CN1257184C - 疏水性蛋白质的增溶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适用于电泳的固定pH梯度(IPG)的凝胶，这种凝胶包括聚合单元(I)CH2＝CR1-CO-NR2R3和(II)CH2＝CR4-CO-NR5R6，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同，并且是氢或C1-C4烷基，其限制条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一种是C1-C4烷基。

Description

疏水性蛋白质的增溶
技术领域
本发明涉及一种分析样品中大分子的方法和仪器。
背景技术
在分析大分子领域中，单向和双向凝胶电泳已经成为分离和显现大分子的标准工具。
单向凝胶电泳，可使例如蛋白质的大分子混合物在变性条件下通过聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按照质量差异分离成单一组分。大分子混合物首先在例如1％十二烷基硫酸钠(SDS)(一种阴离子两亲去污剂)的溶液中溶解。对于蛋白质，这种去污剂破坏几乎天然蛋白质中所有非共价相互作用，即大部分的蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂类相互作用。SDS的阴离子以每两个氨基酸残基与大约一个SDS的比例结合至蛋白质主链，它赋予SDS和变性蛋白的复合物大量的与蛋白质质量粗略成比例的净负电荷。蛋白质的混合物接着在含SDS的凝胶中电泳。
分离、分析和显示大分子混合物的更灵敏的方法是双向电泳。这样的双向电泳通常包括在第一向的等电聚焦电泳和在第二向的SDS凝胶电泳的顺序分离。
等电聚焦电泳分离蛋白质以其酸性和碱性残基的相对含量为基础。在外加电场的影响下，更高荷电的蛋白质比相似大小和形状的较低荷电的蛋白质移动快。如果蛋白质从样品区经过一个非对流介质(常规的例如聚丙烯酰胺的凝胶)移动，将会产生电泳分离。当蛋白质进入某一区域，在该区域的pH值使蛋白质净电荷为零(等电点，p1)，它会停止相对于介质的移动。进一步地，如果蛋白质的移动经过自阳极单调升高的pH梯度，则蛋白质会“聚焦”在其等电点。两种具有不同的荷电比例、或不同的滴定度、不同的氨基酸的蛋白质将凭借它们不同的等电点被分离。事实上，这种分离方法能分辨在其各自序列内几百个氨基酸中仅相差不到一个带电荷的氨基酸的两种蛋白质。
等电聚焦通常在含共价固定pH梯度的聚丙烯酰胺凝胶的薄平胶条(例如，IPG凝胶条)上进行。脱水状态的IPG凝胶条有商品提供，使用之前在适当的溶液中再水合。重要的是，再水合溶液必须与含有要分离蛋白质的溶液相容。
实践中，按照双向凝胶电泳，含有感兴趣的大分子的细胞和组织样品以提取液溶解和增溶。感兴趣的大分子应当溶解，同时仍保留它们的自然电荷。在非变生条件下，某些膜蛋白可通过相对温和的方式溶解，例如用例如TritonX-10的非离子表面活性剂溶液提取。在变性条件下，许多膜蛋白是相对不溶的并且仅能用强表面活性剂和离液序列高的试剂或者有机溶剂溶解。
变性条件下用于溶解膜蛋白的溶液包括含有离液序列高的试剂尿素或硫脲的溶液，其中尿素是弱碱性的并且是弱疏水性的。含有尿素的溶液也用于IPG凝胶的再水合。含有尿素的溶液已知对溶解弱疏水性蛋白有效，并且适于和市售的凝胶(例如Pharmacia，固定化电解质干胶条(ImmobilineDryStrips))一起使用。一种特别常规的溶液是7M尿素、2M硫脲、1％ASB-14、2mM TBP。
然而，含有强疏水性蛋白的细胞膜显示需要强疏水性提取液以溶解细胞膜蛋白。这种高有机质溶液先前未和双向电泳结合使用，由于市售的IPG条(双向电泳的第一向)在疏水和亲水相互作用下，没有恰当的在高有机质溶液中再水合的化学成分。例如，环丁砜提取液不能再水合常规100％丙烯酰胺IPG条。这意味着弱疏水性溶液已持续用于等电点聚焦蛋白质的增溶。
发明内容
本发明人已经生产出包括亲水和疏水单体混合物的IPG凝胶，以生产改进的IPG凝胶。
