KR20020012104A - 단일겔만을 이용한 단백질 전기영동방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 축적겔 없이 폴리아크릴아미드를 지지체로 한 단일겔 시스템을 사용한 단백질의 폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 관한 것이다. 본 발명에 사용되는 전기영동 시스템은 분리겔, 양극 및 음극의 전극액 및 전원공급장치로 이루어지고, 상기 전기영동시스템에 속하는 분리겔 내 및 전극액의 전해질의 조성이 산, 아민 및 양성 전해질을 함유하는 수용액이고, 아민과 양성 전해질의 함유량의 몰 농도비가 1: 0.8∼2이며, 아민의 pK 값이 8∼8.5의 범위이고, 양성 전해질의 음이온성기의 pK 값은 약 3.1이고, 양이온성기의 pK 값은 약 8.0임을 특징으로 한다.

Description

단일겔만을 이용한 단백질 전기영동방법{METHOD OF PROTEIN ELECTROPHORESIS USING ONLY SINGLE GEL}

본 발명은 생물학, 생화학, 의학 등 생명과학 분야에서 단백질, 핵산 등 거대분자의 분리ㆍ분석에 사용되는 폴리아크릴아미드 전기영동법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 폴리아크릴아미드를 지지체로 한 단일겔 시스템을 사용하는 폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 관한 것이다.

폴리아크릴아미드를 지지체로 하는 겔 전기영동법은 겔의 제조시에 아크릴아미드와 가교제의 농도 및 비율을 조절함으로써 겔의 미세통로 크기를 조절할 수 있기 때문에 다양한 크기의 생체 거대분자들을 분리할 수 있고, 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 사용돼 왔다.

아크릴아미드가 지지체로 사용되는 단백질, 핵산 등의 전기영동법은 크게 두가지로 나눌 수 있다. 이들은 하나의 겔만을 사용하는 연속적 겔 시스템법(이하 단일겔 시스템이라고도 한다)과 두개의 겔이 사용되는 불연속 완충용액 방법(이하 불연속법이라고도 한다)이다. 연속적 겔 시스템법은 pH 3∼11 사이의 완충용액을 한가지 선택하여 겔과 음전극액 내 전해질 조성 및 농도를 동일하게 만들어 전기영동하는 방법이다. 이 연속적 겔 시스템법에서는 분리겔 한가지만이 사용된다. 불연속 완충액 방법에서는 두가지의 불연속적인 겔, 즉 축적겔과 분리겔이 사용된다.

연속적 겔 시스템법은 불연속 완충용액법에 비하여 준비가 간단하며 시료 내 단백질 침전이나 집합체 형성 등의 문제점은 적으나 많은 양의 시료를 전기영동하지 못하는 단점을 갖고 있었다. 또한, 분리능 면에 있어서도 불연속 겔 시스템에 비하여 현저히 떨어져 현재는 거의 사용되고 있지 않는 실정이다.

그러나, 단일겔 시스템의 편리성 때문에 축적겔을 사용하지 않는 연속적 겔 시스템에 의한 전기영동 방법들이 몇 차례 시도된 바 있었다. 예를 들면, 전기영동 방향에 대하여 아크릴아미드 농도를 연속적으로 변화시킨 농도구배 겔을 사용하는 연속적 겔 시스템을 이용한 전기영동방법으로서 아크릴아미드 농도를 통상 20%로부터 4∼5%까지 연속적으로 변화시킨 겔 시스템에서는 따로 축적겔이 필요없다는 것이 알려져 있다. 이들 아크릴아미드 농도구배를 이용한 전기영동방법에 관하여는 일본 특개소 61-28512호, 특개소 63-210654호, 특개평 1-263548호 등에 개시되어 있다.

또한, 트리스-인산 완충용액과 글리세린을 겔 내 전해질 용액으로 사용하여 분리 겔을 준비하고, 시료에 아가로즈를 첨가하고 이를 고온에서 녹여 직접 분리겔에 적용하여 단백질을 전기영동하는 방법이 소개된 바 있다(DeWald, D.B. et al,(1986) Anal. Biochem. 154, 502∼508 참조). 이 방법에 의하면 축적겔을 따로 마련할 필요가 없다.

또한, 마샬(Marshall)등은 분리겔 위에 직접 아가로즈로 웰(well)을 만들고 시료를 적용하여 전기영동한 결과, 폴리아크릴아미드를 사용하는 축적겔이 필요없음을 발표한 바 있다(Marshall, T. et al,(1989) Electrophoresis 10, 63∼65).

