KR20030095061A

KR20030095061A - 트리신을 포함하는 단일겔을 이용한 펩타이드 전기영동방법

Info

Publication number: KR20030095061A
Application number: KR1020020032573A
Authority: KR
Inventors: 윤철호; 임성근
Original assignee: 윤철호
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2002-06-11
Publication date: 2003-12-18

Abstract

본 발명은 축적겔 없이 폴리아크릴아미드를 지지체로 한 단일겔 시스템을 사용한 펩타이드(peptide)의 폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 관한 것이다. 본 발명에 사용되는 전기영동 시스템은 분리겔, 양극 및 음극의 전극액 및 전원공급장치로 이루어지고, 상기 전기영동시스템에 속하는 분리겔 내 및 전극액의 전해질의 조성이 산, 아민 그리고 트리신과 아미노산인 양성 전해질을 함유하는 수용액이고, 아민과 양성 전해질의 함유량의 몰 농도비가 1: 0.8∼2이며, 아민의 pK 값이 8∼8.5의 범위이고, 양성 전해질의 음이온성기의 pK 값은 약 2.3~3.1이고, 양이온성기의 pK 값은 8.0~8.6임을 특징으로 한다.

Description

트리신을 포함하는 단일겔을 이용한 펩타이드 전기영동방법 {METHOD OF PEPTIDE ELECTROPHORESIS USING SINGLE GEL CONTAINING TRICINE}

본 발명은 생물학, 생화학, 의학 등 생명과학 분야에서 널리 사용되는 펩타이드(peptide)의 분리ㆍ분석에 사용되는 폴리아크릴아미드 전기영동법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 폴리아크릴아미드를 지지체로 한 단일겔 시스템을 사용하는 펩타이드의 분리 및 분석을 위한 폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 관한 것이다.

폴리아크릴아미드를 지지체로 하는 겔 전기영동법은 겔의 제조시에 아크릴아미드와 가교제의 농도 및 비율을 조절함으로써 겔의 미세통로 크기를 조절할 수 있기 때문에 다양한 크기의 생체 거대분자들을 분리할 수 있고, 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 사용돼 왔다.

분자량 10,000 이하의 펩타이드(peptide)를 분리 분석하기위해서 여러종류의 에스디에스페이지(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, 약어 SDS-PAGE) 시스템들이 개발되어왔다. 이들 방법의 대부분은 펩타이드의 분리하기위해 우레아(urea)를 포함하는 분리겔을 사용하거나(참조: Swank, R.T. and Munkres, K.D (1971) Anal. Biochem. 39, 462-477; Kyte, J. and Rodriguez, H. (1983) Anal. Biochem. 133, 515-522; Hashimoto, F. et al., (1983) Anal. Biochem. 129. 192-199; Anderson, B.L. et al. (1983) Anal. Biochem. 132, 365-375), 고농도의 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)(참조: West, M.H.P. et al (1984) Electrophoresis 5, 133-138), 또는 가파른 폴리아크릴아마이드 농도 구배를 포함하는 분리겔을 이용한 것이다 (참조: Fling, S. P. and Gregerson, D. S. (1986) Anal. Biochem. 155, 83-88; Bothe, D. et al. (1985) Anal. Biochem.). 높은 농도의 완충액들이 비 우레아 에스디에스-페이지 시스템에서 단백질 및 펩타이드 분리에 효율적임이 밝혀졌다(참조: Okajima, T. et al. (1993) Anal. Biochem. 211, 293-300).

