KR0183040B1 - 전기영동용(電氣泳動用) 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액의 조성에 있어서, pKa 값이 5 이하인 산, pKa 값이 8∼8.5인 아민 및 pKa값이 7∼11인 양성전해질을 함유하는 수용액일 것 및 상기 겔 내의 전해질 용액 중의 아민과 산의 함유량 비가 1 : 0.6∼1g당량부이며, 산과 양성전해질의 함유량비가 1 : 0.5∼4g당량부인 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 겔 내의 전해질용액 중에 양성전해질을 공존시키므로써, 장기 보존 안정성이 우수하고, 또, 단백질, 핵산 등의 분리분석에 있어서 측정가능한 분자량 범위를 현저하게 확대할 수 있는 전기영동용 폴리아크릴아미드겔을 제조할 수 있다.

Description

전기영동용(電氣泳動用) 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법

본 발명은 생화학, 의약의 분야에 있어서, 생체유래물질(生體由來物質), 예를들면 단백질, 핵산 등의 분리분석에 사용되는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 관한 것이다.

종래, 전기영동용의 지지체로서 종이, 아가로즈(AGAROSE), 전분 등이 사용되고 있었으나, 그들은 분리능이 나쁘고, 밴드도 불선명 하였다.

근년, 폴리아크릴아미드를 지지체로 하는 겔 전기영동법이 확립되어, 높은 정밀도의 분자체 효과에 의한 고분해능을 기대할 수 있게 되었다.

그 중에서도 영동용 겔로서, 전해질 용액을 내포한 폴리아크릴아미드 가교물을 사용하는 방법은 아크릴아미드 농도와 가교제의 조성에 의해 겔의 포아 사이즈를 임의로 조절할 수 있으므로 현재의 겔 전기영동법에 있어서 주류로 되어 있으며, 분리하고자 하는 단백질, 핵산 등의 분자량에 의해 아크릴아미드 농도를 대체한 겔을 만들어 분석에 사용하고 있다.

즉, 일반으로 비교적 저분자량의 단백질, 핵산의 분리에는 고농도의 폴리아크릴아미드 겔이 사용되고, 고분자량의 단백질, 핵산의 분리에는 저농도의 폴리아크릴아미드 겔이 사용되고 있다.

이들의 기술에 관하여, 예를들면 특개소 63-502456호 공보, 특개소 62-91850호 공보, 특개평 2-22555호 공보 등이 있다.

즉, 특개소 63-502456호 공보에는, 전기영동분리법에 대한 완충용액의 공급방법이 개시되어 있다. 그 전기영동분리법에 대한 완충용액의 공급방법은, 통상은 액상으로 사용되는 전극액을 겔상으로 하여, 분리용 겔과의 접촉을 용이하게 한 것으로서, 겔판 형태의 지지메트릭스로 행하여지는 수평 전기영동분리법에 완충제 용액을 공급하는 것으로서, 2종의 전극완충제를 각각 하나의 겔편(片)에 혼입하여, 이들 겔편을 겔편 사이의 메트릭스가 사용가능한 분리영역을 제공하도록 지지메트릭스와 접촉시켜 놓는 것이다. 또, 겔편이 아가로즈 혹은 폴리아크릴아미드에서 되는 것이다. 또, 각 겔편에 있어서의 전극완충제의 함유량이 80~99중량% 범위내인 것이다.

또, 특개소 62-91850호 공보에는, 폴리아크릴아미드계 수성겔 전기영동용 매체의 제조방법이 개시되어 있다. 그 전기영동용 매체의 제조방법은, 아크릴아미드계 단량체, 가교제, 물 및 중합개시 수단의 존재하에 가교중합시킴에 있어서, 그 중합개시 수단이 과산화물 광증감제 및 여기광(餘起光)의 조합으로 되며, 환원제를 함유하지 않는 방법이다.

또, 특개평 2-22555호 공보에는, 전기영동겔 매체용 키트가 개시되어 있다. 그 전기영동겔 매체용 키트는 폴리아크릴아미드형 폴리머겔 매체를 편리하고 안정하게 형성하기 위한 키트이다.

