JP2001242139A

JP2001242139A - Ｄｎａの電気泳動法

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Publication number: JP2001242139A
Application number: JP2000054166A
Authority: JP
Inventors: Mika Suzuki; 美香鈴木
Original assignee: Hymo Corp
Current assignee: Hymo Corp
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2001-09-07
Anticipated expiration: 2020-02-29
Also published as: JP3967516B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、プレキャストゲルを特定のｐＨと
特定の両性電解質を含むゲル緩衝液を用いて調製するこ
とにより、長期保存安定性を有する電気泳動用ポリアク
リルアミドプレキャストゲルを用いるＤＮＡの電気泳動
法を提供する。【解決手段】トリス、グリシンを含む一種又は二種の
両性電解質及び一価の酸を含有し、ｐＨが６．０〜７．
５の範囲に調整されているゲル緩衝液を内包するポリア
クリルアミドゲルを、トリス、キレート剤と、酢酸、燐
酸、及び硼酸のいずれか一つの酸を含有し、ｐＨが７．
８〜８．３の範囲に調整されている泳動用緩衝液を用い
て、ＤＮＡを電気泳動によって分析する。ポリアクリル
アミドゲルは、保存安定性に優れ、半年から１年以上ゲ
ルの形状変化が無く、ＤＮＡの良好な泳動像が得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、生化学、医学の分野
におけるＤＮＡの分離分析に利用されるＤＮＡの電気泳
動法に関する。更に詳しくは、この発明は、保存安定性
の良いポリアクリルアミドゲルを用いて分析精度の高い
ＤＮＡ分析法に適用することができると共に、電気泳動
用プレキャストゲルの利用分野に広く応用することがで
きるＤＮＡの電気泳動法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】電気泳動法は主としてタンパク質の分析
方法として発展してきたが、分子生物学が進展するに従
ってＤＮＡやＲＮＡの分析調製が必要とされるようにな
ってきた。ＤＮＡやＲＮＡのような核酸の分析には、ア
ガロース電気泳動法及びポリアクリルアミドゲル電気泳
動法が繁用されている。核酸は中性緩衝液中では強い陰
性荷電を示し、その移動度は支持体としてのゲルの分子
篩効果によるため、対象とする核酸の大きさにより０．
３％〜２％程度のアガロースゲル又は３．５％〜２０％
程度のポリアクリルアミドゲルが繁用されている。

【０００３】アガロースゲルは、比較的大きな孔径を有
しているため、高分子の核酸の分離分析を対象とする場
合に用いられている。アガロースには、電気浸透の強
弱、ゲル強度、融点等の性質の異なる多くの種類があ
る。また、アガロースは天然物であるため、同一会社の
同一製品であってもロットによりしばしば性状に差が見
られる。更に、アガロースゲル電気泳動法を調製に用い
てＤＮＡを精製する場合、しばしばアガロース中の不純
物が混入し、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリ
ガーゼ等の酵素の活性を阻害する。このため、アガロー
スゲルを用いたＤＮＡの精製には、フェノール抽出など
による精製法を加味する必要がある。

【０００４】一方、ポリアクリルアミドゲルは、比較的
小さな孔径を有しているため、中分子〜低分子の核酸の
分離分析を対象とする場合に用いられている。ポリアク
リルアミドゲルは、合成品であるために化学的に高純度
であり、アガロースゲルに見られるような性状の不均一
の問題点はない。また、処方を変えることによって、分
離特性の異なるポリアクリルアミドゲルを容易に調製す
ることができる。そのため、様々な分離能を持つように
量産されたプレキャストゲルを予め用意しておき、その
中から適切なプレキャストゲルを選択して用いることに
より、分析の手間を大幅に省くことができる。ポリアク
リルアミドゲルは、均一で再現性の良いことから当該分
野における生産及び品質管理に貢献するところが大であ
る。量産されたポリアクリルアミドゲルを供給するに際
しては、保存安定性が良好であることが期待される。