优选地，本发明的IPG凝胶比市售的凝胶更疏水，并且优选地，IPG凝胶是两亲的且具有改善的稳定性。进一步地，这些IPG凝胶优选和例如环丁砜的强疏水性提取液一起使用，它提供提取样品中更大范围的蛋白质和其它大分子的能力。
本发明提供具有不同特性的多种凝胶，适于分离更大范围的蛋白质和其它大分子。
因此，第一方面，本发明涉及适用于电泳的固定pH梯度(IPG)的凝胶，它包括亲水和疏水单体的混合物，其中至少一种单体包括一种或多种低级烷基基团。优选地，这种凝胶包括聚合单体单元(I)CH2＝CR1-CO-NR2R3和(II)CH2＝CR4-CO-NR5R6，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同并且是氢或C1-C4烷基，其限制条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一种为C1-C4烷基。
在第一方面的第一优选的实施方案中，本发明涉及适用于电泳的IPG凝胶，其中该凝胶包括丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺(DMA)，或者N-丙烯酰基氨基丙醇(AAP)和二甲基丙烯酰胺(DMA)的混合物。
在第二方面，本发明涉及分离和/或分析样品内至少一种大分子的方法，它包括采用如本文所述的本发明的IPG凝胶对样品进行等电聚焦电泳。
优选地，这种方法进一步包括增溶样品内的至少一种大分子。
如第二方面所述，本方法优选继之以进一步的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离或分析。在特别优选的实施方案中，该分离在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行。
第二方面的方法优选结合常规的分离方法以获得改进的分离和分析。
在第三方面，本发明提供如本文所述的本发明的IPG凝胶的用途，以分离和分析样品内的至少一种大分子。大分子优选是蛋白质混合物中的一种蛋白质。
在第四方面，本发明涉及分离和/或分析样品内大分子用的试剂盒，该试剂盒包括：增溶剂、本发明的固定pH梯度(IPG)的凝胶和使用说明书(可选配)。
附图说明
图1是AAP+DMA IPG条的照片复印件，它包括在常规溶液中提取和分离的大肠杆菌(E.coli)的全细胞蛋白提取物。
图2是AAP+DMA IPG条的照片复印件，它包括在环丁砜溶液中提取和分离的大肠杆菌(E.coli)全细胞提取物。
图3是AAP+DMA IPG条的照片复印件，它包括在水基提取液中提取和分离的天然人血浆。
图4是采用常规的和环丁砜的溶液提取和分离的大肠杆菌(E.coli)全细胞制备物的照片复印件。在图4(a)中，常规溶液在7cm 4-7 Pharmacia IPG条上聚焦。在图4(b)中，环丁砜提取液在含丙烯酰胺和DMA的实验室制备的7cm 4-7 IPG上聚焦。
图5是采用常规的和环丁砜的溶液提取和分离的大肠杆菌(E.coli)全细胞制备物的照片复印件。在图5(a)中，常规提取液在18cm 4-7 PharmaciaIPG条上聚焦。在图5(b)中，环丁砜溶液在含丙烯酰胺和DMA的实验室制备的18cm 4-7 IPG上聚焦。
图6是采用常规的和环丁砜的溶液提取和分离的大鼠肝全细胞制备物的照片复印件。
图7是采用常规的和环丁砜的溶液提取和分离的大肠杆菌(E.coli)膜制备物的照片复印件。在图7(a)中，常规提取液用于提取蛋白质。在图7(b)中，环丁砜提取液用于提取蛋白质。在图7(c)中，变化的环丁砜提取液(6M环丁砜4M硫脲，1％ASB-14，2mM TBP)用于提取蛋白质。
图8是显示通过活性炭和AG501×8树脂清洁环丁砜提取液，以还原朝向凝胶酸性末端的离子的照片复印件。使用以下溶液：(a)未经树脂处理过的包括环丁砜、硫脲、C7的环丁砜溶液，(b)未经树脂处理过的包括环丁砜、硫脲和ASB14的环丁砜溶液，(c)经炭和Biorad AG501×8树脂处理的包括环丁砜、硫脲、C7的环丁砜溶液，(d)经炭和Biorad AG501×8树脂处理的包括环丁砜、硫脲、ASB14的环丁砜溶液。