사용하기에 번거로운 우레아를 사용하지않고 대신 트리신(tricine)을 사용한 트리신-에스디에스-페이지 시스템이 분자량 1,000-20,000 범위의 단백질 및 펩타이드 분리에 유용함이 밝혀졌다(참조: Schagger, H. and von Jagow, G. (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379). 이 시스템은 전기영동하여 분리한 펩타이드를 전기전달(electrotransfer) 방법을 이용하여 피브이디에프(PVDF) 막에 전달한 후 펩타이드의 아미노말단 서열을 분석하는데도 적당함이 밝혀졌다(참조: Ploug, M. et al. (1989) Anal. Biochem. 181, 33-39). 그러나 이 방법은 반드시 3개의 겔(분리겔, 축적겔, 스페이스겔)을 사용해야하는 단점이 있다. 각각의 겔은 서로 다른 농도의 아크릴아마이드로 제조해야한다. 또한 사용하기 직전에 이들 겔을 제조해야하는 번거로움이있고 이 과정에서 재현성이 떨어지는 등의 많은 실험적 문제점을 갖고있다. 게다가, 전기영동을 위해 음극 및 양극 완충용액의 두가지 다른 종류의 완충용액을 사용해야만 한다. 가가가의 완충용액은 서로 다른 페하(pH)와 다른 농도의 트리스(Tris), 트리신(tricine), 에스디에스(SDS)로 구성된다. 이들 세개의 겔은 pH가 8.45이다. 이러한 염기성 pH에서는 아크릴아마이드가 시간에따라 가수분해된다. 이 세개의 겔은 결국 시간이 지남에따라 분리능력이 떨어지게된다.

최근, 축적겔없이 하나의 겔만을 이용한 단일겔 시스템이 분자량 14,000 이상의 단백질분리에 매우 유용함이 보고되었다(참조: Ahn, T. et al. (2001) Anal. Biochem. 181, 33-39). 이 단일겔 시스템은 단백질 분리를 위한 전기영동에 있어서 오늘날 가장 광범위하게 쓰이는 램리(Laemmli)에 의해 개발된 SDS-불연속 전기영동법(Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685; 이하 램리법이라 칭함)의 분리능과 유사한 해상력(resolution)을 가진 것으로 밝혀졌다. 그러나 이 단일겔 시스템은 분자량 10,000 이하의 펩타이드를 분리 분석하는데는 분리성능이 매우 낮은단점이 있다.

상기한 바와 같은 종래의 배경기술에 의하면, 펩타이드의 분리 및 분석을 위한 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, 약어 SDS-PAGE) 시스템은 우레아 또는 고농도의 완충용액을 사용해거나 세가지의 겔을 사용해야하는 문제점이 있었다. 최근 개발된 단일겔 시스템은 펩타이드에 적용하지 못한다는 문제점이 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 종래 배경기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로 펩타이드에 대하여 높은 분리능력을 보일수 있는 단일겔 시스템법을 사용한 전기영동방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 폴리아크릴아마이드 단일겔에 트리신(tricine)을 첨가하면 펩타이드의 분리능력이 촉진됨을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 트리신을 포함하는 폴리아크릴아마이드 단일겔을 이용한 펩타이드 분리 및 분석 방법을 제공하는 것이다.

제 1도는 단일겔을 이용한 펩타이드 분리능에 대한 시료부피의 효과 분석 결과를 나타내는 사진

제 2도는 단일겔을 이용한 여러 종류의 표준시료 펩타이드의 분리능에 대한 분석 결과를 나타내는 사진

제 3도는 단일겔을 이용한 펩타이드의 전기영동방법을 이용하여 전기영동한 후 피브이디에프(PVDF) 막에 전기전달(elctrotransfer)한 결과를 나타내는 사진

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

호퍼(Hofer)사에서 판매하는 전기영동용 키트를 구입하여 가로 10 cm, 세로8cm의 직사각형 유리판과 두께 0.75 mm의 스페이서를 사용한 전기영동 장치를 조립하였다. 본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔을 제조하기 위하여, 총아크릴아미드 농도는 15-20 중량%(%T)이고 아크릴아미드 모노머에 대하여 N,N-메틸렌비스아크릴아미드는 3.3 중량%를 포함하는 하기의 조성을 가진 전해질 용액에 대하여 APS 0.1 중량% 및 TEMED를 0.04 중량%가 되게 첨가한 후, 두 유리판 사이에 주입하고 30분 동안 중합시켜 전기영동용 분리겔을 얻었다. 이때, 사용된 전해질 용액은 70~150mM의 트리스, 0.1M 글리신, 0.1M 아스파라진, 0.1M 세린이며, 최종 pH는 염산으로 6.8~8.0이 되도록 조절되었다.