또, 광범위의 분자량 분포를 가진 단백질이나 핵산을 분리하기 위하여, 전기 영동 방향에 대하여 아크릴아미드 농도를 연속적으로 변화시킨 그레이디언트(GRADIENT) 겔에 관한 기술로서, 예를들면 특개소 61-28512호 공보, 특개소 63-210654호 공보, 특개평 1-263548호 공보 등이 있다.

즉, 특개소 61-28512호 공보에는 전기영동겔 물질의 제법이 개시되어 있다.

그 전기영동겔 물질의 제법은, 중합을 수용성의 유기광 반응개시제를 사용하는 균일계 광중합, 혹은 광중합 수용액 중에 유기반응개시제를 현탁 또는 분산시킨 불균일계 광중합에 의해 개시하는, 연속적인 구멍구배를 가지는 그레이디언트 겔의 제법이다.

특개소 63-210654호 공보 및 특개평 1-263548호 공보에는, 전기영동용 매체에 대하여 개시되어 있다. 즉, 이들 공보에는 저분자량 부분에서 고분자량 부분까지 거의 동등의 양호한 고분리능을 가지는, 개량된 폴리아크릴아미드계 수성겔농도 그레이디언트를 가지는 겔 매체가 기재되어 있다.

또, 아크릴아미드농도를 단계적으로 변화시킨 전기영동용 겔을 제조하는 기술로서, 특개평 1-302153호 공보가 있다. 즉, 아크릴아미드농도가 다른 복수개의 모노머 수용액을 단계적으로 순차 겹겹으로 층을 만든 다음, 이것을 중합하여 얻어지는 전기영동용 겔의 제조방법이 기재되어 있다.

상기의 공지기술에 있어서, 겔을 구성하는 아크릴아미드 농도의 실용적인 범위는 4~20중량%이며, 4중량% 이하의 저농도에서는 겔강도가 작고, 20중량% 이상의 고농도에서는 용기면과의 사이에 박리가 일어나기 쉽다.

또, 단백질을 도데실유산나트륨(이하 SDS라 쓴다)으로 처리하여, 단백질 분자의 전하를 균등하게 하여 겔 전기영동을 하면, 분자량 차에만 따라 분리가 되어, 특히 겔 완충액으로서 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(이하 트리스라 쓴다)의 염산에 의한 부분중화물을 사용하여, 전기영동용 전극액으로서 트리스 글리신염을 사용하는 방법은 레무리[U. K. Laemmli, Nature Vol. 227, 680 (1970)]의 처방으로서 단백질의 분석에 상용(賞用)되고 있다. 이 레무리의 처방에 있어서의 겔의 전해질 용액에서는 pH가 8.8이 되도록 트리스의 약 10~20몰%를 염산에 의해 부분중화하고 있다.

상술한 바와같이, 레무리의 처방에 있어서는, 폴리아크릴아미드 겔이 내포하는 전해질 용액의 pH는 8.8이며, 아미드기는 경시적으로 가수분해 반응을 받는다. 가수분해반응은, 냉장고 보관과 같이 저온조건하에서도 진행하며, 폴리아크릴아미드 겔은 부분적으로 음이온기를 가지는 것으로 된다. 이 결과, 단백질의 전기영동거리가 짧게됨과 동시에 분리상은 불선명하게 된다. 가수분해를 방지하기 위하여 트리스의 중화율을 높여, 겔의 전해질 용액의 pH를 중성부근, 혹은 그 이하로 하면, 단백질의 분자량차에 의한 분리성능이 악화하여 실용으로 견딜 수 없는 것으로 된다.