그러나, 이들 방법은 아크릴아미드 농도구배를 위한 별도의 믹서(mixer) 장치를 필요로 하거나 아크릴아미드외에 아가로즈를 지지체의 일종으로 사용해야 하는 번거로움이 있었다.

단백질 분리를 위한 전기영동에 있어서 오늘날 가장 광범위하게 쓰이는 SDS-불연속 전기영동법(이하 램리법이라 한다)은 1970년 영국의 램리(Laemmli)에 의해 개발되었다(Laemmli,U.K.(1970) Nature 227, 680∼685). 이후 여러 논문과 문헌에서 이 방법을 약간씩 변형하여 특수한 상황에 맞는 단백질 전기영동법들이 소개되었으나 그 기본기술이라 할 수 있는 불연속적 겔, 즉 축적겔과 분리겔을 이용함에 있어서는 변함이 없었다

상기 램리법에 따르면, 축적겔과 분리겔은 유사한 화학적 조성, 즉 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충용액, 아크릴아미드/N,N-비스아크릴아미드, 도데실유산염등으로 되어 있으나 각각의 배합비율과 아크릴아미드의 농도, pH가 서로 다른 특성을 가지고 있다. 축적겔은 겔 및 이온전극액 내 이온들이 전기장 하에서 이동하면서 시료 내 단백질이 차지하는 부피를 최소한으로 농축한 후, 분리겔로 넘겨주는 역할을 수행한다. 만일 축적겔이 존재하지 않으면 적용시료의 부피에 따라 단백질 밴드의 분리상이 불선명하게 되며, 분자량 차이에 의한 분리성능이 크게 악화된다. 따라서, 한번의 전기영동을 위해서는 먼저 pH 8.8로 부분 중화된 아민을 갖는 분리겔을 굳힌 다음, 그 위에 pH 6.8의 축적겔을 마련해야 한다. 분리겔은 분리하고자 하는 단백질의 분자량에 따라 통상 7∼18% 아크릴아미드 농도를 이용하나, 축적겔은 4% 또는 5% 농도를 사용한다.

상기와 같이, 램리법은 서로 다른 조성의 용액 준비와 두 번의 공중합 과정을 필요로하기 때문에 비교적 긴 시간, 즉 대략 60∼90분이 소요되는 동시에 겔 준비에 여러 단계의 과정을 거치는 노력을 기울여야 한다.

한편, 이러한 사용자들의 불편을 줄이기 위하여 바이오라드(Bio-Rad), 노벡스(Novex), 아울 세파레이션 시스템스(Owl separation systems) 등과 같은 생명공학 회사를 중심으로 특정 크기의 틀에 축적겔과 분리겔을 미리 중합시킨 제품을 판매하고 있다.

상기한 바와 같은 종래의 배경기술에 의하면, 단일겔 시스템법은 불연속 겔 시스템법에 비하여 분리성능이 낮고 많은 양의 시료를 전기영동하지 못한다는 문제점이 있었다. 또한, 이러한 단일겔 시스템법을 개량한 방법들에 있어서도 별도의 믹서 장치를 필요로 하거나 아크릴아미드외에 아가로즈를 지지체의 일종으로 사용해야 하는 문제점이 있었다. 한편, 종래 가장 많이 사용되어온 불연속겔 시스템법인 램리법에 의하면 서로 다른 조성의 용액 준비와 두 번의 공중합 과정을 필요로 한다는 문제점이 있었다.

본 발명에서는 상기와 같은 종래 배경기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로 단백질, 핵산 등의 생체고분자에 대하여 높은 분해능을 보일 수 있는 단일겔 시스템법을 사용한 전기영동방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

도 1는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 DH5α대장균 스트레인의 단백질 추출물을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도 2A는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 XL1-Blue 및 BL21 대장균 스트레인의 단백질 추출물을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도2B는 종래 램리 겔 시스템을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 XL1-Blue 및 BL21 대장균 스트레인의 단백질 추출물을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도 3은 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 사이즈 마커, 진핵세포 단백질 추출물, 글루타치온 트랜스퍼라제(GST)-융합단백질을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도 4A는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 저분자량(LMW) 단백질 사이즈 마커의 적용 부피를 달리하여 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도 4B는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 저분자량(LMW) 단백질 사이즈 마커 시료내 염화나트륨(NaCl)의 농도를 달리하여 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도 4C는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 저분자량(LMW) 단백질 사이즈 마커 시료내에 계면활성제인 CHAPS 또는 Triton X-100을 첨가한 상태에서 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고,