통상의 방법과 같이 상기 분리겔위에 축적겔을 다시 중합시켜 생성시키는 일 없이 상기 분리겔에 시그마회사로부터 구입한 펩타이드 분자량 표준시료(molecular mass size markers; 분자량의 범위가 2.5~17.0 kDa)를 부피별로 적용하였는데, 미리 단백질 시료에 샘플 완충용액(60mM 트리스, pH 6.8, 2%(w/v)SDS, 10%(w/v) 글리세린, 0.1M dithiothreitol, 0.01%(w/v) 브롬페놀블루)을 첨가하고 95℃에서 4분 동안 끊인 후, 전기영동하였다. 겔의 두께는 0.75 mm이고 모두 10개의 요철상 웰을 사용하였으며, 각 웰당 6∼18㎕의 시료를 적용하였다.

전기영동용 전극액의 조성은 트리스 농도 25mM, 글리신 농도 0.192M, SDS 0.1 중량%를 램리(Laemmli) 방식과 동일하게 사용하였다.

전기영동은 140 V 정전압으로 행하고, 브롬페놀블루 색소의 전기영동 말단이 밑에서 5 mm되는 곳에서 통전을 중지하였다.

펩타이드들은 전기영동 후에 꾸마시 브릴리언트 블루 R250(Coomassiebrilliant blue R250)을 포함하는 염색용액으로 1시간 동안 염색하였으며 메탄올/ 초산을 포함하는 탈염색 용액으로 탈색시켰다.

통상 최대 18㎕의 시료를 전기영동할 수 있는데, 본 발명의 겔 시스템에서도 마찬가지로 약 18㎕까지 시료를 적용하여 전기영동이 가능하였다. 또한, 적용한 펩타이드 표준시료의 농도 및 부피에 대하여 각각의 펩타이드에 대한 분리능과 이동거리에 변화가 없었다.

또한 상업적으로 구입한 여러 종류의 표준 시료들을 상기한 트리신을 포함하는 단일겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 이때 사용한 펩타이드 시료들은 다음과 같다(insuline chain B, 분자량 3.5 kDa; lactofericin B, 분자량 3.2 kDa; bovine growth hormone releasing factor, 분자량 5.1 kDa; cytohrome c, 분자량 12.3 kDa; lysozyme, 분자량 13.9 kDa). 실험결과 분자량 3.2 kDa에서 13.9 kDa까지의 시료들의 분리능력이 표준 시료의 경우와 마찬가지로 기존의 다른 실험방법에 비해 뚜렷하게 향상되었음을 알 수 있었다.

상기한 트리신을 포함하는 단일겔을 이용한 전기영동방법이 PVDF 막이나 NC 막(nitrocellulose)으로 전기전달(electrotransfer) 실험을 수행할때 유용한지 알아보기위해서, 트리신을 포함하는 단일겔을 이용한 표준 펩타이드 시료의 전기영동 한 후 PVDF 막에 전기블롯(electroblotting)을 수행하였다. 전기블롯(electroblotting)을 수행하는데 아무런 문제점이 없었으며 3개의 겔을 이용한 트리신(tricine)을 사용한 Tricine-SDS-PAGE 시스템(참조: Schagger, H. and von Jagow, G. (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379)의 분리능력과 유사한 결과를 얻었다. PVDF 막이나 NC 막(nitrocellulose)으로 전기전달(electrotransfer)된 펩타이드들은 아미노 말단 서열분석이나 면역블롯(western blot)에 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 트리신을 포함하는 폴리아크릴아마이드 단일겔은 생명과학 및 의학 분야에서 요구되는 펩타이드의 분리 및 분석에 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

