CN104764788A

CN104764788A - 一种蛋白质电泳方法

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Publication number: CN104764788A
Application number: CN201510104747.6A
Authority: CN
Inventors: 马海乐; 李云亮; 何华纲; 张艳艳; 王蓓; 任晓峰
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明一种蛋白质电泳方法，涉及蛋白质分析领域。具体涉及一种单层聚丙烯酰胺凝胶的制备以及利用该凝胶进行蛋白质电泳分析的方法。此方法中的单层聚丙烯酰胺凝胶的制备工艺简单，耗时少，对分子量4~100 kDa范围内的蛋白质具有较好的分离效果。

Description

一种蛋白质电泳方法

技术领域

本发明涉及蛋白质分析领域，特别是指一种用于蛋白质分析的电泳方法。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体和少量交联剂双甲叉丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵，AP），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚丙烯酰氨凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，常用于蛋白质和核酸的分离。

在变性胶电泳中，蛋白质在巯基乙醇和十二烷基硫酸钠（SDS）的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成SDS-蛋白质复合物（SDS和蛋白质质量比1.4:1），该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，通过凝胶的分子筛作用，蛋白质依据其分子量大小而逐渐呈梯度分开。

为了取得较好分离效果，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）大多在不连续缓冲溶液系统进行（电泳胶的缓冲溶液与电泳槽中的pH值不同），电泳所用的凝胶也由不同浓度的浓缩胶和分离胶组成。常规SDS-PAGE，对应蛋白质的有效的分离范围为10~100 kDa（分离胶浓度为7.5%~15%），而常用于分离小分子多肽的Tricine-SDS-PAGE，对应的有效分离范围为1~10 kDa，通常在分离1~5 kDa小肽所用的电泳胶由浓缩胶、胶层胶和分离胶三层胶组成，制作起来比较繁琐。

而在分析的蛋白大小处于1~100 kDa的范围内时，由于缺乏一种有效的电泳体系，需要在SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE上分别进行电泳分析，但是电泳结果由于在不同体系产生的，两种电泳结果无法进行有效的横向比较，对实验造成很大的不便。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术存在的问题，提供一种工艺简单，对大分子蛋白和小分子肽同时具有较好分离效果的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方法。

本发明的目的可按照下述步骤进行实现：

1、制备聚丙烯酰胺凝胶。

电泳制胶板中灌制单层胶，即直接灌入聚丙烯酰胺分离胶，灌完插入梳齿板后聚合成型。对于分辨率要求较高或者样品盐离子浓度较高的情况，可以依次灌入位于底层的聚丙烯酰胺分离胶和位于上层的聚丙烯酰胺浓缩胶，浓缩胶上的加样孔由胶凝固前插入梳齿板后聚合成型。一般来说，分离胶和浓缩胶的比例约为4：1~5：1。

其中所述的分离胶和浓缩胶由胶混合溶液在30~37℃凝固30~60分钟形成，其中该分离胶混合液包括以下组成：

丙烯酰胺混合液质量体积分数为12%~15%，其中丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比为19.55~24.95：1；

尿素质量体积分数32~35%；

3 mol/l pH为8.45的三羟基甲烷盐酸（Tris-HCl）缓冲液体积分数20~25%；

十二烷基硫酸钠（SDS）质量体积分数0.1~0.2%；

过硫酸铵质量体积分数0.4~0.8%；

四甲基乙二胺（TEMED）体积分数0.04%~0.08%；

余量为水。

其中该浓缩胶混合液包括以下组成：

丙烯酰胺混合液质量体积分数为4~5%，其中丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比为29：1；