도 5는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 전기영동한 후 웨스턴 블롯트한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 단백질, 핵산 등의 생체고분자의 전기영동에 있어서, 램리 처방과 같은 두 개의 서로 다른 겔 시스템을 사용하는 대신 하나의 겔만을 사용하여 단백질, 핵산 등을 분리하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명은 폴리아크릴아미드를 분리겔로 사용하는 전기영동방법에 있어서, 전기영동 시스템은 분리겔, 양극 및 음극의 전극액 및 전원공급장치로 이루어지고 상기 전기영동시스템에 속하는 분리겔 내 및 전극액의 전해질의 조성이 산, 아민 및 양성 전해질을 함유하는 수용액이고, 아민과 양성 전해질의 함유량의 몰 농도비가 1:0.8∼2이며, 아민의 pK 값이 8∼8.5의 범위임을 특징으로 하는 축적겔 없이 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용하는 단백질의 전기영동방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하면 분리겔 하나만으로 기존의 불연속 겔과 유사한 효과를 얻을 수 있다.

상기에서 아민과 양성 전해질의 함유량의 몰 농도비가 1:0.8 미만이거나 1:2를 초과하는 경우에는 단백질의 분리능이 나빠지게 된다. 또한, 상기 아민의 pK 값이 8미만인 경우에는 pH가 낮아지게 된다. 아민의 pK 값이 8.5를 초과하는 경우에는 pH 조절시에 산을 추가로 첨가해야 하는 불편이 따른다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 있어서, 전기영동용 전극액 중의아민 및 겔 내의 전해질 용액 중의 아민은 어느 것이나 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(이하 트리스로 쓴다)인 것이 바람직하다.

이때, 폴리아크릴아미드 겔 내 트리스의 농도는 0.02 mol/l 이상 0.2 mol/l 사이에서 선택되는 것이 바람직하다. 폴리아크릴아미드 겔 내의 트리스의 농도가 0.02 mol/l 미만이면 완충용액으로서 작용할 수 없고, 0.2 mol/l를 초과하는 경우에는 본 발명의 단일겔을 이용한 단백질 전기영동방법에 있어서 단백질의 분리능이 좋지 않게 된다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 폴리아크릴아미드겔에 있어서 겔 용액의 pH는 6.8∼10 범위이다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔 내의 pH를 6.8∼8 영역으로 조절하기 위하여는 산을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 산은 1가의 산이며, 염산, 초산 및 그들의 혼합물에서 선택되는 것이 특히 바람직하다.

그러나, 아크릴아미드 겔내의 전해질 용액의 pH가 8이상에서 10사이인 폴리아크릴아미드 겔 제조에 있어서는 아민과 양성 전해질들만의 비율로 pH를 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔에 있어서, 겔 용액내의 양성 전해질은 동일 분자내에 동수의 음이온성기와 양이온성기를 갖는다. 양성 전해질의 음이온성기의 pK는 약 3.1, 양이온성기는 pK가 약 8.0이다.

양성 전해질의 이온화 정도는 pH에 의존하며 음이온성기의 pK 보다 낮은 pH에서는 전체적으로 양전하를 띄고, 중성 pH에서는 전기적으로 중성이 되며, 양이온성기의 pK 보다 높은 pH에서는 음전하를 띄게 된다.

따라서, 양성 전해질은 겔 내에서 실질적으로 1가의 의사약산(擬似弱酸)으로서 작용하는데, 이는 양성 전해질이 알칼리 조건의 아민 용액에 용해될 때 양성 전해질의 카르복실기(COOH)가 수소이온과 음이온으로 해리되기 때문이다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔에 있어서, 겔 내의 전해질 용액에 사용되는 양성 전해질이 글리신, 세린, β-알라닌 및 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 중에서 선택되는 1종 또는 복수종의 혼합물인 것이 바람직하다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동 시스템에 있어서, 분자량에 의한 단백질의 분리를 위해서는 음극측의 전기영동용 전극액에 0.01중량% 이상의 도데실유산염(이하 SDS로 쓴다)을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동 시스템에 있어서, 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성 전해질이 글리신, 세린, β-알라닌 등의 아미노산과 아미노산 유도체인 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신(이하 트리신이라 한다) 중에서 선택되는 일종 또는 복수종인 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔은 모노머 형태의 아크릴아미드에 대한 디비닐 화합물 1∼10중량%를 공중합시켜 얻어진 것을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 디비닐 화합물로는 N,N-메틸렌비스 아크릴아미드가 바람직하다. 모노머 형태의 아크릴아미드에 대한 디비닐 화합물이 0.1중량% 미만일 때는 아크릴아미드와 디비닐 화합물로 이루어지는 공중합체의 가교정도가 낮아 단백질의 분리능이 좋지 않다. 또한, 모노머 형태의 아크릴아미드에 대한 디비닐 화합물이 10중량%를 초과하는 경우에는 아크릴아미드와 디비닐 화합물로 이루어지는 공중합체의 가교정도가 너무 높아 단백질의 분리에 과도한 시간이 소요되고, 그에 따른 열발생이 일어나 실용적이지 못하다.