이를 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:트리신을 포함하는 폴리아크릴아마이드 단일겔을 이용한 펩타이드의 분리에대한 시료 부피의 영향

통상의 방법과 같이 상기 분리겔위에 축적겔을 다시 중합시켜 생성시키는 일 없이 상기 분리겔에 시그마회사로부터 구입한 펩타이드 분자량 표준시료(molecular mass size markers; 분자량의 범위가 2.5~17.0 kDa이고 myoglobin을 CNBr로 처리하여 얻은 fragments)를 부피별로 적용하였는데, 미리 단백질 시료에 샘플 완충용액(60mM 트리스, pH 6.8, 2%(w/v)SDS, 10%(w/v) 글리세린, 0.1M dithiothreitol, 0.01%(w/v) 브롬페놀블루)을 첨가하고 95℃에서 4분 동안 끊인 후, 전기영동하였다. 겔의 두께는 0.75 mm이고 모두 10개의 요철상 웰을 사용하였으며, 각 웰당 6∼18㎕의 시료를 적용하였다.

펩타이드들은 전기영동 후에 꾸마시 브릴리언트 블루 R250(Coomassie brilliant blue R250)을 포함하는 염색용액으로 1시간 동안 염색하였으며 메탄올/ 초산을 포함하는 탈염색 용액으로 탈색시켰다.

통상 최대 18㎕의 시료를 전기영동할 수 있는데, 실험 결과 도 1에 나타낸 바와 같이,본 발명의 겔 시스템에서도 마찬가지로 약 18㎕까지 시료를 적용하여 전기영동이 가능하였다. 또한, 적용한 펩타이드 표준시료의 농도 및 부피에 대하여 각각의 펩타이드에 대한 분리능과 이동거리에 변화가 없었다.

전기영동 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 사이즈 마커의 경우 각각의 구성 단백질 밴드로 모두 분리가 되었으며 분리상도 선명하였다. 분자량 사이즈 마커는 2.5∼17.0 kDa 사이의 분자량을 갖는 단백질들의 혼합물이다.

실시예 2:트리신을 포함하는 폴리아크릴아마이드 단일겔을 이용한 여러 종류의 펩타이드 시료의 전기영동

실시예 1에서와 같이 전기영동용 단일겔을 제조하여, 또한 상업적으로 구입한 여러 종류의 표준 시료들을 상기한 트리신을 포함하는 단일겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 이때 모든 실험 조건은 실시예 1과 동일하게 사용하였다. 다만, 시료의 부피는 모두 10㎕로 일정하게 하였다.

이때 사용한 펩타이드 시료들은 다음과 같다(insuline chain B, 분자량 3.5 kDa; lactofericin B, 분자량 3.2 kDa; bovine growth hormone releasing factor, 분자량 5.1 kDa; cytohrome c, 분자량 12.3 kDa; lysozyme, 분자량 13.9 kDa). 실험결과 분자량 3.2 kDa에서 13.9 kDa까지의 시료들의 분리능력이 표준 시료의 경우와 마찬가지로 기존의 다른 실험방법에 비해 뚜렷하게 향상되었음을 알 수 있었다.

전기영동 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 분자량 사이즈 마커의 경우 각각의 구성 단백질 밴드로 모두 분리가 되었으며 분리상도 선명하였다. 상기 도 2에서 제 1레인은 분자량 사이즈 마커(2.5~17.0 kDa), 제 2레인은 insuline chain B(분자량 3.5 kDa), 제 3레인은 lactofericin B(분자량 3.2 kDa), 제 4레인은 bovine growth hormone releasing factor(분자량 5.1 kDa), 제 5레인은 cytohrome c(분자량 12.3 kDa), 제 6레인은 lysozyme(분자량 13.9 kDa), 제 7레인은 분자량 사이즈 마커(2.5~17.0 kDa)이다.

