CN108593394A - 木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电泳法技术领域，公开了一种木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，所述木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法包括：木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取、单向快速分离木兰科植物种子醇溶蛋白和固定、染色、脱色。本发明采用酸性聚丙烯酰胺电泳分离木兰科植物种子醇溶蛋白，简单易行；为不同种类木兰科植物种子的分类和鉴定提供了快速有效的手段。
Description
技术领域
本发明属于电泳法技术领域，尤其涉及一种木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：木兰科植物多为高大的常绿乔木，特别因其花色艳丽，花香宜人，树姿优美多态，树叶、聚合果各具特色，是一类具有很高观赏价值的园林绿化树种。但木兰科植物种子的鉴定却是园林工人在选种时遇到的一大困难，如何快速地实现对木兰科植物种子进行鉴定，具有重要意义。醇溶蛋白是植物种子储存蛋白的组分之一，不能够溶于水，也不溶于无水乙醇，但溶于50％—90％的乙醇，所以人们通常采用乙醇为溶剂来提取醇溶蛋白。除此之外，也还可用丙三醇、丁二醇作为溶剂来提取醇溶蛋白。醇溶蛋白主要存在于植物中，其中以禾本科植物中醇溶蛋白最为丰富，至今对禾本科植物醇溶蛋白进行的相关研究很多，例如对小麦品种的研究，玉米醇溶蛋白的研究等。醇溶蛋白分析已被广泛应用于品种的鉴定、亲缘关系比较和遗传多样性研究等领域。本发明通过提取木兰科植物种子中的醇溶蛋白，使用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分离醇溶蛋白，通过不同醇溶蛋白谱带来鉴定木兰科植物种子。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法从1967年出现以来，迅速得到了推广运用。各国的研究者以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法为基础根据自己实验室的实际情况，在凝胶配方、材料选择、溶液配制、电泳方法等等方面进行了诸多修改，使之更适合自己的实验目的和对象。通过不断修改完善，酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术成为了一种鉴定品种的标准方法，1986年，国际种子检验协会(ISTA)将酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为鉴定小麦、大麦品种的标准方法。目前，对于木兰科植物种子分类和鉴定研究中，通常以植物学形状特征作为鉴定方法，但在实际应用中，木兰科植物种子各品种间植物学特征相似的情况很多，对研究者的专业背景要求高，通过形态进行鉴定可行性不高。而利用与遗传相关的生理生化物质进行品种鉴定是较为简单、准确、快速的方法，但其难点是对于相关物质的提取分离。因此开发出快速分离这些生理生化物质的方法，对于快速品种鉴定意义重大。
综上所述，现有技术存在的问题是：在实际应用中，木兰科植物种子各品种间植物学特征相似的情况很多，对研究者的专业背景要求高，通过形态进行鉴定可行性不高。
解决上述技术问题的难度和意义：难点在于对木兰科植物醇溶蛋白的高效提取，对提取的醇溶蛋白采取合适的电泳体系进行有效分离；其意义在于通过对醇溶蛋白的有效提取和电泳分离，可以借助不同醇溶蛋白谱对木兰科不同种植物的种子进行快速鉴定。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法。
本发明是这样实现的，一种兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，所述木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法包括：木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取、单向快速分离木兰科植物种子醇溶蛋白和固定、染色、脱色。
进一步，所述木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取具体包括：将胚乳在分析天平上称重，胚乳重：提取液体积按1:4比例加入由25％二氯乙醇+12％尿素+1％巯基乙醇配置而成的样品提取液研磨，之后震荡20分钟，随后在常温12000r/min条件下离心20min，所得上清液按照1：1比例加入40％的蔗糖溶液，在该样品中加入0.5％的甲基绿，常温储存备用。
进一步，所述单向快速分离木兰科植物种子醇溶蛋白具体包括：
(1)采用循环水冷却电泳仪进行垂直板酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的聚丙烯酰胺母液配制分离胶浓度5％，pH 3.1丙烯酰胺分离胶灌注至梳子下端1.5cm处，用超纯水液封，凝胶半小时以上；
(2)弃去分离胶上的超纯水，将聚丙烯酰胺母液配制浓缩胶浓度12％，pH 4.2丙烯酰胺浓缩胶，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上；