【０００５】アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル
と共にＤＮＡの電気泳動に使用する緩衝液は、主にｐＨ
７．８〜８．３のエチレンジアミン四酢酸( 以下ＥＤＴ
Ａと称す) 又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(
以下ＥＴＡと称す) を含むトリス( ヒドロキシメチル)
アミノメタン（以下トリスと称す）−酢酸緩衝液( 以下
ＴＡＥと称す) 、トリス−硼酸緩衝液( 以下ＴＢＥと称
す) 、又はトリス−リン酸緩衝液( 以下ＴＰＥと称す)
であり、ゲル緩衝液と泳動用緩衝液の組成が等しい連続
緩衝液系である。

【０００６】一方、タンパク質の分離分析で汎用されて
いる、オルンスタイン（Ｌ．Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ａｎ
ｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１，３２１−３４
９（１９６４））とデービス( Ｂ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ａ
ｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１，４０４−４
２７（１９６４）) によって提案された方法によって、
ＤＮＡの分離分析を行うことも可能である。この方法
は、ゲル緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液（オルンスタ
イン−デービスのゲル緩衝液）、泳動用緩衝液としてト
リスーグリシン緩衝液( オルンスタイン−デービスの泳
動用緩衝液) を使用しており、ゲル緩衝液と泳動用緩衝
液の組成の異なる不連続緩衝液系である。不連続緩衝液
系は、連続緩衝液系に比べ少量の試料添加で良好な解像
力をもたらすことが特徴である。

【０００７】しかし、公知の電気泳動システムにおいて
は、通常、ポリアクリルアミドゲルの内包するゲル緩衝
液のｐＨは７．８〜８．８であり、ポリアクリルアミド
中のアミド基は経時的に加水分解反応を受ける。加水分
解反応は、低温条件下でも進行して部分的にアニオン基
を有するゲルを生る。その結果、ＤＮＡの泳動距離が短
くなり、分離像が不鮮明になる。従って、ポリアクリル
アミドゲルは、時間が経過するほど加水分解反応が進行
するため、長期間に渡って保存して使用することが困難
である。ポリアクリルアミドの加水分解を抑制するため
に、ゲル緩衝液中のトリス中和率を高めてｐＨを下げる
と、連続緩衝液系の場合、泳動時間が非常に長くなり分
析の効率が低下する。不連続緩衝液系の場合、ゲル緩衝
液中のトリスの中和率を高めると、泳動時間が長くなる
だけでなく分離能も劣り、使用に耐えないものとなる。

【０００８】ポリアクリルアミドゲルの安定性を改善す
る方法として、トリス、両性電解質及び酸から成るゲル
緩衝液を内包した、長期保存安定性に優れ且つ測定可能
な分子量範囲を著しく拡大したポリアクリルアミドゲル
の製造方法が、特開平４−１８４１６３号公報に開示さ
れている。この製造方法によって製造されたポリアクリ
ルアミド電気泳動ゲルは、オルンスタイン−デービスの
泳動用緩衝液又はレムリー( Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，
Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０（１９７０）)によって
提案された泳動用緩衝液( レムリーの泳動用緩衝液) を
使用して分析に供することができる。このポリアクリル
アミド電気泳動ゲルは、両性電解質を含有するｐＨ４．
０〜７．５のゲル緩衝液を内包することを特徴とし、そ
の実施例においてｐＨが６．９〜７．４のゲルの製造が
例示され、冷蔵保存で４ヶ月はタンパク質の移動度に変
化なく安定であるとされている。レムリーの泳動用緩衝
液とは、トリス、グリシン及びドデシル硫酸ナトリウム
( 以下ＳＤＳと称す) を含有する緩衝液である。このポ
リアクリルアミドゲルは、タンパク質の分離分析を対象
としているが、オルンスタイン- デービスの泳動用緩衝
液を使用してＤＮＡの分離分析も可能である。特開平４
−１８４１６３号公報に実施例として記載されている条
件で製造したゲルは、ＤＮＡの分離分析に使用するに当
たり、移動度、染色状態の観点から見て、冷蔵保存で2
ヶ月間安定である。