3 mol/l pH为8.45的Tris-HCl 缓冲液体积分数20~25%；

十二烷基硫酸钠（SDS）质量体积分数0.1~0.2%；

过硫酸铵质量体积分数0.4~0.8%；

四甲基乙二胺体积分数0.04%~0.08%；

余量为水。

通过调整聚丙烯酰胺分离胶和聚丙烯酰胺成层胶的组分参数，能够提高大分子蛋白和小分子肽的分离效果，另外，该配方形成的凝胶韧性好，容易取胶，不易破裂。

2、在样品中加入样品缓冲溶液，至于95℃加热15分钟至样品完全溶解。

所述的样品缓冲溶液为以下组分：50 mmol/l Tris-HCl（pH6.8），50~100 mmol/l DTT（二硫苏糖醇），1.5~2.5％SDS（m/v）（电泳级），0.025~0.05%（m/v）溴酚蓝，20~25％（v/v）甘油。该缓冲溶液有效处理蛋白样品，而且处理完的蛋白样品溶液密度高，加入加样孔后能迅速沉降到加样孔底部，改善电泳分离条带，提高分辨率。

3、在制胶器内槽加入阴极缓冲溶液（0.2 mol/l Tris-HCl，pH 8.9）没过加样孔，取出梳齿板，用移液器吸取阴极缓冲液冲洗加样孔，静置2~5分钟，重复以上冲洗两次。可以冲洗从凝胶中渗透出来的尿素，降低加样孔中缓冲液的密度，使上样的样品更容易沉降到加样孔底部。在加样孔中加入电泳样品，制胶器内槽外加入阳极缓冲溶液（0.1 mol/l Tris-HCl，0.1 mol/l三(羟甲基)甲基甘氨酸（Tricine），0.1%（m/v）SDS），接通电源开始电泳。

4、电泳完成后，拆开制胶板，取出凝胶，将凝胶置于5%（v/v）的戊二醛中预处理

10分钟，然后进行凝胶染色和成像。

本发明具体的使用效果：相比SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE，单层胶制作工艺简单，可用于分离较宽分子量范围的蛋白质的分离，并测定其相对分子量。根据比较标准分子量的蛋白质与待测蛋白质在同一块凝胶上电泳条带的相对距离，可以大致确定蛋白质的分子量大小。

从附图1可以清楚看到普通凝胶（图1A）对于小分子的蛋白质的分离效果不好，不能有效分离分子量小于14.3 kDa的蛋白，而本发明中的凝胶（图1B、C和D）对于4~100 kDa的蛋白质具有很好的分离效果，具有更大的分离范围。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1、电泳效果图

A为12%普通SDS凝胶电泳（丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比为29：1），B、C和D为12%的单层凝胶电泳（丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比分别为19.55、22.25和24.95：1）1~10对应蛋白质标记的分子量分别为200、116、97.2、66.4、44.3、29、20.1、14.3、6.5和4 kDa。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用方法对照的方法具体如下实施：

贮存液的配置：

丙烯酰胺母液1：29 g丙烯酰胺和1 g双甲叉丙烯酰胺溶于100 ml蒸馏水。

丙烯酰胺母液2：27.9 g丙烯酰胺和1.8 g双甲叉丙烯酰胺溶于100 ml蒸馏水。

3×胶缓冲溶液：Tris 36.33 g，SDS 0.3 g，调pH至8.45，定容至100 ml。

10%过硫酸铵：100 mg过硫酸铵溶解1 ml蒸馏水。

2×样品缓冲液配方为：100 mmol/l Tris-HCl（pH6.8），200 mmol/l DTT（二硫苏糖醇），5％（m/v）SDS，0.1%（m/v）溴酚蓝，50％（v/v）甘油。

