CN106124597A

CN106124597A - 一种sds‑聚丙烯酰胺电泳胶及其制备方法

Info

Publication number: CN106124597A
Application number: CN201610451698.8A
Authority: CN
Inventors: 何云红; 丁海兵; 邸铭洋; 王长城; 孙承君
Original assignee: Dishen Biotechnology (shanghai) Co Ltd; Ocean University of China
Current assignee: Dishen Biotechnology (shanghai) Co Ltd; Ocean University of China
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2016-06-21
Publication date: 2016-11-16

Abstract

本发明公开了一种SDS‑聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于：由丙烯酰胺单体与交联剂甲叉双丙烯酰胺按比例混合，以三异丙醇胺、牛磺酸、乙醇酸、甘氨酸及三羟甲基氨基甲烷‑盐酸水溶液组成的缓冲体系，并且加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠以及引发剂过硫酸铵和催化剂四甲基乙二胺。本发明方法制得的SDS‑聚丙烯酰胺电泳胶不仅具有良好的分离效能和胶体性能，蛋白谱带的分辨率及清晰度较高，并且胶体的分离速度和凝胶速度均快于Laemmli胶。传统的Laemmli胶体虽然性能优良，但是不具备长期保存能力，本发明的电泳胶相比Laemmli胶体能够维持更长的保质期，在37 °C恒温条件下保存12天以上仍能够保持正常的分离效能，相当于在4 °C下保存超过一年。

Description

一种SDS-聚丙烯酰胺电泳胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种电泳胶及其制备方法，特别涉及一种SDS-聚丙烯酰胺电泳胶及其制备方法。

背景技术

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术主要用于分离蛋白质和寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）已成为目前生物化学实验最常用的支持介质。通过使用强阴离子SDS 建立的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术主要被用于分析蛋白质和多肽、测定其分子量。英国的Laemmli于1970年正式创建含十二烷基硫酸钠（SDS）的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在实验应用时需要聚丙烯酰胺凝胶作为载体进行电泳。

传统Laemmli胶虽然有良好的分离效能，但是无法长期保存，凝胶在冷藏的过程中会发生水解，会使蛋白质的条带清晰度降低，使蛋白质的分析过程中增加难度。目前国际上大型的预制胶制造公司（Pierce公司、Invitrogen公司以及Bio-Rad公司等）都拥有自己独有的预制胶专利生产技术，但是电泳配方都处于保密状态或受到严格的专利保护，而国内对于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳预制胶的研究才刚刚起步，对于胶体配方的探索也才刚刚开始。因此有必要寻找一种既具备Laemmli胶体的优良性能，又能够长期保存，并且规避国外产品专利壁垒的电泳胶配方。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离速度和凝胶速度快、谱带的分辨率及清晰度高，且保质期长的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶及其制备方法，作为SDS电泳技术分离蛋白质的载体。

为了实现上述目的，本发明公开了一种SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，它包括独立配制的堆积胶和分离胶：

(1)堆积胶：配制质量百分比为7.5%的堆积胶，每份所述堆积胶的原料组成为：

2.50 mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液、1.34 mL去离子水、6.00 mL凝胶缓冲液、100 μL阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液、50 μL引发剂过硫酸铵（APS）水溶液、10 μL催化剂四甲基乙二胺（TEMED）；

(2)堆积胶：配制质量百分比为X%的分离胶，每份所述分离胶的原料组成为：

0.33X mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液、（3.84-0.33X）mL去离子水、6.00 mL凝胶缓冲液、100 μL SDS水溶液、50 μL APS水溶液、10 μL TEMED。

所述丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液为丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺的混合溶液，总的丙酰胺单体质量百分比浓度为30%。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合质量比例为37.5:1。

所述SDS水溶液的质量百分比浓度为10%。

所述APS水溶液的质量百分比浓度为10%。

所述凝胶缓冲液是由50 mM三异丙醇胺（TIPA）、150 mM牛磺酸（Taurine）、50 mM乙醇酸（Glycolic acid）、100 mM甘氨酸（Glycine）及0.1 mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）水溶液组成的缓冲体系。其中Tris-HCl的pH为6.4-7.0。