또, 상술한 것과 같이 실용적인 겔 제작범위인 아크릴아미드농도 4~20%의 폴리아크릴아미드 겔에서는 측정 대상인 단백질의 분자량 범위도 한정되어 레무리의 전해질 용액을 사용한 경우, 아크릴아미드 농도 4%의 겔로 분자량 50만, 아크릴아미드 농도 20%의 겔로 분자량 2만의 단백질 분자를 분리하는 것이 한계이며, 측정 가능한 분자량 범위를 더욱 광범위하게 확대하는 것이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 상기의 과제를 해결하는 것으로서, 분자량 측정을 목적으로 한 전기영동법에 있어서, 장기 보존안정성이 뛰어나고, 또 측정가능한 분자량 범위를 현저하게 확대한 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 폴리아크릴아미드 겔은 그 겔내의 전해질용액으로서 특정의 pKa값의 아민, 양성전해질 및 산을 특정의 함유량비로 함유하는 수용액으로 되는 것을 특징으로 한다.

그 결과 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액의 pH는 아미드기의 가수분해가 일어나지 않는 범위로 저하시키면서, 전기영동중의 겔 내의 전위구배의 분포를 적정화 하므로써, 광범위의 분자량의 측정에 적합한 폴리아크릴아미드 겔을 제조할 수가 있다.

본 발명의 구체적인 구성은, 전기영동용 전극액의 조성이 아민 및 양성전해질을 함유하는 수용액인 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 그 겔 내의 전해질 용액의 조성이 산, 아민 및 양성전해질을 함유하는 수용액이어야 할 것 및 그 겔 내의 전해질용액중의 아민과 산의 함유량비가 함유비 1 : 0.6~1g 당량부이며, 산과 양성전해질의 함유비 1 : 0.5~4g 당량부이며, 양성전해질의 pKa 값이 7~11의 범위이며, 아민의 pKa 값이 8~8.5의 범위이며, 또 산의 pKa 값이 5이하인 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법을 제공하는 것이다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 전기영동용 전극액 중의 아민 및 겔 내의 전해질용액 중의 아민은 어느것이나 트리스(히드록시메틸)아미노메탄인 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 겔 내의 전해질용액의 pH는 4~7.5의 범위이다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 음극측의 전기 영동용 전극액 중에 0.01중량% 이상의 도데실유산염이 존재하는 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 도데실유산이온 부가 단백질을 전기영동에 사용하는 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 겔 내의 전해질용액 중의 양성전해질의 pKa 값은, 음극측의 전기영동용 전극액중의 양성전해질의 pKa 값과 동등 및/또는 그것 이하이다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 영동용 전극액 및 겔내 완충액에 사용되는 양성전해질은 동일 분자내에 동수의 음이온성기와 양이온성기를 가진다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성전해질이 글리신, 세린, 아스파라긴, β-알라닌, N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 중에서 선택되는 일종인 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성전해질이 글리신 또는 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신인 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 겔 내의 전해질용액에 사용되는 양성전해질이 글리신, 세린, 아스파라긴, β-알라닌, N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신, N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산 및 그들의 혼합물 중에서 선택되는 일종이어야 한다.

또는 복수종의 혼합물에서 되는 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 겔 내의 전해질용액에 사용되는 산은 1가의 산인 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 겔 내의 전해질용액에 사용되는 산은 염산, 초산 및 그들의 혼합물에서 선택되는 것이 특히 바람직하다.

또, 본 발명은 아크릴아미드를 가교제, 물, 겔 내의 전해질용액,중합개시수단의 존재하에 중합시켜 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔을 제조하는 방법에 있어서, 겔 내의 전해질용액의 조성이 산, 아민 및 양성전해질을 함유하는 수용액이며, 겔 내의 전해질용액 중의 아민과 산의 함유비가 1 : 0.6~1g 당량부이어야 할 것 및 산과 양성전해질의 함유비가 1 : 0.5~4g 당량부인 것을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 관한 것이다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 전 모노머에 대하여 1~10중량%의 디비닐 화합물을 공중합시킨다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 디비닐 화합물은 N.N-메틸렌 비스 아크릴아미드인 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 중합개시 수단은 레독스형의 중합개시제인 것이 바람직하다.

또, 이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 중합개시 수단으로서 과산화물 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민으로 되는 중합촉매를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

이 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에 있어서, 겔의 전해질용액을 구성하는 산은, 소량의 첨가로 전해질용액의 pH를 아미드기의 가수분해가 일어나지 않는 범위까지 저하시키므로, 해리정수가 큰 것이 바람직하고, pKa값이 5 이하인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 산은 염산, 1가의 수용성 유기산이다.