실시예 3:본 발명의 겔 시스템이 전기영동 후 전기블롯(electroblotting) 과정에 미치는 영향

실시예 1에서와 같이 전기영동용 단일겔을 제조하여, 또한 상업적으로 구입한 여러 종류의 표준 시료들을 상기한 트리신을 포함하는 단일겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 이때 모든 실험 조건은 실시예 1과 동일하게 사용하였다. 총아크릴아미드 농도는 17중량%(%T)으로하였다. 다만, 시료의 부피는 모두 10㎕로 일정하게 하였다. 상기한 트리신을 포함하는 단일겔을 이용한 전기영동방법이 PVDF 막이나 NC 막(nitrocellulose)으로 전기전달(electrotransfer) 실험을 수행할때 유용한지 알아보기위해서, 트리신을 포함하는 단일겔을 이용한 표준 펩타이드 시료의 전기영동 한 후 PVDF 막에 전기블롯(electroblotting)을 수행하였다.

전기영동 결과 도 2(A)에 나타낸 바와 같이, 분자량 사이즈 마커의 경우 각각의 구성 단백질 밴드로 모두 분리가 되었으며 분리상도 선명하였다. 도 2(A)에서 나타낸 전기영동한 분자량 사이즈 마커를 전기전달(electrotransfer) 실험을 수행하였다. 도 2(A)및 도 2(B) 에서 제 펩타이드들은 전기영동 후에 꾸마시 브릴리언트 블루 R250(Coomassie brilliant blue R250)을 포함하는 염색용액으로 염색하였으며 메탄올/ 초산을 포함하는 탈염색 용액으로 탈색시켰다.

도 2(B)에서 나타낸바와 같이 전기블롯(electroblotting)을 수행하는데 아무런 문제점이 없었으며 3개의 겔을 이용한 트리신(tricine)을 사용한 트리신-에스디에스-페이지 시스템(참조: Schagger, H. and von Jagow, G. (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379)의 분리능력과 유사한 결과를 얻었다. PVDF 막이나 NC 막(nitrocellulose)으로 전기전달(electrotransfer)된 펩타이드들은 아미노 말단 서열분석이나 면역블롯(western blot)에 이용될 수 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 트리신을 포함하는 단일겔을 이용하여 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 분리 및 분석에 이용할 수 있는 방법을 제공한다.

Claims

폴리아크릴아미드를 분리겔로 사용하는 전기영동방법에 있어서, 분리겔 내 및 전극액의 전해질의 조성이 산, 아민, 트리신 및 아미노산을 함유하는 수용액이고, 아민과 양성 전해질의 함유량의 몰 농도비가 1: 0.8∼2이며, 아민의 pK 값이 8∼8.6의 범위임을 특징으로 하는 축적겔 없이 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용하는 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 전기영동방법.
제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 전극액 중의 아민 및 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액 중의 아민은 모두 트리스(히드록시메틸)아미노메틸임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 전기영동방법.
제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액의 pH가 6.0∼9.0 범위임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 전기영동방법.
제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의전해질 용액에 사용되는 아미노산은 동일 분자내에 동수의 음이온성기와 양이온성기를 가지며, 양성 전해질의 음이온성기는 pK 값이 약 2.3~3.1이고, 양이온성기는 pK 값이 약 8.0임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 전기영동방법.
제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의전해질 용액에 사용되는 트리신은 동일 분자내에 동수의 음이온성기와 양이온성기를 가지며, 트리신의 음이온성기는 pK 값이 약 2.3이고, 양이온성기는 pK 값이 7.8~8.6임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 전기영동방법.
제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액에 사용되는 트리신, 아미노산인 글리신, 세린, 아스파라진 및 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 또는 복수종임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 2.0~20.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드의 전기영동방법.
제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액에 사용되는 트리신, 아미노산인 글리신, 세린, 아스파라진 및 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 또는 복수종임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 분자량 2.0~17.0 kDa 범위의 펩타이드의 전기영동방법.