图9是比较环丁砜溶液和常规样品提取液的的照片复印件。凝胶代表(a)常规或(b)环丁砜提取液内1mg/mL大肠杆菌(E.coli)全细胞蛋白提取物。方框区是在两种凝胶中均发现的蛋白质，圆圈区表示使用常规提取液时未见的一些蛋白质。
缩写
AAP         N-丙烯酰基氨基丙醇
DMA         二甲基丙烯酰胺
SDS PAGE    十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
TEMED       N，N，N′，N′-四甲基乙二胺
APS         过硫酸铵
T           总丙烯酰胺
C           交联剂
ASB         酰氨磺基甜菜碱(Amidosulfobetaine)；Tetradeconoyl酰氨基
            丙基二甲基胺基丙烷磺酸盐(Tetradeconolyamido propyl
            dimethyl ammonio propane sulfonate)
TBP         三丁基膦
PDA         派嗪二-丙烯酰胺
Tris        Tris缓冲液
MQ水        Milli-Q水(纯净水)
具体实施方式
按照本发明，IPG凝胶包括亲水和疏水单体亚基混合物，其中至少一种亚基包括一个或多个低级烷基。优选地，本发明的IPG凝胶比用丙烯酰胺单独生产的那些凝胶更疏水。
聚合凝胶基质：
按照第一方面该凝胶是固定pH梯度的凝胶，优选包括聚合单元(I)CH2＝CR1-CO-NR2R3和(II)CH2＝CR4-CO-NR5R6。
单元(I)的R2和R3优选是C1-C4烷基，更优选是CH3。在特别优选的实施方案中，单元(I)中R1是H，R2和R3是CH3。
在备选的实施方案中，单元(II)中R5和R6相同或不同，并且是氢或丙醇。一项实施方案中，R4、R5和R6是H。在最优选的实施方案中，单元(II)中R4和R5是H，R6是丙醇。
在实施方案中，单元(I)和单元(II)的摩尔比为约1∶10到10∶1。优选单元(I)和单元(II)的摩尔比为约1∶5到5∶1，更优选为约1∶2到2∶1，最优选为1∶1。
优选的实施方案中，凝胶可以干燥并在其干燥状态贮藏。
在一项优选的实施方案中，凝胶包括DMA和丙烯酰胺的混合物。DMA是疏水分子，与丙烯酰胺相差两个额外的甲基。这种IPG凝胶优选在常规提取样品溶液和疏水的环丁砜溶液中充分再水合。
优选地，通过吸收到IPG条中的溶液测量再水合。优选通过计算干燥的和再水合的凝胶之间的重量差异。该胶条优选至少再水合至“倾注体积”，即倾注时的长×宽×厚。
另一优选的实施方案中，凝胶包括AAP和DMA的混合物。优选地，这种凝胶能够和环丁砜提取液、常规提取液和水基提取液再水合。
在特别优选的实施方案中，IPG凝胶含有约1∶1摩尔比的丙烯酰胺和DMA或者AAP和DMA。
优选地，IPG凝胶是稳定的并具有两亲性。
按照本发明，稳定的凝胶板能够洗涤干燥并在使用之前贮藏适当时间。优选地，稳定凝胶板能够在室温或凉爽条件下贮藏约1年，而不会损失其官能度。优选地，贮藏之后，凝胶板能够再水合，提供确定的pH表面性质，并且显示较少的易碎或欠柔顺的趋势。优选地，在适当条件(暗室或凉爽的温度)下贮藏时，凝胶板耐聚合水凝胶随时间的化学分解。
优选地，按照下述的标准方法，试验按照本发明的凝胶板的稳定性：
1)Kirkwood，T.B.L对生物标准物和产品稳定性的判定(Predicting thestability ofbiological standards and products)，Biometrics 33：736-742(1977)；
2)Porterfield，R.I和Capone，J.J.产品稳定性评估中动力学模型和阿累尼乌斯方法的应用(Applications of Kinetic models and Arrhenius methodsto product stability evaluations)，Med.Devices Diagn.Industry April 1984，pg45-50；