(3)用乳酸铝电极缓冲液在120V恒压电泳约40min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200V，恒压电泳3h。
进一步，所述固定、染色、脱色具体包括：电泳结束后，取下玻璃板，沿一角将玻璃板撬开，把凝胶剥离下来放在培养皿内，倒入固定液，放在摇床上固定半小时；固定半小时后再倒入考马斯亮蓝染色液进行染色，染色时间2小时；染色完成后，进行脱色，脱色时间通常为两小时，将脱好色的胶取出放在透明光板上，用扫描仪进行扫描，防止条带扩散。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：采用酸性聚丙烯酰胺电泳分离木兰科植物种子醇溶蛋白，简单易行；可以有效鉴定不同种木兰科植物种子，对于种子采购和种苗繁育生产具有重大指导意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法流程图。
图2是本发明实施例提供的不同种木兰科植物种子醇溶蛋白上样量的示意图；
图中：b-黄花含笑；c-多脉含笑；d-桂南木莲；e-天女木兰；f-山玉兰；g-滇藏木兰；h-毛叶玉兰；i1-毛果木莲。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取技术和利用聚丙烯酰胺酸性电泳分离醇溶蛋白方法；方便快捷、准确有效，适用于实际生产应用。
如图1所示，本发明实施例提供的木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法包括以下步骤：
S101：木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取，先将胚乳在分析天平上称重，按1:4(胚乳重：提取液体积)比例加入由25％二氯乙醇+12％尿素+1％巯基乙醇配置而成的样品提取液研磨，之后震荡20分钟，随后在常温12000r/min条件下离心20min，所得上清液按照1：1比例加入40％的蔗糖溶液，在该样品中加入几滴0.5％的甲基绿，常温储存备用；
S102：单向快速分离木兰科植物种子醇溶蛋白；
S103：电泳结束后，取下玻璃板，沿一角将玻璃板撬开，把凝胶剥离下来放在培养皿内，倒入固定液，放在摇床上固定半小时；固定半小时后再倒入考马斯亮蓝染色液进行染色，染色时间2小时；染色完成后，进行脱色，脱色时间通常为两小时，将脱好色的胶取出放在透明光板上，用扫描仪进行扫描，防止条带扩散。
在本发明的优选实施例中：步骤S101具体包括：木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取，成熟的木兰科种子的种皮可分为三层：最外层革质，即外种皮，为鲜艳的朱红色或粉红色，极光滑。中间层肉质，即中种皮，乳白色，富含脂肪，手触有油腻感。最内层木层，坚硬，大多为黑色，此外还有黄色、褐色等。首先将木兰科植物种子外面三层种皮去掉，取种子中的胚乳。采用研磨的方法提取胚乳中的醇溶蛋白。
步骤S102具体包括：
(1)采用北京六一仪器厂生产的循环水冷却电泳仪进行垂直板酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的聚丙烯酰胺母液配制分离胶浓度5％，pH 3.1丙烯酰胺分离胶灌注至梳子下端1.5cm处，立即用超纯水液封，凝胶半小时以上。
(2)弃去分离胶上的超纯水，将聚丙烯酰胺母液配制浓缩胶浓度12％，pH 4.2丙烯酰胺浓缩胶(含40％蔗糖)，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上。
(3)用乳酸铝电极缓冲液(含0.25％乳酸铝，用乳酸调到pH 3.1)在120V恒压电泳约40min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200V，恒压电泳3h(约2.5h前沿指示剂到达底部，再电泳0.5h使条带分离度提高)。
步骤S103具体包括：固定、染色、脱色，电泳结束后，取下玻璃板，沿一角将玻璃板撬开，把凝胶剥离下来放在培养皿内，倒入固定液，放在摇床上固定半小时；固定半小时后再倒入考马斯亮蓝染色液进行染色，染色时间2小时。染色完成后，进行脱色，脱色时间通常为两小时，具体依据脱色程度(背景颜色脱成无色)而定每半小时更换一次脱色液。将脱好色的胶取出放在透明光板上，用扫描仪进行扫描，防止条带扩散。
下面结合具体实施例对本发明的应用效果作详细的描述。
实施例1：
(1)木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取
A、在分析天平上准确称取木兰科植物中桂南木莲、毛果木莲、山玉兰0.5g，加入2mL由25％二氯乙醇+12％尿素+1％巯基乙醇定容到100ml的样品提取液，于研钵研磨至匀浆后转至5mL离心管中，震荡混匀，在常温下12000r/min条件下离心20min，收集上清液。
B、取1mL上述上清液于5mL试管中，向其中加入1mL 40％的蔗糖溶液和几滴0.5％的甲基绿，震荡混匀后常温下12000r/min条件下离心10min，收集上清，常温储存备用。
(2)电泳试剂的配制
A、丙烯酰胺贮液：称取29.2gAcr(单体丙烯酰胺)和0.8g Bis(甲叉双丙烯酰胺)，加水溶解后定容至100mL，避光保存于4℃冰箱。
B、0.5％FeSO4：称取0.5g FeSO4加入至预先煮沸并加入稀硫酸的少量水中溶解完全后，定容至100mL。