【０００９】しかし、量産されたポリアクリルアミドゲ
ルを供給するに際しては、２ヶ月の保存有効期限では不
十分である。そこで、特開平４−１８４１６３号公報に
開示されている方法で製造したポリアクリルアミドゲル
のゲル緩衝液のｐＨを６．５以下とし、ポリアクリルア
ミドゲルの加水分解を抑制して更に安定性の良い電気泳
動ゲルでのＤＮＡの分析が必須となる。ところが、上記
のｐＨが低いポリアクリルアミドゲルとオルンスタイン
−デービスの泳動用緩衝液でのＤＮＡ分析では鮮明な泳
動像を得ることができなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】そこで、電気泳動用ポ
リアクリルアミドゲルの加水分解をある程度抑制し、核
酸の分離分析に汎用されている泳動用緩衝液とを使用し
て、長期間に渡って保存可能な電気泳動用ポリアクリル
アミドゲルを用いてＤＮＡの鮮明な分離分析を可能にす
る点について解決すべき課題がある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】この発明の目的は、上記
の課題を解決することであり、保存安定性に優れ、保管
有効期限が長い電気泳動ポリアクリルアミドゲルと、核
酸の分析方法として汎用されている泳動用緩衝液を使用
して行い、予め様々な分離特性を持つようにプレキャス
トゲルを量産することを可能にし、泳動時間が長期化せ
ず且つ鮮明な泳動像を得ることが可能なＤＮＡの電気泳
動法を提供することである。

【００１２】この発明は、上記の目的を達成するため、
以下のように構成されている。即ち、この発明は、下記
特徴をそれぞれ有するポリアクリルアミドプレキャスト
ゲルと泳動用緩衝液とを用いたＤＮＡの電気泳動方法に
関する。１）前記ポリアクリルアミドプレキャストゲルに含まれ
るゲル緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、グリシンを必須とした一種以上の両性電解質、及
び一価の酸を含有し、ｐＨが６．０〜７．５の範囲に調
整されている。２）前記泳動用緩衝液は、トリス( ヒドロキシメチル)
アミノメタン、キレート剤、並びに酢酸、燐酸及び硼酸
のいずれか一つの酸を含有し、ｐＨが７．８〜８．３の
範囲に調整されている。

【００１３】このＤＮＡの電気泳動法において、ゲル緩
衝液中にトリス、グリシンを含む一種又は二種以上の両
性電解質及び一価の酸を含有し、ゲル緩衝液のｐＨが特
定範囲である水溶液を用いて調製されたポリアクリルア
ミドゲルと、泳動用緩衝液中にトリス、キレート剤及び
酸を含有し、泳動用緩衝液のｐＨが特定範囲である水溶
液を用いており、ゲルｐＨが酸性領域に設定されるの
で、ポリアクリルアミドゲルの加水分解をある程度抑制
することが可能であり、冷蔵保存で６ヶ月以上安定であ
るという保存安定性が良好な電気泳動ゲルとなる。単
に、ゲルｐＨを低下させただけでは、泳動時間が長くな
ったり、泳動像が不鮮明になるので、グリシンを必須と
した一種以上の両性電解質を含有することにより、泳動
時間の短縮が図られ、泳動像が鮮明になる。また、予め
様々な分離特性を持つプレキャストゲルを量産すること
ができる。更に、核酸の電気泳動法として汎用されてい
る泳動用緩衝液が使用される。

【００１４】このＤＮＡの電気泳動方法において、前記
ゲル緩衝液に含有される前記両性電解質は、塩基解離定
数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６である分子内にカチ
オン性基とアニオン性基を同数有するアミノ酸を含有し
ている。また、前記ゲル緩衝液は、前記一価の酸として
塩酸又は酢酸の少なくとも一つを含有し、長期保存安定
性を目的としてｐＨが６．０〜６．５の範囲に調整され
ている。ゲル緩衝液のｐＨをこの範囲に設定することに
より、一層の長期保存安定性が得られる。更にまた、こ
のＤＮＡの電気泳動法において、前記泳動用緩衝液は、
前記キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウムを含有し、前記酸として硼酸を含有している。