所述凝胶缓冲液各组分体积分别为1.00 mL三异丙醇胺、2.00 mL牛磺酸、1.00 mL乙醇酸、1.00 mL甘氨酸及1.00 mL Tris-HCl。

上述胶体配方中，与传统Laemili配方电泳胶进行对比，新增了几种物质，分别是：甘氨酸、三异丙醇胺、牛磺酸、乙醇酸，将Tris-HCl 缓冲液的含量降低。

其中，甘氨酸的作用是填充在聚丙烯酰胺胶体中，稳固胶体的空间结构，保持其良好的几何外形，保证胶体的分子筛效应，同时在电泳时起到拖尾离子的作用，保证蛋白质分离时不出现强烈的拖尾和滞留现象。

三异丙醇胺是本配方的关键物质，其主要功能是代替Tris-HCl起到缓冲物质的作用，保证胶体pH在近中性的范围内。因为较高的pH会使得SDS-PAGE胶体更容易水解，而胶体水解则会直接导致蛋白质条带的分辨率下降，降低单种蛋白质分子的移动距离；较低的pH虽然能避免水解的发生，但是谱带的清晰度不高，往往会出现谱带歪斜和严重的拖尾，不能获得想要的蛋白分析物。另一方面，由于Tris中与中心碳原子相连的（NH₂-）结构会不断攻击聚丙烯酰胺的酰胺键（-CONH₂），会使其分子的空间网状结构被逐渐破坏，失去分子筛效应，从而丧失分离效能。因此，降低Tris的比例，可以在保证不攻击聚丙烯酰胺的酰胺键的同时，使胶体在长时间内处于稳定状态，延长电泳胶的保质期。

牛磺酸的作用是辅助三异丙醇胺，使之能够更好的起到稳定胶体的作用，延长胶体保质期。

乙醇酸的作用是代替盐酸调节pH，它比盐酸更为温和，能够保证胶体的性质在整体上不发生太大的变化。

之所以保留少量的Tris-HCl缓冲液，是用以保持电泳过程中Tris所起到的作用。

为了实现上述目的，本发明还公开了所述SDS-聚丙烯酰胺电泳胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

配制分离胶：准备好制胶器以及相应的玻璃胶板，将玻璃板用去离子水冲洗并用擦镜纸擦拭干净，然后将两块玻璃胶板按照上下顺序重叠，放入制胶器中压条封边，除APS和TEMED之外，按照配方中所述的药品用量，用移液枪精确地移取相应体积的各种溶液到50ml小烧杯中混合均匀，将胶体溶液用超声波震荡混匀排气，再加入APS和TEMED混匀；然后用移液枪将混匀后的溶液缓慢沿玻璃胶板内侧边缘注入到两板的间隙中（避免产生气泡），至所述胶板的3/4高度处，水封，防止氧化，静置；

待胶体与水出现分界线后，配制浓缩胶：按照配方中所述的药品用量，用移液枪精确地移取相应体积的各种溶液到50ml小烧杯中混合均匀，将胶体溶液用超声波震荡混匀排气，再加入APS和TEMED混匀；倾倒出液封的去离子水，用移液枪将混匀后的溶液缓慢沿玻璃胶板内侧边缘注入到两板的间隙中（避免产生气泡），充满整个玻璃槽，插入电泳梳子，静置，待梳子与胶体之间出现缝隙则表明胶体已经制备完成。

本发明方法制得的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶不仅具有良好的分离效能和胶体性能，蛋白谱带的分辨率及清晰度较高，并且胶体的分离速度和凝胶速度均快于Laemmli胶。传统的Laemmli胶体虽然性能优良，但是不具备长期保存能力，本发明的电泳胶相比Laemmli胶体能够维持更长的保质期，在37 °C恒温条件下保存12天以上仍能够保持正常的分离效能，相当于在4 °C下保存超过一年。

附图说明

图1本发明胶和Laemmli胶电泳分离预染色标准蛋白的谱带对比图。

图2本发明胶和Laemmli胶电泳分离预染色标准蛋白的分离图线。

具体实施方式

为了使公众能充分的了解本发明的技术实质和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明做进一步地阐释，但不是限制本发明的保护范围。任何依据本发明构思形式而非实质的变化都应当视为本发明的保护范围。