또, 본 발명에 사용하는 양성전해질은 분자내에 음이온성기와 양이온성기를 동수 가지는 것으로, pKa 값보다 약간 낮은 pH에서는 모든 음이온성기와 모든 양이온성기가 해리하여 전기적으로 중성이 되며, pKa 값보다 높은 pH에서는 음이온성기 만이 해리하여, 양이온성기의 해리가 억제되기 때문에 마이너스로 대전한다.

이 때문에 상기 양성전해질은 실질적으로 1가의 약산으로서의 거동을 나타내는 것으로서, 상기 함유량에 표시하는 그램 당량부는, 1가의 약산으로서 계산한다. pKa 값은 통상 20℃에서 측정되며, pKa 값이 11 이상의 양성전해질은 전위구배의 저하에 기여하지 않고, 7이하의 경우에는 리딩(LEADING) 이온(겔 내의 전해질용액 중에 존재하는 pKa5 이하의 산근(酸根)과 같이 유출해 버린다.

본 발명에 사용되는 양성전해질로서 글리신, 세린, 아스파라긴, β-알라닌, N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산(이하 TAPS라 쓴다), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신(이하 트리신이라 쓴다), N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산(이하 TES라 쓴다) 등이 있다.

겔 내의 전해질용액을 구성하는 양성전해질의 pKa 값은, 음극측의 전기영동용 전극액을 구성하는 양성전해질의 pKa 값보다 높아서는 안된다. 전위구배의 저하에 기여하는 양성전해질은, 전기영동용 전극액에서 겔 중에 이동해오는 양성전해질(트레이링 이온)과 동일 또는 낮은 pKa 값을 가질 필요가 있다. 겔 내의 전해질용액을 구성하는 양성전해질은 목적에 따라 1종 또는 2종 이상을 사용할 수가 있다.

복수종의 양성전해질을 병용한 경우에는 pKa 값이 낮은것 부터 순차적으로 양극측에 이동하여 겔 내의 전위구배의 변화는 완만한 것으로 되며, 아크릴아미드 농도를 변화시킨 경우와 같이 측정대상의 분자량 범위를 확대할 수가 있다.

본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔은, 겔 내의 전해질용액의 pH조정과 양성전해질의 첨가 이외는, 종래 공지의 상법에 따라 제조할 수가 있다. 예를들면 가교를 목적으로 한 수용성 디비닐 화합물로서는, N,N-메틸렌비스아크릴아미드(이하 BIS라 쓴다)가 가장 많이 사용되고 있으나, 그외 N,N-디알릴주석산 아미드 등 일반적인 디비닐 화합물로 사용할 수가 있다. 디비닐화합물은 전모노머 중의 1~10중량%의 함유량 비로 공중합된다.

또, 모노머 수용액에는 겔에 탄력성을 가지게 하여, 취약성을 개선하기 위해, 아가로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리메틸비닐에텔 등의 수용성 폴리머를 함유시킬 수도 있다. 또는, 20중량% 이하의 함유량으로 아크릴아미드 이외의 비이온성의 모노비닐모노머를 공중합할 수도 있다.

모노머의 중합은 중합개시제나 자외선 조사에 의해 발생하는 라디칼에 의해 행하여진다. 중합개시제로서는 과유산암모늄(이하 APS라 쓴다) 등의 과산화물과 N,N,N ',N'-테트라메틸에틸렌디아민(이하 TEMED라 쓴다) 등의 환원제를 병용하는 레독스형의 중합개시제가 상용되나, 이것들에 특히 한정되는 것은 아니다. 상기 과산화물 및 환원제는 전모노머에 대하여 0.05~5중량%가 사용된다. 또, 중합온도는 개시제가 기능한 온도이면 특히 한정되지 않으나, 통상 15~50℃의 범위가 바람직하다.

본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법에서는 통전에 의해 음이온은 양극측으로 이동한다. 즉, 음극측 전극중의 음이온은 겔 중에 이동하여 겔 중의 음이온이 양극측 전극액 중으로 이동한다.