또한, 본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔 제조에 있어서, 아크릴아미드 모노머와 디비닐 화합물의 공중합을 위한 중합개시 수단으로서는 과유산암모늄(이하 APS라 한다) 등의 과산화물과 N, N, N´,N′-테트라메틸에틸렌디아민(이하 TEMED라 한다)등의 환원제를 사용하는 레독스형의 중합개시제들을 중합촉매로 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔에 사용되는 중합개시제들은 상기한 레독스형에 특히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 리보플라빈에 의한 광유도 공중합 반응 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔 내에 SDS를 첨가하지 않아 샘플처리 용액과 전기영동용 음전극액 중에 SDS의 존재유무에 따라 자연상태의 단백질 전기영동법과 변성조건에서의 전기영동법 모두 가능하도록 할 수 있다. 또한, 변성조건의 전기영동, 즉 샘플처리 용액과 음전극액 내에 SDS가 존재하는 경우, 겔의 전해질 용액 중에 SDS의 존재유무는 전기영동 및 단백질의 분리능에 아무런 영향을 주지 않는다.

실시예

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

호퍼(Hofer)사에서 판매하는 전기영동용 키트를 구입하여 가로 10 cm, 세로 8cm의 직사각형 유리판과 두께 0.75 mm의 스페이서를 사용한 전기영동 장치를 조립하였다. 본 발명의 단일겔을 이용한 전기영동법에 사용되는 전기영동용 겔을 제조하기 위하여, 총 아크릴아미드 농도는 10 중량%(%T)이고 아크릴아미드 모노머에 대하여 N,N-메틸렌비스아크릴아미드는 3.3 중량%를 포함하는 하기의 조성을 가진 전해질 용액에 대하여 APS 0.1 중량% 및 TEMED를 0.04 중량%가 되게 첨가한 후, 두 유리판 사이에 주입하고 30분 동안 중합시켜 전기영동용 분리겔을 얻었다. 이때, 사용된 전해질 용액은 0.075 mol/l의 트리스, 0.1 mol/l 글리신, 0.1 mol/l 세린이며, 최종 pH는 염산으로 7.5가 되도록 조절되었다.

통상의 방법과 같이 상기 분리겔 위에 축적겔을 다시 중합시켜 생성시키는 일 없이 상기 분리겔에 각각의 대장균 스트레인 즉, DH5α, XL1-Blue, BL21 전체 단백질 추출액을 부피별로 적용하였는데, 미리 단백질 시료에 램리(Laemmli) 처방의 샘플 완충용액(β-머캅토에탄올, SDS, 글리세린, 브롬페놀블루)을 첨가하고 95℃에서 4분 동안 끊인 후, 전기영동하였다. 겔의 두께는 0.75 mm이고 모두 10개의 요철상 웰을 사용하였으며, 각 웰당 2∼16㎕의 시료를 적용하였다.

전기영동용 전극액의 조성은 트리스 농도 0.025 mol/l, 글리신 농도 0.192 mol/l, SDS 0.1 중량%를 램리(Laemmli) 방식과 동일하게 사용하였다.

전기영동은 140 V 정전압으로 행하고, 브롬페놀블루 색소의 전기영동 말단이 밑에서 5 mm되는 곳에서 통전을 중지하였다.

단백질들은 전기영동 후에 꾸마시 브릴리언트 블루 R250(Coomassie brilliant blue R250)을 포함하는 염색용액으로 1시간 동안 염색하였으며 메탄올/ 초산을 포함하는 탈염색 용액으로 탈색시켰다.