C、2％抗坏血酸：取0.2g Vc定容至10mL(用煮沸过的纯水配制)；用棕色小试管分装，可于4℃冰箱保存2个月。
D、40％蔗糖：称取40g蔗糖，热水中溶解后，冷却至室温后定容至100mL。
E、3％H2O2：取1mL 30％H2O2原液于10mL容量瓶中定容。
F、0.5％甲基绿：称取0.25g甲基绿于烧杯中，少量水溶解后，定容至50mL。
G、电极缓冲液：称取5g乳酸铝于1000mL烧杯中少量水溶解后，加水至800mL后用乳酸调节pH至3.1，定容至1000mL。
H、pH 3.1 2.5％乳酸铝：称取2.5g乳酸铝加少量水溶解后，加水至80mL，用乳酸调节pH至3.1后，定容至100mL。
I、pH 4.2 1.5％乳酸铝：称取1.5g乳酸铝加少量水溶解后，加水至80mL，用乳酸调节pH至4.2后，定容至100mL。
J、固定液：量取40ml乙醇和10ml的冰乙酸，加去离子水定容至100ml；
K、染色液：用精确度为万分之一的电子秤称取1g考马斯亮蓝R—250倒入烧杯中，再量取450ml甲醇和100ml冰乙酸倒入其中加去离子水定容至1L，放在磁力搅拌器上搅拌至考马斯亮蓝完全溶解；
L、脱色液：25ml的乙醇和8ml的冰乙酸加去离子水定容至100ml；
(3)单向快速分离木兰科植物种子中醇溶蛋白
A、采用北京六一仪器厂生产的循环水冷却电泳仪进行垂直板酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的聚丙烯酰胺母液配制分离胶浓度5％，pH 3.1丙烯酰胺分离胶灌注至梳子下端1.5cm处，立即用超纯水液封，凝胶半小时以上。
B、弃去分离胶上的超纯水，将聚丙烯酰胺母液配制浓缩胶浓度12％，pH4.2丙烯酰胺浓缩胶(含40％蔗糖)，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上。
C、待胶凝完全后，小心拔掉梳子，每孔上样桂南木莲(5μL、10μL、15μL、20μL)、毛果木莲(5μL、10μL、15μL、20μL)、山木兰(5μL、10μL、15μL、20μL)(如图2)。
D、用乳酸铝电极缓冲液(含0.25％乳酸铝，用乳酸调到pH 3.1)在120V(10V/cm)恒压电泳约40min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200V，恒压电泳3h(约2.5h前沿指示剂到达底部，再跑0.5h使条带分离度提高)。
(3)固定、染色、脱色
电泳结束后，取下玻璃板，沿一角将玻璃板撬开，把凝胶剥离下来放在培养皿内，倒入固定液，放在摇床上固定半小时；固定半小时后再倒入考马斯亮蓝染色液进行染色，染色时间2小时。染色完成后，进行脱色，脱色时间通常为两小时，具体依据脱色程度(背景颜色脱成无色)而定每半小时更换一次脱色液。将脱好色的胶取出放在透明光板上，用扫描仪进行扫描，防止条带扩散。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，其特征在于，所述木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法包括：木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取、单向快速分离木兰科植物种子醇溶蛋白和固定、染色、脱色。
2.如权利要求1所述的木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，其特征在于，所述木兰科植物种子中醇溶蛋白的提取具体包括：将胚乳在分析天平上称重，胚乳重：提取液体积按1:4比例加入由25％二氯乙醇+12％尿素+1％巯基乙醇配置而成的样品提取液研磨，之后震荡20分钟，随后在常温12000r/min条件下离心20min，所得上清液按照1：1比例加入40％的蔗糖溶液，在该样品中加入0.5％的甲基绿，常温储存备用。
3.如权利要求1所述的木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，其特征在于，所述单向快速分离木兰科植物种子醇溶蛋白具体包括：
(1)采用循环水冷却电泳仪进行垂直板酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的聚丙烯酰胺母液配制分离胶浓度5％，pH 3.1丙烯酰胺分离胶灌注至梳子下端1.5cm处，用超纯水液封，凝胶半小时以上；
(2)弃去分离胶上的超纯水，将聚丙烯酰胺母液配制浓缩胶浓度12％，pH 4.2丙烯酰胺浓缩胶，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上；
(3)用乳酸铝电极缓冲液在120V恒压电泳约40min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200V，恒压电泳3h。
4.如权利要求1所述的木兰科植物种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，其特征在于，所述固定、染色、脱色具体包括：电泳结束后，取下玻璃板，沿一角将玻璃板撬开，把凝胶剥离下来放在培养皿内，倒入固定液，放在摇床上固定半小时；固定半小时后再倒入考马斯亮蓝染色液进行染色，染色时间2小时；染色完成后，进行脱色，脱色时间通常为两小时，将脱好色的胶取出放在透明光板上，用扫描仪进行扫描，防止条带扩散。
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