【００１５】

【発明の実施の形態】この発明によるＤＮＡの電気泳動
法は、次に述べる特徴をそれぞれ有するポリアクリルア
ミドプレキャストゲルと泳動用緩衝液とを用いることを
特徴としている。ゲル緩衝液は、トリス、グリシンを含
む一種又は二種以上の両性電解質及び一価の酸を含有し
ており、好ましくは、ゲル緩衝液は、トリス、グリシ
ン、塩基解離定数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６であ
る分子内にカチオン性基とアニオン性基を同数有するア
ミノ酸及び一価の酸として塩酸及び酢酸を含有してい
る。

【００１６】グリシンを含む一種又は二種以上の両性電
解質を含有していなければ、ゲル緩衝液のｐＨを酸性側
に設定することでトリスの中和率が高まり、泳動ゲル中
のトリス強酸部分とトリス弱酸部分の境界付近で電位勾
配の変化が非常に大きくなる。このため、境界付近に分
離対象が収斂しやすくなり、分画分子量範囲が非常に狭
くなる。また、泳動時間が非常に長くなるため、作業効
率上も好ましくない。

【００１７】グリシンは、ゲル緩衝液のｐＨを下げて
も、泳動ゲル中のトリス強酸部分とトリス弱酸部分の境
界付近における電位勾配の変化を緩やかにするので、Ｔ
ＢＥやオルンスタイン- デービスのゲル緩衝液を使用し
たゲルと同様の分画分子量範囲を持たせることができ
る。しかし、ゲル緩衝液のｐＨを酸性側にするほど、グ
リシン単独では電位勾配の変化を調節する力が十分でな
くなる。そこで、ゲル緩衝液中に、グリシンと塩基解離
定数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６である分子内にカ
チオン性基とアニオン性基を同数有するアミノ酸を共存
させることにより、より泳動ゲル中の電位勾配を緩やか
にすることが可能となる。

【００１８】グリシンと共存させるアミノ酸のｐＫｂの
範囲は、８．３＜ｐＫｂ＜９．６であり、好ましくは
９．０＜ｐＫｂ＜９．６である。アミノ酸のｐＫｂの範
囲がｐＫｂ＜８．３である場合、ｐＫｂがトリスよりも
低いことになるため、ゲル緩衝液のｐＨが変化し、また
分画分子量範囲が大幅に広くなってしまう。ｐＫｂ＞
９．６の場合、アミノ酸のｐＫｂがグリシンよりも高く
なってしまうため、ゲル内の電位勾配の変化を緩やかに
する作用に寄与しない。９．０＜ｐＫｂ＜９．６である
アミノ酸を使用すると、ｐＫｂの低いものから順に陽極
側に移動し、泳動ゲル内の電位勾配は緩やかなものとな
る。９．０＜ｐＫｂ＜９．６であるアミノ酸としては、
セリン、トリプトファン、フェニルアラニン等がある
が、好ましくはセリンである。

【００１９】更に、グリシンと共存させるアミノ酸は、
分子内にアニオン性基とカチオン性基を同数有するもの
が望ましい。ｐＫｂよりやや低いｐＨでは、全てのアニ
オン性基と全てのカチオン性基とが解離して電気的に中
性となり、ｐＫｂより高いｐＨでは、アニオン性基のみ
が解離しカチオン性基の解離が抑制されるため、負に帯
電する。このため、上記アミノ酸は、実質的に一価の弱
酸としての挙動を示し、疑似弱酸として使用することが
できる。予めゲル緩衝液中に疑似弱酸を添加しておくこ
とにより、泳動ゲル中のトリス弱酸部分の電気抵抗値が
低下し、更に強酸根の存在下ではｐＨが低いため、電気
的に中性であり電気伝導に寄与しない。

【００２０】また、ゲル緩衝液のｐＨは、６．０〜７．
５、好ましくは６．０〜６．５である。ゲル緩衝液のｐ
Ｈが７．５より高い場合、ポリアクリルアミドゲルは経
時的に加水分解を受け、プレキャストゲルとしての保管
有効期限を長くもたせることができない。ゲル緩衝液の
ｐＨが６．０より低い場合、ポリアクリルアミドゲルと
しての安定性は良好となるが、トリスの中和率が上がり
すぎて緩衝液としての機能が損なわれる。ゲル緩衝液の
ｐＨは、プレキャストゲルに長期保存安定性を持たせる
ためアクリルアミド自体のｐＨに近づけることが望まし
い。