본 실시예에 따른 결과는 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 0.75 mm의 겔, 10개의 요철상 웰인 경우, 통상 최대 약 16㎕의 시료를 전기영동할 수 있는데, 본 발명의 겔 시스템에서도 마찬가지로 약 16㎕까지 시료를 적용하여 전기영동이 가능하였다. 또한, 적용한 단백질 추출물의 농도 및 부피에 대하여 각각의 단백질에 대한 분리능과 이동거리에 변화가 없었다.

상기에서 도 1은 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 DH5α대장균 스트레인의 단백질 추출물을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 2A는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 XL1-Blue 및 BL21 대장균 스트레인의 단백질 추출물을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이고, 도2B는 종래 램리 겔 시스템을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 XL1-Blue 및 BL21 대장균 스트레인의 단백질 추출물을 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 2A 및 도 2B에서 레인 1의 시료는 사이즈 마커이고 레인 2의 시료는 XL1-Blue 대장균 스트레인의 단백질 추출물이고 레인 3의 시료는 BL21 대장균 스트레인의 단백질 추출물이었다. 또한, 도 2에서 화살표와 숫자는 각 단백질 밴드의 분자량을 나타내며 K는 분자량 1000을 의미한다.

실시예 2

실시예 1에서와 같이 전기영동용 단일겔을 제조하여, 단백질 사이즈 마커, 진핵세포 단백질 추출물, 글루타치온 트랜스퍼라제(GST)-융합 단백질 등을 전기영동하였다.

이때 모든 실험 조건은 실시예 1과 동일하게 사용하였다. 다만, 시료의 부피는 모두 10㎕로 일정하게 하였다.

전기영동 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, 사이즈 마커의 경우 각각의 구성 단백질 밴드로 모두 분리가 되었으며 분리상도 선명하였다. 상기 도 3에서 레인 1, 2, 10의 시료는 GST 융합단백질이고, 레인 3, 5, 9의 시료는 HMW 사이즈 마커이고 레인 4, 8의 시료는 LMW 사이즈 마커이고 레인 6, 7의 시료는 COS 세포 단백질 추출물이었다. 여기서 GST는 글루타치온 트랜스퍼라제를 나타내고, HMW는 high molecular weight의 약자로 LMW는 low molecular weihgt의 약자로 사용되었다. HMW 사이즈 마커는 42∼200kDa, LMW는 14.4∼97kDa 사이의 분자량을 갖는 단백질들의 혼합물이었다.

실시예 3

LMW 단백질 사이즈 마커의 적용 부피와 단백질의 전기영동에 많은 영향을 미치는 것으로 알려진 시료내 염(鹽) 농도를 여러 가지로 달리 하면서 전기영동하였다. 이때 아크릴아미드 농도는 11중량%를 사용하였으며, 다른 조건은 실시예 1과 동일하였다.

또한, 시료에 SDS 이외에 계면활성제인 CHAPS 2중량%와 Triton X-100 1중량%를 첨가한 상태에서 상기와 같은 방법으로 전기영동을 수행하였다.

실험 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 실시예 1에서와 마찬가지로 시료의 적용 부피(sample volume)가 증가하여도 전기영동 결과는 동일하였으며 염화나트륨(NaCl) 농도를 500 mM까지 증가시켰을 때, LMW 사이즈 마커 단백질 밴드의 모양이나 이동도에 별다른 영향이 없었다. 또한, 다른 계면 활성제들이 존재하여도 분리능에는 차이가 없었다. 상기 도4에서 도 4A는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 저분자량(LMW) 단백질 사이즈 마커의 적용 부피를 달리하여 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4A에서 레인 1, 2, 3, 4에 적용된 시료의 부피는 각각 4, 8, 12, 16㎕이었다. 상기 도4에서 도 4B는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 저분자량(LMW) 단백질 사이즈 마커 시료내 염화나트륨 농도를 달리하여 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4B에서 레인 5, 6, 7, 8에 적용된 시료내의 염화나트륨의 농도는 각각 50, 100, 200, 500mM이었다. 상기 도4에서 도 4C는 본 발명의 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법을 이용하여 저분자량(LMW) 단백질 사이즈 마커 시료내에 계면활성제인 CHAPS 및 Triton X-100을 첨가한 상태에서 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4C에서 레인 9에 적용된 시료 내에는 CHAPS 2중량%가 포함되었고, 레인 10에 적용된 시료 내에서는 Triton X-100 1중량%가 포함되었다.

