을 행하는 것으로 이루어지는 전기영동용 폴리아크릴아미드프리캐스트겔의 사용방법.
하기 (1) 및 하기 (2)의 특징을 갖는 폴리아크릴아미드프리캐스트겔과 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 함유하는 영동용 완충액을 사용하는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법:

(1) 상기 폴리아크릴아미드프리캐스트겔에 함유되는 겔완충액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 글리신을 필수로 한 1종 이상의 양성전해질 및 1가의 산을 함유하고, pH가 6.0∼7.5의 범위로 조정되어 있고,

(2) 상기 겔완충액에 함유되는 상기 양성전해질은 염기해리정수의 범위가 8.3<pKb<9.6인 분자내에 양이온성기와 음이온성기를 동수 갖는 아미노산을 함유하고 있는 것.
제 7항에 있어서, 상기 겔완충액은 상기 1가의 산으로서 염산 및 아세트산의 적어도 하나를 함유하고, 장기보존 안정성을 목적으로 하여 pH가 6.0∼6.5의 범위로 조정되어 있는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법.
제 7항에 있어서, 상기 겔완충액은 상기 1가의 산으로서 염산 및 아세트산의 적어도 하나를 함유하고, 장기보존 안정성을 목적으로 하여 pH가 6.5∼7.5의 범위로 조정되어 있는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법.
제 7항에 있어서, 상기 영동용 완충액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 이외에 하기 (1) 및 하기 (2)를 함유하고, pH가 7.8∼8.3의 범위로 조정되어 있는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법:

(1) 아세트산, 인산 및 붕산중 어느 하나, 및

(2) 킬레이트제로서 에틸렌디아민사아세트산이나트륨.
제 7항에 있어서, 상기 영동용 완충액은 상기 1가의 산으로서 붕산을 함유하는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법.
제 7항에 있어서, 상기 영동용 완충액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 이외에 양성전해질을 함유하고, pH가 7.8∼8.3의 범위로 조정되어 있는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법.
제 7항에 있어서, 상기 영동용 완충액에 함유되는 상기 양성전해질은 글리신인 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법.
제 7항에 있어서, 상기 영동용 완충액에 함유되는 상기 양성전해질은 글리신이고, 상기 영동용 완충액은 도데실황산염을 더 함유하는 것으로 이루어지는 DNA의 전기영동방법.