상술의 레무리 처방과 같이 겔의 전해질용액으로서 강산염 수용액을 사용하고, 전극액으로서 약산염 수용액을 사용하는 전기영동법의 경우에, 겔 중의 강산근은 양극측으로 이동하여 음극측 전극액 중의 약산근은 겔 중에 이동한다. 겔의 전해질용액과 전극액에 공통의 양이온으로 트리스와 같은 약염기를 사용한 경우에는 약산염의 일부가 전하를 잃고 이온량이 감소함에 따라 겔 중의 전기저항(즉, 전위구배)이 상승하여 분리대상인 단백질 분자 등의 전기영동 속도가 높아진다.

그리고, 전기영동용 겔 중의 트리스 강산염 부분과 트리스 약산염 부분은 명료하게 구분되며, 경계부근에서의 전위구배의 변화는 강산에 의해 트리스의 중화율이 높아지는 만큼 크게 된다. 이 때문에 고중화율의 경우는 경계부근에 분리대상이 수렴하기 쉽게 되며, 특히 저분자량 분화부(低分子量分畵部)의 분리특성이 나쁘게 된다. 이것을 방지하기 위하여는 겔 중에 있어서의 약산염 부분의 전기저항치를 적당하게 저하시킬 필요가 있다.

본 발명과 같이 미리 겔의 전해질용액 중에 약산을 첨가하여 둠으로써, 약산염 부분의 이온량이 증가하고, 전기저항치는 저하한다. 전기저항치는 약산의 Pka값과 농도에 의하여 임의로 변경시킬 수가 있다. 게다가 강산근의 존재하에서는 pH가 낮기 때문에 약산은 전기적으로 중성이며, 전기저항치를 내리는 일은 없다.

그러나, 이들 전기저항치를 조절하는 목적에 적합한 약산의 pKa 값은 7~11이며, 통상의 음이온성기의 해리정수와는 차가 큰 값이다.

이 때문에, 본 발명에 있어서 양이온성기와 음이온성기를 동수 가지는 양성전해질을 의사약산(擬似弱酸)으로서 사용하여 양이온성기의 pKa 값을 상기 범위로 함으로써 알카리측에서는 양이온성기의 해리가 억제되어 음이온으로서 거동을 나타내고, 산성측에 있어서는 동수의 음이온성기와 양이온성기가 해리하기 때문에 전기적으로 중성이며, 전기전도에 기여하지 않는다.

이와같이 적당한 pKa 값을 가지는 양성전해질을 미리 겔의 전해질용액에 중에 적량 공존시키므로써 전기영동중의 겔 내의 전위구배의 분포를 조절할 수가 있다. 그리고, 분자량이 다른 여러가지의 시료에 대응하여 광범위하게 걸쳐, 고분해능의 전기영동상을 얻는 것이 가능하게 된다.

또, 본 발명과 같이 겔의 전해질용액 중에 양성전해질을 공존시키면 전기영동 종료후의 산성염료에 의한 단백질의 염색을 돕는 효과가 확인된다. 이것은 염색시의 초산 산성하에 있어서 양성전해질은 음이온성기의 해리가 억제되어 양이온으로서 작용하여 단백질 분자와 결합한 음이온물질의 방해작용을 제거하는 것이라 추측된다.

또, 겔 내의 전해질용액의 산에 의한 트리스의 중화율이 낮은 레무리의 표준처방은 높은 pH 때문에 장기 보존에 의해 이동도가 저하하여 분리능이 나쁘게 된다. 한편, 겔의 전해질용액의 중화율을 높여 pH를 중성부근, 혹은 그 이하로 한 경우에는 장기 보존에 의한 변질은 없으나, 레무리의 표준처방에 비교하여 이동도가 대폭으로 증대한다.

이것에 대하여 본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드겔의 제조방법과 같이 겔 내의 전해질용액에 양성전해질을 공존시킨 경우는 중화율을 높여 변질을 방지하여도 레무리 표준처방에 준한 전기영동상을 얻을 수 있다. 전기영동용 전극액 중에 SDS가 존재하면, 겔의 전해질용액 중의 유무는 전기영동에 영향을 주지 않는다.