以上溶液均用0.45 μm滤膜过滤后，置于4℃下保存。

阳极缓冲液：Tris 12.1 g，调pH至8.9，定容至500 ml。

阴极缓冲液：Tris 6.05 g，Tricine 8.96 g，SDS 0.5 g，pH 8.25，定容至500 ml。

染色液：考马斯亮蓝R250 2.5 g，甲醇450 ml，冰醋酸100 ml，水450 ml

脱色液：甲醇100 ml，冰醋酸70 ml，水830 ml

本实施例，采用的电泳仪为六一24 DN电泳仪，制胶板厚度为10 mm，胶体积为7 ml。

本实施例，所述的聚丙烯酰胺分离胶由分离胶混合溶液凝固成凝胶而成，该分离胶混合溶液包括以下组分：

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

实施例6

尿素

2.3 g

丙烯酰胺母液1

1.96 ml

1.4 ml

0.84 ml

2.45 ml

1.75 ml

1.05ml

丙烯酰胺母液2

0.84 ml

1.4 ml

1.96 ml

1.05 ml

1.75 ml

2.45ml

3×胶缓冲溶液

2.1 ml

水

0.728 ml

0.28 ml

10%过硫酸铵

30μl

40μl

四甲基乙二胺

4 μl

5 μl

制胶工艺按下面步骤进行：

（1）装制胶玻璃板，再装入制胶槽中。

（2）按照实施例中成分配制丙烯酰胺混合液，混合均匀。

（3）将丙烯酰胺混合液加入制胶玻璃板，插入梳齿板，水平放置于37℃培养箱45分钟以上。

（4）胶体完全凝结后，在电泳内槽加入阴极缓冲溶液没过短板，拔出梳齿，用阴极缓冲溶液冲洗加样孔，静置2~5分钟，再次冲洗加样孔。

（5）快速加入样品，将制胶槽放入电泳外槽，在外槽中加入阳极缓冲溶液。

（6）接上电源，25 mA恒流电泳3~5小时，至溴酚蓝带跑至离凝胶底部2厘米停止。

（7）取胶，将凝胶置于5%（v/v/）的戊二醛中处理10分钟，蒸馏水冲洗，加入染色液进行染色30~60分钟，加入脱色液脱色数次至蛋白条带清晰，背景色少，拍照成像。

Claims

1.一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，其特征在于，包括：聚丙烯酰胺凝胶的制备和聚丙烯酰胺凝胶使用方法。

2.根据权利要求1所述一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，特性在于，由单层分离胶组成，可不含浓缩胶。

3.根据权利要求1所述的一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，其特性在于：聚丙烯酰胺凝胶的制备工艺，所述的聚丙烯酰胺凝胶由分离胶混合溶液凝固而成，该分离胶混合溶液包括有以下组分：

丙烯酰胺混合液质量体积分数为12%~15%，其中丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比为19.55~24.95:1；

尿素质量体积分数32~35%；

3 mmol/l pH为8.45的三羟基甲烷盐酸（Tris-HCl）缓冲液体积分数20~25%；

十二烷基硫酸钠（SDS）质量体积分数0.1~0.2%；

过硫酸铵质量体积分数0.4~0.8%；

四甲基乙二胺（TEMED）体积分数0.04%~0.08%；

余量为水。

4.根据权利要求1所述的一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，其特性在于：聚丙烯酰胺凝胶使用方法，（1）在样品中加入样品缓冲溶液溶解样品；

（2）在制胶器内槽加入阴极缓冲溶液没过加样孔，取出梳齿板，用移液器吸取阴极缓冲液反复冲洗加样孔，在加样孔中加入电泳样品，在电泳外槽加入阳级缓冲溶液，开始电泳；

（3）电泳完成后，拆开制胶板，取出凝胶，用固定液处理，然后进行凝胶染色和成像。

5.根据权利要求4的一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，其特性在于：所述的样品缓冲溶液，甘油的体积分数为20~25%。

6.根据权利要求4所述的一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，其特性在于：固定液，使用的固定液为戊二醛溶液。

7.根据权利要求4所述的一种可用于蛋白质和多肽分析的电泳方法，其特性在于：电泳阴极缓冲溶液和阳极缓冲溶液，阴极缓冲溶液包含组分为0.2 mmol/l Tris-HCl（pH 8.9），阳极缓冲溶液包含以下组分：0.1 mmol/l Tris-HCl，0.1 mmol/l三(羟甲基)甲基甘氨酸（Tricine），0.1%（v/v）SDS。