【００２１】また、泳動用緩衝液は、トリス、キレート
剤と酢酸、燐酸及び硼酸のいずれか一つの酸を含有して
おり、含有する酸としては好ましくは硼酸である。ゲル
緩衝液のｐＨを６．０〜６．５の範囲に設定した場合、
オルンスタイン−デービスの泳動用緩衝液を使用すると
泳動像が不鮮明となり、ＤＮＡの分離分析を行うことが
できない。本発明で使用するＴＢＥの組成は、０．０８
９２ｍｏｌ／ｌトリス、０．０８９０ｍｏｌ／ｌ硼酸、
そして０．００２５ｍｏｌ／ｌＥＴＡであり、ｐＨは
８．３であることが望ましい。上記組成の緩衝液は核酸
の分離分析において広く使用されているＴＢＥであるた
め、作業者が効率よく分析を行うことができ、短時間で
泳動が完了し、更に非常に鮮明な泳動像を得ることがで
きる。ＴＡＥ又はＴＰＥを使用してもＤＮＡの分離分析
は可能であるが、泳動時間がかかりＴＢＥに比べ分析効
率が悪くなる。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例１横幅１２ｃｍ、縦１０ｃｍの長方形のガラス板と上部に
凹状の切り込みの入った同寸法のガラス板の間に、厚さ
1 ｍｍのスペーサを挟んでガラスプレートを組み立て
る。アクリルアミド濃度１０％（％Ｔ）、Ｎ，Ｎ′−メ
チレンビスアクリルアミド（以下ＢＩＳと称す）濃度５
％（％Ｃ）、並びに表１に記載する濃度の緩衝液組成か
ら成るモノマー溶液に対し、過硫酸アンモニウム( 以下
ＡＰＳと称す) ４００ｐｐｍ及びテトラメチルエチレン
ジアミン（以下ＴＥＭＥＤと称す）４００ｐｐｍを添加
混合後、プレート内に注入し、常法で重合させ、電気泳
動用ポリアクリルアミドゲルを得た。

【００２３】このポリアクリルアミドゲルを用いて分子
量既知の市販マーカーＤＮＡを電気泳動し、移動距離と
バンドの鮮明さを確認した。マーカーＤＮＡは、３０％
（ｗ／ｖ）ショ糖、着色する程度のブロムフェノールブ
ルー（以下ＢＰＢと称す）を含んだ１０ｍｍｏｌ／ｌ
トリス、1 ｍｍｏｌ／ｌＥＴＡ、２０ｍｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム溶液を塩酸でｐＨ７．９に調整した緩衝
液で１００倍希釈して試験に使用した。泳動用緩衝液の
組成は、０．０８９２ｍｏｌ／ｌトリス、０．０８９０
ｍｏｌ／ｌ硼酸、２．５ｍｍｏｌ／ｌＥＴＡである。

【００２４】電気泳動は２００Ｖ定電圧で行い、上部電
極槽にＢＰＢで着色した電極液を入れた。ＢＰＢの泳動
末端がスペーサの下端に来た時点で通電を中止した。染
色には、銀染色法が用いられた。泳動後のゲルを５０％
（ｖ／ｖ）メタノール、５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢
酸、３．５％（ｗ／ｖ）スルホサリチル酸水溶液中で２
０分間浸透させてＤＮＡを固定し、その後、精製水で１
５分間の水洗を２回行った。その後、８％炭酸ナトリウ
ム水溶液と１％（ｗ／ｖ）けいタングステン酸、０．０
２％（ｗ／ｖ）硝酸銀、０．０２％（ｗ／ｖ）硝酸アン
モニウム、０．２８％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド水溶
液を１：１の割合で混合させた液に浸透させ、染色し
た。７分後にバンドが出現したため染色液を捨て、１％
（ｖ／ｖ）酢酸に１５分浸して停止させた。その結果、
鮮明なＤＮＡのバンドが検出された。