3)Kennon，L.用模型来确定化学制药的稳定性(Use of models indetermining chemical pharmaceutical stability)，J.Pharm.Sci.53：815-818(1964)。这些参考文献通过引用文献并入本文。
优选地，对按照本发明的凝胶板测试其在酸性或碱性条件下的化学稳定性。优选地，二甲基丙烯酰胺和AAP具有比丙烯酰胺更好的水解稳定性。参见，例如，Electrophoresis 1996 Apr：17(4)：723-31，作为参考引入本文。
一项实施方案中，IPG凝胶是IPG凝胶条或IPG凝胶板。
优选地，凝胶板是聚合的一整片凝胶。优选地，典型的胶条通常是从胶板上切下的，用于2-D凝胶的窄条(3至10mm宽)。优选地，胶板比通常用于2-D凝胶的胶宽。通常，市售的IPG是3.3mm宽。
IPG胶条优选附着在衬板上。
优选地，衬板是塑料衬板。塑料优选是处理过的塑料。优选地，这种处理使聚合丙烯酰胺与塑料交联从而固定凝胶。
在第二方面，本发明涉及分离和/或分析样品内至少一种大分子的方法，包括采用如本文所述的IPG凝胶对样品进行等电聚焦。
在优选的实施方案中，该方法包括增溶样品内的大分子。
优选地，增溶通过将样品和疏水性溶剂一起混合的方法进行。
优选地，增溶的大分子是增溶的蛋白质大分子(例如，肽、多肽、蛋白质或蛋白质复合物)。
一项实施方案中，该方法进一步包括混合烷基化剂，优选半胱氨酸烷基化剂，例如和溶解的样品一起的丙烯酰胺或碘乙酰胺。
优选地，样品选自由细胞外液、组织样品、细胞样品、微生物样品和培养样品所组成的组。优选的样品的例子包括但不限于，大肠杆菌(E.coli)样品和大鼠肝脏样品。
优选地，按照本发明的IPG凝胶与强疏水性提取液相容，例如含环丁砜和其它疏水性溶剂(例如不能使常规IPG凝胶或胶条再水合的那些溶液)的溶剂。当细胞样品在疏水性例如环丁砜溶液中溶解时，疏水蛋白质通常溶解。本发明人发现细胞样品顺利地溶于环丁砜溶液，并接着显示在双向凝胶上。显示在凝胶上的蛋白质溶液优于目前市售的最强的样品增溶溶液。
因此，优选地，疏水性溶剂包括活性组分，它选自以下物质组成的组：环丁砜、环丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲亚砜、二甲基甲酰胺。
在一项实施方案中，疏水性溶剂还包括其它组分，例如表面活性剂，如：CHAPS、Triton X100、ASB 14、C7BZ0、SB 3-10或者任何非离子或两性离子表面活性剂或它们的混合物；或者替代前者，或者另外，该溶剂可包括还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、TBP、三氰乙基膦(TCEP)、三羧乙基膦(TCEP)或巯基乙醇，或者它们的混合物。
在一项实施方案中，疏水性溶剂包括环丁砜、环丁烯砜或它们的混合物。
疏水性溶剂优选是环丁砜溶液。一项实施方案中，环丁砜溶液用于从组织样品中提取总蛋白。优选地，从样品中提取强疏水性蛋白质。一项实施方案中，强疏水性蛋白质包括，例如，大肠杆菌(E.coli)的膜蛋白。
一项实施方案中，疏水性溶剂包括约0.1M至约10.58M环丁砜，(饱和或100％环丁砜)。优选地，环丁砜溶液包括1M至8M环丁砜；更优选2M至6M环丁砜；更优选地，3M至5M环丁砜；最优选4M环丁砜。
优选地，疏水性溶剂进一步包括硫脲、ASB14和TBP。一项特别优选的实施方案中，疏水性溶剂包括4M环丁砜、4M硫脲、1％ASB-14、2mM TBP。
在一可替代的实施方案中，疏水溶剂可包括市售的溶剂如含有尿素的溶剂，特别是含有7M的尿素。优选地，该疏水溶剂还包括硫脲、ASB14和TBP。在一特别优选的实施方案中，尿素溶液包括7M尿素、2M硫脲、1％ASB14、2mM TBP。
第三方面，本发明涉及如文所述的本发明的IPG凝胶分离或分析样品内大分子的用途，例如，分离或分析蛋白质复杂混合物中蛋白质的分子(例如，肽、多肽、蛋白质或蛋白质复合物)。