실시예 4

본 발명의 겔 시스템이 전기영동 후 웨스턴 블롯트 과정에 미치는 영향을 조사하였다.

3종류의 동물세포(MCF7, HeLa, RKO)에 검출하고자 하는 단백질을 과발현할 수 있는 벡터를 삽입시키고 기존의 방법대로 세포를 배양한 후, 파쇄하여 단백질 추출물을 얻었다.

실시예 1에서 상술한 방법으로 12중량%(%T) 폴리아크릴아미드 겔을 제조하고 전기영동한 후, 분리된 단백질들을 PVDF막으로 옮겼다. 통상의 방법으로 p53 및 p21과 같은 검출하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체 및 2차 항체를 처리하고 아머샴 회사의 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 사용하여 검출을 시도하였다.

실험 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 기존의 램리 겔 시스템과 마찬가지로 분리된 단백질들이 원활하게 PVDF 막으로 이동하였으며, p53, p21 등의 세포 내 단백질을 항체로 검출하는데 문제가 없었다.

도 5에서 숫자는 세포 안으로 도입(transfection)된 DNA의 양을 나노그람(ng) 단위로 표시한 것이며, CTL은 대조군으로서 DNA가 도입되지 않은 세포를 시료로 하여 웨스턴 블롯트를 수행한 결과를 나타내는 것이다.

본 발명의 단일겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법에 따르면, 종래의 축적겔 및 분리겔을 사용하는 분연속적 겔 시스템을 사용한 전기영동방법에 비하여 거의 유사한 분리능을 가지면서도 단일겔만을 사용하는 연속적 겔 시스템을 이용하여 단백질의 전기영동을 수행할 수 있게 된다.

또한, 본 발명에 따르면, 단일겔만을 사용하는 연속적 겔 시스템을 사용함으로써 축적겔을 제조하거나 구매할 필요가 없으므로 단백질의 전기영동용 겔을 제조하는 데 소요되는 시간, 노력, 비용을 절감할 수 있게 된다.

Claims (13)

1. 폴리아크릴아미드를 분리겔로 사용하는 전기영동방법에 있어서, 전기영동 시스템은 분리겔, 양극 및 음극의 전극액 및 전원공급장치로 이루어지고, 상기 전기영동시스템에 속하는 분리겔 내 및 전극액의 전해질의 조성이 산, 아민 및 양성 전해질을 함유하는 수용액이고, 아민과 양성 전해질의 함유량의 몰 농도비가 1: 0.8∼2이며, 아민의 pK 값이 8∼8.5의 범위임을 특징으로 하는 축적겔 없이 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용하는 단백질의 전기영동방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 전극액 중의 아민 및 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액 중의 아민은 모두 트리스(히드록시메틸)아미노메틸임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액의 pH가 6.8∼10 범위임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액의 pH는 1가의 산을 이용하여 6.8∼8로 조절된 것을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 1가의 산은 염산, 초산 및 그들의 혼합물에서 선택됨을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액의 pH는 어떠한 종류의 산도 사용하지 않고 아민과 양성 전해질의 농도 비율에 의해 8∼10의 범위로 조절된 것임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의전해질 용액에 사용되는 양성 전해질은 동일 분자내에 동수의 음이온성기와 양이온성기를 가지며, 양성 전해질의 음이온성기는 pK 값이 약 3.1이고, 양이온성기는 pK 값이 약 8.0임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔 내의 전해질 용액에 사용되는 양성 전해질은 글리신, 세린, β-알라닌 및 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 또는 복수종임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 음극측의 전기영동용 전극액에 사용되는 양성 전해질은 글리신, 세린, β-알라닌 및 N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 또는 복수종임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔은 아크릴아미드 모노머에 대하여 1∼10중량%의 디비닐 화합물을 공중합 시켜 얻어진 것임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 디비닐 화합물은 N,N-메틸렌비스아크릴아미드임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 전기영동 시스템에 속하는 폴리아크릴아미드 겔은 아크릴아미드 모노머와 디비닐화합물의 공중합을 위한 중합개시수단으로서 레독스형의 중합개시제를 사용하여 중합되어진 것임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 레독스형의 중합개시제는 과산화물 및 N,N,N′,N′-테트라메틸에틸렌디아민으로 이루어진 것임을 특징으로 하는 단일 폴리아크릴아미드 겔만을 이용한 단백질의 전기영동방법.