【００２５】ＢＰＢ泳動距離に対する各ＤＮＡフラグメ
ントの泳動距離の相対位置を移動度（下記の式で定義さ
れる）として表２に記載する。移動度（％）＝（ウェル下端から各バンドの位置までの
距離）／（ウェル下端からＢＰＢの泳動末端までの距
離）×１００また、各ゲルの泳動時間を表３に記載する。

【表１】

【表２】

【表３】

【００２６】表１、表２、表３に示したように、ゲル緩
衝液のｐＨが６．３、６．８、７．５である各ポリアク
リルアミドゲルをＴＢＥで泳動した場合、いずれも鮮明
な泳動像が得られ、ＤＮＡフラグメントの移動度や、泳
動時間もほぼ同じであった。

【００２７】比較例１実施例１と同様のガラスプレートを用い、アクリルアミ
ド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度５％（％Ｃ）並びに
表４に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液
に対し、実施例１と同様に電気泳動用ポリアクリルアミ
ドゲルを製造した。このポリアクリルアミドゲルを用い
て分子量既知の市販マーカーＤＮＡを電気泳動し、移動
距離とバンドの鮮明さを確認した。泳動用緩衝液の組成
は０．０２５ｍｏｌ／ｌトリス、０．１９２ｍｏｌ／ｌ
グリシンであるオルンスタイン−デービスの泳動用緩衝
液を使用した。ＢＰＢ泳動距離に対する各ＤＮＡフラグ
メントの泳動距離の比を移動度として表５に示す。また
泳動時間を表６に示す。

【表４】

【表５】

【表６】

【００２８】表４、表５及び表６に示したように、ゲル
緩衝液のｐＨが６．３のポリアクリルアミドゲルをオル
ンスタイン- デービスの泳動用緩衝液を用いて泳動を行
うと、ＤＮＡのバンドが不鮮明で検出不可能であった。
そのため、本発明では、硼酸バッファ等が使用される。

【００２９】実施例２実施例１と同様のガラスプレートを用い、アクリルアミ
ド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度５％（％Ｃ）並びに
表７に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液
に対し、実施例１と同様に電気泳動用ポリアクリルアミ
ドゲルを製造した。このポリアクリルアミドゲルを５℃
下に保管し、一定期間ごとに取り出して、実施例１と同
じＴＢＥを使用してＤＮＡの電気泳動を行った。電気泳
動は２００Ｖ定電圧で行ない、５０分経過した時点で泳
動を停止し、移動距離とバンドの鮮明さを確認した。そ
の結果を表８、表９及び表１０に示す。

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【００３０】表８に示したようにゲル緩衝液のｐＨが
７．５のポリアクリルアミドゲルは、５℃下でも経時的
に加水分解を起こし、発生するアニオン基によってＤＮ
Ａの移動速度も遅くなる。６ヶ月以上経過したものに、
低分子のフラグメントが検出不可能となるものが現れ
た。また、表９に示したようにゲル緩衝液のｐＨが６．
８であるポリアクリルアミドゲルは、ｐＨ７．５の時に
比べて加水分解速度は低下するが、やはり５℃下で６ヶ
月も経過すると、ＤＮＡの移動速度に大きな変化が見ら
れた。それに比べて、表１０に示したように、ゲル緩衝
液のｐＨが６．３であるポリアクリルアミドゲルは、５
℃下で７ヶ月経過してもＤＮＡの移動度、泳動像に変化
が見られず安定であった。

【００３１】実施例３実施例２で作成した電気泳動ゲルについて、５℃下で一
定期間保存後、テンシロン万能試験機（株式会社オリエ
ンテック、型式Ｕ−２１２９) でガラスプレートを上下
に引っ張り、その引っ張り強度を測定した結果を表１１
に示す。