第四方面，本发明涉及用于分离和/或分析样品内至少一种大分子的试剂盒，这种试剂盒包括增溶剂、本发明的固定pH梯度(IPG)的凝胶和使用说明书(可选配)。
优选地，增溶剂是疏水性溶剂。
优选地，疏水性溶剂包括活性组分、表面活性剂和还原剂，其中活性组分选自由环丁砜、环丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺组成的组。
在优选的实施方案中，疏水性溶剂包括4M环丁砜、4M硫脲、1％ASB-14和2mM TBP。
优选地，试剂盒进一步包括烷基化试剂，优选半胱氨酸烷基化试剂，例如丙烯酰胺或碘乙酰胺。
整个说明书中，所使用的词“包括(comprise)”，或者其变化，例如“comprises”、“comprising”，应理解成意味包含规定的成分、整数或步骤、或者多种成分、多个整数或步骤，但不是排除任何其它成分、整数或步骤，或者多种成分、多个整数或步骤。
已经包含于本说明书中的文献、做法、材料、装置、论文等的任何讨论仅仅是为了说明本发明。不能因为其在本申请每个权利要求优选权日之前已存在于澳大利亚，就认为任何或所有这些素材成为一部分现有技术基础或者是与本发明有关领域的普通常识。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1
丙烯酰胺和DMA IPG条的IPG倾注。
倾注这些IPG所需的丙烯酰胺溶液由50％丙烯酰胺和50％DMA(以摩尔为基础)组成。用于倾注IPG的丙烯酰胺的百分比是40％T、4％C。因此丙烯酰胺配方如下所示：
40％T，4％ C：
丙烯酰胺 19.5g
二甲基丙烯酰胺(DMA) 27.26mL
PDA 1.6g
以MQ水制成100mL
表1
为倾注7cm，4-7 DMA IPG(0.5mm)，采用Dr pH确定以下配方：
pH4  pH7
固定化电解质3.1，150.5μl 固定化电解质4.6，56.6μl
固定化电解质4.6，174.9μl 固定化电解质6.2，191.6μl
固定化电解质6.2，174.6μl 固定化电解质7.0，53.5μl
 40％T，4％C，625μl  40％T，4％C，625μl
 3mL 50％甘油 以MQ水制成5mL
 64μl 1M Tris
 以MQ水制成5mL
表2
为倾注7cm，3-10 DMA IPG(0.5mm)，采用Dr pH确定以下配方：
pH3 pH10
固定化电解质3.1  41.4μl 固定化电解质4.6  12μl
固定化电解质4.6  238.4μl 固定化电解质6.2  276.8μl
40％T  4％C，625μl 固定化电解质7.0  90.4μl
3mL  50％甘油 固定化电解质8.5  46.6μl
1M Tris  58μl 固定化电解质9.3  74μl
MQ水  制成5mL 40％T，4％C  625μl
1M乙酸  40μl
MQ水  制成5mL
表3
在采用小型倾注机倾注IPG梯度之前，向以上两种溶液中，加入2μl的TEMED和5μl的40％APS。IPG在50度聚合1小时。它们接着以10％甲醇洗涤3次，以5％甘油、10％甲醇洗涤1次，并干燥过夜。然后可将IPG切成条，在-20℃或-80℃贮藏直至需要用于再水合。
实施例2
AAP和DMA IPG条的IPG倾注。
制备具有3-10pH梯度和7cm的平板凝胶的IPG条。概述丙烯酰胺溶液和3-10溶液的配方。采用50∶50摩尔定量的DMA和AAP制备40％T、4％C丙烯酰胺溶液。
二甲基丙烯酰胺 0.546mL
N-丙烯酰氨基丙醇 1.42mL
哌嗪二丙烯酰胺 0.032g
水 最终体积2mL
表4
IPG倾注pH室。
pH3 pH10
固定化电解质3.1  41.4μl 固定化电解质4.6  12μl
固定化电解质4.6  238.4μl 固定化电解质6.2  276.8μl
40％T，4％C  625μl 固定化电解质7.0  90.4μl
50％甘油  3mL 固定化电解质8.5  46.6μl
1M Tris  58μl 固定化电解质9.3  74μl