또, 아크릴아미드농도 10%의 균일 겔 임에도 불구하고 pKa 값이 다른 복수개의 양성전해질을 적의 겔 중에 공존시키므로써, 광범위의 분자량 분포를 가진 시료에 대하여 양호한 분리성능을 나타내며, 그레이디언트 겔과 유사한 전기영동상을 얻을 수 있다.

또, 종래에는 곤란하였던 2만 이하의 저분자량의 폴리펩티드도 본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 경우는 쉽게 분리하는 것이 가능하다. 더욱, 양성전해질의 존재에 의해 전기영동 종료후의 단백질의 염색이 조장된다.

[실시예]

이하, 본 발명에 의한 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법이 실시예를 통해 설명된다.

[실시예 1]

가로 12cm, 세로 10cm의 직사각형의 유리판과 상부에 凹상의 칼집을 낸 동치수의 유리판 사이에, 두께 1mm의 스패이셔를 사이에 두고 유리판을 조립한다. 아크릴 아미드농도 12.5%(%T), BIS농도 2.6(%C) 및 표 1에 기재한 농도의 전해질 용액 조성으로 되는 모노머 용액에 대하여 APS 400ppm 및 TEMED 400ppm을 첨가혼합한 후, 플레이트 내에 주입하여 상법으로 중합시켜 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔을 얻었다.

그 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분자량 기지의 시판마커 단백질을 전기영동하여 이동거리를 측정하였다. 마커단백질은 β-머캅토에탄올, SDS를 사용하여 처리하고, 7% 글리세린 및 0.05% 브롬페놀블루(이하, BPB라 쓴다)를 가하여 시험에 제공하였다.

전기영동용 전극액의 조성은, 트리스농도 0.025mol/ℓ, 글리신농도 0.192mol/ℓ, SDS 0.1중량% 레무리 처방이다.

전기영동은 20mA 정전류로 행하고, BPB의 전기영동 말단이 밑에서 5mm 곳에서 통전을 중지하였다.

염색은 0.25% 크머시블리리언트 블루(이하 CBB라 쓴다) G-250, 10% 초산, 30% 메탄올용액 중에서 2시간 실시되었다. 또 탈색은 7% 초산, 3% 메탄올 용액으로 적의 새로운 용액으로 대체하면서 1주야동안 하였다.

BPB 전기영동 거리에 대한 각 단백의 전기영동 거리의 비를 이동도로 하여 표 2 및 표 3에 기재한다. 표 2는 제조직후의 이동도이며, 또, 표 3은 45℃에서 120일간 보존후의 이동도이다.

상기 표에서 시료-1 및 시료-2의 단위는 mol/ℓ로 나타내고 있으며, 여기서 글리신의 산(염소이온)에 대한 비(그램 당량비)는

0.08 : 0.19 ≒ 1 : 2.4

이다.

[실시예 2]

실시예 1과 같은 유리판을 사용하여 표 4에 기재하는 농도의 전해질용액 조성으로 되는 모노머 조성으로 폴리아크릴아미드 겔을 제조하여 실시예 1과 같은 조건에서 전기영동을 한 결과를 표 5에 나타낸다. 단 BIS 농도는 모두 5.0%(%℃)이다.

[실시예 3]

실시예 1과 같은 유리판을 사용하여 표 6에 기재한 농도의 전해질용액 조성으로 되는 모노머 조성으로 폴리아크릴아미드 겔을 제조하여 저 분자량의 시료 분리를 시험하였다. 단지 BIS 농도는 모두 5.0%(%℃)이다.

분자량 마커로서는 파르마시아사 제조의 폴리펩티드를 사용하였다. SDS 및 β-머캅토 에탄올을 각각 2.5%, 5% 용해한 50mM 트리스 염산 전해질용액(pH6.8)에 마커를 용해하여 0.01%의 CBB를 가하여 실온에서 하룻밤 방치한 후, 시험에 제공하였다.