本发明实施例中所用的SDS-PAGE电泳的缓冲液为25 mM Tris, 192 mM Gly 和0.1% SDS。

本发明实施例中在平板凝胶上进行电泳，室温，电压恒定范围约为50 V-600 V，优选为50 V-350 V。根据蛋白质电泳的分离情况，时间为30-50 min。

本发明实施例中使用预染色的蛋白质标准样品，包括6种纯化蛋白，分子量从大到小分别为120 kDa、85 kDa、50 kDa、35 kDa、25 kDa和20 kDa。

实施例1：

本实施例中对本发明制备的聚丙烯酰胺电泳胶和传统的Laemmli胶在电泳分离中的性能进行比较。在电泳胶制备当天进行蛋白质分离操作。

在平板凝胶电泳槽中制备一系列的SDS-PAGE电泳胶。准备好制胶器以及相应的玻璃胶板，配制质量百分比为7.5%的分离胶，用移液枪移取准确体积的各组分溶液充分混合均匀。胶体原料中各组分体积为：2.48 mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液、1.46 mL去离子水、6.00 mL凝胶缓冲液、100 μL SDS水溶液、50 μL APS水溶液、10 μL TEMED。分离胶注入后用去离子水液封，分离胶注入量约为整个胶板间隙深度的3/4，静置待分离胶凝固。配制质量百分比为7.5%的堆积胶，胶体原料中各组分体积为：2.50 mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液、1.34 mL去离子水、6.00 mL凝胶缓冲液、100 μL SDS水溶液、50 μL APS水溶液、10 μL TEMED。然后在胶板剩余的1/4部分注入堆积胶。注入堆积胶之后，将已经准备好的电泳梳子插入胶板上边缘，静置至堆积胶凝固。

对凝胶进行蛋白质电泳实验，检验胶体性能。从制胶器上取下已经制作好的胶板，插入电泳槽中，然后取下梳子，露出上样槽，向电泳槽内室注入已经配制好的电泳缓冲液，并在在外室内注入同样的电泳缓冲液。然后用微量进样器取5~7 μl的预染色蛋白质样品注入到胶体的上样槽内。将电极盖盖在电泳槽上的相应的电极上，打开与之相连的电泳仪，调节各项电泳参数，恒压200 V，开始电泳，观察电泳时的分离情况。

对图1 Laemmli胶和本发明胶新鲜制备后的蛋白条带对比图（即在0天条件下）进行比较，新鲜制备的本发明胶体对蛋白的分离效能很高，蛋白质分离形成的谱带清晰，并且胶体的各项性能良好，空间结构完整，凝胶孔径均匀。对图2 Laemmli胶和本发明胶新鲜制备后的蛋白分离图线（即在0天条件下）进行比较，电泳后六种蛋白质分离谱带的比移值R _f随着蛋白质分子量M r 的增大而逐渐降低，以蛋白质分子量的对数lgM r 为横坐标，以R _f值为纵坐标作线性图，线性相关系数很高，R²达到0.9985。本发明胶体中R _f 的平均变化率都能大致稳定在某一个常数，且每一种蛋白的R _f 值也基本上和新鲜制备的Laemmli胶体在一定范围内保持一致。除此之外，在相同电泳条件下，本发明胶体电泳时间为30 min；Laemmli胶电泳分离时间为45 min，电泳时间缩短约三分之一。

实施例2：

本实施例是在加速测试中研究本发明范围内SDS-PAGE电泳胶的保质期。

电泳胶各组分浓度体积与实施例1中相同。将电泳胶胶板连同梳子放入封口袋，注入胶体保护液，约30 mL，抽真空封口，存贮在37 °C（37 °C存贮1天相当于常规存贮温度4 °C下存贮1个月）的恒温箱中进行加速测试。分别存贮6、10和12天后在凝胶上对预染色的蛋白质混合物进行电泳。