MQ水  制成5mL 40％T，4％C  625μl
1M乙酸  40μl
MQ水  制成5mL
表5
继之以IPG倾注步骤(如丙烯酰胺和DMA IPG条)。
实施例3
环丁砜处理，以改进环丁砜的性能。
1.加热环丁砜至约50°并通过活性炭柱。这还可以成批操作。
2.在加入一种或多种表面活性剂和一种或多种还原剂之前，使环丁砜/硫脲溶液去离子(借助于混合床离子交换树脂)。
实施例4
大肠杆菌(E.coli)总蛋白的提取
冻干的大肠杆菌(E.coli)购自Sigma(EC1)并从头到尾用于这些实验。大肠杆菌(E.coli)再悬浮于5mL的常规提取液或环丁砜提取液中。它们接着超声处理1.5分钟15秒为一次冲击，并置于冰上保持低温。每个样品在21000×g旋转离心10分钟，移走上清液并用于再水合DMA IPG(用环丁砜提取液)或Pharmacia IPG(用常规提取液)。
实施例5
大鼠肝脏总蛋白的提取
将一个冰冻的大鼠肝脏(7.65g湿重)解冻，先切成小块，再在液氮中碾碎。肝脏分成三份并分别以20mL的常规提取液、环丁砜提取液或变化的环丁砜提取液(6M环丁砜、4M硫脲、1％ASB-14、2mM TBP)提取。样品采用探测器在70％强度下超声处理4×15秒，在冰上保持低温。样品接着在14000×g旋转离心45分钟，收集上清液并用于IPG再水合。
实施例6
大肠杆菌(E.coli)膜蛋白的提取
将两个1ml等分的冰冻大肠杆菌(E.coli)解冻并汇合。向汇合的样品中加入10mL冰冷的100mM碳酸钠。然后超声处理(30％强度1×15秒，40％强度3×15秒，50％强度2×15秒)样品，并且置于冰上保持低温。室温下样品以2500rpm旋转离心10分钟。向上清液中加入90mL 100mM碳酸钠，样品在冰上搅拌1小时。样品接着在4度于115000×g旋转离心1小时，以使膜蛋白成为小球。然后采用1.5mL 50mM Tris-HCl，pH7.3将小球洗涤两次，并分成4份装入微量离心管中。每次洗涤之后蛋白质在室温下于21000×g旋转10分钟。小球分别在500μl的常规提取液、环丁砜提取液或变化的环丁砜提取液(6M环丁砜、4M硫脲、1％ASB-14、2mM三丁基膦)中再悬浮。样品置于超声浴5分钟，再在室温下于21000×g旋转离心10分钟。收集上清液并用于IPG再水合。
实施例7
天然人血浆的制备
收集人血(50mL)并肝素化。在4度将样品在2000×g旋转离心20分钟。仔细移走血浆留下红细胞，并在-80度贮藏。
实施例8
IPG条再水合
大肠杆菌(E.coli)样品不经稀释施加至混合IPG条。大鼠肝脏样品用提取液(不含蛋白质)稀释五倍，加样至IPG条上。人血浆(天然)用水稀释60倍以上，并加至AAP+DMA IPG条上。每个样品以125μl以及作为示踪染料的痕量橘黄G一起加至IPG条。IPG条通常需再水合5-6小时。
实施例9
IPG聚焦
IPG条的聚焦在Pharmacia Consort装置(E752型)上实施。等电聚焦的程序是300伏特4小时，1000伏特4小时，2500伏特4小时和5000伏特4-5小时。最大产生35-40KVh。
实施例10
IPG条的均衡
在第二向凝胶电泳开始之前，将环丁砜提取液中的大肠杆菌(E.coli)样品和大鼠肝脏样品以均衡溶液(6M尿素、2％w/v SDS、1×Tris-HCl凝胶缓冲液pH8.8、20％甘油，2.5％丙烯酰胺，5mM TBP)均衡2×5分钟、1×10分钟。人血浆(天然)样品以1×Tris-HCl凝胶缓冲液pH8.8、20％甘油均衡20分钟。所有以常规提取液再水合的IPG条在均衡缓冲液(6M尿素、2％w/vSDS、1×Tris-HCl凝胶缓冲液pH8.8、20％甘油、2.5％丙烯酰胺、5mM TBP)中均衡1×20分钟。
实施例11
第二向凝胶