전기영동용 전극액의 조성은 트리스농도 0.025mol/ℓ, SDS 0.1중량%로, 여기에 가하는 양성전해질을 표 6의 전기영동용 전극액의 항에 나타낸다.

전기영동은 20mA 정전류로 하며, CBB의 전기영동 말단이 밑에서 10mm의 곳에서 통전을 중지하였다. 전기영동후, 겔을 50% 메탄올, 10% 초산용액으로 45분동안 고정한다. 염색은 0.025% CBBG-250, 10% 초산용액 중에서 2시간동안 하며, 탈색은 10% 초산용액으로 적의 새로운 용액으로 대체하면서 하룻밤 하였다.

CBB 전기영동 거리에 대한 각 단백질의 전기영동 거리의 비를 이동도로서 표 7에 기재한다.

Claims (21)

1. 전기영동용 전극액의 조성이 아민 및 양성전해질을 함유하는 수용액인 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드 겔을 제조하는 방법에 있어서, 그 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액의 조성이 산, 아민 및 양성전해질을 함유하는 수용액이고, 그 폴리아크릴아미드겔 내의 전해질용액 중의 아민과 산의 함유량 비가 1 : 0.6~1g당량부이며, 산과 양성전해질의 함유량 비가 1 : 0.5~4g당량부이며, 또 아민의 pKa 값이 8~8.5의 범위이고, 양성전해질의 pKa 값이 7~11의 범위이며, 산의 pKa 값이 5 이하임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 전기영동용 전극액 중의 아민 및 폴리아크릴아미드 겔내의 전해질용액 중의 아민이 모두 트리스(히드록시메틸)아미노메탄임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액의 pH가 4~7.5 범위임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 전기영동용 전극액 중에 도데실유산염이 존재함을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 도데실유산 이온 부가단백질을(付加蛋白質)을 전기영동에 사용함을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액 중에 도데실유산염은 0.01중량% 이상으로 존재함을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액 중의 양성전해질의 pKa 값은, 음극측의 전기영동용 전극액 중의 양성전해질의 pKa 값과 동등 및/또는 그 이하임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
8. 제1항에 있어서, 전기영동용 전극액 및 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액에 사용되는 양성전해질은, 동일 분자내에 동수의 음이온성기와 양이온성기를 가짐을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
9. 제1항에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성전해질은 글리신, 세린, 아스파라긴, β-알라닌, N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 중에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
10. 제1항에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성전해질은 글리신임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
11. 제1항에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성전해질은 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
12. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액에 사용되는 양성전해는, 전위구배를 조절함을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
13. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액에 사용되는 양성전해질은, 글리신, 세린, 아스파라긴, β-알라닌, N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신, N-트리스(히드록시메틸)-2-아미노에탄술폰산 및 그들의 혼합물 중에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
14. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액에 사용되는 양성전해질은 복수종의 혼합물로 됨을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
15. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액에 사용되는 산은 1가의 산임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
16. 제1항에 있어서, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액에 사용되는 산은 염산, 초산 및 그들의 혼합물에서 선택됨을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
17. 제1항에 있어서, 아크릴아미드를 가교제, 물, 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액, 중합개시수단의 존재하에 중합시켜 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔을 제조하는 방법에 있어서, 그 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질용액의 조성이 산, 아민 및 양성전해질을 함유하는 수용액이며, 그 겔 내의 전해질용액 중의 아민과 산의 함유량비는 1 : 0.6~1g당량부 및 산과 양성전해질의 함유량비는 1 : 0.5~4g당량부 임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
18. 제1항에 있어서 전 모노머에 대하여 1~10중량%의 디비닐 화합물을 공중합 시킴을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
19. 제1항에 있어서, 디비닐 화합물은 N,N-메틸렌비스아크릴아미드 임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
20. 제1항에 있어서, 중합개시수단은 레독스형의 중합개시제 임을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.
21. 제1항에 있어서, 중합개시 수단으로서, 과산화물 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민으로 되는 중합촉매를 사용함을 특징으로 하는 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔의 제조방법.