【表１１】

【００３２】表１１に示したように、ゲル緩衝液のｐＨ
を下げることで、ＤＮＡの移動度や泳動像のみならず、
泳動ゲルの形状も安定に保つことができる。ポリアクリ
ルアミドゲルは加水分解すると膨潤し易くなりガラスプ
レートがずれ易くなる。ゲル緩衝液のｐＨが７．５の泳
動ゲル( 試料Ｅ) はガラスプレートをずらすのに必要な
力( 引っ張り強度) が５℃下２ヶ月後に約１／３となっ
た。それに対し，ゲル緩衝液のｐＨが６．８の泳動ゲル
( 試料Ｆ) は、５℃下６ヶ月後まで製造直後と同等の引
っ張り強度を示していた。それに対し、ゲル緩衝液のｐ
Ｈが６．３の泳動ゲル( 試料Ｇ) は、５℃下で１２ヶ月
後も製造直後と同等の引っ張り強度を示していた。ゲル
緩衝液のｐＨが６．３の場合、アクリルアミド自体のｐ
Ｈに近いためｐＨ６．８の時に比べて著しく加水分解速
度が減少する。その結果、５℃下で１年もの長期間泳動
ゲルの形状が安定に保たれる。

【００３３】比較例２実施例１と同様のガラスプレートを用い、アクリルアミ
ド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度５％（％Ｃ）並びに
表１２に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶
液に対し、実施例１と同様に電気泳動用ポリアクリルア
ミドゲルを製造した。製造した電気泳動ゲルについて、
５℃下で一定期間保存後、テンシロン万能試験機でガラ
スプレートを上下に引っ張り、その引っ張り強度を測定
した結果を表１３に示す。

【表１２】

【表１３】

【００３４】表１２に示したように、ゲル緩衝液のｐＨ
が８．８である泳動ゲルは、５℃下で１ケ月経過する
と、ガラスプレートをずらすのに必要な力が製造直後に
比べて１／２以下となった。ゲル緩衝液のｐＨが高いと
泳動ゲルの形状も安定に保つことができなかった。

【００３５】

【発明の効果】本発明によるＤＮＡの電気泳動法は、長
期保存安定性を持つ電気泳動ポリアクリルアミドゲルと
核酸の電気泳動に汎用されている泳動用緩衝液を使用し
てＤＮＡの鮮明な分離分析を行う方法に関するものであ
る。ゲルｐＨを酸性〜中性領域に設定すればポリアクリ
ルアミドゲルの加水分解をある程度抑制することが可能
であり、保存安定性が良好な電気泳動ゲルとなる。従っ
て、保管有効期限を長く設定することが可能となり、プ
レキャストゲルとして予め様々な分離特性を持つように
量産し、広範囲に供給することが可能となる。このよう
な電気泳動ポリアクリルアミドゲルと、核酸の電気泳動
法として公知であるＴＢＥを使用してＤＮＡの鮮明な分
離分析が可能であることから使用者が経済的かつ効率的
に分析を遂行することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｇ３２５Ｅ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記特徴をそれぞれ有するポリアクリル
アミドプレキャストゲルと泳動用緩衝液とを用いたＤＮ
Ａの電気泳動方法。１）前記ポリアクリルアミドプレキャストゲルに含まれ
るゲル緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、グリシンを必須とした一種以上の両性電解質、及
び一価の酸を含有し、ｐＨが６．０〜７．５の範囲に調
整されている。２）前記泳動用緩衝液は、トリス( ヒドロキシメチル)
アミノメタン、キレート剤、並びに酢酸、燐酸及び硼酸
のいずれか一つの酸を含有し、ｐＨが７．８〜８．３の
範囲に調整されている。
【請求項２】前記ゲル緩衝液に含有される前記両性電
解質は、塩基解離定数の範囲が８．３＜ｐＫｂ＜９．６
である分子内にカチオン性基とアニオン性基を同数有す
るアミノ酸を含有していることから成る請求項１に記載
のＤＮＡの電気泳動方法。
【請求項３】前記ゲル緩衝液は、前記一価の酸として
塩酸又は酢酸の少なくとも一つを含有し、長期保存安定
性を目的としてｐＨが６．０〜６．５の範囲に調整され
ていることから成る請求項１に記載のＤＮＡの電気泳動
方法。
【請求項４】前記泳動用緩衝液は、前記キレート剤と
してエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含有し、前
記酸として硼酸を含有することから成る請求項１〜３の
いずれか１項に記載のＤＮＡの電気泳動方法。