适用于大肠杆菌(E.coli)和大鼠肝脏样品的第二向凝胶是Novex4-12％1.5mm厚，双-Tris凝胶。采用含0.5％琼脂糖的1×MOPS缓冲液(50mMMOPS，50mM Tris，0.1％SDS，1mM EDTA)和痕量溴酚蓝，将IPG条嵌在上述凝胶上。第二向采用持续的电流以5mA/凝胶工作30分钟、10mA/凝胶工作30分钟、20mA/凝胶工作1小时和25mA/凝胶工作2小时。当溴酚蓝染料前沿已经从凝胶中移动出来时第二向电泳结束。人血浆样品在Noverx3-8％1.5mM Tris-乙酸盐凝胶上分离。用含0.5％琼脂糖的1×Tris-乙酸盐凝胶流动缓冲液(无SDS的50mM麦角胺(Tricine)、50mM Tris，以保持血浆的天然状态)和痕量溴酚蓝，将IPG凝胶条嵌在上述凝胶上。第二向采用持续的电流以2mA/凝胶工作1小时，5mA/凝胶工作1小时，10mA/凝胶工作2小时，和15mA/凝胶工作2小时。染料前沿移出凝胶后，使凝胶电泳再持续30分钟。
实施例12
蛋白质检测
用于本实验的所有样品以胶体考马斯(Colloidal Coomassie)G-250检测。在凝胶电泳结束后，凝胶自盒中移走并以G-250染色。在染色持续一夜之前更换一次染料。凝胶接着在1％乙酸中脱色24小时，然后扫描(惠普Scanjet5200以150dpi)并成像。
实施例13
丙烯酰胺和DMA IPG条的结果
结果表明环丁砜提取液优于常规提取液，由于它提取更多的蛋白质并显示对提取蛋白质的更好的溶解，尤其在IPG碱性末端。DMA IPG防止蛋白质在IPG碱性末端沉淀，表明碱性水解显著减少了，从而改善了凝胶图像质量。同样不具有DMA的IPG具有在IPG条内保留蛋白质的倾向(明显示于图1)，然而在含DMA的IPG带中未发现，因此在2D图像上有更广泛种类的蛋白质和更多的原始蛋白质提取物。
实施例14
AAP和DMA IPG条的结果
参考图1和图2，在这些IPG条上的用常规提取液和环丁砜提取液的大肠杆菌(E.coli)均产生良好的分离。这里显示在所有的IPG条内有蛋白质保留，然而可在均衡步骤中由于多次洗涤而溶解。如果使用常规的和环丁砜提取液的凝胶有重叠，很明显，不同的蛋白质以不同的比率从这些溶液中提取出来。这表明需要两种提取方法以分开更大量集合的蛋白质。
参考图3，天然人血浆副本已经获得和采用Pharmacia 3-10 IPG带时观察到的相似的分离性能。将其与电泳(Electrophoresis)(T Manabe等1999，20，830-835)中公开的一个凝胶图像比较时，显示很少有拖尾。然而这种公开的凝胶是天然血浆的大凝胶(18cm IPG条和20cm的第二向)，通过采用更高填充，就会出现更多的蛋白质斑点。
含AAP和DMA的IPG条的新配方已在与不同类型提取液再水合中成功。这些样品溶液包括常规的和环丁砜提取液以及适于天然凝胶的水基提取液。它们还成功聚焦这些蛋白质并产生良好溶解的双向凝胶。这种IPG条配方具有制备多用途IPG条的极大潜力。
参考图7，其中常规提取液使用Pharmacia 4-7 IPG条，环丁砜提取液用于再水合在实验室制备的丙烯酰胺/DMA 4-7 IPG条，常规的和环丁砜提取液在彼此类似浓度提取类似蛋白质。相反，变化的环丁砜提取液在非常低的浓度下提取较少数量的蛋白质。
本领域技术人员会理解，对如具体实施方案所示的本发明可进行许多变化和修正，而并不背离本发明所概括描述的精神或范围。因此，此处的实施方案被认为在所有方面是说明性的和非限制性的。

Claims (37)

1、适用于电泳的固定pH梯度的凝胶，该凝胶包括：聚合单体单元丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺，或者聚合单体单元N-丙烯酰基氨基丙醇和二甲基丙烯酰胺，其中所述聚合单体单元的摩尔比是1∶2至2∶1。
2、按照权利要求1的固定pH梯度的凝胶，其中摩尔比是1∶1。
3、按照权利要求1的固定pH梯度的凝胶，其中固定pH梯度的凝胶处于干燥状态。
4、按照权利要求1的固定pH梯度的凝胶，其中固定pH梯度的凝胶是固定pH梯度的凝胶条或固定pH梯度的凝胶板。
5、一种用于在样品中分析大分子的装置，包括根据权利要求1的固定pH梯度的凝胶，其中该固定pH梯度的凝胶附着于固体支持物或衬板上。
6、按照权利要求5的装置，其中衬板是塑料的。
7、按照权利要求6的装置，其中塑料是处理过的塑料。