本实施中所用胶体保护液为无SDS的电泳缓冲液，是浓度为25 mM Tris和192 mMGly配成的水溶液。

对本发明胶体和Laemmli胶上的蛋白质分离条带，分子量M r 和相对迁移率R _f 的Laemmli图进行比较。

图1中，经过加速寿命6天，10天后，Laemmli胶体中蛋白质的谱带逐渐区分不开；分离效能显著下降。保存至第12天时，只有前面的两条谱带能够被分清，其余的谱带十分模糊，最后两条谱带无法区分开。并且保存12天后的Laemmli胶体明显存在气泡，且电泳后胶板下端出现部分胶体突出，失去原有的几何外形，出现漏胶现象。而对比本发明胶体，不论是6天、10天还是12天的加速实验，电泳完成后的胶体对蛋白分离的谱带清晰，分辨率高，谱带位置变化不大，保持着良好的分离能力，条带不存在模糊或者分离不清的现象，且没有拖尾、变形的情况。本发明的凝胶胶体中也不存在出现气泡或漏胶现象，胶体强度、胶体性状良好，几何外形完整，胶体质量基本上维持在一个较高的水平。

图2中，经过加速试验后，Laemmli胶体R _f 值的变化率从第6天到第12天依次降低，分离效果明显下降。在恒温保存至第6天的实验中，R _f -lgMr 的线性相关系数尚能达到0.9801。到了第10天的时候，R _f -lgMr 线性相关系数变低，只有0.9413。Laemmli胶体在保存到第12天时，蛋白质迁移率与lgMr 基本没有线性关系。对比本发明胶体，同时进行电泳实验的凝胶胶体则有很好的分离效果。它的R _f 值与lgMr 始终保持线性关系，且变化率稳定，线性回归系数高出同期的Laemmli胶体很多，线性相关系数偏差不超过0.001且均在0.9900之上。

Claims

1.一种SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于它包括独立配制的堆积胶和分离胶：

（1）堆积胶：配制质量百分比为7.5%的堆积胶，每份所述堆积胶的原料组成为：

2.50 mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液、1.34 mL去离子水、6.00 mL凝胶缓冲液、100 μL阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠水溶液、50 μL引发剂过硫酸铵水溶液、10 μL催化剂四甲基乙二胺；

（2）分离胶：配制质量百分比为X%的分离胶，每份所述分离胶的原料组成为：

0.33X mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液、（3.84-0.33X）mL去离子水、6.00 mL凝胶缓冲液、100 μL 阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠水溶液、50 μL 引发剂过硫酸铵水溶液、10 μL催化剂四甲基乙二胺；

所述凝胶缓冲液是由50 mM三异丙醇胺、150 mM牛磺酸、50 mM乙醇酸、100 mM甘氨酸及0.1 mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸水溶液组成的缓冲体系。

2.根据权利要求1所述的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于所述丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺水溶液为丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺的混合溶液，总的丙酰胺单体质量百分比浓度为30%。

3.根据权利要求1或2所述的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于所述丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合质量比例为37.5:1。

4.根据权利要求1所述的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于所述十二烷基硫酸钠水溶液的质量百分比浓度为10%。

5.根据权利要求1所述的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于所述过硫酸铵水溶液的质量百分比浓度为10%。

6.根据权利要求1所述的SDS-聚丙烯酰胺电泳胶，其特征在于所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸水溶液的pH为6.4-7.0。

7.如权利要求1所述SDS-聚丙烯酰胺电泳胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）配制分离胶：准备好制胶器以及相应的玻璃胶板，将玻璃板用去离子水冲洗并用擦镜纸擦拭干净，然后将两块玻璃胶板按照上下顺序重叠，放入制胶器中压条封边，除过硫酸铵和四甲基乙二胺之外，按照配方中所述的药品用量，用移液枪精确地移取相应体积的各种溶液到50 mL小烧杯中混合均匀，将胶体溶液用超声波震荡混匀排气，再加入过硫酸铵和四甲基乙二胺混匀；然后用移液枪将混匀后的溶液缓慢沿玻璃胶板内侧边缘注入到两板的间隙中，至所述胶板的3/4高度处，水封，防止氧化，静置；

（2）待胶体与水出现分界线后，配制浓缩胶：按照配方中所述的药品用量，用移液枪精确地移取相应体积的各种溶液到50 mL小烧杯中混合均匀，将胶体溶液用超声波震荡混匀排气，再加入APS和TEMED混匀；倾倒出液封的去离子水，用移液枪将混匀后的溶液缓慢沿玻璃胶板内侧边缘注入到两板的间隙中，充满整个玻璃槽，插入电泳梳子，静置，待梳子与胶体之间出现缝隙则表明胶体已经制备完成。