8、按照权利要求7的装置，其中聚合单体单元丙烯酰胺、DMA或AAP与处理过的塑料交联。
9、一种分离或分析样品内至少一种大分子的方法，包括采用权利要求1的固定pH梯度凝胶对样品进行等电聚焦电泳。
10、按照权利要求9的方法，该方法进一步包括增溶样品内至少一种大分子。
11、按照权利要求9的方法，其中样品选自由细胞外液、组织样品、细胞样品、微生物样品和培养样品组成的组中。
12、按照权利要求11的方法，其中大分子是蛋白质或其片段。
13、按照权利要求10的方法，其中通过包括混合样品和疏水性溶剂的方法进行增溶。
14、按照权利要求13的方法，其中疏水性溶剂包括一种或多种选自以下物质组成的组：环丁砜、环丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲亚砜、二甲基甲酰胺。
15、按照权利要求13的方法，其中疏水性溶剂包括环丁砜或环丁烯砜或它们的混合物。
16、按照权利要求13的方法，其中疏水性溶剂进一步包括表面活性剂、还原剂或它们的混合物。
17、按照权利要求13的方法，其中疏水性溶剂进一步包括一种或多种以下组分：CHAPS、Triton X100、ASB 14、C7bZ0、SB 3-10、或任何非离子或两性离子表面活性剂、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、TBP、三氰乙基膦、三羧乙基膦、或巯基乙醇、或者它们的混合物。
18、按照权利要求9的方法，进一步包括在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对样品进行电泳。
19、按照权利要求1的固定pH梯度的凝胶在分离或分析样品中至少一种大分子中的用途。
20、一种用于分离和/或分析样品内至少一种大分子的试剂盒，该试剂盒包括包括：增溶剂，按照权利要求1的固定pH梯度的凝胶和可选配的使用说明书。
21、按照权利要求20的试剂盒，其中增溶剂是疏水性溶剂。
22、按照权利要求21的试剂盒，其中疏水性溶剂包括一种或多种活性组分选自以下物质组成的组：环丁砜、环丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲亚砜和二甲基甲酰胺。
23、按照权利要求22的试剂盒，其中疏水性溶剂包括环丁砜或环丁烯砜或它们的混合物。
24、按照权利要求23的试剂盒，其中疏水性溶剂包括0.1M至10.58M的环丁砜。
25、按照权利要求23的试剂盒，其中疏水性溶剂包括1M至8M的环丁砜。
26、按照权利要求23的试剂盒，其中疏水性溶剂包括2M至6M的环丁砜。
27、按照权利要求23的试剂盒，其中疏水性溶剂包括3M至5M的环丁砜。
28、按照权利要求23的试剂盒，其中疏水性溶剂包括4M的环丁砜。
29、按照权利要求20的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括：表面活性剂或还原剂或者它们的混合物。
30、按照权利要求29的试剂盒，其中表面活性剂或还原剂包括以下组分中的任何一种或多种：CHAPS、Triton X100、ASB 14、C7bZ0、SB 3-10、或任何非离子或两性离子表面活性剂、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、TBP、三氰乙基膦、三羧乙基膦、或巯基乙醇。
31、按照权利要求20的试剂盒，其中增溶剂包括：表面活性剂或还原剂或者它们的混合物。
32、按照权利要求20的试剂盒，进一步包括：烷基化剂。
33、按照权利要求32的试剂盒，其中烷基化剂是半胱氨酸烷基化剂。
34、按照权利要求32的试剂盒，其中烷基化剂是丙烯酰胺或碘乙酰胺或它们的混合物。
35、按照权利要求20的试剂盒，其中增溶剂包括4M环丁砜和4M硫脲。
36、按照权利要求20的试剂盒，其中增溶剂包括尿素。
37、按照权利要求36的试剂盒，其中尿素是7M尿素。
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